JPH0213383A - ヘルペスウイルスｄｎａポリメラーゼの発現およびその発現ベクター含有酵母株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヘルペスウィルスＤＮＡポリメラーゼプラス
ミド発現ベクターおよび単純ヘルペスウィルスＤＮＡポ
リメラーゼプラスミド発現ベクター、それを含有する酵
母株、およびそれを用いたヘルペスウィルスＤＮＡポリ
メラーゼの製造方法に関する。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）単純
ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）ＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏ
ｌ）は、ウィルスＤＮＡの複製に必要な約１４０キロダ
ルトン（ｋＤａ）のポリペプチドとして同定されている
。ＨＳＶｐｏｌは、アシクロビルのような抗ウィルス剤
の主要な目標である。ざらにＨＳＶｐｏｌは、他のヘル
ペスウィルスＤＮＡポリメラーゼ、および哺乳動物およ
び酵母のαポリメラーゼを含む種々の真核生物ＤＮＡポ
リメラーゼと相同のアミノ酸配列を有する。従って、Ｈ
ＳＶｐｏｌの構造に関する理解を深めることは新規な抗
ウィルス剤を設計する上で有用なだけでなく、ＤＮＡ合
成、ウィルス複製および細胞増幅の制御についての情報
を得ることをも可能するものである。

ヘルペスウィルスｐｏｌの構造についての理解を深める
ことのできる１つの方法は、機能性のｐｏｔタンパク質
を製造し精製することによるものである。過去において
ｐｏｌタンパク質の唯一の入手源は感染細胞であったが
、この入手源にはいくつかの限界がある。ＨＳＶｐｏｌ
をコードするｍＲＮＡは感染細胞中に豊富に存在すると
思われるが、低いレベルのｐｏｌタンパク質しか産生さ
れない。加えて、精製工程中にいくつかの別のポリペプ
チドが〜１４０ｋＤａポリペプチドに堅固に結合してし
まうように思われる。従って、大量の純粋な〜１４０ｋ
Ｄａタンパク質を研究用に感染細胞から得ることは困難
である。

以前、ドースキー（Ｄ　ｏｒｓｋｙ）ら［１９８７，Ｊ
、Ｖｉｒｏｌ、　６上（５）：１７０４〜１７０７］は
機能性形態のＨ９Ｖｐｏｌ遺伝子の哺乳動物細胞におけ
る発現に成功したが、この系では低いレベルの活性酵素
しか産生されず、発現されたｐｏｌ酵素は、ｐａｌに変
異を含む温度感受性Ｈ９Ｖの相補性によってのみ検出す
ることができた。ドースキーおよびクランバッカー（Ｃ
ｒｔ＋ｍｐａｃｋｅｒ）はまた、ｒ１５０ｋＤａＪポリ
メラーゼポリペプチドのインビトロ翻訳系での発現を報
告しているが［１９８７，アブストラクツ・オブ・ザ・
ペーパーズ・ブリセンテッド・アット・ザ・ツウエルラ
ス・インターナシ９ナル・バーピーズパイラス・ワーク
ショップ（Ａ　ｂｓｔｒａｃｔｓｏｆ　ｔｈｅ　ｐａｐ
ｅｒｓ　ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ　ａｔ　ｔｈｅ　ｔｗｅ１
４ｔｈ　Ｉ　ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｈｅｒｐｅｓ
ｖｉｒｕｓ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ）、６３頁］、ここでも
低レベルしか産生されなかった。加えて、彼等はまた高
レベルのＨＳＶｐｏｌタンパク質を大腸菌中で発現させ
ているが、発現されたタンパク質は不溶性であり、容易
に検出可能な酵素活性を有していなかった。

以前、マツクネイル（ＭａｃＮｅｉｌ）およびフリーセ
ン（Ｆ　ｒｉｅｓｅｎ）［１９８１、Ｍｏ１．　Ｇｅｎ
、　Ｇ　ｅｎｅｔ、　１１±：３８６〜３９３］は、機
能性形態の他のヘルペスウィルス酵素（チミジンキナー
ゼ）を酵母中で発現させており、多くの他の外来遺伝子
が酵母中で発現されている。

（課題を解決するための手段） 本発明は、酵母内で機能するプロモーターの下流域にヘ
ルペスウィルスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現できる
ような態様でクローニングしたヘルペスウィルスＤＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子を含むプラスミド発現ベクター； 酵母内で機能するプロモーターの下流域に単純ヘルペス
ウィルスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現できるような
態様でクローニングした単純ヘルペスウィルスＤＮＡポ
リメラーゼ遺伝子を含むプラスミド発現ベクター； 上記ヘルペスウィルスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む
プラスミド発現ベクターを含み、機能性のヘルペスウィ
ルスＤＮＡポリメラーゼ酵素を産生ずる酵母株； 上記単純ヘルペスウィルスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を
含むプラスミド発現ベクターを含み、機能性の単純ヘル
ペスウィルスＤＮＡポリメラーゼ酵素を産生ずる酵母株
； 酵母の組換え株から機能性のヘルペスウィルスＤＮＡポ
リメラーゼを製造する方法；および酵母の組換え株から
機能性の単純ヘルペスウィルスＤＮＡポリメラーゼを製
造する方法を提供するものである。

