JPH02131415A - 土壌線虫駆除方法およびそれに用いる線虫駆除組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、土壌線虫駆除方法、それに用いる線虫駆除組
成物およびその製造法に関する。

〔従来の技術〕

近年、従来の化学殺虫剤が環境汚染への影響が大きいと
いう観点から、農業への害虫を生物学的に抑制すること
に対する関心が増大している。

農作物を害する主な害虫の１つは線虫である。

かくして、環境を汚染せずに、この害虫を有効に駆除す
る方法はきわめて望ましいものである。

ルートノット（『ｏｏｔ−ｋｎｏｔ）線虫、ルートリー
ジョン（『００ｔｌｅｓｊｏｎ）線虫、シスト（ｃｙｓ
ｔ）線虫などの線虫を抑制するのに線虫を喰べるバクテ
リアを使用することは特開昭（Ｊ−Ａｔ）５８−０２４
５０８号公報で開示されている。この公開公報によれば
、線虫を喰べるバクテリアを含む溶液はバーミキュライ
ト、バーライト、ゼオライトまたはピートモスなどの多
孔性物質中に注入され、その注入された多孔性物質は植
物の周囲に加えられる。

リゾバクテリアのある菌株による、線虫の阻止と植物へ
の菌進入の阻止についてはＥＰ−ＡＩ−１６００８９号
公報に開示されている。この公開公報によれば、線虫に
対する防御はそれらのバクテリアを植物の根城に導入す
るか、または、種子を、土地に播種前にこれらのバクテ
リアを含む溶液に浸漬することによってなされうる。こ
れらのバクテリア株による阻止は、吸収された窒素・炭
素源が存在するぱあい、とくに有゛効である。

カルバミン酸塩またはジチオカルバミン酸塩線虫駆除剤
とバステウリア　ベネトランス（Ｐａｓｔｅｕｒｌａ　
ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）菌とを併用した線虫駆除組成はＥ
Ｐ−ＡＩ−２１７．３７８号公報に開示されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明にしたがえば、キチンまたはコラーゲンで富養化
した土壌から分離された微生物は、多分線虫の卵殻か卵
サック（ｅｇｇ　ｓａｃｓ）を破壊するがゆえに、土壌
線虫の抑制にきわめて有効であることが見出された。さ
らに本発明によれば、その中で微生物が生育され、回収
される成長培地上澄み液、ホモジュネートまたはその抽
出物は、それら上澄み液、ホモジュネートまたは抽出物
からえられる固形物と同様に、土壌線虫の抑制に有効で
ありうるということが意外にも見出された。そのような
上澄み液、ホモジュネート抽出物および固形生成物は、
本発明においては以下、残存培地（ｒｅｓｉｄｕａｌ　
ｍｅｄ１ｕｍまたはｒｅｓｉｄｕａｌ　ｍｅｄｉａ）と
称する。

かくして、本発明はキチンまたはコラーゲンで富養化し
た土壌から分離された線虫駆除微生物および（または）
残存培地の有効量を土壌内に入れることからなる線虫駆
除の方法を提供するものである。

本発明はまた、活性成分として前記線虫駆除微生物およ
び（または）ここに定義された残存培地の有効量および
土壌環境とも相互作用のない担体からなる植物防保護用
の線虫駆除の組成物を提供する。

本発明はさらにキチンかコラーゲンで土壌を人工的に富
養化し、微生物がその土壌内で増殖するのを許し、微生
物を含んだ該土壌のサンプルを、実質的に唯一の炭素源
としてのキチンかコラーゲンを有する成長養土をうるた
めに（土壌の富養化のタイプによって）キチンかコラー
ゲンと混ぜ、微生物の成長をひきおこすようにその成長
養土を培養し、えられた微生物培養株をよく知られた方
法で精製処理をすることからなる線虫駆除微生株の純粋
な培養を行なう方法を提供する。

キチンかコラーゲンで富養化した土壌から本発明にした
がって数種類のタイプの線虫駆除微生物かえられた。キ
チンに富んだ土壌から分離されたそのような微生物の例
は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属とア
エロモナス（Ａｅｒｏｉｏｎａｓ）属のバクテリアであ
る。コラーゲンに富んだ土壌から分離されたそのような
微生物の例は、クニンガメラ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅ
ｌ　ｌａ）属の菌、とくにエレガンス（Ｅｌｅｇａｎｓ
）種の菌である。

これらの微生物の種類の株は純粋な培養形としてえられ
た。以下のものがとくに記載される。

（ｉ）まだ未同定のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ）のバクテリアの、“２０Ｍ″と呼ばれる株。こ
ノ株は１９８８年１０月ｔｏ日にパストール研究所のコ
レクシオン・ナショナル・ドウ・クルトウール●ドウΦ
ミクロオルガニスム （Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　
Ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｄｅ旧ｃｒｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ　
（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ））に寄託され、Ｉ−８０４の呼称が
与えられた。

（ｉ）“２０Ｍ−２”と呼ばれる２０Ｍの突然変異株。

（至）アエロモナス（　Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属の、未
同定ノバクテリアの“２Ｆ”と名づけられた株。

０クニンガメラ（Ｃｕｎｎｌｎｇｈａｍｅｌ　Ｉａ）属
の菌からえられる“３０ＣＥ”と名づけられたエレガン
ス（Ｅｌｅｇａｎｓ）種の株。

本発明はこのようにさらにキチンあるいはコラーゲンで
富養化された土壌から遊離された線虫駆除微生物の純粋
培養株を提供する。とくに、本発明は菌株２０Ｍ　、２
０Ｆおよび３０ＣＨの純粋培養株を提供するものである
。

さらに本発明によって、前記３つの微生物株の使用によ
る線虫駆除の方法と組成物が提供される。

そのようにえられた純粋培養株は、キチンかコラーゲン
を炭素源として含む培地中で成長され、保存された。た
だし、培地中にはグルコースのような他の炭素源もまた
存在してもよい。

〔課題を解決するための手段〕

本発明による純粋培養株は、新しい突然変異株をうるた
めに放射性物質、突然変異誘発性化学物質、γ線または
Ｘ線の照射による制御された突然変異処理を受けてもよ
い。該突然変異株はすぐれた線虫駆除能力、すぐれた生
存力、貯蔵中の改良された感染性、高成長率などのすぐ
れた他の性能をもっている。したがって、以下に使用す
る“線虫駆除微生物の純粋培養株”という語は、純粋な
状態で最初にえられる線虫駆除微生物の親株と、それの
、線虫駆除に活性な突然変異株とを含んでいる。

本発明にしたがって、線虫駆除微生物かその残存培地は
、線虫による感染を防止するかその発生後そのような感
染の拡散を阻止するために、土壌に適用されるか、ポッ
トの土壌混合物の中に加えられる。これらの微生物か残
存混合物を土壌に適用するのに、それらを液体に調製す
ることができる。その液体は散布されても潅厩水に混ぜ
られても、種子や根の、接種あるいは植えつけ前の浸漬
用に用いられてもよい。それらはまた固体の担体と乾い
た組成物に調製され、この形で土壌に混ぜられてもよい
。

産業上の目的のためには線虫駆除微生物を含んだ農業用
組成物を作るために多量の線虫駆除微生物が必要である
。そのような多量のものは醗酵法でもっともよくえられ
る。その醗酵の過程は、特定した種の微生物培養株のサ
ンプルを、そのばあいに応じてキチンおよび（または）
コラーゲンとさらにその他の栄養剤を含む醗酵培地を入
れた醗酵タンク中に接種することからなっている。醗酵
は充分な濃度、たとえばバクテリアのぱあいで１０”細
胞／　ｍｌ　，菌のぱあいで１０７細胞／　ｍｌの微生
物かえられるまで続けられる。原則として、線虫駆除微
生物の工業的規模での醗酵のばあいには、キチン以外の
蛋白質も含んでいる純粋でない、それ故に安価なキチン
原料が用いられてもよい。

