JPH0213396A - 選択的免疫学的定量のためのモノクローナル抗体 - Google Patents
選択的免疫学的定量のためのモノクローナル抗体Info
- Publication number
- JPH0213396A JPH0213396A JP1104804A JP10480489A JPH0213396A JP H0213396 A JPH0213396 A JP H0213396A JP 1104804 A JP1104804 A JP 1104804A JP 10480489 A JP10480489 A JP 10480489A JP H0213396 A JPH0213396 A JP H0213396A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- type iii
- procollagen
- amino
- monoclonal antibody
- peptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6878—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids in epitope analysis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
プロコラーゲンペプチド（旧型） （ｐｕｐ ）は、プ
ロコラーゲン（旧型）分子の分泌後１拙胞外除去を受け
ろコラーゲン（ｂｌｌｆｆｌ）のアミノ末端プロはブテ
ドである。一方、プロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ■型
）はコラ−ゲナーゼでさらに、それ自体公知のタンパク
質化学の方法を用いて単離できるフラグメントＣ○１１
、ｃｏｌ ２およびｃｏａｔ ３に分離される（Ｎｏｗ
ａｃｋら： ｌ１ｆｉｕｒ、、Ｔ、Ｂｉｏｃｈｏｍ、、
７０：２０５−２１６．１９７６；Ｂｒｕｃｋｎｅｒ
Ｐ、ら： Ｅｕｒ、Ｊ。
ロコラーゲン（旧型）分子の分泌後１拙胞外除去を受け
ろコラーゲン（ｂｌｌｆｆｌ）のアミノ末端プロはブテ
ドである。一方、プロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ■型
）はコラ−ゲナーゼでさらに、それ自体公知のタンパク
質化学の方法を用いて単離できるフラグメントＣ○１１
、ｃｏｌ ２およびｃｏａｔ ３に分離される（Ｎｏｗ
ａｃｋら： ｌ１ｆｉｕｒ、、Ｔ、Ｂｉｏｃｈｏｍ、、
７０：２０５−２１６．１９７６；Ｂｒｕｃｋｎｅｒ
Ｐ、ら： Ｅｕｒ、Ｊ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、、９０：５９５−６０３．１９７８）
。
。
ヨーロッパ特許筒４，９４０号に記載されている放射免
疫定量法は、体液中の上記プロコラーケ゛ンはブチドの
濃度を測定するのに使用できる。Ｊこのペプチドの血清
濃度の知識からたとえば肝臓の繊維性疾患の活動性に関
する情報が提供される（Ｒｏｂｄ、Ｈ，ら： Ｅｕｒ、
、Ｔ、Ｃ１１ｎ、工ｎｖｅａｔ、 、 ９：４５１〜４
５９，１９７９）。
疫定量法は、体液中の上記プロコラーケ゛ンはブチドの
濃度を測定するのに使用できる。Ｊこのペプチドの血清
濃度の知識からたとえば肝臓の繊維性疾患の活動性に関
する情報が提供される（Ｒｏｂｄ、Ｈ，ら： Ｅｕｒ、
、Ｔ、Ｃ１１ｎ、工ｎｖｅａｔ、 、 ９：４５１〜４
５９，１９７９）。
血清および他の体液中のプロコラーゲンはプチド（旧型
）およびプロコラーケ゛ン（旧型）の正確な選択的定量
はヨーロッパ特許出願筒２８９、９３０号に提案されて
いる。しかしながら、これは多数の遠心分離工程を必要
とし、それが定常的な臨床検査への使用を困難にしてい
る。
）およびプロコラーケ゛ン（旧型）の正確な選択的定量
はヨーロッパ特許出願筒２８９、９３０号に提案されて
いる。しかしながら、これは多数の遠心分離工程を必要
とし、それが定常的な臨床検査への使用を困難にしてい
る。
イムノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）法では、
さらに単純な操作が可能になる。この方法では２ｍの抗
体が使用される。そのひとつは固体担体にカップリング
されるが、それによシ沈殿工程がひとつ、その結果遠心
分離工程がひとつとビベツテイング工程がいくつか不要
になる。
さらに単純な操作が可能になる。この方法では２ｍの抗
体が使用される。そのひとつは固体担体にカップリング
されるが、それによシ沈殿工程がひとつ、その結果遠心
分離工程がひとつとビベツテイング工程がいくつか不要
になる。
ゲルｐ過クロマトグラフィーでは特徴的な、ピ叫りとし
てこれまで明らかにされていなかったプロコラーゲン（
旧型）のフラグメントと反応するモノクローナル抗体が
驚くべきことに発見された。この抗体を、プロコラーゲ
ンペプチド（旧型）および／またはプロコラ−ダン（旧
型）に対する特異性を有する他のモノクローナルまたは
ポリクローナル抗体と組合せると、Ｂ工ＭＡ技術を用い
たこれらの抗原の定量が可能になる。
てこれまで明らかにされていなかったプロコラーゲン（
旧型）のフラグメントと反応するモノクローナル抗体が
驚くべきことに発見された。この抗体を、プロコラーゲ
ンペプチド（旧型）および／またはプロコラ−ダン（旧
型）に対する特異性を有する他のモノクローナルまたは
ポリクローナル抗体と組合せると、Ｂ工ＭＡ技術を用い
たこれらの抗原の定量が可能になる。
したがって、本発明は、
（ｂ） 完全プロコラーゲン（旧型）およびｐＮ−コ
ラーゲ゛ン（ｃ末端プロはプテドを欠（プロコラーケ゛
ン）（キーク１ａ）、完全アミノ末端プロコラーゲンは
ブチド（旧型）（ピーク２ａ）、分子量がアミノ末端プ
ロコラーケ゛ンはブチド（ｎｌ型）の分子量とｃｏｌ
１の分子量の間にあるアミノ末端プロコラーゲンペプチ
ド（ｉｌ［Ｗ）の分解生成物（ピーク３ａ）、ならびに
ｃｏｌ １およびＣ０１１と同じ分子量をもつアミノ末
端プロコラーケ゛ンはブチド（旧型）の分解生成物（ピ
ーク４ａ）に対して第２図に抽かれた反応パターンを有
するモノクローナル抗体、 （２） ミエローマ系の細胞と、予めアミノ末端プロ
コラーゲンはプチド（旧型）で免疫感作された動物から
のリンパ球細胞との細胞融合によって得られ、上記（ｂ
）に定義された抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞系統
（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｃｅｌｌ １ｉｎｅ）ｓ（５）
上記（ｂ）に定義された抗体の製造方法、（４） 上
記（ｂ）に定義された抗体を用いるプロコラーゲンはプ
チド（旧型）の免疫学的定量方法、（５）上記（ｂ）に
定義されたモノクローナル抗体の有効量を、単独または
他の抗体と（にヨーロッパ特許出願筒２８９．９３０号
に提案されているモノクローナル抗体の有効量と組合せ
て、診断的に許容される担体と混合して含有する、体液
中のプロコラーダンＲブチ）ｌ’（ｉｌｌ型）の量を確
立するための診断用組成物、に関する。
ラーゲ゛ン（ｃ末端プロはプテドを欠（プロコラーケ゛
ン）（キーク１ａ）、完全アミノ末端プロコラーゲンは
ブチド（旧型）（ピーク２ａ）、分子量がアミノ末端プ
ロコラーケ゛ンはブチド（ｎｌ型）の分子量とｃｏｌ
１の分子量の間にあるアミノ末端プロコラーゲンペプチ
ド（ｉｌ［Ｗ）の分解生成物（ピーク３ａ）、ならびに
ｃｏｌ １およびＣ０１１と同じ分子量をもつアミノ末
端プロコラーケ゛ンはブチド（旧型）の分解生成物（ピ
ーク４ａ）に対して第２図に抽かれた反応パターンを有
するモノクローナル抗体、 （２） ミエローマ系の細胞と、予めアミノ末端プロ
コラーゲンはプチド（旧型）で免疫感作された動物から
のリンパ球細胞との細胞融合によって得られ、上記（ｂ
）に定義された抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞系統