上記方法は、 （ｉ）酵母内で機能するプロモーターの制御下でクロー
ニングされたヘルペスウィルスＤＮＡポリメラーゼ遺伝
子を含むプラスミド発現ベクターを構築し、 （ｉｉ）該プラスミド発現ベクターを適当な酵母株中に
導入し、 （ｉｉｉ）得られた組換え体酵母株を、該ヘルペスウィ
ルスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を制御する該プロモータ
ーが機能し、該ヘルペスウィルスＤＮＡポリメラーゼ酵
素タンパク質が蓄積するような条件下で増殖させ、つい
で （ｉｖ）該酵母細胞を溶解して機能性のヘルペスウィル
スＤＮＡポリメラーゼを放出させ、その特徴付けおよび
精製を行う ことを特徴とする。

本発明のプラスミド発現ベクターは、酵母（サツカロミ
セス・セレビシェ）中で機能するプロモーター［ガラク
トキナーゼ［ＧＡＬ−１１；［ジョンストン（Ｊｏｈｎ
ｓｔｏｎ、Ｍ）およびデイビス（Ｄａｖｉｓ、Ｒ。

Ｗ、）の１９８４　、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃ
ｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂ　ｉ。

１ｏｇｙ±（３）；１４４０〜１４４８］コ制御下でヘ
ルペスウィルス（単純ヘルペスウィルス）ｐｏｌ遺伝子
を含むように構築したものである。このプラスミド発現
ベクターを酵母株［Ｙ　２９４　［ＭＡ　Ｔ　ａ　：１
ｅｕ２−３．１１２　；ｕｒａ３−５２　；ｔｒｐ　−
１；ｈｉｓ３△：Ｇ　Ａ　Ｌ　＋　；ｃｉｒ＋］］［ブ
ラッグ（Ｂ　ｒｕｇｇｅ、　Ｊ　、　Ｓ　、）らの１９
８７　、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａ
ｒ　Ｂ　ｉｏｌｏｇｙ工（６）：２１８０〜２１８７コ
中へ導入した。

得られた酵母の組換え株を、ヘルペスウィルス（単純ヘ
ルペスウィルス）ｐｏｌの機能性形態が発現できるよう
な条件下（ガラクトース中）で増殖させた。この株は、
他のウィルスタンパク質と識別可能で直接検出可能な機
能性のＨＳＶｐｏｌ酵素の入手源に対する必要性を満た
すものである。

以下に、実施例を含めて、発現ベクターの構築、組換え
体酵母の製造、ヘルペスウィルスＤＮＡポリメラーゼの
製造について、さらに具体的に説明する。

酵母発現ベクターｐＭＨ２０２の構築 ＨＳＶ　ＤＮＡ　ｐｏｔ酵母発現ベクターの横築は、第
１図にまとめである。第１図は、そのような発現ベクタ
ーをいかにして構築することができるかということの単
なる１つの例示に過ぎないものであり、他の例示として
は、 （１）単コピー（動原体）ベクターを使用すること；（
２）組込みベクターを使用すること；（３）ＧＡＬ−１
プロモーターの代わりに異なるプロモーターを使用する
こと； （４）異なるターミネータ−配列を使用すること；また
は （５）異なる単純ヘルペスウィルスまたはヘルペスウィ
ルスｐｏｌ遺伝子を使用すること 等が含まれる。

出発プラスミドのＹｅｐ３５２は、酵母中で機能するプ
ロモーターを含む遺伝子の発現に用いる高コピー数の大
腸菌／酵母シャトルベクターである［ヒル（Ｈｉｌｌ、
　Ｊ　、　Ｅ　、）らの１９８６．Ｙｅａｓｔ２：Ｌ６
３〜１６７コ。Ｙｅｐ３５２は、アンピシリン含有培地
中で選択的に増殖することのできる大腸菌中のβ−ラク
タマーゼ遺伝子、およびウラシル欠乏培地中で選択的に
増殖することのできる酵母中のＵＲＡ３遺伝子を含んで
いる。加えて、このベクターは細菌および酵母中で自律
複製するためのＤＮＡ配列を含んでいる。このベクター
は、調節可能な酵母プロモーターであるガラクトキナー
ゼプロモーター（ＧＡＬ−１）の制御下で外来遺伝子を
発現するために修飾されている。ＧＡＬ−１プロモータ
ーは他の箇所（ジョンストンおよびデイビスの上記文献
参照）に詳細に記載されており、外来タンパク質を発現
するために他の研究者により首尾よく用いられている［
ウエン（Ｗｅｎ、Ｄ）およびシュレシンガー（Ｓ　ｃｈ
ｌｅｓｉｎｇｅｒ、Ｍ、　Ｊ　、）の１９８６、ＰＮＡ
Ｓｌ　　８３：３６３９〜３６４３コ。　ジ副節回能な
プロモーターを使用することにより、外来タンパク質の
発現を誘導する前に細胞を高密度まで増殖させることが
可能になり、それゆえ外来タンパク質が蓄積することに
よって細胞の増殖が有害な影響を受ける可能性を回避す
ることができる。ＧＡＬ−１プロモーターによって調節
された遺伝子の発現はガラクトースによって誘導され、
グルコースによって抑制され、ラフィノースによって逆
誘導される（ｕｎｉｎｄｕｃｅｄ）。

