JPH02142473A - ストレプトマイセス属および他の微生物から転位因子を単離する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、種々の細胞供給源から転位因子を単離する新
規な方法に関する。

トランスボゾン、挿入配列、または転位バクテリオファ
ージ（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈ
ａｇｅｓ）のような転位因子は、原核細胞および真核細
胞の両者において見いだされる。これらの因子は、ゲノ
ムのほんのわずかまたは多くの異なった部位で挿入する
ことができる。ＤＮＡホモロジ−（ＤＮＡ　ｈｏｍｏｌ
ｏｇｙ）の非存在下であっても、この転位および挿入す
ることができる能力によって、転位因子を有効な遺伝的
手段として利用することができる。このような因子の利
用の例としては、遺伝子マツピング、プロモータープロ
ーブとしての用途、挿入変異の構築、遺伝子間組換えの
仲介、受容菌株のゲノムへの遺伝情報の挿入および特定
の遺伝子の遺伝的標識化が挙げられる。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）従来
、ストレプトマイセス属（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
）由来の転位因子は、プラスミドまたはファージの大き
さが顕著に増大した場合のような偶発的な出来事が起こ
った後にだけ単離されていた。このような出来事は、は
とんどの原核性転位因子（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｔ
ｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ）が１世代
にｉｏ−’から１０＝７の割合で転位するくらい比較的
稀である。

（課題を解決するための手段） 本発明は、科学者がこれらの稀な出来事を選択しかつ同
定することを可能ならしめるものであり、特にストレプ
トマイセス属のような工業的に重要な既知の大きな微生
物群において、有用な転位因子を大規模に単離するため
の容易な体系的な方法を提供するものである。

ストレプトマイセス属における組換えＤＮＡ技術の開発
および展開は、これらの細胞のゲノムに天然（未変性）
ＤＮＡの多数コピー（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｐｉｅｓ
）または外来ＤＮＡを導入するための遺伝的手段の入手
可能性に依存している。この発達は、ストレプトマイセ
ス属において用いるのに現在有用な転位因子が非常に少
数であることによって妨げられている。本発明は、この
ように有用な遺伝的手段に関する迅速かつ体系的な研究
をするのに有用でありかつ特に重要である。異なる因子
は異なる特性をもたらすので、種々の転位因子を単離す
る能力を有していることは重要なことである。転位頻度
、標的部位特異性、および転位機構のようなこれらの異
なる特性によって特定の遺伝子操作に有用な特定因子が
つくられる。本発明方法によってストレプトマイセス属
由来の転位因子の数が増大すると同様に、ストレプトマ
イセス属細胞を都合よく変えることができる能力も増大
するであろう。したかって、本発明は、この商業的に重
要な群において新規で有用な種々の遺伝的手段およびク
ローニングシステムを導入することを提供するものであ
る。これら新規な遺伝的手段によって、これら微生物の
遺伝子操作ならびに代謝経路および遺伝子構造の分析が
なされる。また、新規な転位因子の発見によって、既知
の抗体および他の有用な代謝物の収量を増大させるため
、ならびに新規な抗体および池の新規な代謝誘導体を生
産するための両者のための遺伝子のクローニングが助長
されるであろう。

また、本発明は、本明細書に記載している新規な本発明
方法を用いることによって、特異的に単離された、スト
レプトマイセス属由来の転位因子を提供するものである
。この因子は、染色体遺伝子を挿入的に不活化するため
、およびストレプトマイセス属のゲノムにあらゆる種類
の外来ＤＮＡを挿入するために有用である。したがって
、本発明は、ストレプトマイセス属において使用される
ための、このような個別の、明確に定義された因子に関
する長い間求められて来た要求を満たし、これによって
、染色体外性因子または相同組込み（ｈｏｍｏｌｏｇｏ
ｕｓ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）への依存から熟練者を
解放するものである。

以下に、本発明における用語を定義する。

ＡＩＩＩＲ−アンピシリン耐性表現型またはアンピシリ
ン耐性付与遺伝子。

Ａ　ｐＲ−アンピシリン耐性表現型またはアンピシリン
耐性付与遺伝子。

遺伝子−プロモーター機能、リボゾーム結合部位および
翻訳可能な遺伝子産物をコードしているＤＮＡセグメン
ト。

挿入配列−挿入機能に関係なく知られていない遺伝子を
コードしている小さい（一般に２０００ｂｐより小さい
）因子。

○Ｔ１−複製起源。

複製起源−特異的宿主細胞における染色体外性因子を複
製させるＤＮＡ配列。

組換えＤＮＡクローニングベクター−１またはそれ以上
の付加的ＤＮＡセグメントを添加することができるかま
たは添加しているＤＮＡ分子からなる、プラスミドおよ
びファージ（限定されない）を含んでいる自動的に複製
する作用物。

リプレッサー−特異的遺伝子産物の発現を抑制するかま
たは妨害するプロティン。

選択マーカー−発現が容易に決定できる既知の機能を有
する遺伝子またはこれら遺伝子の混合物。

形質導入−ファージによる受容宿主細胞へのＤＮＡの導
入。

トランスフェクション−ファージＤＮＡによる受容宿主
細胞へのＤＮＡの導入。

形質転換−プラスミドによる受容宿主細胞へのＤＮＡの
導入。

転位因子−トランスボゾン、挿入配列、転位バクテリオ
ファージ、またはゲノムにおける２、３もしくは多くの
部位で挿入することができる二重鎖ＤＮＡの個々に分離
した断片。

トランスボゾンー抗生物質もしくは重金属耐性付与遺伝
子または生合成遺伝子のような挿入機能に無関係の付加
的決定要素を含んでいてよい一般に２ｋｂより大きい転
位因子。

ＴｓｒＲ−チオストレプトン耐性表現型またはチオスト
レプトン耐性付与遺伝子。

以下に、本明細書に添付する図面について簡単に説明す
る。これらの図面は、実寸大ではない。

第１図は、プラスミドｐＣＺＡ１２６の制限部位および
機能地図を示す模式図である。

第２図は、プラスミドｐＣＺΔ１４１の制限部位および
機能地図を示す模式図である。ｌ５４９３の矢印は発表
された配列の５゛→３′配向を示しており、転写および
読み取り枠とは無関係である。

第３図は、プラスミドｐＣＺＡ１５０およびｐＣＺＡ１
５１の制限部位および機能地図を示す模式第４図は、プ
ラスミドｐＣＺＡ１５２およびｐＣＺＡ１５３の制限部
位および機能地図を示す模式第５図は、プラスミドｐＣ
ＺＡ１５４およびｐＣＺＡｉ５５の制限部位および機能
地図を示す模式本発明は、転位因子について細胞培養を
スクリーニングする方法であって、 （ａ　）（１）リプレッサー機能をフードする遺伝子を
含有するＤＮＡセグメント、 く２）該リプレッサー機能が発現する場合は第２宿主細
胞において機能的でなく、該リプレッサー機能が発現し
ない場合は第２宿主細胞において機能的であるリブレッ
ジプルプロモーター （３）発現が該リプレッシブルプロモーターによって作
動される選択マーカー （４）第２宿主細胞において機能的である複製起源、お
よび （５）第１宿主細胞において機能的である第２複製起源 を含有する組換えＤＮＡクローニングベクターによって
第１宿主細胞の培養を形質転換、トランスフェクション
、または形質導入すること、 （ｂ）第２宿主細胞においてリプレッサー機能をコード
する遺伝子を含有する該ＤＮＡセグメント中に転位因子
を導入するのに適している条件下、工程（ａ）において
形質転換、トランスフェクションまたは形質導入された
宿主細胞を培養すること、 （ｃ）工程（ｂ）において培養された宿主細胞から単離
した組換えＤＮＡクローニングベクターＤＮＡによって
第２宿主細胞の培養を形質転換、トランスフェクション
、または形質導入すること、および （ｄ）工程（ａ）のベクターに含まれているマーカーが
発現するように選択された条件下で工程（ｃ）ニオいて
形質転換、トランスフェクションまたは形質導入した第
２宿生細胞の培養を培養することによって、第１宿主細
胞が転位因子を含むか否かを決定すること、 からなり、第１宿主細胞および第２宿主細胞が形質転ｔ
ｉ、トランスフェクションまたは形質導入され得るもの
であることを条件とするスクリーニング方法を提供する
ものである。