（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｃｅｌｌ １ｉｎｅ）ｓ（５）
上記（ｂ）に定義された抗体の製造方法、（４） 上
記（ｂ）に定義された抗体を用いるプロコラーゲンはプ
チド（旧型）の免疫学的定量方法、（５）上記（ｂ）に
定義されたモノクローナル抗体の有効量を、単独または
他の抗体と（にヨーロッパ特許出願筒２８９．９３０号
に提案されているモノクローナル抗体の有効量と組合せ
て、診断的に許容される担体と混合して含有する、体液
中のプロコラーダンＲブチ）ｌ’（ｉｌｌ型）の量を確
立するための診断用組成物、に関する。
本発明を以下に、とくにその好ましい態様について詳細
に説明する。本発明はまた。特許請求の範囲に明示され
ている。
に説明する。本発明はまた。特許請求の範囲に明示され
ている。
モノクローナル抗体を製造するには、動物好ましくはた
とえばマウス、ラット、ウサギまたはモルモットのよう
なげつ書類動物を、ヨーロッパ特許第４，９４０号の方
法によって単離されたプロコラーゲンペプチド（ｌＩｌ
型）によシ、アジュバントの存在下に免疫感作すること
ができる。
とえばマウス、ラット、ウサギまたはモルモットのよう
なげつ書類動物を、ヨーロッパ特許第４，９４０号の方
法によって単離されたプロコラーゲンペプチド（ｌＩｌ
型）によシ、アジュバントの存在下に免疫感作すること
ができる。
マウスの使用が好ましく、とくに８．Ｔｉ株のマウスが
好ましい。免疫応答は、たとえば４〜８週の間隔で、反
復ブースター注射することによって増強される。免疫感
作の成否は、放射能結合検定で抗体の濃度を測定するこ
とによってチエツクされる（Ｒ，Ｔｉｍｐｌ ＆ Ｌ、
Ｒ１５ｔｅｌｉ：工ｍｍｕｎｏｃｈｅ−ｍｉｓｔｒｙ
ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒ
ｉｘ、 Ｈ，Ｆｕｒ−ｔｈｍａ７ｒ編、第１巻、１９９
頁（ｂ９８２））。 リンパ球細胞とミエローマ細胞系
統（ＩＩＩｙｅｘｏｍａ ｃｅｘｘ １ｉｎｅ）との融
合の何日か前に、動物を、アジュバントを使用せすにプ
ロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ型）で処理する。リンパ
球細胞は動物から採取し、ミエローマ細胞系統と融合さ
せる。このミエローマ細胞も同様に上述の動物種のひと
つに出来するものを使用できるが、マウス起源のものが
好ましく、とくに細胞系統Ｐ３Ｘ６３ＡＧ８ 、６５３
と融合させる。同じ種のリンパ球細胞とミエローマ細胞
系統を融合させるのが有利である。融合およびその後の
細胞クローンの培養は、当業者によく知られた方法で行
われ、特異的抗体の濃度は細胞培養液からの上清につい
て、免疫学的結合検定を用いて測定される。この過程か
ら誘導される細胞クローンから、工ＲＭＡに使用するた
め、ひとつのクローンを選択する。マウスミエローマ細
胞系統Ｐ３Ｘ６３ＡＧａ６５３と、プロコラーゲンペプ
チド（ＩＩＩＪ）で予め免疫感作したＳ、ＴＬ株ママウ
スらのリンパ球細胞との融合によって製造され、第２図
に示すような反応ノぞタンを有するモノクローナル抗体
を産生ずる細胞系統を用いるのがとくに好ましい。この
細胞系統は、１９８８年６月２日に、ブダペスト条約の
条件に従い、Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃｏｌ１ｅｃｔｉｏｎ
ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅ１ｌ Ｃｕｌ四ｅａ（ＥＣ
ＡＣＣ）、ＰＨＬ８ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ａｐｐｌ
ｉｅｃｌ Ｍｉｃｒｏｔ＋ｉｏ−１ｏｇｙ ａｎｄ Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ、 Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ、 ８ａｌ
ｉａｂｕｒｙ。
好ましい。免疫応答は、たとえば４〜８週の間隔で、反
復ブースター注射することによって増強される。免疫感
作の成否は、放射能結合検定で抗体の濃度を測定するこ
とによってチエツクされる（Ｒ，Ｔｉｍｐｌ ＆ Ｌ、
Ｒ１５ｔｅｌｉ：工ｍｍｕｎｏｃｈｅ−ｍｉｓｔｒｙ
ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒ
ｉｘ、 Ｈ，Ｆｕｒ−ｔｈｍａ７ｒ編、第１巻、１９９
頁（ｂ９８２））。 リンパ球細胞とミエローマ細胞系
統（ＩＩＩｙｅｘｏｍａ ｃｅｘｘ １ｉｎｅ）との融
合の何日か前に、動物を、アジュバントを使用せすにプ
ロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ型）で処理する。リンパ
球細胞は動物から採取し、ミエローマ細胞系統と融合さ
せる。このミエローマ細胞も同様に上述の動物種のひと
つに出来するものを使用できるが、マウス起源のものが
好ましく、とくに細胞系統Ｐ３Ｘ６３ＡＧ８ 、６５３
と融合させる。同じ種のリンパ球細胞とミエローマ細胞
系統を融合させるのが有利である。融合およびその後の
細胞クローンの培養は、当業者によく知られた方法で行
われ、特異的抗体の濃度は細胞培養液からの上清につい
て、免疫学的結合検定を用いて測定される。この過程か
ら誘導される細胞クローンから、工ＲＭＡに使用するた
め、ひとつのクローンを選択する。マウスミエローマ細
胞系統Ｐ３Ｘ６３ＡＧａ６５３と、プロコラーゲンペプ
チド（ＩＩＩＪ）で予め免疫感作したＳ、ＴＬ株ママウ
スらのリンパ球細胞との融合によって製造され、第２図
に示すような反応ノぞタンを有するモノクローナル抗体
を産生ずる細胞系統を用いるのがとくに好ましい。この
細胞系統は、１９８８年６月２日に、ブダペスト条約の
条件に従い、Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃｏｌ１ｅｃｔｉｏｎ
ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅ１ｌ Ｃｕｌ四ｅａ（ＥＣ
ＡＣＣ）、ＰＨＬ８ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ａｐｐｌ
ｉｅｃｌ Ｍｉｃｒｏｔ＋ｉｏ−１ｏｇｙ ａｎｄ Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ、 Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ、 ８ａｌ
ｉａｂｕｒｙ。
８Ｐ４０ＪＧ、 Ｄ、に、に第８８０ｉ２０２号として
寄託された。
寄託された。
本発明によるモノクローナル抗体は工ｇＧ、■ｇＭおよ
び工ｇムタンパク質クラスに属する。ＸｇＧクラス、と
くに工ｇＧ２ｂサブクラスの抗体はとくに有利に使用で
きる。細胞系統ＩＣＡＣＣ８８０３０２０２から得られ
るモノクローナル抗体ＰＩＰ ２２６を用い、血清中に
存在する抗原をゲルー過クロマトグラフィーによって分
子量に応じて分画し、このクロマトグラフィーから分画
な放射免疫検定に用いた場合のモノクローナル抗体の性
質を例示する。第２図は、モノクローナル抗体ＰＩｌｌ
Ｐ２２６によって示されるゲル濾過クロマトグラフィー
溶出像を、ポリクローナル抗体が示す溶出像と比較して
表した図であるっ ピーク１／１ａは完全プロコラーゲ
ン（ＩＩＩ型）およびｐＮ−コラーゲン（ＩＩＩ型）に
相当する。ピークＶ２ａは完全アミノ末端プロコラーゲ
ンペプチド（ＩＩＩ型）およびその類似サイズの分解生
成物に相当する。ピーク３ａは、クロマトグラムにおい
てプロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ型）より小さいがｃ
ｏｌｌよ勺明らかに大ぎいピークを生じるプロコラーゲ
ンペプチド（ＩＩＩ温）の分解生成物を示す。すなわち
、各分解生成物の分子量は約４５．［］００（プロコラ
ーゲンペプチド）と約１へ０００ （ｃｏｘ １ ）の