特に断らない限り、本発明に用いたすべての組換えＤＮ
Ａ技術は、マニアナイスらの文献［１９８２、モレキュ
ラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｔｏｎｉｎ
ｇ）ニア・ラボラトリ−・マニュアル（Ａ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・
ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ
ａｒｂｏｒＬ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプ
リング・ハーバ−１ＮＹ］に見出すことができるもので
ある。クローニングに用いるＹｅｐ３５２プラスミドＤ
ＮＡの断片は、マルチクローニング部位（ｍｕｌｔｉｐ
ｌｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　５ｉｔｅ、Ｍ　ＣＳ　）の部分
を除き突起状（ｏｖｅｒｈａｎｇ　ｉｎｇ）５゛末端を
生じさせるために、制限エンドヌクレアーゼ［二ニー・
イングランド・バイオラブダ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ
　Ｂｉｏｌａｂｓ）、ベセスダ・リサーチ・ラブダ（Ｂ
ｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ）コＥｃ
ｏＲＩおよびＢａｌｌｌ１−１１を用いて約５μ９のＹ
ｅｐ３５２プラスミドＤＮＡを消化することにより得た
。

加えて、ＧＡＬ　　１−１０プロモ一ター配列を含む約
８１０塩基対（ｂｐ）断片を、９８Ｍ１２５の誘導体で
あるプラスミドＹｃｐ１２５Ｈから得た（ジョンストン
およびデイビスの上記文献参照ＸＹｃｐ１２５Ｈが９８
Ｍ１２５と相異する点は、Ｙｃｐ１２５Ｈが唯一のＢａ
ｍ８１部位に付加したＨｉｎｄｎｌオリゴヌクレオチド
リンカーを有しているということである）。

本発明に用いる８１０ｂｐ断片は、ＨｉｎｄＩＩ［リン
カ−の付加によって影響を受けない。約８１０ｂｐ断片
は、約４０μ９の精製Ｙｃｐ１２５ＨプラスミドＤＮＡ
を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ
で消化することによって得た。

ＤＮＡ断片の精製は、消化したＤＮＡを１％低融点温度
アガロース（ベセスダ・リサーチ・ラブダ）ゲルにかけ
、所望のバンドをスカベル（ｓｃａｐｅｌ）で切り取り
、マイクロヒュージ管（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ　ｔｕｂｅ
）に移し、６５℃に加熱し、１／２容量のフェノールを
３７℃で加え、混合物を迅速に回転撹拌しくｖｏｒｔｅ
ｘｅｄ）、マイクロヒュージ管中で１２．００Ｏｒｐｍ
にて遠心分離することにより行った。水層を除き、１／
２容量のフェノールで再抽出し、再び水層を除き、ｌ／
１０容量の５Ｍ　ＮａＣ１を加えた。混合物を再びマイ
クロヒュージ管中で１２゜００　Ｏｒｐｍにて遠心分離
にかけ、水層を除き、２容量のエタノールを加えてＤＮ
Ａを沈澱させた。

水層／エタノール混合物をドライアイス上で３０分間貯
蔵し、マイクロヒュージ管中で１２，００Ｏｒｐｍにて
遠心分離を行うことによりＤＮＡをペレット化した。Ｄ
ＮＡペレットを７０％エタノール／水ですすぎ、スピー
ド（Ｓ　ｐｅｅｄ）　Ｖ　ａｃ遠心管中で真空下で乾燥
させ、少量の１０ｍＭ）リス−ＨＣ１，１ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８，０中に再溶解させナー− ２つの精製ＤＮＡ断片（それぞれ約１μｇ）を、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（ベセスダ・リサーチ・ラブダ）を用いて
１３℃にて一夜一緒に結合させた。

この結合混合物の約ｌ／１０を用いて、凍結したコンピ
テントなＸＬ−１ブルー（ｂｌｕｅ）大腸菌［ストラテ
ジーン・クローニング・システムズ（Ｓｔｒａｔｇｅｎ
ｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）コを形質転換し
た。プラスミド調製物の制限エンドヌクレアーゼ分析に
より、ランダムな形質転換体から組換え体コロニーを選
択した。この分析のために用いた制限エンドヌクレアー
ゼは上記と同じＥｃｏＲＩおよびＢａＩＩＩＨｌであり
、これらは正しく組み立てられたベクターから約５ｔｏ
ｂｐ挿入物を遊離した。