もし線虫駆除微生物の培養株が、たとえば他のバクテリ
アで汚染されると、その結果生じた発酵物は線虫駆除活
性のない多量の、あるばあいにはきわめて多量にさえな
るバクテリアを含むであろう。このことはこの発酵物か
らつくられる組成物の効果の低減をもたらす。したがっ
て醗酵に純粋な培養株を使うことは好ましいことである
。

このようにしてえられた醗酵上澄み液は植物の防護に用
いられる線虫駆除微生物の液状線虫駆除組成物としてそ
のまま使用されうる。あるいはまた、液状組成物は微生
物または微生物と土壌環境と両方を他の培地に移すこと
によってつくられうる。

線虫駆除微生物の乾燥組成物はたとえば、そのようにし
てえられた醗酵上澄み液を多孔性固体担体の中に注入し
、乾燥してつくられる。しかしながら、長い間の貯蔵後
や地中での長期間ののちにさえこの微生物に活性が残る
ためには、種々の適当な添加剤によって達成されるとい
うことを注意しておくことが必要である。そのうえさら
に、前記担体は、そこで他のタイプの微生物が増殖する
ことを避けるために、好ましくは栄養の乏しいものであ
るべきである。

〔実施例〕

以下の記述と実施例において下記の用語が用いられる。

すなわち、 “キチノリチックバクテリア（ｃｈｌｔｉｎｏ＋ｙｔｌ
ｃｂａｃｔｅｒｉａ）　” キチンで富養化した土壌から分離したバクテリアを示す
。

“コラーゲノリチックバクテリア （ｃｏｌｌａｇｅｎｏｌｙｔＩｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ）
　”コラーゲンで富養化した土壌から分離したバクテリ
アを示す。

“キチノリチック菌（ｃｈｉｔｉｎｏｌｙｔｌｃ　ｆｕ
ｎｇｉ）”キチンで富養化した土壌から分離した菌を示
す。

１コラーゲノリチック菌（ｃｏｔ　ｌａｇｅｎｏｌｙｔ
１ｃｒｕｎｇｉ）“ コラーゲンで富養化した土壌から分離した菌を示す。

しかしながら、これらの語は、上に定義されたキチノリ
チックバクテリアが、ただキチノリチック活性だけをも
ち、たとえばコラーゲノリチック活性を持たないという
意味を指し示しているのではないということを記憶され
るべきである。反対に、ここで定義されたあるキチノリ
チックバクテリアは、ときとしてはそのキチノリチック
活性より強くさえあるコラーゲノリチック活性をもちう
る。同じことはキチノリチソク菌そして反対にコラーゲ
ノリチックバクテリアや菌にも適用される。加えて、本
発明にしたがって分離されたすべての微生物は、実質的
な一般の蛋白質加水分解活性を示すことが見出された。

下記において引用は折々とりわけキチノリチックバクテ
リアについてなされるであろう。同じことはキチノリチ
ツクおよびコラーゲノリチック菌と同様にコラーゲノリ
チツクバクテリア、ムタティス　ムタンデイス（ｌｕｔ
ａｔｉｓ　ｆｆｌｕｔａｎｄｉｓ）にも適用されうろこ
とは理解されるべきである。

１線虫駆除微生物の調製 線虫駆除微生物は乾燥あるいは液状の組成物に調製され
うる。乾燥組成物は、原則として微生物量や土壌環境と
折り合いのよい固体担体からなる。担体は微生物の生存
力の保持と、かつ土壌に適用した際の微生物の増殖に寄
与する。

担体はさらにバクテリアとその標的（すなわち根城にあ
る線虫の卵および卵サックとの相互作用を妨害してはな
らない。好ましい担体は、多孔性の材料でつくられてい
て、付着剤としてはたらく添加物が共存してもよい。

線虫駆除微生物の乾燥組成物は、一般に固体担体の粒子
を微生物の液状懸濁液と充分な時間、すなわち粒子に微
生物懸濁液が充分注入するようになるまで接触させるこ
とでつくられる。そののち、担体は液から分離、乾燥さ
れる。種々の添加物、たとえば付着剤のようなものは注
入された担体の乾燥前に加えられる。

本発明による線虫駆除微生物の乾燥組成物は、通常の方
法で土壌内に適用されうる。たとえば、組成物は農場（
その全域または一部）に播種機や乾燥肥料の散布に用い
られる通常の装置を用いて散布されうる。乾燥組成物は
同様にポット内の土壌混合物にも含ませうる。

線虫駆除微生物の土壌内への導入はまた液状の組成物の
形で、たとえばそれらの組成物を直接処理すべき地域に
散布するとか、あるいはあらかじめ乾燥または液状の組
成物を潅厩用水に混合させて、肥料を施すときに普通に
行なわれるのと同様の方法で適用されうる。散布用の線
虫駆除微生物の水溶液組成物は、醗酵によってえられた
微生物の懸濁液あるいはその希釈物であってもよいし、
または乾燥した純粋培養株か固体組成物に水または水溶
液を加えてつくってもよい。

線虫駆除微生物がその中で育てられ、そこから回収され
る培地は、また線虫駆除活性を持つ。

したがって、そのような培地はそのままで線虫駆除の組
成物として使用しうるし、または、線虫駆除活性をもっ
た水溶液か乾燥生成物の形に、それ自体知られている方
法で処理されてもよい。

前述のとおりこのような残存培地は有効な線虫駆除剤で
あって、バクテリアそのものと同様の方法で適用される
。

線虫駆除微成物の液状組成物および（または）残存培地
はまた播種や植つけ前の種子や植物の浸漬にも用いられ
る。

この組成物は土壌中への導入に際し、微生物の増殖を惹
き起すことができるので好ましい。

その目的のため、たとえば綿の実のあらびき粉、そのば
あいに応じてコラーゲンおよび（または）キチン、およ
び同様のものなどを栄養源として加えることは有用なこ
とである。一方、原則として組成物への栄養分の添加は
前もって行なわれるが、以下のことは記憶されるべきで
ある。

すなわち早期の導入は乾燥組成物のばあいにのみ実際的
であって、そのときですら好ましくない汚染微生物の増
殖を避けるための注意がなされねばならない。

■線虫駆除微成物の純粋な培養株の生成本発明による純
粋な培養株はキチンかコラーゲンで人工的に富養化した
土壌からえられた。

これらの富養化した土壌はキチノリチックまたはコラー
ゲノリチックバクテリアと菌の増殖を推進する。それら
のバクテリアや菌の多くは土壌線虫の抑制に有効である
。

富養化した土壌は戸外の場所にあるいは温室・各種のコ
ンテナー・容器などの閉鎖系の中に置かれうる。この目
的のためのある好ましいキチン源は甲殻類（ｇｒｏｕｎ
ｄ　ｃｒｕｓｔａｃｅａｎ）の殻や類似のものからえら
れるような種々のキチンに富んだ廃棄物である。コラー
ゲンの１つの好ましいソースはたとえば食肉産業に用い
られる種類のものである。キチンかコラーゲン源が土壌
の上に散かれた場所での好ましいその量は約１５〜２０
ｇ／ｒｒｒである。一方、キチンかコラーゲン源が土壌
、たとえばポット用混合物（　ｐｏｔｍｉｘｔｕｒｅ）
に混ぜられると、好ましい量は、約０，Ｏｌ〜０．０５
％（重量基準）である。

以下の論及は、とくにキチノリティックバクテリアの純
粋培養株の生成について行なう。

一旦キチノリチックバクテリアがキチンに富んだ土壌中
で増殖すると、この土壌のサンプルは集められ、唯一の
炭素源としてキチンを含む選択培地に接種される。この
目的のためには、非キチノリティックバクテリアの生長
を避けるため純粋なキチンを使うことが必要である。キ
チンの好ましい純粋な源は、たとえば、９１ｇｍａ．Ｎ
ｏ．，米国で製造されるコロイドキチンである。