間にある。ピーク４／４ａはｃａｌ １プラスアミノ末
端プロコラーダンはプチド（ＩＩＩ型）のｃｏ１１ト同
じ分子量の分解生成物に相当する。ポリクローナル抗体
での分析でも検出され、ｃｏｌｌの分解生成物の分子量
をもつ抗原分画またはｃｏｌｌである抗原分画は、本発
明のモノクローナル抗体でははるかに弱くしか検出され
ないことが明らかである。したがって、本発明のモノク
ローナル抗体は、ｃｏｌｌ中には存在しないアミノ末端
プロコラーゲンはブチド（ＩＩＩ型）のエピドープに対
する特異的な作用を有する。さらに、ピーク２にポリク
ローナル抗体によって検出される抗原のい（つかは抗体
ＰＩＩＩＰ ２２６によって認識されず、その結果、抗
体ＰＩＩＩＰ ２２６ではビーク２の位置に２つのピー
ク（２ａおよび３ａ）が明らかである。ビーク３ａは同
様に、ドイツ特許出願に提案されている抗体Ｐ［ｌｌＰ
２９６を用いては見出されない。
び工ｇムタンパク質クラスに属する。ＸｇＧクラス、と
くに工ｇＧ２ｂサブクラスの抗体はとくに有利に使用で
きる。細胞系統ＩＣＡＣＣ８８０３０２０２から得られ
るモノクローナル抗体ＰＩＰ ２２６を用い、血清中に
存在する抗原をゲルー過クロマトグラフィーによって分
子量に応じて分画し、このクロマトグラフィーから分画
な放射免疫検定に用いた場合のモノクローナル抗体の性
質を例示する。第２図は、モノクローナル抗体ＰＩｌｌ
Ｐ２２６によって示されるゲル濾過クロマトグラフィー
溶出像を、ポリクローナル抗体が示す溶出像と比較して
表した図であるっ ピーク１／１ａは完全プロコラーゲ
ン（ＩＩＩ型）およびｐＮ−コラーゲン（ＩＩＩ型）に
相当する。ピークＶ２ａは完全アミノ末端プロコラーゲ
ンペプチド（ＩＩＩ型）およびその類似サイズの分解生
成物に相当する。ピーク３ａは、クロマトグラムにおい
てプロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ型）より小さいがｃ
ｏｌｌよ勺明らかに大ぎいピークを生じるプロコラーゲ
ンペプチド（ＩＩＩ温）の分解生成物を示す。すなわち
、各分解生成物の分子量は約４５．［］００（プロコラ
ーゲンペプチド）と約１へ０００ （ｃｏｘ １ ）の
間にある。ピーク４／４ａはｃａｌ １プラスアミノ末
端プロコラーダンはプチド（ＩＩＩ型）のｃｏ１１ト同
じ分子量の分解生成物に相当する。ポリクローナル抗体
での分析でも検出され、ｃｏｌｌの分解生成物の分子量
をもつ抗原分画またはｃｏｌｌである抗原分画は、本発
明のモノクローナル抗体でははるかに弱くしか検出され
ないことが明らかである。したがって、本発明のモノク
ローナル抗体は、ｃｏｌｌ中には存在しないアミノ末端
プロコラーゲンはブチド（ＩＩＩ型）のエピドープに対
する特異的な作用を有する。さらに、ピーク２にポリク
ローナル抗体によって検出される抗原のい（つかは抗体
ＰＩＩＩＰ ２２６によって認識されず、その結果、抗
体ＰＩＩＩＰ ２２６ではビーク２の位置に２つのピー
ク（２ａおよび３ａ）が明らかである。ビーク３ａは同
様に、ドイツ特許出願に提案されている抗体Ｐ［ｌｌＰ
２９６を用いては見出されない。
本発明の抗体の製造に際しては、抗原を得るのに適当な
原料の入手が重要である。既述のように、ヒトまたは動
物の高度に精製されたプロコラ−ダンペプチド（ＩＩＩ
型）は、関連組織または病的体液をコラ−ゲナーゼで分
解し、反応溶液からプロコラーゲンペプチドを取出し、
クロマトグラフィー法および／または免疫吸着の組合せ
によって精製するヨーロッパ特許第４，９４０号によっ
て有利に単離される。
原料の入手が重要である。既述のように、ヒトまたは動
物の高度に精製されたプロコラ−ダンペプチド（ＩＩＩ
型）は、関連組織または病的体液をコラ−ゲナーゼで分
解し、反応溶液からプロコラーゲンペプチドを取出し、
クロマトグラフィー法および／または免疫吸着の組合せ
によって精製するヨーロッパ特許第４，９４０号によっ
て有利に単離される。
本発明のモノクローナル抗体は、すべての言類の放射免
疫測定法たとえば連続飽和分析もしくは平衡分析、なら
びに他の競合的および非結合的結合検定たとえば螢光、
酵素、化学発光もしくは他の免疫検定を包含する様々の
免疫学的方法に使用することができる。とくに免疫吸着
検定においてサンドインチ法に使用するのに適している
。すなわち１本発明のモノクローナル抗体は、組織また
は体液中のプロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ型）の単離
および特性づけ、ならびに定量的測定のための免疫学的
方法に使用することができる。使用される方法はそれ自
体は当業者によく知られた方法であシ、プロコラーゲン
にブチド＜ｍｍ）を含有する液体サンプルを、好ましく
はプラスチック材料から構成される固体マトリックスと
（にプラスチック試験管に結合させた本発明のモノクロ
ーナル抗体と反応させ、ついで放射性または他のトレー
サーを付与されたポリクローナルまたは第２のモノクロ
ーナル抗体好ましくはヨーロッパ特許出願用２８９、９
３０号に提案されているモノクローナル抗体の結合によ
シプロコラーゲンはブチド（ｂ１［屋）の量を測定する
のが有利である。この方法はまた、ポリクローナル抗体
またはモノクローナル抗体とくにヨーロッパ特許出願用
２８９，９３０号に提案されているモノクローナル抗体
を固体マトリックスに結合させて抗原と反応させ、この
抗原をついで標識された本発明の抗体の結合で定量的に
測定することによっても実施できる。
疫測定法たとえば連続飽和分析もしくは平衡分析、なら
びに他の競合的および非結合的結合検定たとえば螢光、
酵素、化学発光もしくは他の免疫検定を包含する様々の
免疫学的方法に使用することができる。とくに免疫吸着
検定においてサンドインチ法に使用するのに適している
。すなわち１本発明のモノクローナル抗体は、組織また
は体液中のプロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ型）の単離
および特性づけ、ならびに定量的測定のための免疫学的
方法に使用することができる。使用される方法はそれ自
体は当業者によく知られた方法であシ、プロコラーゲン
にブチド＜ｍｍ）を含有する液体サンプルを、好ましく
はプラスチック材料から構成される固体マトリックスと
（にプラスチック試験管に結合させた本発明のモノクロ
ーナル抗体と反応させ、ついで放射性または他のトレー
サーを付与されたポリクローナルまたは第２のモノクロ
ーナル抗体好ましくはヨーロッパ特許出願用２８９、９
３０号に提案されているモノクローナル抗体の結合によ
シプロコラーゲンはブチド（ｂ１［屋）の量を測定する
のが有利である。この方法はまた、ポリクローナル抗体
またはモノクローナル抗体とくにヨーロッパ特許出願用
２８９，９３０号に提案されているモノクローナル抗体
を固体マトリックスに結合させて抗原と反応させ、この
抗原をついで標識された本発明の抗体の結合で定量的に
測定することによっても実施できる。
これらの方法では、プロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ型
）がプロコラーゲン＜ ｍｍ＞のアミノ末端にまだ連結
しているかどうかは重要でない。
）がプロコラーゲン＜ ｍｍ＞のアミノ末端にまだ連結
しているかどうかは重要でない。
ポリクローナル抗体を用いる免疫学的測定では従来妨害
となっていたプロコラーゲンペプチド（ＩＩＩＷ）の分
解生成物とくにｃｏｌｌは上述の検定システムでは検出
されない。
となっていたプロコラーゲンペプチド（ＩＩＩＷ）の分
解生成物とくにｃｏｌｌは上述の検定システムでは検出
されない。
ヨーロッパ特許出願用２８９．９３０号に提案されてい
るモノクローナル抗体は、完全プロコラーゲン（ＩＩＩ
型）およびｐＮ−コラーゲン（ｃ末端プロペプチドを欠
くプロコラーゲン、ビーク４ａ）。
るモノクローナル抗体は、完全プロコラーゲン（ＩＩＩ
型）およびｐＮ−コラーゲン（ｃ末端プロペプチドを欠
くプロコラーゲン、ビーク４ａ）。