また、本発明は、転位因子からなるベクターを含有する
宿主細胞の選択方法および該ベクターから該転位因子を
単離する方法を提供するものである。この転位因子を単
離する方法は、第２宿主細胞において機能するリプレッ
サー遺伝子、第２宿主細胞中のリプレッサープロティン
に敏感であるプロモーターを含む組換えＤＮＡクローニ
ングベクターによって第１宿主細胞を形質導入、トラン
スフェクションまたは形質転換することによって行われ
、該プロモーターおよび第２宿主細胞において機能的で
ある複製起源によって作動されることができる。耐性−
付与遺伝子を作動するプロモーターがもはや抑制されて
いないので、第２宿主細胞へのクローニングベクターの
再単離および再形質転換によって妨害されたリプレッサ
ー遺伝子を含むこれらクローンは、抗生物質の毒性レベ
ルを含む媒体において生存に適している。本発明は、発
現したリプレッサー機能の存在下、第２宿主細胞におい
て機能的である第２選択マーカーからなるベクターを用
いることによって実施することもできる。このようなベ
クターは、「捕獲する」転位因子の効率と形質転換効率
とを比較して特に有用である。また、ベクターは、第１
宿主細胞において機能的である第３選択マーカーをも含
むことができ、第１宿主細胞へのベクターの導入後、ト
ランスフェクション細胞、形質転換細胞または形質導入
細胞を選択させる。本発明は、第１および第２の両宿主
細胞において機能的である選択マーカーを用いることが
できる。

本発明は、プラスミドｐＣＺＡ１２６の使用によって最
も良い例が示される。プラスミドｐＣＺＡ１２６はアブ
ラマイシン耐性付与遺伝子の発現を惹起するために直列
的に作動するλバクテリオファージ由来のＰＲおよびＰ
Ｌ抑制プロモーターを含む。直列的ＰＲＰＬプロモータ
ーはアブラマイシン耐性付与遺伝子の発現を促進するこ
とができないので、プラスミドｐＣＺＡ１２６は、機能
する場合に大腸１（Ｅ、ｃｏｌｉ）においてリプレッサ
ー機能を産生ずるλバクテリオファージｃＩ８５７リプ
レノサー遺伝子も含んでいる。ｃＩ８５７リプレノサー
遺伝子のプロモーター、リボゾーム結合部位または翻訳
可能な配列が分断されると、リプレッサー機能は不活化
され、次いで、λＰＲＰＬブ凸モーターはアブラマイシ
ン耐性付与遺伝子の発現を促進する。アブラマイシン耐
性付与遺伝子の解読（コード）領域は、ｐＫＣ４６２Ａ
［１９８５年６月３日に寄託、ＮＲＲＬ　Ｂ−１５９８
３］由来である。

上記因子に加えて、プラスミドｐＣＺＡ１２６は、プラ
スミドｐＢＲ３２２のＣｏｌＥ１ｍ製起源およびアンピ
シリン耐性付与遺伝子、ならびにプラスミドｐＨＪＬ４
００の５ＣＰ２宜ｘ導体複製起源およびチオストレプト
ン耐性付与遺伝子も含んでいる［ラーソン（Ｌａｒｓｏ
ｎ）およびハーシニバーガ−（Ｉｌｅｒｓｈｂｅｒｇｅ
ｒ）、１９８６年、プラスミド１５、第１９９〜２０９
・頁］。プラスミドｐＣＺＡ１２６の制限部位および機
能地図を第１図に示す。プラスミドｐＣＺＡ１２６は、
大腸菌に１２ＪＭＩＱ９／ｐＣＺＡ１２６から得ること
ができ、菌株は１９８８年９月１４日に寄託され、ノー
ザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリ−（Ｎ　Ｒ
ＲＬ）［Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
　５ｅｒｖｉｃｅ、　　１８１５　Ｎｏｒｔｈ　Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉＬｙ　５ｔｒｅｅｔ、　Ｕ、Ｓ、　Ｄｅｐａ
ｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、　Ｐｅ
ｏｒｉａ、　ＩＬ　６１６０４］の永久貯蔵培養の一部
である。取得番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１８４１６のちとにプ
ラスミドの供給源および貯蔵物として一般に入手可能で
ある。

プラスミドｐＣＺＡ１２６をまず、ストレプトマイセス
・リビダンス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　１ｉｖｉ
ｄａｎｓ）Ｃｒ２に形質転換し、菌株は１９８８年９月
１４日に取得番号ＮＲＲＬ　　１８４１８のもと、上記
ＮＲＲＬに寄託した。チオストレプトンを含む培地上に
形質転換体を抜粋し、次いで、この形質転換体からプラ
スミドＤＮＡを単離し、犬１１ｉ菌Ｋ１２　　ＪＭ１０
９細胞に再形質転換した。ｃＩ８５７遺伝子の破壊の結
果、形質転換した大腸菌細胞がアブラマイシン耐性に転
換された。さらに、配列分析およびサザンハイブリソド
形成分析の結果、挿入がストレプトマイセスリビダンス
ＣＴ２起源の挿入配列であることがわかった。

本発明において用いるベクターの種々の因子は本明細書
において例示するものに限定されない。

例えば、真核転位因子は、種々の真核細胞中にベクター
をシャトリングすることによって単離することができる
。酵母因子についてプローブ検索する場合、例えば、酵
母プラスミドＹＥＰ２４由来の複製起源ならびにＵＲＡ
３またはＬＥＵ２選択マーカーを用いることができる。

多細胞微生物の細胞は、所望のベクターの種々の因子を
代わりに用いることによって転位因子の存在についてス
クリーニングすることもできる。ルピン等（Ｒｕｂｉｎ
ｅｔａｌ、）の米国特許束４．６７０．３８８号には、
ショウジヨウバエ（Ｄ　ｒｏｓｏｐｈ　ｉ　Ｉａ）の遺
伝において有用な種々のファージおよび選択マーカーが
開示されている。

これらの因子は本発明のベクターに容易に転移すること
ができ、転位因子についてショウジヨウバエをスクリー
ニングすることができる。

種々の因子に代えることによって他の属においてスクリ
ーニングすることができるばかりか、該因子を代わりに
用いてストレプトマイセス属の種におけるスクリーニン
グの容易さおよび効果を増大することもできる。例えば
、ｐＣＺＡ１２６に存在するｐＨＪＬ４００由来のスト
レプトマイセス属複製起源は、当業者に知られている多
くの複製起源のうちの１つと容易に交換することができ
る。第１表に、機能的なストレプトマイセス属複製起源
を得ることができるストレプトマイセス属プラスミドを
示すが、これらは例示であってすべてではない。当業者
には、複製起源機能が破壊されない限り、プラスミドの
全部または一部分を、本発明を例証するベクターの構築
に用いることができることがわかる。宿主を含有してい
るプラスミドおよび取得番号を第１表に示す。

（以下、余白） 第１表 プラスミド 宿　主　　　　取得番号 ｐｌＪ７０２　　　　ストレブトフイセス・リビダンス
　　　　　　　　　　　　　　ＡＴＣＣ”　　３９１５
５１ナシヨナル・コレクション・オブ・インダストリア
ル・／　（クチリア：　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅ
ｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｂａｃｔｅ
ｒｉａ（ＮＣＩＢ）、Ｔｏｒｒｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
５ｔａｔｉｏｎ、　Ｐｏ５ｔ　（Ｍｆ’ｉｃｅ　Ｂｏｘ
　３１．１３５　Ａｂｂｅｙ　Ｒｏａｄ、　Ａｂｅｒｄ
ｅｅｎ　ＡＢ９８ＤＧ、　５ｃｏｔｌａｎｄ、　Ｕｎｉ
ｔｅｄ　Ｋｉｎｄｏｍ 雪アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション：　
Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、　１２３０１　Ｐａｒｋ
ｌａｗｎ　Ｄｒｉｗｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒ
ｙｌａｎｄ　２０５８２．　Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅ
ｓ　ｏｆ　ＡｍｅｒｉＳＬＰｌ、２［ホリノウチ等（ｌ
［ｏｒｉｎｏｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ、）１９８５、　、
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　１６２　：　４０６］、
ｐＳＲＣｌ−ｂ［シンドー等（Ｓｈｉｎｄｏｈ　ｅｔ　
ａｌ、）、　１９８４．　Ｊ、Ａｎｔｉｂｉｏｔ。

３７　：　５１２］、ｐｓ　Ｌ　１　［ナカノ等（Ｎａ
ｋａｎｏ　ｅｔ　ａｌ、）、　　１９８２、　ＦＥＭＳ
　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｌｅｔｔ、　１３　：　２７９
］、およびｐＳＦ７６５［ムラカミ等（Ｍｕｒａｋａｍ
ｉ　ｅｔ　ａｌ、）、　１９８３、　Ｊ、　Ａｎｔｉｂ
ｉｏｔ、　３６　：　４２９］のような他の複製起源も
、本発明の範囲内のベクターを構築するために用いるこ
とができる。