このものは知られた方法で作られうる。キチンに加えて
、選択培地（ｓｅｌｅｃｔ１ｏｎ　ｍｅｄ１ｕＩＩｌ）
は、また、ＫＮＯ３のような窒素源、Ｎａ　　％　Ｍｇ
２”ＰＯａ−３ＳＯａ−２のようなある種のイオンおよ
びｐＨを６〜８、好ましくは８．５〜７．５に保つため
の緩衝剤を含む必要がある。

バクテリアが増殖するに充分な期間の培養ののち、培地
のサンプルは選択段階を加えるために、本質的に同じ組
成からなる他の選択培地に移される。このようにしてた
とえば、選択培地が寒天培地のぱあいでは、バクテリア
の一つのコロニーが液状の溶液に懸濁され充分に希釈の
のち寒天に接種される。

この選択段階は純粋な培養株かえられるまで数回くり返
されうる。

コラーゲノリテイツクバクテリアの純粋培養株の分離方
法は、各段階でキチンがコラーゲンに置きかえられるが
、全く同様である。

菌の分離の方法も全く同様である。本質的な違いは菌の
成長に用いられる菌の成長に適当であるべき培地の違い
である。たとえば、適当な培地は“マーチンーローズ・
ベンガル・培地（Ｍａｒｔｉｎ−Ｒｏｓｅ　Ｂｅｎｇａ
ｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）”である。それは炭素源としてキチ
ンかコラーゲンを含んでいるが、バクテリアの分離のた
めに用いられた培地との違いは、この培地はそのほかの
炭素源としてグルコースのようなものを含んでいること
である。

■培養株の保存 本発明に従ってえられたキチノリティックバクテリアの
純粋培養株は、すくなくともバクテリアの生存と成長の
ための最小限の要求物を供給する培地の入った培養容器
の中で保存されうる。この培地は原則としては当該分野
で知られているどんなバクテリア成長培地でもよいが、
汚染微生物の成長を抑制するために、主要炭素源として
キチンを含む成長培地を用いることが望ましい。この培
地は、それ故選択培地と同じでありうるが、キチン源は
純粋である必要はない。微生物を常に成長フエーズに保
つために、培養株のサンプルはときどき、たとえば２週
間に１回、新しい培地に移されるべきである。

培養株のこのような保存は、ただ比較的短期間、すなわ
ち数週間から数か月が適当であるということは記憶され
るべきである。培養株のより長い期間、すなわち何か月
から何年という保存は２、３日ごとに繰り返し移し変え
が必要なので骨のおれることである。加えて、たとえ最
高の注意が払われたとしても他の微生物による汚染の可
能性は常に存在する。さらに、時がたつにつれて、制御
できない形で培養株の性質を変えるであろう自然の突然
変異が起りうるのである。

コラーゲノリチックバクテリアの純粋な培養株は同様な
方法で、しかしキチンをコラーゲンに変えることで保存
できる。

本発明による、菌の培養株は菌の成長と増殖に適当な培
地中で一時保存されうる。このような培地の例は、その
ばあいによって小麦ぬかの抽出物やキチンかコラーゲン
のような炭素源を含む寒天培地である。

菌の細胞による栄養の消費と老廃物の分泌によって細胞
か、それにより生成された分生子を含むサンプルはそれ
故定期的に新しく、新鮮な培地に移されるべきである。

たとえば、もし培養株が寒天培地で成長されたぱあいは
、菌細胞で生成された分生子は収集され、新しい寒天培
地上に接種される。分生子の収集は寒天培地上に蒸溜水
を加えることによって、うまく行なわれる。寒天培地の
上では浸透圧のために熟成した（ｒｉｐｅ）分生子は、
上澄み液中に排出され、そこから容易に回収される。

バクテリアに関する前記の記載と同様の理由から、その
ような保存は比較的短期間のばあいにのみ適当である。

６か月までの保存期間については、たとえばぬか抽出物
の寒天培地のような、固体マトリックス上の菌細胞の単
層膜が、約４℃で保存される。

他方、分生子懸濁液は長期間、すなわち約１２カ月まで
４℃で貯蔵されうる。

■菌株の長期貯蔵 長期の貯蔵は、前記のとおり、微生物懸濁液を凍らせる
かそれの凍結乾燥でおこなわれる。

キチノリティックバクテリアのぱあい、培養株はある時
間、対数増殖期に到達するまで成長させられる。そのよ
うな成長に適した培地は液状のコロイド状キチン培地で
ある。凍結の前に、たとえばグリセロール８０％とコロ
イド状キチンを含む液状培地２０％からなる凍結混合物
がバクテリア懸濁液中に混ぜられる。こうしてえられた
混合懸濁液は、しばらくの間、たとえば３０分間、室温
に保たれ、それから−７０℃にまで凍らされる。

凍結乾燥のためには、キチノリティックバクテリアは液
状のコロイド状キチン培地中で対数増殖期に達するまで
成長させられる。そのバクテリア懸濁液は、そののち、
たとえば１２０００ｇで１０分間遠心分離にかけられる
。上澄液を除いたあとにえられるバクテリアのペレット
（ｐｅｌｌｅｔ）はｌＯ％の脱脂乳粉の液に懸濁され、
その懸濁液はゆっくりと、たとえば渦巻によって混合さ
れる。このようにして混ぜられた懸濁液はドライアイス
ーアセトン中で凍らされ、そののち凍結乾燥にされる。

バクテリアの解凍または水和化は、それ自体知られてい
る方法で行なわれる。

本発明の他の微生物の長期貯蔵は、当業者にとって明ら
かな種々の変法と共に同様の方法で行なわれる。

■醗　酵 これらの微生物の農業用線虫駆除組成物を作るための大
量の微生物をうるためには醗酵が必要である。醗酵の培
地は一般に炭素源と微生物の成長と増殖に必要な他の成
分を含んでいる。

しかしながら、汚染した、線虫駆除能力のない微生物の
成長を防ぐために、炭素源には、すくなくとも主要なも
のとして特定の微生物に従ってキチンかコラーゲンを用
いることが好ましい。

以下、醗酵についてはキチノリティックバクテリアにつ
いて記載する。

大量のキチノリチックバクテリアをうるための醗酵培地
は好ましくは炭素源としてキチン、たとえば未精製の甲
穀類（ｇｒｏｕｎｄ　ｃｒｕｓｔａｅｅａｍ）の穀（以
下“粗キチン”と呼ぶ）を含み、さらにグルコースのよ
うな付加的な炭素源を含んでもよい。好ましくは醗酵培
地は、また緩衝塩類、酵母エキス、グルコースおよびＫ
ＮＯ３のような窒素源を含んでいる。

そのような醗酵培地ではどのファクターも限界にならな
いように注意されねばならない。そして多くのパラメー
ターすなわち、ｐｌ１、ミネラル濃度（ｍｉｎｅｒａｌ
　ｓｔｒｅｎｇｔｈ）、温度などはバクテリアの許容範
囲内に、好ましくは最高レベルに保たれるべきである。

発酵の最適ｐＨは約６．５〜７．５であることが見出さ
れた。酵母エキスの最適濃度は約０．１％から０．４％
（重量／体積比）であることが見出された。その好まし
い濃度は約０．３％である。

チッ素源としてＫＮＯ３が用いられたときは、前記のよ
うな培地におけるその最高濃度は約０．５％から約０．
２％であって、０．１％が好ましいことが見出された。

グルコースは必然的な構成物ではないが、゜バクテリア
の成長にポジティブの効果をもつことが分った。グルコ
ースの最適濃度範囲は約０．１％ないし０．４％、そし
て０．２駕が好ましいことが分った。キチン源として粗
キチンが用いられたときは、その好ましい濃度範囲は約
０．１％から０．４％で約０．２％がより好ましい。こ
れらのバクテリアの成長は緩衝塩の濃度に敏感であるこ
とが分った。緩衝塩の濃度は約０．０１Ｍ以下に保たれ
るべきである。好ましい濃度は約０．００８Ｍである。