外来遺伝子の発現をよくするために、酵母の終止配列を
ベクター中に導入した。終止配列は２つの合成オリゴヌ
クレオチドからなっており（第１図参照）、これはアニ
ールして酵母イソー１−チトクロームｃ（ＣＹＣ−１）
遺伝子終止配列［ザレット（Ｚａｒｅｔ、に、Ｓ　、）
およびジャーマン（Ｓ　ｈｅｒｍａｎ　。

Ｆ、）のｆ　９８２．Ｃｅ１１２８　：５６３〜５７３
］お上び３つの可能な解読わくにおける翻訳停止コドン
を含む断片を生成した。二本鎖オリゴヌクレオチドを、
ｐＭ）ｌ　ｌ　００のＭＣ８中のＨｉｎｄｌｌｌ制限部
位中に直接挿入すべく設計した。挿入が正しい方向に行
なわれたならば、オリゴヌクレオチドは、ＭＯＳ配列に
隣接し３つの停止コドンの上流の末端のみにおいてＨｉ
ｎｄＩ１１部位を保持するであろう。

ｃｙｃ−を終止配列を含む５０塩基オリゴヌクレオチド
の合成を、本研究のためにβ−シアノエチルホスホラミ
ダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を用い
アプライド・バイオシステムズ・モデル（Ａｐｐｌｉｅ
ｄ　Ｂ　ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ）３８０　Ｂ
　Ｄ　Ｎ　Ａシンセサイザー（Ｓ　ｙｎｔｈｅｓｉｚｅ
ｒ）上で行った。オリゴの精製は、上記手順［アプライ
ド・バイオシステムズ・ユーザー・プリテン（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｕｓｅｒ　Ｂ　ｕｌ　
ｌｅｔ　ｉｎ）、発行＃１３１１月９日、１９８４］に
従いセファロースＧ５０１ｄ［上でクロマトグラフィー
にかけることにより行った。オリゴヌクレオチドの最終
濃度は、１０＋＋＋Ｍ）リス−ＨＣ１，ｐＨ８，０、Ｉ
ｍＭＥＤＴＡ中で約７〜８μ９／ｊｌｆ２であった。各
精製オリゴ約１５μ９をマイクロヒュージ管中に入れ、
混合物を５５℃に５分間加熱し室温に３０分間冷却する
ことによりアニールした。

さらに、約２μ９の精製した直線状ＰＭＨ１００の調製
を、このプラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＨ
ｉｎｄＩＩ［により消化して直線状分子を生成すること
により行い、上記のようにして直線状ＤＮＡの低融点温
度アガロースゲルからのゲル精製を行った。上記直線状
プラスミド（約２μｇ）およびオリゴＤＮＡ（３０μ９
）を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（上記）を用い１３℃で一夜
結合させた。結合混合物の約ｌ／１０を用い、凍結した
コンピテントな）（Ｂ　Ｉ　ＯＩ大腸菌（ベセスダ・リ
サーチ・ラブダ）を形質転換した。

組換え体コロニーをランダムに選択し、プラスミド調製
物を制限エンドヌクレアーゼ分析することによりランダ
ムな形質転換体からスクリーニングし、組換え体プラス
ミドを適当な制限酵素で消化して生成したパターンの特
有の相異（ｐＭＨ１００と比較して）によって、挿入が
適当な方向に行なわれたものを決定した。この分析に用
いた制限エンドヌクレアーゼはＥｃｏＲＩおよびＮａｒ
ｌであり、別のアッセイではＮａｒｌおよびＨｉｎｄＩ
Ｉ［であった。

両方の場合において、正しく構築されたものからは短い
ＤＮＡ断片が生じ、これは５０ｂｐが付加しているとい
う点で出発のベクターｐＭＨ１００から生じる断片とは
異なっていた。正しい方向に５０ｂｐオリゴヌクレオチ
ドを含有する新しい構築物は、ｐＭＨｌｏｌと命名した
。

ｐＭＨｌｏｔを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ（上
記）で消化し、マニアナイスらの上記文献に記載のよう
に大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（クレノー断片）（ベセス
ダ・リサーチ・ラブダ）を用いて突起状５°末端を埋め
て平滑末端を生成した（これはＨＳＶｐｏｌ遺伝子を受
は入れることかできた）。

Ｈ３Ｖｐｏｌ遺伝子をプラスミドｐＤ　７０２から単離
した。制限酵素ＢａｍＨｌおよびＳ　ｓｐｌを用いてプ
ラスミドｐＤ７０２（ドースキーおよびクランバッカー
の上記文献参照）を消化し、上記のようにして突起状５
′末端を平滑末端にした。全ＨＳＶ　−１ｐｏｌ遺伝子
を含む５．８キロ塩基対（ｋｂ）のＨｉｎｄ■−Ｓ　ｓ
ｐｌ断片、および直線状の平滑末端ｐＭ）ＩＩＯｌをと
もに上記のようにして低融点温度アガロースから精製し
た。ついでベクター（２μｇ）およびｐｏｌ挿入ＤＮＡ
（１μ９）を１３℃で一夜一緒に結合させた（上記のよ
うにして）。