完全７ミノ末端プロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ型）（
ピーク５ａ）、ならびにＣＯＩ １およびｃｏｌｌと同
じ分子址をもつアミノ末端プロコラーゲンペプチド（Ｉ
ＩＩ型）の分解生成物（ピーク６ａ）に対して第５図に
抽かれた反応パタンを示す。
ピーク５ａ）、ならびにＣＯＩ １およびｃｏｌｌと同
じ分子址をもつアミノ末端プロコラーゲンペプチド（Ｉ
ＩＩ型）の分解生成物（ピーク６ａ）に対して第５図に
抽かれた反応パタンを示す。
このモノクローナル抗体の製造操作は上述の操作とほぼ
同じである。マウスミエローマ細胞系統Ｐ３Ｘ６３ＡＧ
＆ ６５５と、プロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ型）で
免疫感作した８、７ｔ株マウスからのリンパ球細胞との
融合によって製造された細胞系統の使用がとくに好まし
い。この細胞系統は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃｏｌ１ｅｃ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌ Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅｓ（ｊｃｃＡｃＣ） 、 ＰＨＬＳ ｃｅｎｔｒｅ
ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ−１ｏｇｙ
ａｎｄ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗ
ｎ、 ５ａｌｉｓｂｕｒｙ。
同じである。マウスミエローマ細胞系統Ｐ３Ｘ６３ＡＧ
＆ ６５５と、プロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ型）で
免疫感作した８、７ｔ株マウスからのリンパ球細胞との
融合によって製造された細胞系統の使用がとくに好まし
い。この細胞系統は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃｏｌ１ｅｃ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌ Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅｓ（ｊｃｃＡｃＣ） 、 ＰＨＬＳ ｃｅｎｔｒｅ
ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ−１ｏｇｙ
ａｎｄ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗ
ｎ、 ５ａｌｉｓｂｕｒｙ。
ＳＦ３０ＪＧ、σ、に、に第８７０４２３０８号として
寄託されている。
寄託されている。
本発明を以下の実施例によシさらに説明する。
とくに指示がない限シ、百分率の数値は重量に基づくも
のである。
のである。
実施例 １
プロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ型）の製造プロコラー
ゲンペプチド（ＩＩＩ型）はプロコラーゲン（ＩＩＩ型
）に３７℃でコラ−ゲナーゼを作用させて製造される。
ゲンペプチド（ＩＩＩ型）はプロコラーゲン（ＩＩＩ型
）に３７℃でコラ−ゲナーゼを作用させて製造される。
この間、ペプチドを変性剤に曝すことはしない。大量の
ペプチドを製造するためには改良方法を使用する。コラ
−ゲナーゼを作用させるまでの全工程は冷却室内で行う
。可溶化に用いられるＮａＣ２溶液はｌ１０５Ｍトリス
塩酸塩、ｐＨ７，４，αＯＩＭＥＤ’ｒＡ、ナトリウム
アジド（２００η／−）ならびにプロテアーゼ阻害剤、
フェニルメチルスルホニルフルオライド（５μＩ／−）
およびｐ−クロロメルクリ安息香酸（５μＶｍｌ ）を
含有する。
ペプチドを製造するためには改良方法を使用する。コラ
−ゲナーゼを作用させるまでの全工程は冷却室内で行う
。可溶化に用いられるＮａＣ２溶液はｌ１０５Ｍトリス
塩酸塩、ｐＨ７，４，αＯＩＭＥＤ’ｒＡ、ナトリウム
アジド（２００η／−）ならびにプロテアーゼ阻害剤、
フェニルメチルスルホニルフルオライド（５μＩ／−）
およびｐ−クロロメルクリ安息香酸（５μＶｍｌ ）を
含有する。
ウシ胎児皮膚Ｃ３Ｋｐ）を、Ｉ Ｍ ＮａＣｔｌ ０
を中で２日間ホモジナイズし、抽出する。溶解したコラ
ーゲンを抽出溶液から、最終濃度が２．５Ｍになるよう
に固体ＮａＣｔを加えて沈殿させる。沈殿を一夜攪拌し
たのち、遠心分離して（ｂ８００Ｘ＃。
を中で２日間ホモジナイズし、抽出する。溶解したコラ
ーゲンを抽出溶液から、最終濃度が２．５Ｍになるよう
に固体ＮａＣｔを加えて沈殿させる。沈殿を一夜攪拌し
たのち、遠心分離して（ｂ８００Ｘ＃。
２０分）集め、２．５ Ｍ ＮａＣ１で２回洗浄し、ａ
５ＭＮａＣｔ１０Ａ中で一夜攪拌して再溶解する。少量
の不溶物質を遠心分離にょシ除去する。この方法で得ら
れたコラーゲン（Ｉｎ）およびプロコラーゲン（ＩＩＩ
型）の混合物は１６ ＭＮａＣｔで沈殿する。沈殿をつ
いでｃＬ０５Ｍトリス塩酸塩（ｐＨａＯ）２Ａ中に懸濁
し、 ［１０２Ｍ Ｃ’ａＣｊ２を加えたのち、５０℃
に２０分間加熱し、ついで湿った沈殿１１あたシフ５０
０［７の細菌性コラ−ゲナーゼとともに３７℃で３時間
インキュベートする。
５ＭＮａＣｔ１０Ａ中で一夜攪拌して再溶解する。少量
の不溶物質を遠心分離にょシ除去する。この方法で得ら
れたコラーゲン（Ｉｎ）およびプロコラーゲン（ＩＩＩ
型）の混合物は１６ ＭＮａＣｔで沈殿する。沈殿をつ
いでｃＬ０５Ｍトリス塩酸塩（ｐＨａＯ）２Ａ中に懸濁
し、 ［１０２Ｍ Ｃ’ａＣｊ２を加えたのち、５０℃
に２０分間加熱し、ついで湿った沈殿１１あたシフ５０
０［７の細菌性コラ−ゲナーゼとともに３７℃で３時間
インキュベートする。
コラーゲンを作用させたのち、生成した沈殿を遠心分離
で除き、溶液を（ＬＯＯ５ＭトＩＪスー塩酸塩、ｐＨａ
ｏ、６．８Ｍｗ累で透析し、同じ緩衝液で予め平衡化し
たＤＫＡＥ−セルロースカラム（５，。
で除き、溶液を（ＬＯＯ５ＭトＩＪスー塩酸塩、ｐＨａ
ｏ、６．８Ｍｗ累で透析し、同じ緩衝液で予め平衡化し
たＤＫＡＥ−セルロースカラム（５，。
ｘ ３０ ｃｍ ）を通過させる。
カラムに結合したタンパク質を、 ＮａＣ１溶液でその
濃度を０からＣＬ３Ｍに上昇させて洗い出す。
濃度を０からＣＬ３Ｍに上昇させて洗い出す。
溶出する総量は２ｔである。カラムから流出した溶液に
ついて、２３６ｎｍの吸収と、プロコラーゲン（ＩＩＩ
型）のアミノ末端セグメントに対して特異的な抗体を用
いてその抗原活性を調べる。
ついて、２３６ｎｍの吸収と、プロコラーゲン（ＩＩＩ
型）のアミノ末端セグメントに対して特異的な抗体を用
いてその抗原活性を調べる。
通常、プロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ型）を含有する
のｉカラムから溶出する最終ピークである。
のｉカラムから溶出する最終ピークである。
蒸留水で透析してペプチドから塩を除去し、凍結乾燥す
る。次の精製は、アガロースＡ １．５ Ｍを含有する
カラム（２Ｘ １２０ｃｎｔ） （Ｅｉｏｒａｄから入
手）をＩ Ｍ ＣａＣｌ２．１１０５Ｍ ｌ−リス塩酸
塩、≠Ｚ５で平衡化して実施する。
る。次の精製は、アガロースＡ １．５ Ｍを含有する
カラム（２Ｘ １２０ｃｎｔ） （Ｅｉｏｒａｄから入
手）をＩ Ｍ ＣａＣｌ２．１１０５Ｍ ｌ−リス塩酸
塩、≠Ｚ５で平衡化して実施する。
実施例 ２
ハイブリドーマの製造
Ｅｌ、ＴＬ株のマウスに１例１のようにして得られたプ
ロコラーゲンペプチド（Ｉｌｌ型）５μＩを完全７算イ
ンドアジユバントの存在下に筋肉内注射して免疫感作す
る。免疫応答はさらにプロコラーケ゛ンベブチド（ＩＩ
Ｉｍ）ｓμ９を不完全フロインドアジュバントの存在下
、４週後および５力月後に筋肉内注射することによシ増
強される。融合の３日前にさらに５０μｇのプロコラー
ゲンペプチド（ＩＩＩ型）を注射して免疫応答を増強す
る。
ロコラーゲンペプチド（Ｉｌｌ型）５μＩを完全７算イ