最高条件が保たれると、最終的な細胞数は１０”細胞／
　ｍｌの数に到達する。

コラーゲノリチックバクテリアの発酵は同様な方法で、
ただしキチンをコラーゲンに変え、他のすべての条件は
同じままで行なった。好ましいコラーゲン源は、たとえ
ば食肉産業に用いられるものである。

線虫駆除菌の発酵は菌をたとえば種々の産業廃棄物中で
成長させて行なわれる。好ましい発酵培地はたとえばじ
ゃが芋の煮汁（煮たじゃが芋の可溶性抽出物である）、
トウモロコシのひたし汁（ｃｏｒｎ−ｓｔｅｅｐ　Ｉｌ
ｑｕｏｒ）　　（澱粉工業におけるトウモロコシの種子
を煮込んだのちに残るシ０−／ブ）、コットンミール（
ｃｏｔｔｏｎ　ｍｅａｌ）の抽出物（綿の実を煮込んだ
のちの抽出組成物）、乳ショウ、麦ぬかまたはこれらの
混合物であって、それらにはコラーゲンおよび（または
）キチンが添加されてもよい。菌は半固体メデューム、
すなわち湿った粒子固体培地すなわちバーミキュライト
、ビートモスのような粉状担体、またはさとうもろこし
、小麦または大麦の粒のような湿った粉状化されたマト
リックス内でも発酵しうる。

液体発酵は菌のサンプルを成長培地に接種し、かつ培地
を充分な時間好気培養することにより行われる。発酵の
ための最適な温度は約２５℃であり、そして最適なｐＨ
は６．５〜約８．０である。

発酵は撹拌のもと、たとえばフラスコを振りながら行な
われるのが好ましい。

前記の培地の中で、菌の培養株の発酵を行なうための好
ましい液状培地は、約２０％のじゃが芋煮汁、０，１％
のコラーゲンおよび（または）キチンを含むものである
。この培地内では、７〜９日間の培養後の細胞の生産量
は上にあげられた他の培地のそれの約１０倍である。加
うるに、乳しようととうもろこしひたし汁の相対体積割
合が２＝１になるまでとうもうこしひたし汁を追加され
た乳しよう培地においても同様の生産量が達成されるこ
とが見出された。

半固体発酵は前記の特定された多数の担体上において行
なってもよい。そのような発酵後に収集されることがで
きる菌細胞の最終的数量は、液体発酵によりえられる量
よりも多いが、発酵時間は、担体の形式にもよるが、通
常はより長い。

以下の記述の中に、いくつかの例やテストが記載されて
いて本発明を説明しているが、本発明はこれらの例に限
定されるものではなく、また請求の範囲の記載に定義さ
れた発明の範囲内に限られるものでもなく、当該分野に
通じた者によって直ちに理解されるであろうような修飾
が可能であると理解されている。

さらに、以下の例はとくにすぐれた生産物であり、本発
明の姿であるバクテリア菌株２０８、２Ｆおよび菌株３
　０ＣＨの純粋培養株を引用している。

しかしながら請求の範囲のおよぶ範囲内の他のバクテリ
ア株によっても同様の結果かえられるということは了解
されるべきである。

以下の記載においては、つぎに示す添付図面が折々参照
されている。

第１図および第２図はそれぞれ異なる培地が２０Ｍ細胞
増殖に与える影響を調べた実験結果を示すグラフ、第３
図はｐＨが２０Ｍ細胞増殖に与える影響を調べた実験結
果を示すグラフ、第４図は異なる２つの培地において酵
母エキスが２０Ｍ細胞増殖に与える影響を調べた実験結
果の一例を示すグラフ、第５図はキチン、２０Ｍおよび
２Ｆがトマト苗木の根におけるゴール指数に与える影響
を調べた実験結果の一例を示すグラフ、第６図はキチン
、２０Ｍおよび２Ｆがトマト苗木の根あたりの線虫の幼
虫の数に与える影響を調べた実験結果の一例を示すグラ
フ、第７図は８０ＣＥ，そのホモジェネート、コラーゲ
ンおよびキチン・プラス・コラーゲンがゴール指数に与
える影響を調べた実験結果の一例を示すグラフ、第８図
はコラーゲンを伴なった３０ＣＥおよび伴なわない３０
ＣＥがゴール指数に与える影響を調べた実験結果の一例
を示すグラフである。

実施例１　（２０Ｍおよび２Ｆの分離〕５０ｍｌ容のポ
ットは、０．２％（重量基準）のクランドサン（Ｃｌａ
ｎｄｏｓａｎ）が混合された天然砂質土壌で満たされ温
度が２７〜２９℃に制御された温室中で４５日間培養さ
れた。土壌は全培養期間中湿り気をもたせられた。

毎日４つのポットをとり、それぞれのポットから土壌試
料２０．を、キチノリティックバクテリアの分離の処理
をそれらに施すまで５℃で貯蔵した。

キチノリティックバクテリアを分離するため、土壌のサ
ンプルｌｏｇを、２５０　ｍｌ容のフラスコ中で無菌水
９０ｍｌに懸濁させ、ついでこのフラスコを回転振とう
機で３０分間振盪した。デシマル希釈液（ｄｅｃｌａ＋
ａｌ　ｄｉｌｕｔ１ｏｎｓ）を調整し、唯一の炭素源と
して０．２％（重量基準）のキチン（シダ？　（８１ｇ
ｍａ）　ＭＯ．　．ＵＳＡ）を含むソルト培地（ｓａｌ
ｔｍｅｄｉｕｍ）をもった寒天プレートに０，１ｍｌ散
布された。

バクテリアのキチン活性はキチンの分解によって生じた
バクテリア・コロニーの周囲の環によって明示された。

キチン活性を示すコロニーは分離され、さらに処理され
た。最も強いキチン活性（すなわち、コロニーの周囲の
もっともはっきりした環）を示したコロニーはさらに線
虫駆除活性のふるいにかけられた。

線虫駆除活性を有する多くの培養株かえられた。そのな
かでも、２０日後に取った土壌サンプルから分離された
２０Ｍおよび２Ｆは、最も強いキチン活性と最高の線虫
駆除活性を示した。

実施例２　（２０Ｍおよび２Ｆの成長培地〕２０Ｍおよ
び２Ｆの培養株を成長させるために適した培地は、つぎ
のような組成である：粗キチン０．２％、グルコースロ
，２％、ＫＮＯ３０，１％、（ＮＨ４　）２ＳＯ４　　
　０．１％、　ＭｇＳＯ４　・７Ｈ２００．０３％、Ｋ
Ｈ２ＰＯ４　　０．１％、Ｋ２ＨＰＯ４　　０．１５％
および酵母エキス０．０５％。

この培地において、最適ｐＨは６．５から７．０であり
、最適温度は約２５℃であることがわかった。

この培地はそのままで、発酵培地としても、グルコース
なしで保存培地としても好適なものである。

実施例３　［２０Ｍの特性〕 （ａ）抗生物質感度 ２０Ｍの懸濁液を、実施例１の成長培地を含んでいる寒
天プレートに散布した。様々な抗生物質が含浸されたデ
ィスクが寒天プレート上に置かれ、ついでこれは３０℃
で２４時間培養された。

抗生物質の効果を、成長阻止区域の直径を測定すること
により検定した。

その結果を以下の第１表に示す。

山》いろいろな発酵の段階における２０Ｍのキチン活性
および蛋白質分解活性 ２０Ｍは以下のように３段階で発酵させられた。

第１段階：１０６細胞／　ｍｌを含有している２０Ｍの
懸濁液は、実施例２のグルコースを 除いた成長培地８０ｍｌ中に混合され、２４時間培養さ
れた。

第２段階：第１段階でえられた２０Ｍの懸濁液１００ｍ
ｌは、酵母エキスを０．３％に上げた以外は実施例２の
組成をもつ成 長培地９００　ｍｌ中に移され、さらに２４時間培養さ
れた。