結合混合物の約１／１０を用い、凍結したコンピテント
なＸＬ−１ブルー大腸菌（上記）を形質転換した。α−
”Ｐ−ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ミリモルアマージャム
）で放射性標識した５　、　８　ｋｂ断片からなるプロ
ーブを用い、市販のニックトランスレーションキット（
ベセスダ・リサーチ・ラブダ）を用いてマニアナイスら
の上記文献に記載に従ってコロニーハイブリダイゼーシ
ョンを行うことにより、組換え体単離物を選択した。遺
伝子の挿入が正しい方向に行なわれているかどうかは、
適当な制限エンドヌクレアーゼで消化することにより決
定した。用いた制限酵素はＥｃｏＲｌであり、これはベ
クターを１度だけ切断した。最終構築物はｐＭＨ２０２
と命名した。

酵母中での誘導条件下、ＨＳＶｐｏｌ遺伝子の天然のＡ
ＴＧ開始コドンの前に〜１４０塩基の５゛非非翻訳列を
含み、転写終止オリゴヌクレオチド配列に達する前に天
然のＵＧＡ終止コドンの下流に約２．１キロ塩基を含む
転写物が得られるように、最終構築物（ｐＭＨ２０２）
を設計した。従って、ベクターは、ＤＮＡ配列から予測
されるように完全なＨＳＶ　ＤＮＡポリメラーゼポリペ
プチドに翻訳することができるＲＮＡをコードしていな
ければならない［キン（Ｑ　ｕｉｎ、　Ｊ　、　Ｐ　、
）およびマツクゲオック（ＭａｃＧｅｏｃｈ、Ｄ、Ｊ　
、）の１９８５．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ
、１３：８１４３−８１６３］。

里 ＨＳＶｐｏｌタンパク質が発現奈れたかどうか、および
ｐＭＨ２０２を含有する酵母中でＨ９Ｖ特異的ＤＮＡポ
リメラーゼ活性を検出することができたかどうかを決定
するために、以下の実験を行つた。ただし、この記載は
、そのような株がいかにして構築されるかの１つの例示
に過ぎない。他の例示としては、異なる酵母宿主および
／または異なる形質転換手順が含まれる。

発現ベクター含有酵母株の調製例： 酵母細胞（Ｙ２９４）をｐＭＨ１０１（ＨＳＶ　ｐｏｌ
遺伝子を含まないコントロールプラスミド）ＤＮＡまた
はｐＭＨ２０２（ＨＳＶ　ｐｏｔ遺伝子を含む発現プラ
スミド）ＤＮＡで形質転換した。酵母細胞の形質転換は
、ベッグズ（Ｊ、Ｄ、Ｂｅｇｇｓ）の方法（１９７８、
Ｎａｔｕｒｅ２７５：１０４〜１０９）を用いて行った
。

形質転換体の選択は、ソルビトール（１８２，２９／（
ｔ）ニゲルコース（２０９／（り；ロイシン（３０μ９
／ＪＩｆ２）、ヒスチジン（２０μ９ＩＲＱ）、トリプ
トファン（２０μ９／祿）およびグルコース（２％）を
加えであるがウラシルは含有しない酵母窒素ベース（６
，７ｇ／ＱＸジフコ）を含む最小培地上で増殖させるこ
とによりウラシル原栄養について行った。各タイプ（そ
れぞれＹ−ＭＨＩＯＩまたはＹ−ＭＨ２０２と命名）の
コロニー１つをランダムに選び、さらに分析に供した。

酵母株によるＨＳＶ　ＤＮＡポリメラーゼの発現例： これら２つの株から１００ｊＩＱ−夜培養物を、上記の
必要なアミノ酸および２％ラフィノースを含む最小培地
（０，７％酵母窒素ベース［シフココ）中で増殖させた
。翌日、培養物を半分ずつに分け、細胞をベレット化さ
せ、２％ラフィノースかまたは２％グルコースを含む新
たな培地（１００ｉ１２）中に再懸濁させ、再び一夜増
殖させた。翌日、４つの培養物を４℃でベレット化させ
た。

ノョンソンら（１９８５，Ｃｅ１１４３　：３６９−３
７７）に記載のようにして、細胞溶解液を調製した。こ
れは、そのような溶解液をいかにして調製するかという
ことの１つの例示に過ぎない。細胞ベレットを、５０ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，０（１ｚｆ２）；５０ｍＭ
　ＮａＣ１；１％ジメチルスルホキサミド：１０％グリ
セリン；５ｍＭ　β−メルカプトエタノール；ｌ　Ｏｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ；２ｍＭベンズアミジン；および１ｍＭフ
ェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）中に
懸濁した。細胞溶解は、等容量の酸洗浄ガラスピーズの
存在下で細胞を１分間回転撹拌することを１５〜２０回
繰り返すことにより行った。溶解の程度は、顕微鏡によ
りモニターした。溶解抽出物をマイクロヒュージ管に移
し、１２．０００Ｘ９にて１０分間遠心分離を行った。