当業者には、多くの異なる複製起源が大腸菌において有
用であることも認められるであろう。特定の大腸菌複製
起源の存在は、本発明の制限要素ではないので、例えば
ｐｃＺｌｏｌ［ショナー等（Ｓｈｏｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ
、）、　１９８＋Ｌ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ。

ｔｌｓＡ８１　：　５４０３］、ｐＡｃＹｃＩ８４、ｐ
ＢＲ３２５、ｐＢＲ３２８のような大腸菌プラスミド由
来の機能的な複製起源含有および所望により抗生物質耐
性付与制限フラグメントを、本発明の目的のために代え
て用いることもできる。本明細書に例示されている抗生
物質耐性付与遺伝子の代わりに種々の選択マーカーを用
いることもできる。例えば、β−ガラクトシダーゼ系の
ような比色マーカーまたは酵母ＵＲＡ３もしくはＬＥＵ
２遺伝子のような栄養性マーカーを用いることもできる
。種々のストレプトマイセス属の種のチロシン、スピラ
マイシン、カルボマイシンまたはピクロマイシン耐性付
与遺伝子（限定されない）のような多くの異なる抗生物
質耐性付与遺伝子も、本発明のベクターにおいて用いる
ことができる。少ししか名称を挙げないが、カナマイシ
ンおよびテトラサイクリン耐性付与遺伝子のような大腸
菌において機能的である多くの異なる抗生物質耐性付与
遺伝子であってもよい。天然の大腸菌アブラマイシン耐
性付与遺伝子のようにいくつかの遺伝子は、大腸菌とス
トレプトマイセス属の両者において機能的である。

当業者には、これらの遺伝子の全てが、単独でまたは混
合されて、本発明を別に例示するために用いることがで
きる。

本発明方法において用いる前述のベクターのリプレッサ
ー／プロモーター系は、当業者の必要に応じて変えるこ
ともできる。例えば、３７°Ｃでのインキュベーション
を必要とするこれらの系は、λバクテリオファージｃｌ
リプレッサーを利用すべきであり、これに対して、ｃＩ
８５７リブレツサーは３７℃付近の温度ではうまく機能
しない。

１ａｃＺリプレツサー／プロモーター系も本発明におい
て用いることができる。また、リプレッサー機能をコー
ドしている配列は、他の配列が機能リプレッサーを常に
コードしている限り、容易に変化させることができる。

このような他の配列は、転移に関する他の標的部位を与
える。当業者には、前述のベクターの因子全ての多種多
様な混合が可能であり、したがって、本発明方法は広範
囲の第１および第２宿主細胞において有用であることが
わかる。非常に大きい可変性のトランスボゾン捕獲プラ
スミドは種々の種において機能するいくつかの複製起源
を有することができる。したがって、本発明は、真核系
および原核系の両者において容易に実施することができ
、したがって、本発明は以下に挙げる実施例に限定され
るものではない。

また、本発明は、ｌ５４９３と称した新規に単離された
挿入因子を提供するものである。ｌ５４９３のヌクレオ
チド配列は、以下のとおりである。

ＴＣＣＴＧＡＧＣＣＡ　ＣＧＣＧＣＡＴＧＧＣＣＴＣＧ
ＧＣＧＴＡＴ　ＡＣＧＧＧＧＴＣＣＴ　ＧＣＡＧＣＣＧ
ＣＴＴここで、Ａはデオキシアデニルであり、Ｇはデオ
キシグアニルであり、Ｃはデオキシシチジルであり、Ｔ
はチミジルである。

ｌ５４９３転位因子は、大腸菌に１２　　ＪＭＩ０９／
ｐＣＺＡ１４１から都合よく単離することができるプラ
スミドｐＣＺＡ１４１から得ること９５１　　　ＧＴＧ
ＣＧＣＴＧＣＴ　ＧＣＧＣＣＣＧＴＧＧ　　ＣＧＴＣＧ
ＡＣＣＧＣτＧＡＧＣＴＣＧＧＣＧＴＣＧＡＧＴＧＴＣ
ができ、菌株は１９８８年９月１４日に寄託されており
、ＮＲＲＬの永久貯蔵培養収集品の一部分である。大腸
菌に１２　　ＪＭ１０９／ｐＣＺＡ１４１の培養物は、
取得番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１８４１７のちとにＮＲＲＬか
ら入手することができる。

プラスミドｐＣＺＡ１４１の制限部位および機能地図を
第２図に示す。ｌ３４９３転位因子の組込み機能を用い
るために、前述のベク９−ｐＣＺＡ１５２、ｐＣＺＡ１
５３、ｐＣＺＡ１５４およびｐＣＺＡ１５５のような種
々のベクターを構築することができる。

プラスミドｐＣＺＡ１５０は、まず大腸菌に１２　　Ｓ
Ｆ８／ｐＫＣ４６２Ａ（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５９７３）
からプラスミドｐＫＣ４６２Ａを単離することによって
構築される。プラスミドｐＫＣ４６２Ａを制限酵素Ｐｓ
ｔｌおよびＢａｍＨＩで消化し、〜１．５ｋｂ制限フラ
グメントを単離する。この制限フラグメントは、アブラ
マイシン耐性付与遺伝子を含んでいる。プラスミドｐＵ
ｃＩ９（ＢＲＬ）も〜ｌ　、　５　ｋｂアブラマイシン
耐性付与制限フラグメントをＰｓｔｒ／ＢａｍＨｒ切断
プラスミドｐＵｃＩ９にライゲートし、プラスミドｐＯ
Ｊ１０７を形成する。次に、プラスミドｐＣＺＡ１４１
を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、〜２．１ｋｂ　ｌ
５４９３含有制限フラグメントを単離する。次いで、こ
のフラグメントをＨｉｎｄｌＩｔ消化したプラスミドｐ
ＯＪ１０７にライゲートし、ｌ５４９３含有制限フラグ
メントの指向に関してのみ異なるプラスミドｐＣＺＡ１
５０およびｐＣＺＡ１５１を形成する。これらのプラス
ミド中の［５４９３因子の指向は、制限酵素Ｓ　ａｕ　
ＩおよびＢａｍＨＩでプラスミドを消化し、特異的制限
フラグメントの存在を検査することによって決定される
。〜２．９ｋｂおよび〜３．４ｋｂ制限フラグメントを
含有するこれらのプラスミドをプラスミドｐＣＺＡ１５
０と称し、一方、〜１．７ｋｂおよび４．６ｋｂ制限フ
ラグメントを含有するこれらのプラスミドをプラスミド
ｐＣＺＡ１５１と称する。プラスミドｐＣＺＡ１５０お
よびｐＣＺＡ１５１の制限部位および機能地図を第３図
に示す。

プラスミドｐＣＺＡ１５０を制限酵素ＢａｍＨＩで切断
し、〜２．１ｋｂＯものと共に、ＨｉｎｄＩ［−カット
したブー７スプラスミドｐＣＺＡ１４１１７＞ｌ５４９
３含有制限フラグメントを、緑豆（ｍｕｎｇ　ｂｅａｎ
）ヌ’ｙ　レアーゼで処理して制限部位の端部を平滑（
ｂｌｕｎｔ）にする。次いで、平滑化ｌ５４９３含有制
限フラグメントをＢａｍＨＩ消化平滑化ｐ’ｃＺＡＩ５
０にライゲートして、第２のｌ５４９３含有制限フラグ
メントの指向に関してのみ異なるプラスミドｐＣＺＡ１
５２およびｐＣＺＡ１５３を形成する。

制限酵素Ｓ　ａｕ　ＩおよびＳ　ｍａ　ｒでプラスミド
を消化し、特異的制限フラグメントの存在を検査するこ
とによって、これらのプラスミド内のこの第２のｌ３４
９３因子の指向を決定する。〜２．９３ｋｔ＋。

〜５．３ｋｂｔｊヨヒ〜０．２３ｋｂ制限フラグメント
を含有するプラスミドをプラスミドｐＣＺＡ１５２と称
し、一方、〜３．６３ｋｂ、〜２．９３ｋｂおよび〜１
．９ｋｂ制限フラグメントを含有するプラスミドをプラ
スミドｐＣＺＡ１５３と称する。プラスミドｐＣＺΔ１
５２の制限部位および機能地図を第４図に示す。