第３段階：第２段階でえられた２０Ｍの懸濁液１ｇは、
第２段階のものと同じ組成の 成長培地４１に移された。

試料は第２段階および第３段階の終りに回収され、キチ
ン活性および蛋白質分解活性を検出するために比色試験
が施された。

その結果を以下の第２表に要約して示す。

第２表からわかるように、キチナーゼ活性を別として、
２０Ｍは比較的強い蛋白質分解活性を有している。

実施例４　（２０Ｍの突然変異体〕 リファンピイシン（ｒｉｆ’ａｍｐ１　１ｃ１ｎ）に対
する耐性を示す２０Ｍの突然変異株が分離された。その
耐性は、この抗生物質２００μｇ　／　ｍｌの存在下で
阻止されずに成長する菌株の能力によって明らかである
。そうでなければ、その特性は２０Ｍの特性と同一であ
る。

２０Ｍ−２と称せられるこの菌株は、抗生物質をその成
長培地または発酵培地に加えてもよいという利点があり
、この微生物が阻止されることなく成長する間に、それ
だけで困難で高価な専門技術である厳しい滅菌条件を守
るという必要なしに他の種類の汚染微生物の成長が除か
れるかまたは少なくとも最小にされる。

実施例５　［２０Ｍおよび２Ｆの発酵〕＋１）２０Ｍ （ω初期発酵 実施例２にしたがってえられた成長培地５Ｉｌを入れた
５ｊ１）容のベンチ・トップ（ｂｅｎｃｈ　ｔｏｐ）発
酵槽に、２０Ｍ懸濁液５０１が最終濃度が１０’細胞／
１となるように接種され、バクテリアが２４時間好気的
に（ａｅｒｏｂｌｃａｌ　ｌｙ）成長させられた。

山》主発酵 初期発酵でそのように培養された培地は実施例１の培地
をさらに２００ｇ入れた２００ｇ容のバッチ（ｂａｔｃ
ｈ）発酵槽に移され、その混合物はさらに２０〜２４時
間培養された。培養後、細胞を数えたが、いずれのばあ
いにも収量は約ｌＯＫｌ細胞／ｉｆであった。

（ｌ）　２　Ｆ ２Ｆの発酵は、２０Ｍのぱあいと同様の方法で行なわれ
、ほぼ同じ収量の細胞かえられた。

実施例６〔寒天における成長〕 （Ｉ）２０Ｍ ２０Ｍの培養株の試料は、寒天培地を含んでいるプレー
ト上で成長させられた。その寒天はコロイド状キチンと
さらには実施例２のぱあいと同様の成分（粗キチンおよ
びグルコースを除く）を含んでいる。約２４時間後、バ
クテリアの細胞を数えたところ、細胞の収量は約ｌＯη
細胞／１であることがわかった。

細胞のキチン活性はバクテリアのコロニーの周りの環に
よって明らかであった。

（１１２Ｆ ２Ｆは、２０Ｍと同様の方法で寒天上で成長させられ、
同様のキチン活性が観察された。

実施例７〔様々な成長培地における２０Ｍの成長〕《ω
キチン源、ミネラルの組合せおよびグルコースの効果 ２つの異なったミネラル溶液を用いた。ひとつは、すな
わち硫酸塩を含んでいる“Ｃ”と名づけたちのであり、
もうひとつは硫酸塩およびリン酸塩を含んでいる“Ｓ″
と名づけたちのである。

それぞれの溶液に、３種類のキチンのいずれかを加えた
。これらの３種類とは粉末キチン（ＣＴ）、コロイド状
キチン（ＣＯＬＯ）および粗キチン（ＣＬ）である。試
験された培地の半分にグルコースを補充した。

このようにして、以下のような培地が試験された。

Ｓ−ＣＴ　：バッファＳ＋グラウンドキチンｓ−ｃ’ｒ
＋ｃ　：バッファＳ＋グラウンドキチン＋グルコース Ｓ−ＣＯＬＯ　：バッファＳ＋コロイド状キチンｓ−ｃ
ｏｔ，ｏ＋ｃ　：バッファＳ＋コロイド状キチン＋グル
コース Ｓ−ＣＬ　：バッファＳ十粗チキン Ｓ−ＣＬ＋Ｇ　：　ｌ＜ッファＳ十粗チキン＋グルコー
スＣ−ＣＴ　：バ・ソファＣ＋グラウンドキチンＣ−Ｃ
Ｔ＋Ｇ　：バッファＣ＋グラウンドキチン＋グルコース Ｃ−ＣＯＬＯ　：　ハッファＣ＋コロイド状キチンｃ−
ｃｏｔ，ｏ＋ｃ　：バッファＣ＋コロイド状キチン＋グ
ルコース １０７細胞／１の細胞を含んでいる２０Ｍの培養株から
取り出された懸濁液０．１１は、試験されたそれぞれの
培地２０１に接種された。このようにして、試験された
培地における初期の細胞の濃度は約１０５細胞／１であ
った。培養株がその対数増殖期であった６時間後および
培養株が定常期であった２４時間後に、細胞数を数えた
。その結果を添付した図面である第１図および第２図に
グラフで示す。

結果から明らかなように、６時間後および２４時間後両
方の接種において、Ｓミネラル培地はＣミネラル培地よ
りもすぐれていることがわかる。また、試験された３つ
のキチン源のうち、ＣＴはＣＯＬＯと同じくらいかまた
はそれよりもすぐれ、またＣＬはその両者よりもすぐれ
ていることがはっきりわかる。

粗キチンは、廃棄物から調製され、そのため３つのキチ
ン源のうち最も安価なキチン源であるが、２０Ｍ培養株
を成長させるのに好ましいキチン源である。粗キチンが
すぐれているのは、他の２つのキチン源がキチン以外の
有機物をほとんど含まないのに対して、粗キチンは蛋白
質残留物をはじめ、おそらくビタミン類や他の栄養成分
も含んでいるという事実によるのであろつ◎ より純粋なキチン源が要求されるばあいには、ＣＴを使
用することが好ましい。その理由としては、よりよい成
長を生じさせることに加え、調製に労力を要し時間がか
かるＣＯＬＯよりも安価なキチン源でもあるからである
。

Ｃミネラル溶液のばあいには、グルコースの補充は害が
あった。これは、Ｓミネラル培地が一塩基性リン酸カリ
ウムと二塩基性リン酸カリウムとのバランスにより、よ
りすぐれた緩衝能を有するのに対してＣ溶液培地はたい
へん小さい緩衝能しか有さないことによるのであろう。

グルコースは発酵培地中でｐＨを低下させるので、おそ
らく、Ｃ培地の限られた緩衝能によって、培地はバクテ
リアが成長するには酸性になりすぎたのであろう。その
一方でＳ培地では、ｐＨの低下が小さかったので好適な
成長の条件が供されのーであろう。

しかしながら、６時間後にはグルコースは、Ｓ−ＣＴお
よびＳ−ＣＬ培地において成長を遅らせたが、この効果
は２４時間後に逆になり、グルコースの補充をうけた培
地はグルコースのない培地よりもこの時間までに相当高
い細胞数となったことは注目すべきである。１つの可能
な説明はこれらの２つの培養株に対する遅れ時間が異な
るということである。

曲ｐＨの効果： 培養株はコロイド状キチンを含むＳ培地中で成長され、
ｐＨは一塩基性リン酸カリウムと二塩基リン酸カリウム
の比率を変えることにより操作された。ｐＨを５．２と
７．２間で変化させた。その結果を添付した図面の第３
図にグラフで示す。