抽出物は、使用するときまで１５％グリセリン中に一８
０℃で貯蔵した。各抽出物の最終のタンパク質濃度は、
５〜６巧／村であった。

感染細胞抽出物の調製は、本質的にカーカス（Ｋａｒｋ
ａｓ）ら（１９８６Ｊ、Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ、２９：８４
２〜８４８）の方法により行った。細胞当たり１０プラ
一ク形成単位の感染多重度でヒラＳ３細胞にＨＳＶ−Ｉ
　　ＫＯＳを感染させ、感染１６時間後に集めた。細胞
ベレット（〜Ｉ　Ｘ　１０’細胞）を−８０℃で一夜凍
結し、氷上で解凍し、低張溶液Ａ（１０ｍＭ　Ｋ＊ＰＯ
４、りＨ７，０；１０ｍＭ　ＫＣＩ；１ｍＭ　ＰＭＳＦ
；１ｍＭジチオトレイトール［Ｄ　Ｔ　Ｔ　］）（２２
０ｍ１２中に再懸濁し、時々撹拌しながら氷上で３０分
間インキュベートした。等容最の溶液Ｂ（０，７Ｍ　Ｋ
、ＰＯ，、ｐＨ７，ｏ；２Ｂ％グリセリン：６ｍＭ　Ｄ
ＴＴ；０．４％ＮＰ−４０；１ｍＭ　ＰＭＳＦ）を加え
、時々撹拌しながら混合物を水上でさらに３０分間イン
キュベートした。混合物を１２５゜０００×９にて１時
間遠心分離し、ＮＰ−４０を最終濃度が０．４％となる
ように加えた。アリコートを一８０℃で凍結貯蔵した。

抽出物の最終タンパク質濃度は、５〜６ｔｇ／ｘＱであ
った。

生成タンパク質の分析および酵素活性の測定二組換え体
培養物のスクリーニングは、ハイネ（Ｈｅｉｎｅ）らの
手順（１９７４，Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、↓±：６４０〜６５
１）に従い、上記酵素抽出物溶解液を１０％ポリアクリ
ルアミドゲル上で分析することにより、Ｆ（ＳＶ　ＤＮ
Ａポリメラーゼポリペプチドの産生について行った。溶
解液を５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で処理した後、トービン（Ｔ
ｏｗｂｉｎ）ら（１９７９゜ＰＮＡＳ７６：４３５０〜
４３５４）の方法によりニトロセルロースに移し、バイ
オラド社からのイミューンープロット（Ｉ　ｍｍｕｎ　
−Ｂ　１ｏｔ）アッセイキットを用いてフィルターの加
工処理を行った。ただし、ゼラチンの代わりにウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ）を用いた。イムノブロッティング
は、高度に精製したＨＳＶ−Ｉ　　ＤＮＡポリメラーゼ
調製物に対して調製した抗血清を用いて行った。抗血清
の産生は、投与当たり精製ポリメラーゼｌＯμ９を用い
た一連の５回の免疫によりニューシーラント白ウサギに
おいて行った。最初の注射では完全フロインドアジュバ
ントを、それ以後の注射では不完全フロインドアジュバ
ントを用いた。−次ウサギ抗体の１　：２００希釈およ
び抗ウサギアルカリホスファターゼ結合体の１：１００
０希釈を用いた。

イムノブロッティング手順の結果を第２図に示す。比較
のため、レーンｌは、我々の抗血清を調製するために免
疫源として用いた高度に精製した調製物からのＨＳＶ−
Ｉ　　ＤＮＡ　ｐｏｔ（約９μ９）を含んでおり、レー
ン２は、ｐｏｌ酵素アッセイのためにコントロールとし
て調製した感染ヒラ細胞からの粗製のＨＳＶ−１ｐｏｌ
調製物（６０μ９）を含んでいる。レーン３〜６（約５
０〜６０μ９／レーン）は、指示のごとく酵母細胞抽出
物を含んでいる。この結果は、誘導条件下で増殖したＹ
−ＭＨ２０２（レーン６）においてのみ約１４０ｋＤａ
の免疫反応性ポリペプチドの特異的な誘導があることを
示している。加えて、酵母発現ポリペプチドは、粗製の
感染細胞抽出物からのＨＳＶ−１ｐｏｌと同じ電気泳動
移動度を示している。レーンｌ中のｐ。

１ポリペプチド（ＨＳＶ−Ｉｍｐ由来）は、レーン２中
の優性な高分子量ｐｏｌタンパク質バンド（ＨＳＶ−Ｉ
　　ＫＯ５株由来）に比べて電気泳動移動度がわずかに
遅いことに注意すべきである。加えて、我々の抗血清は
また、感染細胞中および精製ＤＮＡｐｏｌ免疫源中にみ
られるＨＳＶ特異的６５ｋＤａタンパク質とも反応する
ことに注意すべきである。