ンドアジユバントの存在下に筋肉内注射して免疫感作す
る。免疫応答はさらにプロコラーケ゛ンベブチド（ＩＩ
Ｉｍ）ｓμ９を不完全フロインドアジュバントの存在下
、４週後および５力月後に筋肉内注射することによシ増
強される。融合の３日前にさらに５０μｇのプロコラー
ゲンペプチド（ＩＩＩ型）を注射して免疫応答を増強す
る。
融合に際しては動物を層殺し、膵臓細胞を単離する。膵
臓細胞をミエローマ細胞系統Ｐ３Ｘ６３ＡＧ８．６５３
と、ポリエチレングリコールの存在下に融合させる（得
られた細胞系統はＥＣＡＣＣに番号８８０３０２０２で
寄託されている）。膵臓細胞ｘＰ３Ｘ６３ａＧ８．６５
３ハイブリッドは、融合混合物をヒボキサンチン／アミ
ノプテリン／チミジン培地中で２週間にわたって培養し
て選択する。生成した細胞クローンを数回サブクローニ
ングするとモノクローナル細胞系が得られる。生成した
細胞コロニーの上清について、抗体の産生な放射免疫結
合検定法で検定する。この方法で二元性モノクローナル
抗体ＰｍＰ ２２６が得られる。
臓細胞をミエローマ細胞系統Ｐ３Ｘ６３ＡＧ８．６５３
と、ポリエチレングリコールの存在下に融合させる（得
られた細胞系統はＥＣＡＣＣに番号８８０３０２０２で
寄託されている）。膵臓細胞ｘＰ３Ｘ６３ａＧ８．６５
３ハイブリッドは、融合混合物をヒボキサンチン／アミ
ノプテリン／チミジン培地中で２週間にわたって培養し
て選択する。生成した細胞クローンを数回サブクローニ
ングするとモノクローナル細胞系が得られる。生成した
細胞コロニーの上清について、抗体の産生な放射免疫結
合検定法で検定する。この方法で二元性モノクローナル
抗体ＰｍＰ ２２６が得られる。
実施例 ３
放射免疫結合検定法
５００μｔの細胞培養上清、またはたとえばマウスの腹
腔内でハイブリドーマ細胞を培養したのちの腹水のよう
な他のサンプルを、１２５エープロコラーケ゛ンはプチ
ド（ｎｔ型）溶液（タンパク質１ ｎＪｉ’／１００μ
ｔ、ＦＰ４，９４０の例１に記載されているようにして
調製）１００μｔと一夜インキユベートする。生成した
抗原−抗体複合体を、ヒツジまたは他の種からの抗−マ
ウスエｇＧ血清を加えて沈殿させる。遠心分離し、上清
をデカンテーションで除去し、ついで沈殿した放射能量
をガンマシンチレーションスはクトロメーターで測定す
る。
腔内でハイブリドーマ細胞を培養したのちの腹水のよう
な他のサンプルを、１２５エープロコラーケ゛ンはプチ
ド（ｎｔ型）溶液（タンパク質１ ｎＪｉ’／１００μ
ｔ、ＦＰ４，９４０の例１に記載されているようにして
調製）１００μｔと一夜インキユベートする。生成した
抗原−抗体複合体を、ヒツジまたは他の種からの抗−マ
ウスエｇＧ血清を加えて沈殿させる。遠心分離し、上清
をデカンテーションで除去し、ついで沈殿した放射能量
をガンマシンチレーションスはクトロメーターで測定す
る。
実施例 ４
抗体の放射性標識
ドイツ特許出願ｐ５，７１ａ、６５１５の例２に記載さ
れたようにして得られた七ツクローナル抗体ＰＩＩ［Ｐ
２９６または他の抗体α２ｇｑを（ｂ０５Ｍリン酸緩
衝液ｐＨ７，４中に含有する溶液ＣＬ２−をポリスチレ
ン検定管（ｂ２Ｘ５５ｍｍ）に取、９，１０μ／！、の
ＣＬ５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，４で緩衝化した１ ００
ＭＢｑのＮ、１２５工溶液を加える。２０μ９のクロ
ラミンＴの水溶液５０μｔを加え、１分間混合する。つ
いで２０μ９の亜硫酸ナトリウム水溶液５０μｔを加え
てヨード化反応を停止させる。次に、陰イオン交換樹脂
上クロマトグラフィーに付して、未反応Ｎ、１２５Ｉを
１２５ニ一標識抗体から除去する。
れたようにして得られた七ツクローナル抗体ＰＩＩ［Ｐ
２９６または他の抗体α２ｇｑを（ｂ０５Ｍリン酸緩
衝液ｐＨ７，４中に含有する溶液ＣＬ２−をポリスチレ
ン検定管（ｂ２Ｘ５５ｍｍ）に取、９，１０μ／！、の
ＣＬ５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，４で緩衝化した１ ００
ＭＢｑのＮ、１２５工溶液を加える。２０μ９のクロ
ラミンＴの水溶液５０μｔを加え、１分間混合する。つ
いで２０μ９の亜硫酸ナトリウム水溶液５０μｔを加え
てヨード化反応を停止させる。次に、陰イオン交換樹脂
上クロマトグラフィーに付して、未反応Ｎ、１２５Ｉを
１２５ニ一標識抗体から除去する。
精！！！１１２５ニー標識抗体を含むクロマトグラフィ
ー分画を、１ｔの［１０５Ｍ）リス塩酸塩、−ａＯ中に
２０９のツイーン２０および１４．６ｇのＮａ２ＥＤ′
ｒＡを溶解した液で希釈して標識抗体の濃度が２００μ
ｍ１／ｌになるようにする。
ー分画を、１ｔの［１０５Ｍ）リス塩酸塩、−ａＯ中に
２０９のツイーン２０および１４．６ｇのＮａ２ＥＤ′
ｒＡを溶解した液で希釈して標識抗体の濃度が２００μ
ｍ１／ｌになるようにする。
実施例 ５
検定管の抗体によるコーティング
抗体をポリスチレン検定管（ｂ２ｘ７５麿）に固定化す
るには、（ＬＯＩＭリン酸ナトリウム緩衝液。
るには、（ＬＯＩＭリン酸ナトリウム緩衝液。
ｐ！（６，４中４η／ｌの抗体たとえばＰＩＩＩＰ ２
２６の溶液３００μｔを各検定管に取υ、室温で一夜イ
ンキユベートする。ついで吸引して抗体溶液を除去し、
α０５Ｍトリス−クエン酸塩、 ｐ［１７，５中つシ血
清アルブミン１％濃度溶液５００μｔを各検定管に加え
る。室温で一夜インキュベーション後、溶液を吸引して
除去する。抗体でコーティングされた検定管をシリカゲ
ルで乾燥させる。
２６の溶液３００μｔを各検定管に取υ、室温で一夜イ
ンキユベートする。ついで吸引して抗体溶液を除去し、
α０５Ｍトリス−クエン酸塩、 ｐ［１７，５中つシ血
清アルブミン１％濃度溶液５００μｔを各検定管に加え
る。室温で一夜インキュベーション後、溶液を吸引して
除去する。抗体でコーティングされた検定管をシリカゲ
ルで乾燥させる。
実施例 ６
イムノラジオメトリックアッセイ（ラジオイムノメトリ
ックアツセー、工ＲＭＡ ） 分析用サンプルまたはプロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ
型）標準液ＣＬＩＭｔを、実施例５に記載したようにし
てモノクローナル抗体ＰＩＩＩＰ ２２６でコーティン
グしたポリスチレン検定管中で、リン酸緩衝食塩水（Ｐ
ＢＸ） ｌ １−とともに、室温で２時間インキュベー
トする。次に検定管を各回１−のＰＢ８で２回洗浄する
。ついで２００μｔの１２５ニ一標識抗体ｐｍｐ２９６
（−抗体４０ ｎｇ）または他の抗原を検定管に取シ、
室温で２時間インキュベートする。検定管壁に結合した
抗体−抗原−１２５ニ一抗体複合体の放射能は、各回１
−のＰＢＸ３で２回洗浄しついでデカンテーションした
のちガンマシンチレーションスペクトロメーターで測定
する。
ックアツセー、工ＲＭＡ ） 分析用サンプルまたはプロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ
型）標準液ＣＬＩＭｔを、実施例５に記載したようにし
てモノクローナル抗体ＰＩＩＩＰ ２２６でコーティン
グしたポリスチレン検定管中で、リン酸緩衝食塩水（Ｐ
ＢＸ） ｌ １−とともに、室温で２時間インキュベー
トする。次に検定管を各回１−のＰＢ８で２回洗浄する
。ついで２００μｔの１２５ニ一標識抗体ｐｍｐ２９６
（−抗体４０ ｎｇ）または他の抗原を検定管に取シ、
室温で２時間インキュベートする。検定管壁に結合した
抗体−抗原−１２５ニ一抗体複合体の放射能は、各回１
−のＰＢＸ３で２回洗浄しついでデカンテーションした
のちガンマシンチレーションスペクトロメーターで測定
する。
次に異なる量のプロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ型）を
含む標準液を用いて作成した検量プロットと比較するこ
とによシ未知サンプル溶液中のプロコラーゲンペプチド
（ＩＩＩ型）の濃度の計算が可能になる。第１図にはイ
ムノラジオメトリックアッセイの検量プロットを示す（
Ｂ／々は結合放射能と使用した総放射能の比を意味する