その結果から、この培地中で２０Ｍバクテリアが成長す
るための最適ｐＨは６．４〜７．２であることがわかる
。

このｐｌに対する感度によって、《Ｊにおいて試験され
たいろいろな培地に対する成長のちがいが説明される。

ｐＨの変化が許容限界をこえて起こる培地では、ｐＨが
許容レベルにある培地よりも成長が小さいだろう。

キチン源としての粗キチンにより達成されたすぐれた成
長の結果は、キチンは蛋白質を含有し、グルコースを伴
なう発酵はｐＨを下げる傾向があるけれども蛋白質を含
む培地での発酵はｐＨを上げる傾向があることによって
説明されうるかもしれない。明らかに、粗キチンやグル
コースはｐＨのバランスを破るが、一方同時にグルコー
スはすぐれた成長培地を構成するのである。

（Ｃ）緩衝剤のモル濃度の２０Ｍの成長への影響：培地
中の最適ｐＨレベルの維持は、原則として緩衝能を強め
ることにより達せられつる。２０Ｍバクテリアが、緩衝
能を増加させるために必要であるより高い塩濃度に耐え
つるかを試験するために、残りの成長培地の構成はその
まま変えずに異なった緩衝剤濃度で細胞の成長を測定し
た。２４時間の好気性の成長ののち、生成したバクテリ
アの細胞の濃度がそれぞれのばあいに数えられた。

バクテリアは高い緩衝剤レベルにおいてもまた成長した
が、最大のバクテリア細胞濃度は、緩衝剤レベルが０．
ＯＩＭ以下の培地においてみられることがわかった。こ
れらの結果からこの微生物は高い塩濃度に敏感であり、
それゆえに本発明によれば発酵培地における緩衝剤濃度
は約０．０ＩＭ以下に保たれることが好ましい。

（小酵母エキス濃度の２０Ｍの成長への影響二酵母エキ
ス濃度の２０Ｍの成長への影響をＳ−ＣＬ十Ｇ培地およ
びＳ−ＣＯＬＯ培地について試験した。その結果を第４
図にグラフで示す。

Ｓ−ＣＯＬＯ培地において、酵母の補充によって２ｇ／
Ｉ）をピークとして、成長が改善された。しかしながら
、３ｇ／Ｒをこえたばあいには成長は減少した。この減
少は、酵母エキスの補充が培地のｐＨを許容限界以上に
高くする傾向があることに起因しているかもしれない。

要求される酵母エキスの最適量は、培地に加えられる炭
素源によって異なるかもしれない。

（ｅ）様々な培地成分の比率の２０Ｍの成長への影響成
長培地を調整するには、どんな１つの要因も限界に達し
ないように、しかもｐＨおよびミネラルの強さはバクテ
リアの成長の許容制限内に保たれるように栄養素をバラ
ンスよく供給しなければならない。前記に示されたよう
に、酵母エキスは確実に成長に影響があるが、酵母エキ
スの供給が高いレベルにおよぶとｐＨに影響があるため
、その供給は制限内に保たれるべきである。加えて、下
記に示すようにグルコースは極端に高い量のチッ素源が
培地中にないぱあいのみ、成長を高めることがわかった
。しかしながら、もし様々な補充のつりあいかうまく保
たれれば、たとえば、より多くの粗キチンとグルコース
をその２つのバランスを維持しながら同時に供給するこ
とにより、よりすぐれた成長が達成されるだろう。以下
の実験は、異なった補充の比率を変えることより成長速
度を改善しつるかどうかを試験するために行なわれた。

（ｅｌ）キチン：グルコール比が２０Ｍの生長に与える
影響 結果をまとめて第３表に示す。第３表中ＣＬは粗キチン
Ｇはグルコースを示す。

粗キチンとグルコースとを各々　０．４％含有する培地
を除き、すべてのテストにおいて最高細胞密度はほぼ同
程度であった。粗キチンとグルコースを各々　０．４％
含有する培地のぱあい、最高細胞密度が他よりあきらか
に高く、成長率も他より高いものであった。

これらの結果は、粗キチンとグルコースとの相対比が維
持されているならばそれらを増量しうろことを示してい
る。

（ｅ２）粗キチン、グルコース、酵母エキス、ＫＮＯ３
栄養源が２０Ｍ成長率に与える影響 残りの成分は実施例２と同じままで、粗キチン、グルコ
ース、酵母エキスおよびＫＮＯ３の濃度が変更された。

２０Ｍ培養株の成長率が、各ケースにおいて測定された
。結果をまとめて第４表に示す。

？４表中ＣＬは粗キチン、Ｇはグルコース、Ｙｅはイー
スト抽出物を示す。

各々のケースにおいて、ＫＮＯ３を１　ｇｉｒｌとする
ことにより成長は低下せしめられ、最大細胞密度はＫＮ
Ｏ３が０．５１ｇ＃）のばあいに匹敵する程度に低下せ
しめられた。また、グルコースを０，４％とすることに
より酸性状態となり、その結果、最終的な細胞密度はグ
ルコースが０、２％のばあいに匹敵する程度に一貫して
低下せしめられた。

また、酵母エキスの添加により、ｐＨがわずかに上昇せ
しめられ、成長が促進される傾向があった。

前記結果によれば、本発明に用いる好ましい培地として
、０．１ｇ＃！のＫＮＯｓと、０．３％のイースト抽出
物と、キチン源として０．２〜０■４％の粗キチンと、
０．２％のグルコースとが添加されたＳミネラル培地が
あげられる。

実施例８　（２０Ｍの線虫駆除活性〕 ２０Ｍバックド・セル（ｐａｃｋｅｄ　ｃｅｌｌｓ）の
一定量が、一線虫を接種した土壌を含有したポット（各
ポットあたりエムφジャバニ力（Ｍ．　ｊａｖａｎｌｃ
ａ）が５００卵）に添加された。トマトの苗が植えられ
るのに先だって、１０８細胞／ｇの土壌が添加された。

２０Ｍが植物に与える影響は、いくつかのパラメータを
用いて評価された。すなわち、全地上部生体重、根にお
けるこぶ形成度および卵の数が用いられた。

その結果を第５表に示す。

この結果より、２０Ｍがエム・ジャバニカの増殖に対し
て驚くべき阻止効果を生じ、計数において９０％の減少
をもたらすことがわかる。

同様の結果が、別な９つの実験においてもえられた。

〔以下余白〕

実施例９　（２０Ｍ菌株の特性描写〕 この菌株の特性を容認された実施方法にしたがって測定
したところ、以下のような結果かえられた。

細胞の形　　　　　　　　　　棒状（ｒｏｄｓ）幅（扉
）　　　　　　　　０．８　−１．０長さ（虜）１．５
〜５．０ 自動性　　　　　　　　　　　　　十 鞭毛突出　　　　　　ポーラ−（ｐｏｌａｒ）　＞　１
グラム（ｇｒａｍ）反応 ３％ＫＯＨにる溶菌 アミノベブチダーゼ　　　　　　　＋ （セル二一（Ｃｅｒｎｙ）） 胞子 オキシダーゼ 力タラーゼ 成　　長： 嫌気性 ３７／　４１℃ ｐｌ１５．８ ＋ ＋ ＋／− マック・コンキー （Ｍａｃ−Ｃｏｎｋｅｙ）寒天 ＳＳ寒天 セトリミド（ＣｅｔｒｉＩＩｌｉｄ）一寒天ＮａＣＩ　
　Ｂ％ 色　　素 非拡散性 拡散性 けい光Ｘ線 ビオシアニン 酸性化（　Ａｃｉｄ　ｆｒｏＩＱ） グルコース好気性 グルコース嫌気性 グルコースからのガス 酸性化（Ａｃｉｄ　ｆ’ｒｏｍ）　（ＡＳＳ）　：アラ
ビノース セロビオース ガラクトース グルコース フルクトース （ＯＦ−Ｔｅｓｔ）： ラクトース マノレトース　　　　　　　　　　　士サツ力ロース キシロース　　　　　　　　　　　＋ エタノール ＯＮＰＧ　　　　　　　　　　　　　　　　　−抗利尿
ホルモン（ＡＤＨ） ｖＰ インドール ＮＯｘからのＮＯ２　　　　　　　　　　　　−脱チッ
素反応　　　　　　　　　　　一フエニルアラニンデア
ミナーゼ シヨ糖からのレバン レシチナーゼ ウレアーゼ ポリーβ−ヒドロキシブチレート　　＋細胞壁タイブ：
Ａ１７、メソーＤＡＰ　ｄ１ｒｅｃｔ少量のメソーＤＡ
Ｐが見つかった。それはダラム陰性のバクテリアに対し
て特有なものである。