酵母細胞抽出物中において、この６５ｋＤａタンパク質
は１４０ｋＤａ　ＨＳＶ　　ＤＮＡポリペプチドの分解
産物を表している。しかしながら、レーンＩおよび２中
の６５ｋＤａタンパク質はまた、６５ｋＤａ　ＨＳＶ　
ＤＮＡ結合タンパク質をも含んでおり、このタンパク質
は精製手順中にしばしば１４０ｋＤａ　ＤＮＡ　ｐｏｔ
ポリペプチドと強固に結合しているのが見られる。本発
明の抗血清は、この６５ｋＤａ　ＤＮＡ結合タンパク質
と反応することが免疫沈降により示された。

ＤＮＡポリメラーゼ酵素活性についても、溶解液の分析
を行った。４つの酵母細胞抽出物のそれぞれについて、
２種の条件下でＤＮＡｐｏｌ活性についてアッセイした
。酵母ＤＮＡｐｏｌのアッセイ条件は、すべての溶解液
中に存在するαポリメラーゼを検出するようにした。Ｈ
ＳＶ　ＤＮＡ　ｐｏｌのアッセイ条件は、高い塩（１０
０ｍＭ硫酸アンモニウム）により高められるＨＳＶに特
異的なりＮＡ　ｐａｌ活性を検出するよう選択した。対
照的なことに、酵母のαＤＮＡｐｏｌはこれらの塩条件
下では抑制された。酵母ＤＮＡポリメラーゼのアッセイ
は、本質的にチェルニ力−（Ｃｅｌｎｉｋｅｒ）および
キャンプベル（Ｃａｍｐｂｅｌ　ｌ）の方法（１９８２
，Ｃｅ１１３１、：２０１〜２１３）に従って行ったが
、リボヌクレオチド三リン酸は加えなかった。反応混合
物は、１０ｍＭ）リス−ＨＣＬ　１）Ｈ７，５；１０ｍ
ＭＭｇＣ１，：ｌ　ＯｍＭ　（ＮＨ，）ｙｓＯ，；０．
１ｍＭ　ＤＴＴ；各１００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、
ｄＧＴＰ。

１００μＭ　３Ｈ−ＴＴＰ（１０ｃｐｍ／ピコモル）；
ニラキングしたウシ胸腺ＤＮＡ（４０μ９ＩＲＱ）　；
および最終容量５０μｇの２ｍＭスペルミジン中に酵素
抽出物（タンパク質２５〜３０μ９）（５μＱ）を含ん
でいた。

ＨＳＶ　−Ｉ　　ＤＮＡ　ｐｏｌのアッセイは以下のよ
うにして行った。反応混合物は、５０ｍＭ）リスＨＣｌ
１ｐＨ８，０；５ｍＭ　ＭｇＣ１ｙ；１００ｍＭ　（Ｎ
Ｈ４）＊Ｓ　Ｏ−；　ｌ　ｍＭ　Ｄ　Ｔ　Ｔ　；各５μ
ＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴ　Ｐ、　ｄＧＴ　Ｐ　：５　ｕＭ
　３Ｈ−ＴＴ　Ｐ（２００ｃｐｍ／ピコモル）；ニラキ
ングしたウシ胸腺ＤＮＡ（３０μ９／ＩＩＱ）　；およ
び最終容量５０μＣのＢＳＡ（１００μｇ／ｄ）中に酵
素抽出物（タンパク質２５μ９）（５μｇ）を含んでい
た。すべてのＤＮＡポリメラーゼアッセイは、反応物を
３７℃で１５分間インキュベートすることにより行った
。反応混合物をガラス繊維フィルター上にスポットし、
５％ＴＣＡ中の１０ｍＭピロリン酸ナトリウムを加える
ことにより反応を停止させた。ＩＮ　ＭＣＩを用いて２
回、９５％エタノールを用いて１回フィルターを充分洗
浄し、空気乾燥し、ＬＫＢＩ２１４ラックベータ（Ｒａ
ｃｋｂｅｔａ）カウンターを用いｔ÷有効性６３％のシ
ンチレーシッンカウンテイングにより定虫した。すべて
のアッセイは２回行った。

第１表は、誘導条件下（ガラクトース）で増殖させたＨ
ＳＶ　ＤＮＡ　ｐｏ１発現細胞であるＹ−ＭＨ２０２の
みが、有為量の高温ＤＮＡｐｏｌ活性を生じたことを示
している。加えて、第２表は、このＹ−ＭＨ２０２酵母
細胞における新規な高温活性がアシクロビル三リン酸（
ＡＣＶＴＰ８２３μＭ）およびアフィジコリン（ａｐｈ
ｉｄｉｃｏｌｉｎＸ　５　、３　ｕ　Ｍ）（ともにＨＳ
Ｖ　ＤＮＡ　ｐｏｌ酵素のよく知られた阻害剤である）
により抑制されることを示している。

第２表はまた、試験したすべての抽出物における低塩Ｄ
ＮＡｐｏｌ活性は、試験した濃度においてＡＣＶＴＰに
は感受性でないが、アフィジコリン（αポリメラーゼの
特性を有する）には感受性であることをも明らかにして
いる。