）。
含む標準液を用いて作成した検量プロットと比較するこ
とによシ未知サンプル溶液中のプロコラーゲンペプチド
（ＩＩＩ型）の濃度の計算が可能になる。第１図にはイ
ムノラジオメトリックアッセイの検量プロットを示す（
Ｂ／々は結合放射能と使用した総放射能の比を意味する
）。
実施例 ７
ＰｌｎＰ ２２６と反応するヒト血清中の抗原の分子量
分布の測定 血清１−を、１１０４％の非イオン界面活性剤たとえば
ポリエトキシ化ンルビタンモノラクレート（ツイーン２
０）を含有するＰＢＥＩで平衡化したＮ、Ｎ’−メチレ
ンビスアクリルアミド架橋アリルデキストラン上〔セフ
ァクリル■５３００カラム（ｂ，６ｘ１５０ｃｒ１Ｍ）
）ゲル濾過クロマトグラフィーによって分画する。各［
１Ｌ２ｒｎｔの分画を個々に、検討すべき抗体の標識抗
原量に関して制限される量（緩衝液α１ゴ中）およびα
１−の１２５ニー標識プロコ２−ダンはプチド（ＩＩＩ
凰） （ｂｎｇのタンパク質を含む）と％ ４℃で一夜
インキユベートする。次に、予め検定した量のヒツジか
らの抗−マウスＩｇＧ血清と１０俤ポリエチレングリコ
ール（ｐｘｏ６０００）の存在下に１時間インキュベー
トする。沈殿した抗原−抗体複合体を遠心分離しく１５
００Ｘ＆）、デカンテーションしたのチ、カンマシンチ
レーションスヘクトロメーター中で放射能を測定する７
ついで、異なる量のプロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ型
）を含む標準溶液を用いて作成した検量プロットと比較
することによシ、使用した抗体と反応する抗原のクロマ
トグラフィー分画中の濃度測定することが可能である。
分布の測定 血清１−を、１１０４％の非イオン界面活性剤たとえば
ポリエトキシ化ンルビタンモノラクレート（ツイーン２
０）を含有するＰＢＥＩで平衡化したＮ、Ｎ’−メチレ
ンビスアクリルアミド架橋アリルデキストラン上〔セフ
ァクリル■５３００カラム（ｂ，６ｘ１５０ｃｒ１Ｍ）
）ゲル濾過クロマトグラフィーによって分画する。各［
１Ｌ２ｒｎｔの分画を個々に、検討すべき抗体の標識抗
原量に関して制限される量（緩衝液α１ゴ中）およびα
１−の１２５ニー標識プロコ２−ダンはプチド（ＩＩＩ
凰） （ｂｎｇのタンパク質を含む）と％ ４℃で一夜
インキユベートする。次に、予め検定した量のヒツジか
らの抗−マウスＩｇＧ血清と１０俤ポリエチレングリコ
ール（ｐｘｏ６０００）の存在下に１時間インキュベー
トする。沈殿した抗原−抗体複合体を遠心分離しく１５
００Ｘ＆）、デカンテーションしたのチ、カンマシンチ
レーションスヘクトロメーター中で放射能を測定する７
ついで、異なる量のプロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ型
）を含む標準溶液を用いて作成した検量プロットと比較
することによシ、使用した抗体と反応する抗原のクロマ
トグラフィー分画中の濃度測定することが可能である。
第２図にＰＩＩＩＰ ２２６を用いて測定される抗原の
溶出像を、ポリクローナル抗体を用いて測定される抗原
の溶出像と比較して示す。
溶出像を、ポリクローナル抗体を用いて測定される抗原
の溶出像と比較して示す。
第１図は本発明の定量方法に用いられるＰＩＩＩＰを含
む標準液で作成した検量曲線の例である。 第２図および第５図はそれぞれ、モノクローナル抗体Ｐ
ｌｕＰ ２２６およびＰＩＩＩＰ ２９６の反応パタン
をポリクローナル抗体のそれと比較した図である。 外２名
む標準液で作成した検量曲線の例である。 第２図および第５図はそれぞれ、モノクローナル抗体Ｐ
ｌｕＰ ２２６およびＰＩＩＩＰ ２９６の反応パタン
をポリクローナル抗体のそれと比較した図である。 外２名
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）完全プロコラーゲン（III型）およびｐＮ−コラー
ゲン（ピーク１ａ）、完全アミノ末端プロコラーゲンペ
プチド（III型）（ピーク２ａ）、分子量がアミノ末端
プロコラーゲンペプチド（III型）の分子量とｃｏｌ１
の分子量の間にあるアミノ末端プロコラーゲンペプチド
（III型）の分解生成物（ピーク３ａ）、ならびにｃｏ
ｌ１およびｃｏｌ１と同じ分子量をもつアミノ末端プロ
コラーゲンペプチド（III型）の分解生成物（ピーク４
ａ）に対して第２図に描かれた反応パタンを有するモノ
クローナル抗体。 ２）ｃｏｌ１には存在しないアミノ末端プロコラーゲン
ペプチド（III型）のエピドープに対して特異的活性を
有する請求項１に記載のモノクローナル抗体。 ３）ＩｇＧクラスに属する請求項１または２に記載のモ
ノクローナル抗体。 ４）ミエローマ系の細胞と予めアミノ末端プロコラーゲ
ンペプチド（III型）で免疫感作された動物からのリン
パ球細胞との細胞融合によつて生成するハイブリドーマ
によつて形成される請求項１から３までの１以上に記載
のモノクローナル抗体。 ５）ハイブリドーマ細胞系統ＥＣＡＣＣ８８０３０２０
２のモノクローナル抗体ＰIIIＰ２２６。 ６）ミエローマ細胞系統からの細胞と、予めプロコラー
ゲンペプチド（III型）で免疫感作した動物からのリン
パ球細胞との細胞融合によつて形成された、請求項１か
ら５までのいずれかに記載の抗体を産生するハイブリド
ーマ細胞系統。 ７）ハイブリドーマ細胞系統ＥＣＡＣＣ８８０３０２０
２。 ８）（ａ）動物をアミノ末端プロコラーゲンペプチド（
III型）で免疫感作し、（ｂ）リンパ球細胞を採取して
ミエローマ細胞と融合させ、（ｃ）請求項１から３まで
のひとつに指示した性質を有する抗体の存在によつてハ
イブリドーマを選択してクローン化し、（ｄ）このクロ
ーンから抗体を得ることからなる請求項１から５までの
１以上に記載のモノクローナル抗体を製造する方法。 ９）工程（ｄ）の実施にはハイブリドーマ細胞系統ＥＣ
ＡＣＣ８８０３０２０２を使用する請求項８に記載の方
法。 １０）（ａ）アミノ末端プロコラーゲンペプチド（III
型）またはプロコラーゲン（III型）を含有する液体サ
ンプルを請求項１から５までの１以上に記載のモノクロ
ーナル抗体と反応させ、（２）アミノ末端プロコラーゲ
ンペプチド（III型）またはプロコラーゲン（III型）の
量を生成した抗原−抗体複合体を介して測定することか
らなる抗体を用いるプロコラーゲンペプチド（III型）
の免疫学的定量方法。 １１）（ａ）請求項１から５までの１以上に記載のモノ
クローナル抗体を固体マトリックスにカップリングさせ
、（ｂ）アミノ末端プロコラーゲンペプチド（III型）
またはプロコラーゲン（III型）を含有する液体サンプ
ルを上記抗体と反応させ、（ｃ）結合した抗原を、プロ
コラーゲンペプチド（III型）またはプロコラーゲン（
III型）に対する特異性を有する標識モノクローナルま
たはポリクローナル抗体によつて検出することからなる
抗体を用いるプロコラーゲンペプチド（III型）の免疫
学的定量方法。 １２）プロコラーゲンペプチド（III型）および／また
はプロコラーゲン（III型）に対する特異性を有するポ
リクローナルまたはモノクローナル抗体を工程（ａ）に
使用し、請求項１から５までの１以上に記載の標識モノ
クローナル抗体を工程（ｃ）に使用する請求項１１に記
載の方法。 １３）工程（ｂ）に使用するモノクローナル抗体は、完
全プロコラーゲン（III型）およびｐＮ−コラーゲン（
ピーク４ａ）、完全アミノ末端プロコラーゲンペプチド
（III型）（ピーク５ａ）ならびにｃｏｌ１およびｃｏ
ｌ１と同じ分子量をもつアミノ末端プロコラーゲンペプ
チド（III型）の分解生成物（ピーク６ａ）に対して第
５図に抽かれた反応パタンを有する抗体である請求項１
１に記載の方法。 １４）工程（ａ）に使用するモノクローナル抗体は、完
全プロコラーゲン（III型）およびｐＮ−コラーゲン（
ピーク４ａ）、完全アミノ末端プロコラーゲンペプチド
（III型）（ピーク５ａ）ならびにｃｏｌ１およびｃｏ
ｌ１と同じ分子量をもつアミノ末端プロコラーゲンペプ
チド（III型）の分解生成物（ピーク６ａ）に対して第
５図に抽かれた反応パターンを有する抗体である請求項