同様に、プラスミドｐＣＺＡ１５１を制限酵素ＢａｍＨ
Ｉで切断し、緑豆ヌクレアーゼで処理した。

次いで、ｐＣＺＡ１４１の平滑化ｌ３４９３含有制限フ
ラグメントをＢａｍＨ［／ｌ’ｌ化平滑化ｐｃ　Ｚ　Ａ
１５１にライゲートして、第２のｌ５４９３含有制限フ
ラグメントの指向に関してのみ異なるプラスミドｐＣＺ
Ａｉ５４およびｐＣＺＡ１５５を形成することができる
。これらのプラスミド中の第２のｌ３４９３因子の指向
は、制限酵素Ｓ　ａｕ　ＴおよびＳ　ｍａ　Ｉによって
プラスミドを消化し、特異的制限フラグメントの存在下
で検査することによって決定される。〜１゜９６　ｋｂ
、〜４．６ｋｂおよび〜１゜９ｋｂ制限フラグメントを
含有するプラスミドをプラスミドｐＣＺＡ１５４と称し
、一方、〜３．６３ｋｂ、〜４．６ｋｂおよび〜０．２
３ｋｂ制限フラグメントを含有するプラスミドをプラス
ミドｐＣＺＡ１５５と弥する。プラスミドｐＣＺＡ１５
４およびｐＣＺＡ１５５の制限部位および機能地図を第
５図に示す。ストレプトマイセス・リビダンスＣＴ２中
にブ５ス４Ｆ’ｐＣＺＡ１５２、ｐＣＺＡ１５３、ｐＣ
ＺＡ１５４およびｐＣＺＡ　１５５を含有する７”−ル
の形質転換の結果、抗生物質アブラマイシンに耐性であ
るコロニーが形質転換される。例示したプラスミドは全
てストレプトマイセス属機能性複製起源を含有していな
いので、アブラマイシン耐性コロニーの出現は、多（の
場合、アブラマイシン耐性付与遺伝子および側面にある
ｒｓ４９３配列がストレプトマイセス・リビダンスのゲ
ノム中に取り込まれた転移によるものであろう。

ｌ５４９３によってなされ得るような転移は、転移がゲ
ノムの種々の位置で生じ、組込みについてＤＮＡホモロ
ジーを必要としないので、非常に有用である。さらに、
転移［ＩによるＤＮＡの組込みは機能的な相同組換え系
を有する微生物に限定されない。宿主細胞中に転位因子
を導入するために多くの異なる技術およびクローニング
ベクターを用いることができるので、ｌ５４９３転位因
子は本明細書に記載されているプラスミドにおける用途
に限定されない。また、ｌ５４９３因子を用いる転移に
よって染色体に組込まれた遺伝子のタイプも実質的には
限定されない。例示されたプラスミドの抗生物質耐性付
与遺伝子は、多くの異なる抗生物質耐性付与遺伝子によ
って置換され得るか、またはこの抗生物質耐性付与遺伝
子は、重金属耐性付与遺伝子もしくは生合成遺伝子によ
って置換され得る。宿主細胞の染色体中への生合成遺伝
子の安定した組込みによって、所望の遺伝子産生物の産
生または新規な雑種遺伝子産生物の産生を増加させるこ
とができる。当業者には、実質的に、本明細書に記載さ
れているｌ５４９３因子を用いて、任意の機能をフード
している遺伝子を宿主染色体中に転移できることが理解
される。したがって、１５４９３因子のパラメーター中
に外来のＤＮＡを添加することは本発明の範囲内である
。

本発明に係るＤＮＡ配列の多くの修飾および変形が可能
である。このような修飾は、ｌ５４９３配列中に新しい
制限部位を導入することができ、因子の有用性を非常に
増大させ、因子が転移する能力を維持するようにできる
。実際に、ｌ５４９３誘導体によって制御された転移頻
度を変化させることができる修飾もある。これらの修飾
された１ｓ４９３因子は自然に生じるかまたはイタクラ
等１１Ｌａｋｕｒａ　ｅｔ　ａｔ、、　１９７７．５ｃ
ｉｅｎｃｅ　１９８：１０５６］およびクリア等ｒＣｒ
ｅａ　ａｔ　ａｌ、、　　１９７８．　　Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔ、　　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　７５：
５７６５］の方法に実質的に従った合成方法によって製
造することができる。また、合成成分またはリンカ−は
、シスチック（Ｓ　ｙｓｔｅｃ）１４５０Ａ　ＤＮＡシ
ンセサイザー［５ｙｓｔｅｃ　Ｉｎｃ、。

３６１８　Ｃｈａｎｄｌｅｒ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｍｉｎｎ
ｅａｐｏｌｉｓ、　ＭＮコまたはＡＢＳ　　３８０Ａ　
ＤＮＡシンセサイザー［Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎ
ｃ、、　８５０　ＬｉｎｃｏＩｎ　Ｃｅｎｔｅｒ　Ｄｒ
ｉｖｅ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ４ｔｙ、　ＣＡ　９４４０
４ｊを用いることによって合成することができる。当技
術分野において多くの他のＤＮＡ合成装置が知られてお
り、合成り　Ｎ　Ａフラグメントをつくるのに用いるこ
とができる。したがって、本発明は詳細に例示されたＤ
ＮＡ配列およびプラスミドに限定されるものではない。

以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳しく説明し、
好ましい例を挙げる。本発明の説明および本発明を構成
するための実際の方法は、適切な箇所で記述する。

実施例１ニブラスミドｐＣＺ　Ａ　１２６　（７１ｉｔ
ＱＩＣプラスミドｐＣＺＡ１２６は、ノーザン・リージ
ョナル・リサーチ・センターから取得番号ＮＲＲＬ　　
Ｂ−１８４１６のもとで入手することができる大腸菌に
１２　　ＪＭ１０９から得ることができる。大腸菌Ｋ　
１２　　ＪＭ１０９／Ｉ）ＣＺ、Ａ　１２６の凍結乾燥
品を、アンピシリン２５μｇ／ｘ（ｌを含むし一寒天プ
レート［ＩＩ２あたりバクトートリブトン（Ｉｌａｃｔ
ｏ−ｔｒｙｐｔｏｎ）　１０９、Ｎａ（１！１０９、バ
クトーイースト抽出物（Ｂａｃｔｏ−Ｙｅａｓｔ　Ｅｘ
ｔｒａｃｔ）　５９および寒天１５９］で培養し、菌株
の単一コロニー単離体を得る。このコロニーを用いてＬ
ブロス（寒天以外のｆ−寒天）約５００１１２に接種し
、細胞が定常期に達するまで、得られた培養物を曝気し
ながら３７０Ｃでインキュベ−１・する。

マニアティス等［Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　
１９ｇ２．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ（
ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ）コによって修正が加えられた以下の方
法に従って細胞からプラスミドＤＮＡが得られる。縮小
スケールで行ったことと、超遠心工程をフェノール抽出
とそれに続くクロロホルム抽出に代えたこと以外は、上
記の方法を用いて、大腸菌形質転換体の同定に用いるプ
ラスミドＤＮＡを調製した。

４℃、４０００Ｘｙで１０分間遠心分離することによっ
て定常期の大腸菌／ｐＣＺＡ１２６細胞約５００１Ｑを
集め、上清を捨てた。細胞ペレットを水冷のＳＴＥ緩衝
液［０，１Ｍ　ＮａＣＱ：　ｌ　Ｃ）＋ＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｆｆ（ｐＨ７，８）：およびＩＪＩＭ　ＥＤＴＡ］１
０Ｍで洗浄した。細胞ベレットを洗浄した後、このベレ
ットを、５　ｕ／　３１１２リソチーム含有の溶液１［
５０１Ｍグルコース：　２５ｘＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ（１
（ｐＨ＝８）；および１０ｍＭ　ＥＤＴＡ］１０酎に再
懸濁し、室温で１０分間放置した。次いで、リソチーム
処理した細胞に溶液２［０，２Ｎ　ＮａＯＨおよび１％
ＳＤＳ］２０ＩＱを加え、この溶液を反転させて穏やか
に混合した。この混合物を水上で１０分間インキュベー
トした。

この溶菌細胞混合物に水冷の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
＝４．８）１５＋（２を加え、溶液を反転混合した。こ
の溶液を水上で６０分間インキュベートした。この３Ｍ
酢酸ナトリウム溶液は、同量の３Ｍ酢酸と３Ｍ酢酸ナト
リウムとを混合して調製した。

この溶菌細胞混合物を、ベックマン５ｗ２７０−夕−（
またはそれと等価なもの）中、４℃、２０゜０００　ｒ
ｐｍで２０分間遠心分離した。上清約３６村を回収し、
エタノール２．５容量を加えて混合し、得られた溶液を
水上に１５分間放置した。室昌、１２，０００Ｘ１ｉ１
で３０分間遠心分離することによってプラスミドＤＮＡ
を集めた。上清を捨て、室温でＤＮＡベレットを７０％
エタノールにより洗浄した。エタ／−ル洗液をデカンテ
ーションし、ペレットを真空デシケータ−中で乾燥した
。次いで、このペレットをＴＥｉ５衝１夜８１１１１２
に再懸濁した。