加水分解： デンブン ゼラチン カゼイン ＤＮＡ トウイーン　８０ エスクリン チロシン分解 成長要因必要物 使用した物質： アセトン アジベート（ａｄｉｐａｔｅ） ペンゾエート ブチレート カパレート（ｅａｐａｒａｔｅ） シトレート シトラコネート フマレート グリコレート ラクテート レブリネート ＋ マレート マロネート フエニルアセテート ブロビオネート ピルベート サツ力レート スクシネート Ｌ−アラビノース フルクトース グルコース マンノース マルトース し−ラムノース リボース サツ力ロース トリハロース（ｔｒｉｈａｌｏｓｅ） キジロース ｍ−イノシトール マンニトール グルコネート ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ２−ケトグルコネート Ｎ−アセチルグルコサミン Ｌ−グノレタメート　　　　　　　　　　＋Ｌ−ヒスチ
ジン　　　　　　　　　　＋Ｌ−セリン Ｌ−スレオニン ｎ−ブタノール 前記の結果に基づき、菌株２０Ｍはシュードモナス属に
属することが決定された。この菌株の種はまだ同定され
なかったが、新しい種であるかもしれない。

実施例１０〔菌株２Ｆの特性描写〕 Ｉ：八Ｐ．２０Ｂ試験 以下に示す結果かえられた： 形 自動性 成長反応 胞子 オキシダーゼ 力タラーゼ 棒状（ｒｏｄｓ） ＋ ＋ 成長： 嫌気性 好気性 Ｎａ（Ｊ　　Ｏ％ ３％ ７．５％ 色素（ｏｐ．１００　〜２００ｎｍ） 加水分解： デンブン トウイーン８０ カゼイン ビブリオスタティック（ｖｌｂｒｉｏｔａｔｉｃ）化合
物２．４−ジアミノ−６．７−ジイソブ口ピルブテリジ
ンへの耐性 酸性化（Ａｃｉｄ　ｆ’ｒｏｍ）　： グルコース マンニトール イノシトール ソルビトール ラムノース ＋ 十 ＋ 十 ＋ ＋ スクロース メリビオース アニグダリン アラビナーゼ β−ガラクトシダーゼ アルギニンーデヒド口ラーゼ リシンーデカルポキシラーゼ オルニチンーデカルポキシラーゼ クエン酸ナトリウム利用能 Ｈ２Ｓ生成 ウレアーゼ トリブトファンーデアミナーゼ インドール生成 アセトン生成（ビルビン酸から） セラチナーゼ ＮＯ３からのＮＯ２生成 Ｎ２ガスへの還元 グルコース発酵 グルコース酸化 マツコンキー培地成長 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ （グルコースからのガス　　　　　　ー）前記の結果に
基づき、９９．９％の確率で、２Ｆはアエロモナス―ビ
ドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｙｌａ
）種であると同定された。

ＩＩ　：　ＡＰＩ　２０ＮＥ試験 以下のような結果かえられた： ＮＯ３のＮＯ２への還元　　　　　　　　　十ＴＰＰイ
ンドール生成 グルコール酸処理　　　　　　　　　　十抗利尿ホルモ
ン（ＡＤＨ）　　　　　　　　　　＋ウレアーゼ エスクリン加水分解　　　　　　　　　＋（β−グルコ
シダーゼ） セラチン（ｃｅｌａｔｉｎ）加水分解　　　　　十（プ
ロテアーゼ） ＯＮＰＣ　（β−ガラクトシダーゼ）　　　　＋同　　
化　： グルコース　　　　　　　　　　　　＋アラビノース マンノース　　　　　　　　　　　　　＋マンニトーノ
レ　　　　　　　　　　十Ｎ−アセチルーグルコースア
ミン　　　＋マルトース　　　　　　　　　　　　やグ
ルコネート（ｇｌｕｃｏｎａｔｅ）　　　　　　＋コブ
レート（ｃｏｐｒａｔｅ）　　　　　　　　　＋アジベ
ート（ａｄｉｐａｔｅ） マレート　　　　　　　　　　　　　　＋シ　　ト　　
レ　ー　　ト　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋フ
エニルアセテート オキシダーゼ　　　　　　　　　　　＋これらの結果に
基づき、２Ｆは種のはつきりした同定なしにアエロモナ
ス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属に属していると同定される
。

ｍ　：　ＡＰ：５０ＣＩＩ試験 えられた結果を以下の第６表に示す。

〔以下余白〕

この試験に基づき、２Ｆは種のはっきりした同定はない
が、アエロモナス属に属していると同定される。

実施例１１［２Ｆの線虫駆除効果〕 線虫を接種した土壌を含有したポットまたはスチロフォ
ームのコーン型カップ（ポットあたリエム・ジャバニカ
５００卵およびカップあたり同１００卵）にトマトの苗
が植えられた。植付に先だって、前記土壌はさらに、つ
ぎの処理のうちの１つを受けた。

《田無処理； 山》キチン０．０５％の添加； （Ｃ）キチンおよび２０Ｍバックド・セルの添加；｛小
キチンおよび２Ｆバックド・セルの添加；（ｅ）キチン
および２０Ｍプラス２Ｆパックド・セルの添加。

スチロフォームのカップからの植物は、植付後７日で収
穫され、ポットの植物は植付後３５日で収穫された。ポ
ット中のゴール指数（Ｇ１）およびスチロフォームのカ
ップ中の植物の根あたりの幼虫の数量が測定された。そ
の結果をそれぞれ第５図および第６図に示す。

これにより、キチン自体が線虫の汚染の防御に有効であ
り、それがおそらくは、土壌中に存在するキチンノリチ
ック微生物の増殖を開始することによるものであろうこ
とがわかる。

前記結果はまた、２Ｆと２０Ｍとがともに線虫駆除活性
を有しており、同様な有効性を有していることも示して
いる。

実施例１２　［３０ＣＨの分離］ クニンガメラ　エレガンス（Ｃｕｎｎ１ｎｇｈａｍｅｌ
　ＩａＥｌｅｇａｎｓ）　（ムコラレス（Ｍｕｃｏｒａ
ｌｅｓ））なる種の３０ＣＥなる菌株が、コラーゲンで
改質された砂質土壌から分離され、マーチンーロゼ●ベ
ンガル（Ｍａｒｔｉｎ−Ｒｏｓｅ　Ｂｅｎｇａｌ）培地
中で純粋化された。

１０ｇ：の土壌のサンプルが、２５０ｍｌ容のフラスコ
内で９　０　ｍｌの無菌水中に懸濁せしめられたのち、
３０分間振盪された。ついで前記懸濁液をデシマル希釈
液（ｄｅｃｉＩ！ｌａｌ　ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ）に調製
され、各希釈液のサンプルは、そののち、培養プレート
中に０．１％のコラーゲンを含有する塩培地で調製され
た寒天培地上に散布された。

該プレートが菌細胞の実質的な成長が生ずるまである時
間培養されたのち、サンプルが新たな寒天培地に移入さ
れ、この培養一移入サイクルは均一な培養株が選択され
るまで数回繰返された。

実施例１３　［３０ＣＨの成長培地〕 ３０ＣＩＥなる培養株を成長させるための好適な培地と
しては、つぎの組成を有するものがあげられる。

コラーゲン：０．２％ Ｋ２ＨＰＯ４　　：　０．０８％ ＣａＣＩ４：　０．０１９％ ＭｇＳＯ４　　・７Ｈ２０　：　０．０３９％グルコー
ス：０．２％ このような培地においては、最適ｐＨは約６．５〜７．
０で、最適温度は約３０℃であることがわかった。