１２に記載の方法。 １５）使用するモノクローナル抗体はハイブリドーマ細
胞系統ＥＣＡＣＣ８７０４２３０８のＰIIIＰ２９６で
ある請求項１３または１４に記載の方法。 １６）請求項１から５までの１以上に記載のモノクロー
ナル抗体の有効量を、単独または他の抗体と組合せて、
診断的に許容される担体と混合して含有する、体液中の
プロコラーゲンペプチド（III型）の量を確立するため
診断用組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3814216.3 | 1988-04-27 | ||
| DE3814216 | 1988-04-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0213396A true JPH0213396A (ja) | 1990-01-17 |
| JPH07110880B2 JPH07110880B2 (ja) | 1995-11-29 |
Family
ID=6353005
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1104804A Expired - Lifetime JPH07110880B2 (ja) | 1988-04-27 | 1989-04-26 | 選択的免疫学的定量のためのモノクローナル抗体 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0339443B1 (ja) |
| JP (1) | JPH07110880B2 (ja) |
| AT (1) | ATE115963T1 (ja) |
| CA (1) | CA1338324C (ja) |
| DE (1) | DE58908787D1 (ja) |
| DK (1) | DK169571B1 (ja) |
| ES (1) | ES2065350T3 (ja) |
| FI (1) | FI98705C (ja) |
| GR (1) | GR3014957T3 (ja) |
| IE (1) | IE66320B1 (ja) |
| NO (1) | NO179107C (ja) |
| PT (1) | PT90369B (ja) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6010862A (en) * | 1987-11-06 | 2000-01-04 | Washington Research Foundation | Methods of detecting collagen type III degradation in vivo |
| DE4225038C2 (de) * | 1992-07-29 | 1995-11-30 | Boehringer Mannheim Gmbh | Herstellung und Verwendung von Antikörpern gegen Kollagen |
| JP2703116B2 (ja) * | 1993-07-28 | 1998-01-26 | ベーリンガー マンハイム ゲーエムベーハー | コラーゲンまたはコラーゲン断片を検出するためのイムノアッセイ |
| GB9506050D0 (en) | 1995-03-24 | 1995-05-10 | Osteometer A S | Assaying collagen fragments in body fluids |
| AU3746295A (en) | 1994-10-17 | 1996-05-06 | Osteometer Biotech As | Estimation of the fragmentation pattern of collagen in body fluids and the diagnosis of disorders associated with the metabolism of collagen |
| US6107047A (en) * | 1996-03-21 | 2000-08-22 | Osteometer Biotech A/S | Assaying protein fragments in body fluids |
| GB9617616D0 (en) | 1996-08-22 | 1996-10-02 | Osteometer Biotech As | Assaying protein fragments in body fluids |
| EP0944833B1 (en) | 1996-12-09 | 2001-06-27 | Osteometer Biotech AS | Sandwich assays for collagen fragments |
| US6117646A (en) * | 1997-09-22 | 2000-09-12 | Osteometer Biotech A/S | Assaying protein fragments in body fluids |
| PT1086135E (pt) | 1998-05-28 | 2004-07-30 | Bayer Healthcare Ag | Anticorpo monoclonal e analise para a deteccao de piiinp |
| US6602980B1 (en) | 1998-06-19 | 2003-08-05 | Washington Research Foundation | Collagen type III synthetic peptides for collagen resorption assays |
| US6916903B2 (en) | 1998-06-19 | 2005-07-12 | Washington Research Foundation | Collagen type III synthetic peptides for collagen resorption assays |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3209149A1 (de) * | 1982-03-13 | 1983-10-06 | Hoechst Ag | Verfahren zur gemeinsamen immunologischen bestimmung von prokollagen-peptid (typ iii) und prokollagen-peptid col 1 (typ iii) und verfahren zur herstellung von anti-prokollagen-peptid col 1 (typ iii)-serum |
-
1989
- 1989-04-19 EP EP89106970A patent/EP0339443B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-19 ES ES89106970T patent/ES2065350T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-19 AT AT89106970T patent/ATE115963T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-04-19 DE DE58908787T patent/DE58908787D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-25 FI FI891953A patent/FI98705C/fi not_active IP Right Cessation
- 1989-04-26 CA CA000597887A patent/CA1338324C/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-26 NO NO891732A patent/NO179107C/no not_active IP Right Cessation