ＤＮＡ溶液にＣ５ＣＱ８９を加えた。各Ｌｏｗ（ｌのＣ
ｓＣ１２−ＤＮＡ溶液に１ｏＲ９／ｍｃの臭化エチジウ
ム水溶成約０．８ａ＋ｆｆを加えた。最終溶液の密度は
約１　、５５９／ｘＱであり、臭化エチジウム濃度は約
８００μｇ／ｍ（ｌであった。この溶液をベックマン・
タイプ５０遠心管に移し、その上部を１．５５ｙ／村の
ＣｓＣρを含有するＴＥ緩衝液で満たし、封をし、そし
て２０’Ｃ１４５，ＯＯＯｒｐｍで２４時間遠心した。

遠心後、常光のもとて２つのＤＮＡバンドが見え、ＵＶ
光ではさらに顕著となった。管からキャップを取った後
、遠心管の側部から挿入した＃２１皮下注射針の注射器
を用いて低い方のＤＮＡバンドを取った。

水飽和ｌ−ブタノールで数回抽出することによってプラ
スミドＤＮＡの溶液から臭化エチジウムを除去し、ＴＥ
緩衝液に対して透析することによってＣ５ＣＱを除去し
た。緩衝フェノール、次いでクロロホルムで抽出した後
、ＤＮＡを沈澱させ、７０％エタノールで洗浄し、そし
て乾燥した。この方法によって、プラスミドｐＣＺＡ１
２６　　ＤＮＡ約０．５ｚｙを得ることができた。

実施例２：ストレプトマイセス・リビタンスＣＡ、溶液
のリスト 以下に示した溶液は実施例中で引用されるものであり、
ここに明示する。

１、　　ｐ培地（〜１００ｍの＝ 成　　分　　　　　　　　　　　　　　　　ヱスクロー
ス　　　　　　　　　　　　　１０．３９に、Ｓ　Ｏ，
０，０２、Ｍ 微量元素溶液（下記２参照）　　　　　　　０．２１（
Ｍ　ｇ　ＣＱ・６Ｈ，ＯＯ，２０３９ 水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　８０肩Ｑオ
ートクレーブで滅菌した後、下記成分を追加する。

Ｋ　Ｈ、ＰＯ２（０゜５％）　　　　　　　　１１ＱＣ
ａＣ１２ｔ・２Ｈ，Ｏ（３，６８％）１０ｆｆ１２（ｐ
Ｈ＝７．２） １Ｕ’１ｌＱ （以下、余白） 微量元素溶液（〜１の： 成　　分 ＺｎＣ（！ｔ ＦｅＣ２，・６Ｈ，０ Ｃｕ（Ｊｔ−２Ｈ，Ｏ ＭｎＯ４，−４８，０ ＮａｔＢ、Ｏｔ’　１０Ｈ，０ （ＮＨ４）８ＭＯ？０２４・４Ｈｔ。

Ｈ，Ｏ Ｒ２再生培地（〜ＩＱ）： 成　　　分　　　　　　　　　　　　　　　　量スクロ
ース　　　　　　　　　　　　　１０３９に、ＳＯ，０
，２５９ 微量元素溶液　　　　　　　　　　　　　２１１ＱＭｇ
ＣＱ＝　・６　Ｈ＊０　　　　　　　　　　１０−１２
９グルコース　　　　　　　　　　　　　　１０ｇＬ−
アスパラギン・ＩＨ，０２，０Ｗ カザミノ酸　　　　　　　　　　　　　　　０．１９寒
天　　　　　　　　　　　　　　　　２２９これに水を
加えて全量を７００吋とする。

量 ４０肩９ ００ｍ９ １０肩９ １Ｏη １０巧 １０η ｉ２ オートクレーブ滅菌の前にｐＨを７．２に調節し、滅菌
後に以下の成分を追加する。

ＫＨ，ＰＯ，（０，０５９／１００ｉＱ）ＣａＣＩ２ｔ
（２，２２９／　ｌ　Ｏｏｘｇ）００ＭＱ １００舷 ４、ＹＭＸ寒天は、０，３％酵母エキス、０．３％麦芽
エキス、０．２％デキストロースおよび２．０％寒天か
らなる。

５、ＴＳＢ　−）リブチカーゼ・ソイ・ブロスは、３０
９／Ｉで調製され、バルチモア・バイオロジカル・ラボ
ラトリーズ［Ｂａｔｉｍｏｒｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（［３ＢＬ）＋　ＰＲＯ
，Ｂｏｘ　２４３．　Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ、　Ｍ
ａｒｙｌａｎｄ　２１０３１］から人手される。

Ｂ、ストレプトマイセス・リビダンスＣＴ２の形利転閃 ＹＭＸ寒天上でストレプトマイセス・リビダンスＣＴ２
（ＮＲＲＬ　　１８４１８）を培養し、３０°Ｃで約７
２時間インキュベートした。細胞のプラグをプレートか
ら取り出し、これを用いてＴＳＢ１０！ｌ（ｌに接種し
た。この培養物をホモジナイズし、３０°Ｃで〜３０時
間インキュベートした。この培養物約４：Ｉ（ｌをホモ
ジナイズし、これを用いて０゜４％グリシン含有のＴＳ
Ｂ１００１１２に接種した。

培養物を３０°Ｃで約２４時間インキュベートした。

この培養物約４１１Ｑを再度ホモジナイズし、これを用
いて０．４％グリシン含有のＴＳＢｌｏｏＲ（に接種し
た。この培養物を３０℃で約１６時間インキュベートし
た。細胞を集めて、１０．３％スクロースで３回洗浄し
た。この細胞を、１ｏ／ｍＱ、のりソチームを含有する
Ｐ培地１００ｉ（２中に再懸濁し、得られた溶液を３０
°Ｃで２時間インキュベートした。このプロトプラスト
化工程中は、ピペットによる吸い上げと戻しを行って細
胞凝集を分散させた。プロトプラストを集めて、Ｐ培地
で３回洗浄した。次いで、このプロトプラストをＰ培地
１０Ｈに懸濁した。通常、この方法により溶液１５０μ
Ｑあたり２〜５Ｘ１０’のプロトプラストが得られる。

このプロトプラスト溶成約１５０μＱを、ライゲージタ
ンまたはＴＥのいずれかのｆｌｉｔ　Ｂｉ液液中形質転
換り、ＮＡ１０１７１２に加えて混合した。次いで、Ｐ
培地中５０％ポリエチレングリコール１０００約１００
μＱを加えて混合した。室温でしばら＜（１〜２分）イ
ンキュベートした後、Ｐ培地を加えて細胞−Ｄ　Ｎ　Ａ
混合物の容量をｉｏ２にした。細胞懸濁液を修飾Ｒ２再
生培地で培養した。Ｒ２プレートあたり細胞約ｏ、ｉ、
ｔρを接種した。プレートを３０℃で一晩（〜１６時間
）インキュベートし、次いで、充分量のチオストレプト
ンを含有するＲ２寒天層［１１２あたりスクロース１０
３ｇ、ＭｇＣ１２ｚｌＯ，１２ｇ、ＣａＣＱ−２，２２
９、寒天４．１９およびＴＥＳ　５．７２ｇ（ＰＨ７，
２）］〜３肩Ｑをかぶせ、拡散後の最終濃度２５μ９／
酎を得た。次いで、プレートを３０℃で約４日間インキ
ュベートすると、コロニーが肉眼で見えるようになった
。

次いで、単一コロニーを用いて、２５μｙ／ｘＱのチオ
ストレプトンを含有するＴＳＢ培養物１０１１１２に接
種した。培養物をホモジナイズし、次いで、３０°Ｃで
一晩、回転振の型中で増殖させた。

構造上無傷のプラスミドｐＣＺＡ１２６の分析および確
認のために、以下のとおり、プラスミドの単離を行った
。

遠心分離によって菌糸体を集め、１０．３％スクロース
で２回洗浄し、次いで、１０．３％スクロース１〜２肩
ρに懸濁した。細胞混合物４００μＣを小さい管に移し
、５ｘ　リソチーム溶液（１２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｑ、　ｐｉ−１８；　１２５＋１！Ｍ　Ｅ　ＤＴ　Ａ。

ｐＨ８；１０．３％スク’−ス；　１０ｘｇ／Ｒ０’）
　ソチーム）を加えた。添加後、懸濁液を３０°Ｃで３
０〜６０分間インキュベートし、１％ＳＤＳ含有の０．
３Ｎ　ＮａＯＨ３００μ１２と混合した。この溶液は、
細胞混合物に添加する前に５０’Ｃに維持しておいた。