実施ｆｌＪＩ４（｛ＯＣＥの発酵培地〕３０ＣＨの発酵
のための培地としては、約２０％のじゃが芋の煮汁と約
０．１％のコラーゲンとを含むものがあげられる。

実施例１５　（３０ＣＥまたはその残留培地の線虫駆除
活性〕 ３０ＣＨの菌株が実施例１３の成長培地中に添加され、
エルレンマイヤー・フラスコ内で振盪しながら３０℃で
３日間培養された。菌細胞自体を伴なった培地（以下、
培地という）または均一化された培地（以下、ホモジエ
ネートという）のいずれかが、そののちテストされた。

ポットあたり８５０個の卵を接種された５００ｇの土壌
を入れた複数のポットの各々に、前記培地、ろ液または
ホモジエネートのいずれかが添加された。ばあいによっ
ては、前述の添加に加えてコラーゲンが、それ自体、ま
たはキチンとの組合わせとして土壌に添加された。

５週間後、該植物は引抜かれ、根のこぶおよびゴール指
数を調べるために観察された。ばあいによっては、線虫
の計数が行なわれた。線虫で汚染されてはいるが無処理
のポットが対照の基準とされた。

（ａ）３０ＣＨの培地およびホモジュネートの線虫駆除
効果 種々の処理がゴール指数（Ｇ１）に与える影響が第７図
に示されている。第７図よりわかるように、３０ＣＥの
ホモジエネートはＧｌを減少させる最強の効果を有して
いた。また、前述のものと統計的に有意差のない同様の
強い効果が、土壌を培地（生きた３０ＣＥ細胞を含有す
るもの）およびキチンとコラーゲンとの混合物で処理し
たばあいにも観察された。（後者の効果は、おそらくは
土壌中のコラーゲノリティックおよびキチノリティック
微生物の増殖を開始することに起因している。）ある効
果については、コラーゲンで処理されたものについても
観察された。

《ｂ》コラーゲンの添加が３０ＣＥの線虫駆除活性に与
える影響 第８図よりわかるように、土壌中への３０ＣＨの添加は
ゴール指数の減少にある効果を有し、３０ＣＢの培養株
にコラーゲンが添加されたばあいにはそれによりはるか
に強い効果が観察された。

このようなコラーゲンの添加は菌細胞の増殖の促進を可
能にする。

なお、前記実施例では３０ＣＥが調製されない形態で土
壌に添加されたが、適切に調整された３０ＣＥを添加し
たばあいには、はるかに強い効果、すなわち、コラーゲ
ンを伴なうばあいにえられる効果に匹敵する効果または
それをこえる効果が期待されつる。

〔発明の効果〕

本発明の方法によってえられた微生物および該微生物を
含む組成物は、線虫駆除活性を有し、化学物質からなる
農薬にみられるような環境汚染の危険なしに植物の線虫
からの防御に有効であることが分る。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図はそれぞれ異なる培地が２０Ｍ細胞
増殖に与える影響を調べた実験結果を示すグラフ、第３
図はｐＨが２０Ｍ細胞増殖に与える影響を調べた実験結
果の一例を示すグラフ、第４図は異なる２つの培地にお
いて酵母エキスが２０Ｍ細胞増殖に与える影響を調べた
実験結果の一例を示すグラフ、第５図はキチン、２０Ｍ
および２Ｆがトマト苗木の根におけるゴール指数に与え
る影響を調べた実験結果の一例を示すグラフ、第６図は
キチン、２０Ｍおよび２Ｆがトマト苗木の根あたりの線
虫の幼虫の数に与える影響を調べた実験結果の一例を示
すグラフ、第７図は３０ＣＥ，そのホモジュネート、コ
ラーゲンおよびキチン・プラス・コラーゲンがゴール指
数に与える影響を調べた実験結果の一例を示すグラフ、
第８図はコラーゲンを伴なった３００Ｅおよび伴なわな
い３０ＣＥがゴール指数に与える影響を調べた実験結果
の一例を示すグラフである。 細胞数／　ｒｎｌ　（　Ｘ　１０９） 初濃度に対する倍率 Ｆｉｇ・ 日，スｌ．冬１．１８．１ ｐＨ Ｆ１９． 酵母エキス濃度（　ｇｒ／ｌ　） Ｆ１９． ２１Ｆ Ｆｉｇ． 対照 ２０Ｍ ２Ｆ ２０Ｍ＋　　キチン

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　キチンまたはコラーゲンで富養化した土壌から分離
   された線虫駆除微生物、その線虫駆除活性を有する突然
   変異体および残存培地からなる群より選ばれた線虫駆除
   活性剤の有効量を土壌中に導入することからなる土壌線
   虫駆除方法。 ２　キチンまたはコラーゲンで富養化した土壌から分離
   された線虫駆除微生物、その線虫駆除活性を有する突然
   変異体および残存培地からなる群より選ばれた線虫駆除
   活性成分の有効量、ならびに該活性成分および該土壌環
   境と親和性ある担体からなる植物防護用線虫駆除組成物
   。 ３　水性液状担体と、該担体中に懸濁された前記微生物
   からなる請求項２記載の組成物。 ４　担体が固体多孔性物質であり、前記微生物が該固体
   多孔性物質に充填されてなる請求項２記載の組成物。 ５　前記組成物が付着剤として作用する添加剤をさらに
   含む請求項４記載の組成物。 ６　さらに栄養源を含んでなる請求項２、３、４または
   ５記載の組成物。 ７　前記栄養源がコットンミール、キチンおよびコラー
   ゲンからなる群よりえらばれたものである請求項６記載
   の組成物。 ８　キチンまたはコラーゲンで富養化した土壌から分離
   された線虫駆除微生物またはその線虫駆除活性を有する
   突然変異体の純粋培養法。 ９　前記微生物がシュードモナスまたはアエロモナス属
   である請求項８記載の純粋培養法。 １０　バクテリアが２０Ｍ株（ＣＮＣＭ、１−８０４）
   、２０Ｍ−２株または２Ｆ株である請求項９記載の純粋
   培養法。 １１　前記微生物がクニンガメラ属の菌種である請求項
   ８記載の純粋培養株。 １２　前記菌種がクニンガメラ属エレガンス種である請
   求項１１記載の純粋培養株。 １３　前記菌が３０ＣＥ株である請求項１２記載の純粋
   培養株。 １４　微生物として請求項８、９、１０、１１、１２ま
   たは１３記載の純粋培養株からなる請求項２、３、４、
   ５、６または７記載の組成物。 １５　請求項２、３、４、５、６、７または１４記載の
   組成物の有効量を土壌中に導入することからなる請求項
   １記載の方法。 １６　キチンまたはコラーゲンで富養化した土壌から分
   離された線虫駆除微生物またはその線虫駆除活性を有す
   る突然変異体の水性懸濁液に、粒状固体多孔性物質を混
   合して混合物をえ、該粒状固体多孔性物質が微生物懸濁
   液で充満されるに充分な時間、該混合物をインキュベー
   ションし、分離し、微生物懸濁液で充満された粒状固体
   多孔性物質を乾燥することからなる請求項４記載の線虫
   駆除組成物の製造方法。 １７　キチンまたはコラーゲンで土壌を人為的に富養化
   し、キチノリティック微生物またはコラーゲノリティッ
   ク微生物を該土壌中で増殖せしめ、該微生物を含有した
   土壌サンプルを、主炭素源としてキチンまたはコラーゲ
   ンで成長混合物をつくるために、ばあいに応じてキチン
   またはコラーゲンと混合し、該成長混合物を微生物成長
   をひき起すべくインキュベーションし、えられた微生物
   培養株を既知の方法で精製処理することからなる請求項
   ８記載の線虫駆除微生物の純粋培養株の製造法。 １８　さらにえられた純粋培養株を制御された突然変異
   処理を既知の方法で行なう請求項１７記載の純粋培養株
   の製造法。