- 1989-04-26 PT PT90369A patent/PT90369B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-04-26 IE IE137289A patent/IE66320B1/en not_active IP Right Cessation
- 1989-04-26 DK DK202189A patent/DK169571B1/da not_active IP Right Cessation
- 1989-04-26 JP JP1104804A patent/JPH07110880B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-02-03 GR GR950400025T patent/GR3014957T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK202189D0 (da) | 1989-04-26 |
| EP0339443A3 (en) | 1990-05-09 |
| NO179107C (no) | 1996-08-07 |
| NO179107B (no) | 1996-04-29 |
| FI891953A0 (fi) | 1989-04-25 |
| CA1338324C (en) | 1996-05-14 |
| FI98705C (fi) | 1997-08-11 |
| IE66320B1 (en) | 1995-12-27 |
| JPH07110880B2 (ja) | 1995-11-29 |
| EP0339443A2 (de) | 1989-11-02 |
| IE891372L (en) | 1989-10-27 |
| DK169571B1 (da) | 1994-12-05 |
| PT90369A (pt) | 1989-11-10 |
| GR3014957T3 (en) | 1995-05-31 |
| DE58908787D1 (de) | 1995-02-02 |
| EP0339443B1 (de) | 1994-12-21 |
| FI98705B (fi) | 1997-04-30 |
| ATE115963T1 (de) | 1995-01-15 |
| PT90369B (pt) | 1994-08-31 |
| NO891732D0 (no) | 1989-04-26 |
| DK202189A (da) | 1989-10-28 |
| FI891953L (fi) | 1989-10-28 |
| ES2065350T3 (es) | 1995-02-16 |
| NO891732L (no) | 1989-10-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| McClure et al. | Immunochemical studies on thymosin: radioimmunoassay of thymosin alpha1. | |
| JPS63109796A (ja) | 高純度プロコラ−ゲン・ペプチド（３型）の製法 | |
| JPH0588421B2 (ja) | ||
| JPH05184384A (ja) | ｈＢＮＰのＣ端を認識するモノクロ−ナル抗体 | |
| JPH0213396A (ja) | 選択的免疫学的定量のためのモノクローナル抗体 | |
| JP2729159B2 (ja) | ヒトグリセンチンのモノクローナル抗体、この抗体を産生するハイブリドーマおよびそれを用いるヒトグリセンチンの定量法 | |
| FI95579B (fi) | Immunologinen menetelmä intaktin prokollageenipeptidin (tyyppi III) ja prokollageenin (tyyppi III) määrittämiseksi selektiivisesti elimistönesteistä ja väline sen toteuttamiseksi | |
| JP2012082210A (ja) | Ａｄａｍｔｓ１３活性検定用抗体及び活性検定方法 | |
| JP3018110B2 (ja) | モノクローナル抗体 | |
| US5679583A (en) | Monoclonal antibodies for the selective immunological determination of intact procollagen peptide (type III) and procollagen (type III) in body fluids | |
| JPH04507285A (ja) | 抗イディオトープ免疫検定法 | |
| US4610960A (en) | Monoclonal antibody to thrombospondin and method for assaying for and isolating thrombospondin | |
| JP2622260B2 (ja) | Ｉｆｎ−オメガに対する新規モノクローナル抗体、その製造方法、及びｉｆｎ−オメガの精製及び検出におけるその使用 | |
| FI96433C (fi) | Monoklonaalisia vasta-aineita intaktin prokollageenipeptidin (tyyppi III) ja prokollageenin (tyyppi III) selektiivistä, immunologista määritystä varten kehonnesteistä | |
| JPH11151085A (ja) | 抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体、その製造方法及びそれを用いる免疫学的測定方法 | |
| Chandler et al. | Monoclonal hybridoma antibodies against human IgE and their use in a rapid and sensitive enzyme immunoassay for the semiquantitative assessment of total IgE levels in human blood | |
| JPH0677017B2 (ja) | ヒト▲ｉｖ▼型コラーゲンのサンドイツチ酵素免疫学的定量法 | |
| JP2878317B2 (ja) | ラミニン測定試薬 | |
| JPS6284100A (ja) | 扁平上皮癌関連抗原に対する抗体及びその免疫学的利用法 | |
| JPH07117534B2 (ja) | ヒトプロテインｓに対するモノクローナル抗体を用いた免疫学的測定試薬及びキット | |
| JPH11236399A (ja) | モノクローナル抗体 | |
| JPH0785085B2 (ja) | フイブロネクチン測定試薬 | |
| JPH08201385A (ja) | プテリジン化合物の測定方法 | |
| JPH06100599A (ja) | 扁平上皮癌関連抗原及びその免疫学的利用方法 | |
| JPH01131462A (ja) | 慢性関節リウマチ疾患の診断法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20071129 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081129 Year of fee payment: 13 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091129 Year of fee payment: 14 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091129 Year of fee payment: 14 |