細胞混合物を８０°Ｃで１０分間放置し、ＩｊＦＡに冷
却し、次いて、フェノール°ＣＨＣＱ。

（５０：　５０）２００μＱで抽出した。水相を透明な
管に移し、Ｎａ０Ａｃ中で０．３Ｍとし、次いで、イン
プロパツール１容量を加えた。ＤＮＡを室温で５分間イ
ンキュベートし、次いて、遠心分離によってペレット化
した。ペレットをＴＥ緩衝液５ＯＯμｅに溶解し、この
ＤＮＡ溶液にＯ，１Ｍスペルミン約２５μＱを添加し、
混合物を室温で５分間インキュベートし、遠心分離後、
ＤＮＡペレットを７５％エタノールで洗浄し、次いで、
エタノールを用いて０．３Ｍ酢酸ナトリウムから再懸濁
および再沈澱した。この再沈澱後、プラスミドＤＮＡを
ＴＥ緩衝液５０μσに！ひ濁した。反応生成物の制限酵
素切断および電気泳動分析を用いて、プラスミドの構築
を確認した。

実施例２において単離した培養物を２５μｙ／ｍ（１の
チオストレプトン含有のＴＳＢにおいて定常期まで増殖
させ、ホモジナイズした。ホモジナイズした培養物５ｍ
（を用いて２５ｇ９／πρのチオストレプトンを含有す
るＴＳＢｌｏｏｉＱに接種した。ストレプトマイセス・
リビダンス／ｐＣＺＡ’１２６細胞が定常期に達するま
で、培養物Ｌｏｏｍ（！を３０℃で曝気しながらインキ
ュベートした。

この細胞を集めて、１０．３％スクロース溶液で１回洗
浄した。次いで、この細胞を１０．３％スクロース２４
ｒｔｔＱに懸濁し、５ｘリソチーム溶液６ＲＱを加えた
。溶液をａ＝し、次いで、３０′Ｃで３０〜６０分間イ
ンキュベートし、次に、予め５０°Ｃに加温した０、３
ＭＮａＯＨ１１％ＳＤＳの溶成約１８ｘρを加えて混合
し、得られた混合物を８０°Ｃで１０分間インキュベー
トした。次いで、この混合物を室温に冷却し、Ｈ＝０２
００ｙ（中でフェノール５００９とＣＨＣｄ、５００ｇ
とを混合することによって得られた溶液１２ｉ（を加え
、細胞抽出物とよく混合した。６０００〜８０００　ｒ
ｐｍで１０分間遠心分離して相を分離し、得られた上相
約４５鱈を透明なビンに移した。

次に、この上清に３Ｍ酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ＞４
．５１およびインプロパツール５０吋を加え、溶液を混
合し、室温に３０分間放置した。次いて、溶液を遠心分
離しく８０００ｒｐｍで３０分間）、得られた上清を捨
てた。ペレノｔ−を、ＣｓＣＱ９．５９を含有するＴｃ
Ｉｌ衝液（ｌ　ＱＩＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ（１、ｐＨ＝
８およびｌｘＭ　ＥＤＴＡ）ｌ　０２Ｃに再懸濁した。

この溶液に臭化エチジウムの５ｍｇ／ｄ溶液約ＩＪ成約
２を添加し、最終容量を１２．５ｚρとした。次いて、
この溶液をベックマンＴｉ−７５装着アングルローター
（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｔｉ−７５ｆｉｘｅｄ−ａｎｇｌｅ
　ｒｏｔｏｒ）中、２０°Ｃ１５２，００Ｏｒｐｍで４
８時間遠心分離した。２０Ｘ　　５ＳＣ（０，３Ｍ　Ｎ
ａＣｆ！および０１３Ｍコハク酸ナトリウム）で飽和し
たイソプロパ／−ルで、プラスミドバンドを含有する分
画を５回抽出し、臭化エチジウムを除去した。抽出後、
試料を、Ｈ２Ｃ１０００容量、次いでＴＥ緩衝液１５０
０容量に対して透析した。この工程で〜０゜２　μ９／
　ｕ（ｌ　）’ｔＱ度のプ５スプラスミドｐＣＺＡ　１
２６　　ＤＮＡ約５０μ９を得、４°Ｃで貯蔵した。

次に、ストレプトマイセス・リビダンスＣＴ２から単離
したプラスミドを、ストラタゲンＩｓ　ｔｒａｔａｇｅ
ｎ　：　１１０９９　Ｎｏｒｔｈ　Ｔｏｒｒｅｙ　Ｐｉ
ｎｅｓ　Ｒｄ、、　！、ａＪ０１１ａ、　Ｃ＾９２０３
７］から入手したコンピテント大腸菌に１２装Ｍ１０９
に再形質転換した。前記実施例によって得たＤＮＡ約０
．１μ２に細胞の一部試料０．１＊Ｑを加えた。細胞−
ＤＮＡ混合物を水上で１時間インキュベートし、４２℃
で９０秒間熱ショック処理し、次いで、水上で２分間冷
却した。

このＤＮＡと細胞との混合物を、ｌ　ＯＷＭ　ＭｇＳＯ
４，１０ｍＭ　ＭｇＣＱｔおよび１０５１Ｍグルコース
を有するし培地０．９ｇｆｆを含有する管に入れ、次い
で、穏やかに振盪しながら、この混合物を３０℃で４５
分間インキコベートした。

形質転換混合物の微量試料を、２５μ９／村アンピシリ
ンおよび２５μ９／ｙＱアブラマインンを含有するし寒
天プレートで増殖した。別に、アンピシリンの代わりに
２５μ９／ｙＱカルベニシリン（シグマ）を用いること
もできる。次いで、このプレートを３０°Ｃで４８時間
インキュベートした。アンピシリンおよびアブラマイシ
ンの両者の存在下で増殖した多くのコロニーはプラスミ
ド中の非機能性ｃＩ８５７リプレツサー遺伝子を有する
クローンから生じるのであろう。約１０分の１の形質転
換混合物を２５μｙ／ｘＱのアンピシリンだけを含有す
るＩ、寒天上で増殖させ、リプレッサー遺伝子の破壊頻
度に対する形質転換頻度を調べた。実質的に実施例１に
記載の方法に従って、アンピシリンおよびアブラマイシ
ンの両者に対して耐性のコロニーからプラスミドＤＮＡ
を単離した。

プラスミドｐＣＺＡ１２６のリプレッサー遺伝子をＰｓ
ｔｌ制限フラグメントに配置した。上記で単離精製した
プラスミドＤＮＡをＰｓｔｌで消化し、転位因子の挿入
能力を調べた。８．０１０μσ中のプラスミドＤＮＡ約
０．５μ９と、ＩＯＸ　　ＰｓｔＩ緩衝液（１００ＩＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ、ｐＨ７，５、ＩＭＮａＣｆｆ、お
よびｌ　Ｑ　Ｑ　ｍＭ　ＭｇＣ１２Ｊ　２　ｕσ、Ｈ，
０７μσおよび制限酵素ＰｓｔＩ［〜１５ユニ・ソト；
ユニットの定義は、特記しない限り、二ニー・イングラ
ンド・バイオラブズ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ
ｌａｂｓ。

３２　Ｔｏｚｅｒ　Ｒｏａｄ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　Ｍ
Ａ　０１９１５−９９９０）のそれに対応する］１μＱ
とを混合した。得られた反応物を３７°Ｃで２時間イン
キュベートした。

ＤＮＡを１％アガロースゲルを用いて電気泳動にかけ、
臭化エチジウムで染色した後、ＤＮＡバンドを長波長Ｕ
Ｖ光によって観察した。少量のプラスミドが、天然ｃＩ
８５７遺伝子含有ＤＮＡフラグメントの予想される大き
さに対応する〜ｌ。

２ＫＰｓｔｌ制限フラグメントを含有していた。

これらのプラスミドを運搬するクローンは、おそらく、
ｃＩ８５７遺伝子における単純な点突然変異によるアブ
ラマイシン耐性または自発性染色体アブラマイシン耐性
となっている。自発性染色体アブラマイシン耐性を有す
るコロニーの数は、アンピシリンまたはカルベニシリン
を含有する培地上で細胞を増殖させることによって減少
することができる。なぜなら、これは、プラスミドによ
って形質転換された細胞だけからなる副側体群に対して
選択されるからである。しかし、大きい、〜２．８ｋｂ
ＰｓｔＩフラグメントを示すプラスミドもあり、これは
、〜１．６ｋｂの挿入転位因子を有する〜１．２ｋｂリ
プレッサー遺伝子フラグメントに相当する。この転位因
子をｌ５４９３と弥した。