これらの結果は、ガラクトース誘導Ｙ−ＭＨ２０２酵母
細胞中でＨＳＶ　ＤＮＡ　ｐｏｌの活性形が首尾よく発
現したことを示している。

（注）ａ：ポリメラーゼ活性は、反応当たり組み込まれ
た’Ｈ−ＴＴＰのＣｐｌｎとして表した。アッセイ条件
は上記の通りである。

ｂ：ｒｏｊはバックグラウンド未満の値を示す。

第２表（アシクロビル三リン酸およびアフイジコリン（
注）ａ：抽出物は上記のようにして調製した。酵母コン
トロール（Ｙ−ＭＨ１０１）および発現体（Ｙ−ＭＨ２
０２）細胞抽出物は、ガラクトースの存在下で増殖させ
た培養液から調製した。

ｂ＝アブセイ条件は上記と同じである。

Ｃニアシクロピル二リン酸（ＡＣＶＴＰ）およびアフィ
ジコリンは、それぞれ２３μＭおよび５．３μＭで反応
液中に存在させた。％抑制は、相対活性（薬剤を用いた
反応当たりに導入されたｃｐｍ／薬剤なしの反応当たり
に導入されたｃｐｎ＋の比）を１．０から差し引き、こ
れに１００％を乗することにより決定した。０％値は、
相対活性が≧１．０であったことを示している。「−」
は、ポリメラーゼ活性が低いために統計的に有為な値が
得られなかったことを示す。

酵母中でのＨＳＶ　ＤＮＡ　ｐｏｔの活性形の発現がこ
の酵素の構造についての研究を容易にすることは間違い
ないであろう。酵母発現ＨＳＶ　ＤＮＡポリメラーゼ酵
素は、基質特異性および阻害動力学に関して特徴付ける
ことができる。部位特異的突然変異は、そのような突然
変異が酵素活性に及ぼす影響および細胞内での位置を評
価するために遺伝子中に作製することができる。このタ
ンパク質の精製により、３次元構造および該タンパク質
の機能領域、すなわち基質／阻害剤結合部位に関する物
理的／化学的研究が可能となることは間違いないであろ
う。加えて、チャルバーグ（Ｃｈａｌｌｂｅｒｇ）によ
り記載されているように（１９８６，ＰＮＡＳ８３：９
０９４〜９０９８）、ＨＳＶ由来特異的ＤＮＡ複製複合
体の他の成分をサツカロミセス中で発現させ、該成分の
Ｉ　４０ｋＤａ　ＤＮＡポリメラーゼタンパク質との相
互作用およびＤＮＡポリメラーゼ活性に対する影響を評
価することも可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、酵母中にＨ９Ｖｐｏｌを産生させるための発
現ベクター（ｐＭＨ２０２）の構築を示す模式図、 第２図は、ベクター（Ｙ−ＭＨ２０２）を含む酵母細胞
中で産生されたＨＳＶｐｏｌタンパク質のイムノブロッ
ティングを示す模式図である。 特許出願人　イー・アール・スクイブ・アンド・サンズ
・インコーホレイテッド 代理　人　弁理士　青　山　葆　ほか１８舅２図 １オ千里　　１２３４５６ ９７．５ ４５．０

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）酵母内で機能するプロモーターの下流域にヘルペ
   スウィルスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現できるよう
   な態様でクローニングしたヘルペスウィルスＤＮＡポリ
   メラーゼ遺伝子を含むプラスミド発現ベクター。
2. （２）酵母内で機能するプロモーターの下流域に単純ヘ
   ルペスウィルスＤＮＡを発現できるような態様でクロー
   ニングした単純ヘルペスウィルスＤＮＡポリメラーゼ遺
   伝子を含むプラスミド発現ベクター。
3. （３）請求項（１）記載のプラスミド発現ベクターを含
   み機能性のヘルペスウィルスＤＮＡポリメラーゼ酵素を
   産生する酵母株。
4. （４）請求項（２）記載のプラスミド発現ベクターを含
   み機能性の単純ヘルペスウィルスＤＮＡポリメラーゼ酵
   素を産生する酵母株。
5. （５）機能性のヘルペスウィルスＤＮＡポリメラーゼを
   組換え体酵母から産生する方法であって、 （ｉ）酵母内で機能するプロモーターの制御下でクロー
   ニングされたヘルペスウィルスＤＮＡポリメラーゼ遺伝
   子を含むプラスミド発現ベクターを構築し、 （ｉｉ）該プラスミド発現ベクターを適当な酵母株中に
   導入し、 （ｉｉｉ）得られた組換え体酵母株を、該ヘルペスウィ
   ルスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を制御する該プロモータ
   ーが機能し、該ヘルペスウィルスＤＮＡポリメラーゼ酵
   素タンパク質が蓄積するような条件下で増殖さ、ついで （ｉｖ）該酵母細胞を溶解して機能性のヘルペスウィル
   スＤＮＡポリメラーゼを放出させ、その特徴付けおよび
   精製を行うことを特徴とする方法。
6. （６）ヘルペスウィルスＤＮＡポリメラーゼが単純ヘル
   ペスウィルスＤＮＡポリメラーゼである請求項（５）記
   載の方法。