また、別の選択的な増殖によって、他の転位因子が発見
される。転移は比較的希な出来事であり、したがって、
プラスミドｐＣＺＡ１２６は、挿入配列およびトランス
ボゾンの選択に関して非常に有効な手段である。

プラスミドｐＫＣ４６２Ａは、ノーザン・リージョナル
・リサーチ・センターから取得番号ＮＲＲＬ　　Ｂ−１
５９７３のもとで入手することができる大腸菌に１２　
　ＳＦ８／ｐＫＣ４６２Ａから得ることができる。実施
例１の記載に実質的に従って細胞からプラスミドＤＮＡ
を抽出した。プラスミドｐＫＣ４６２Ａのアブラマイシ
ン耐性付与遺伝子が、約１．５ｋｂ　ＢａｍＨＩ　−Ｐ
ｓｔ　Ｉ制限フラグメント上に見出された。Ｈ２Ｏ１０
μσ中のプラスミ　ドｐＫＣ４６２Δ　ＤＮＡ約１ｕ９
と、　１０ＸＰｓｔ■緩衝液２μｇ、Ｈ，０７μＱおよ
び制限酵素Ｐｓｔｒとを混合して、このフラグメントを
単離した。３７℃で１時間インキュベートした後、この
混合物に、ｌＱＸＢａｍＨＩ緩衝液［２０ＱｘＭ　Ｔｒ
ｉｓ　・Ｈ（Ｊ（ｐＨｓ、０）、ＬＭ　ＮａＣＱおよび
７Ｑａ＋ＭＭｇＣＱ、１３μｍ２．Ｈｔ○６μσおよび
制限酵素１肋Ｈ１ｌμＱを加え、３７°Ｃでさらに１時
間インキュベーションし続けた。

次いで、所望の〜１．５ｋｂ制限フラグメントが他の消
化生成物と明確に分離されるまで、１％アガロースゲル
を用いて、Ｐｓｔ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ消化プラスミドｌ
１ｌＫＣ４６２Ａを電気泳動にかけた。電気泳動にかけ
たＤＮＡの視覚化は、臭化エチジウムの希溶液（０，５
μ９／ｍｃ）中でゲルを着色し、長波長ＵＶ光に着色さ
れたゲルを曝すことによって達せられる。所望のフラグ
メントの位置を決めた後、フラグメントの前方のゲル中
に小さいスリットヲつくり、シュライヒャー・アンド・
ジュール［５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅ
ｌｌ（Ｋｅｅｎｅ、　Ｎ　Ｈ０３４３１）コＮＡ−４５
ＤＥＡＥ膜の微小片をスＩハツト中に置く。次に電気泳
動することによって、〜１．５ｋｂＰ　ｓｔ　Ｉ　−Ｂ
　ａｍＨＩ制限フラグメントはＤＥＡＥ膜に非共有的に
結合する。所望のフラグメントがＤＥＡＥ膜に結合した
後、膜を除去し、低塩緩衝液（１５０ｘＭ　ＮａＣＱ：
０．１ｔＭ　ＥＤＴＡ；および２０ｘＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＬ　ｐ［（−８，）で洗浄する。次に、膜を小さい管
に入れ、高塩緩衝液（１ＭＮａＣｆ２；　０．１ｔＭ　
ＥＤＴＡ　；および２ＱｘＭ　ＴｒｉｓＨＣＩ２、ｐＨ
＝　８　＞中に浸漬し、次いで、６５°Ｃで１時間イン
キュベートし、ＤＥＡＥ紙からＤＮＡを溶離した。６５
℃でインキュベートした後、インキュベーション緩衝液
を回収し、膜を高塩緩衝液で洗浄した。所望のＤ　Ｎ　
Ａフラグメントを回収する前に、洗浄溶液をインキュベ
ーション緩衝液と一緒にプールした。

同様に、プラスミドｐＵｃＩ９（ＢＲＬから入手、Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８７
７）を制限酵素Ｐｓｔ■およびＢａｍＨｌで消化し、次
いで、電気泳動にかけ、上記に従って〜２．７ｋｂベク
ターフラグメントを単離した。次いで、ｐＵｃＩ９の精
製した消化ベクターフラグメントをＴＥ緩衝液５０μＣ
に！ヒ：蜀させた。Ｐｓｔ　Ｉ　−ＢａａＨＩ−ｉ肖化
プラスミドｐＵｃＩ９　　ＤＮＡ（１μＩ２）を、プラ
スミドｐＫＣ４６２、Ａの〜１．５ｋｂアブラマイシン
耐性付与Ｂ　ａ　ｍＨｌ−Ｐｓｔｌ制限フラグメント１
０μ（！（〜０．５ｕｙ）、１０Ｘリガーゼ緩衝液ｒ５
５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２、ｐＨ＝８　；　６６１
１Ｍ　ＭｇＣ１２ｔ　；　ｌ　ＯバＭジチオトレイトー
ル（ＤＴＴ）；および１０ｘＭＡＴＰｌ、およびＨ７０
６μＱに加えた。Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ約１μＱ（〜
１００ユニット）を、ＤＮＡ溶液に加え、得られた溶液
を１５°Ｃで一晩（〜１６時間）インキュベートした。

ライゲーションの結果、得られた〜４．２ｋｂプラスミ
ドをプラスミドｐＯＪ１０７と称する。プラスミドｐＯ
Ｊ１０７の制限部位および機能地図を第３図に示す。

形質転換に関する成分である大腸菌に１２　ＭＭ２９４
細胞を産生ずるために、ＮＲＲＬから入手した大腸菌Ｋ
１２ＭＭ２９４（取得番号ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５６２５
、寄託臼１９８３年９月２８０）の凍結乾燥品を再構築
して単一コロニーを単離した。ＭＭ２９４の１つの単一
コロニーをＬブロス５ＭＱ中に接種し、培養物を３７°
Ｃで一晩曝気しながらインキュベーションした。−晩培
養物５０Ｉ７１２を用いてＬブロス５酎に接種した。培
養物を３７°Ｃで一晩曝気しながらインキュベートした
。翌朝、培養物をＬグロスで２００１に希釈した。５５
０ｎｍでの吸収（Ａ６．。）が約０．５になるまで、希
釈培養物を３７°Ｃで曝気しながらインキュベートした
。

これは約ｌＸｌ０”細胞／ｎρの細胞密度を示した。

培養物を氷水浴中で１０分間冷却し、次いで４℃で４０
００Ｘ９で１０分間遠心分離することによって細胞を回
収した。細胞ペレットを冷１０．ｖＭＮａＣρ１００酎
中に再懸濁し、次に、遠心分離によって再ペレット化し
た。細胞ベレットを３ＱｉＭＣａＣＱ、１００ｍＱに再
懸濁し、水上て２０分間インキュベートした。

細胞を遠心によって再度回収し、３０ｘＭｃａＣ１２，
１０ｘ（！中に再懸濁した。細胞の微量試料１゜５ｔＱ
を、上記で得られたライゲートＤＮＡに加えた。細胞−
ＤＮＡ混合物を水上で１時間インキュベートし、４２°
Ｃで９０秒間熱ショック処理し、次いで、約２分間水上
で冷却した。細胞−ＤＮＡ混合物を遠心分離し、１．５
ＦＩ１２の管中、Ｌグロス０．１５１１２中に細胞ペレ
ットを再懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。

形質転換混合物の微量試料を、アブラマイシン１００μ
９／ｖｔＱを含有するし一寒天プレートに増殖した。プ
レートを３７℃で一晩インキユベートした。いくつかの
アブラマイシン耐性コロニーを選択し、次いで、〜１．
５ｋｂＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ制限フラグメントの存在下
、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によってスクリーン
した。実施例１の記載に実質的に従って、大腸菌に１２
　ＭＭ２９４／ｐＯＪ１０７形質転換体からプラスミド
ＤＮＡを得た。

Ｂ、ブラスミＦｐＣＺＡ１５０およびｐＣＺＡＩ５１の
構築 約２．　ｌｋｂ　ＨｉｎｄｌＩｌ制限フラグメントにｌ
５４９３を含有するプラスミドｐＣＺＡ１４１は、ＮＥ
ＥＬから取得番号ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８４１７のもとで
入手することができ、大腸菌に１２　　ＪＭ１０９／ｐ
ＣＺＡ１４１から得られる。プラスミドｐＣＺＡ１４１
の制限部位および機能地図を第２図に示す。実施例１の
記載に実質的に従って細胞からプラスミドＤＮＡを抽出
し、次いで、Ｈｉｎｄｒｌｌ制限酵素１ｕＱおよび１０
ＸＨｉｎｄＩＩＩ緩衝液［５００１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｆ２（ｐＨ＝８．０）、１０１０Ｏｘ　ｇ　Ｇ　（１２
および５００ｐｔＭ　ＮａＣ（ｌコ２ｕ（ｌを用イタ以
外は、実施例５Ａの記載に実質的に従ってプラスミドｐ
ＣＺＡ１４１約５μ９を消化した。このＨｉｎｄ■消化
後、実施例５Ａの記載に実質的に従って〜２、　ｌ　ｋ
ｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌ制限フラグメントをアガロースゲル
から単離した。

次いで、プラスミドｐＯＪ１０７約１μ９を制限酵素Ｈ
ｉｎｄＩ［［で消化し、上記に従って、線形ベクターを
単離した。次に、実施例５Ａの記載に実質的に従って、
プラスミドｐＣＺＡ１４１の〜２．１ｋｂＨｉｎｄｎ［
制限フラグメントをＨ１ｎｄＩＩＩ　消化ベクターｐＯ
Ｊ１７０にライゲートした。このライゲーション混合物
を大腸菌ＭＭ２９４細胞に形質転換した後、得られたア
ブラマイシン耐性コロニーから単離したプラスミドを制
限消化によって分析した。　〜２．９ｋｂおよび〜３．
４ｋｂ　Ｓａｕｌ−ＢａｍＨＩ制限フラグメントを含有
するこれらのプラスミドをプラスミドｐＣＺＡＩ５１と
弥する。プラスプラスミドｐＣＺＡ１５０およびｐＣＺ
Ａ１５１１７）制限部位および機能地図を第３図に示す
。

実施例５Ａの記載に実質的に従って、プラスミドｐＣＺ
Ａ１５０約１０μ９を制限酵素ＢａｍＨＩで消化した。

次いで、この線形ベクターフラグメントを精製し、Ｈ２
Ｏ９０μｅおよびＩＯＸ線豆ヌクレアーゼ緩衝液「Ｍｕ
ｎｇ　Ｂｅａｎ　ＮｕｃＩｅａｓｅ　ｂｕｆｆｅｒＪ（
３００１１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ＝４．６　；　５０
０ｙＭＮａｃ（！および１０ｍＭ　ＺｎＣＣｔ）１０Ｊ
ｉＱに溶解した。緑豆ヌクレアーゼ（ファルマシア）１
０ユニツトを加え、混合物を３７℃で１０分間インキュ
ベートし、次いで、フェノール／クロロホルム（１：１
）混合物で抽出した。水相に３Ｍ酢酸ナトリウムを容ｆ
ｆ１ｌ：ｔｏの割合でエタノール３容量と一緒に加えた
。−７０℃で１０分間インキュベートした後、工、ペン
ドルフ遠心分離器で試料を５分間遠心分偏し、液体を捨
てた。ベレットを７０％エタノールで洗浄し、次いで、
風乾し、ＴＥ２０μｇに再懸濁した。

同様に、プラスミドｐＣＺＡ１４１の〜２．１ｋｂＨｉ
ｎｄｌｌｌ制限フラグメント（実施例５Ｂで単離した）
を緑豆ヌクレアーゼで処理し、端部を平滑化した。次い
で、実施例５Ａの記載に実質的に従って、これらの端部
を平滑化したプラスミドｐＣＺＡ１４１の〜２．　ｌｋ
ｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントを、ＢａｍＨＩ−
切断緑豆ヌクレアーゼ処理したプラスミドｐＣＺＡ１５
０にライゲートした。大腸菌に１２ＭＭ２９４細胞に形
質転換した後、アブラマイシン耐性コロニーから単離し
たプラスミドを制限酵素ΣａｕｉおよびＳ　ｍａ　Ｉで
消化した。〜５゜３ｋｂ、〜２．９３ｋｂ、および〜０
．２３ｋｂ制限フラグメントを含有するこれらのプラス
ミドをプラスミドｐＣＺＡ１５２と称し、〜３．６３ｋ
ｂ、〜２゜９３ｋｂおよび〜１．９ｋｂ制限フラグメン
トを含有するこれらのプラスミドをｐＣＺＡ１５３と称
する。ｐＣＺＡ１５２およびｐＣＺＡ１５３の制限部位
および機能地図を第４図に示す。

プラスミドｐＣＺＡ１５１約１０μ９を制限酵素Ｂａｍ
Ｈ［で消化し、上記に従って緑豆ヌクレアーゼで処理し
た。次いで、プラスミドｐＣＺＡ１４１由来の〜２．　
ｌｋｂ　ＨｉｎｄＩ［Ｉ−切断緑豆ヌクレアーゼ処理制
限フラグメント約１μ９を、上記に実質的に従って、Ｂ
ａｍＨＩ−緑豆ヌクレアーゼ処理プラスミドｐＣＺＡ１
５１にライゲートした。大腸菌ＭＭ２９４細胞に形質転
換した後、アブラマイシン耐性コロニーから単離したプ
ラスミドを制限酵素５ａｕｌおよびＳ　ｍａ　Ｉて消化
した。〜４．６ｋｂ。

〜１．９６ｋｂおよび〜１．９ｋｂ制限フラグメントを
含有するこれらのプラスミドをプラスミドｐＣＺＡ１５
４と称し、〜４　、６　ｋｂ、〜３．６３ｋｉ）および
〜０．２３ｋｂ制限フラグメントを含有するこれらのプ
ラスミドをプラスミドＰＣＺＡ１５５と称する。プラス
ミドｐＣＺＡ１．５４およびプラスミドｐＣＺＡ１５５
の制限部位および機能地図を第５図に示す。

次に、実施例２の記載に従って、プラスミドｐＣＺＡ１
５２、ｐＣＺＡ１５３、ｐＣＺＡ１５４およびｐＣＺＡ
１５５のプールをストレプトマイセス・リビダンスＣＴ
２に形質転換した。増殖した細胞に、最終濃度２５μｇ
／ｍ（ｌのアブラマイシン層をかぶせた。アブラマイシ
ン耐性コロニーの発生が、アプラマイ／ン耐性付与遺伝
子がストレフトマイセス・リビダンス染色体に組み込ま
れた転移を示す。

【図面の簡単な説明】 第１図は、プラスミドｐＣＺＡ１２６の制限部位および
機能地図を示す模式図である。 第２図は、プラスミドｐＣＺＡ１４１の制限部位および
機能地図を示す模式図である。ＴＳ４９３の矢印は発表
された配列の５°−３”配向を示しており、転写および
読み取り枠とは無関係である。 第３図は、プラスミドｐＣＺＡ１５０およびｐＣＺＡ１
５１の制限部位および機能地図を示す模式第４図は、プ
ラスミドｐＣＺＡ１５２およびｐＣＺＡ１５３の制限部
位および機能地図を示す模式第５図は、プラスミドｐＣ
ＺＡ１５４およびｐＣＺＡ１５５の制限部位および機能
地図を示す模式特許出願人イーライ・リリー・アンド・
カンパニー代理　人　弁理士　青　山　葆　はが１名Ｆ
ＩＧ、１ プラスミドｐＣＺＡ１２６ （〜８．７ｋｂ） ｄｅＩ ＦＩＧ、２ プラスミドｐＣＺＡ１４１ （〜４．８ｋｂ） ＨｉｎｄＩＩＩ ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、転位因子について細胞培養をスクリーニングする方
   法であって、 （ａ）（１）リプレッサー機能をコードする遺伝子を含
   有するＤＮＡセグメント、 （２）該リプレッサー機能が発現する場合は第２宿主細
   胞において機能的でなく、該リ プレッサー機能が発現しない場合は第２ 宿主細胞において機能的であるリプレッ シブルプロモーター、 （３）発現が該リプレッシブルプロモーターによって作
   動される選択マーカー、 （４）第２宿主細胞において機能的である複製起源、お
   よび （５）第１宿主細胞において機能的である第２複製起源 を含有する組換えＤＮＡクローニングベクターによって
   第１宿主細胞の培養を形質転換、トランスフェクション
   、または形質導入すること、 （ｂ）第２宿主細胞においてリプレッサー機能をコード
   する遺伝子を含有する該ＤＮＡセグメント中に転位因子
   を導入するのに適している条件下、工程（ａ）において
   形質転換、トランスフェクションまたは形質導入された
   宿主細胞を培養すること、 （ｃ）工程（ｂ）において培養された宿主細胞から単離
   された組換えＤＮＡクローニングベクターＤＮＡによっ
   て第２宿主細胞の培養を形質転換、トランスフェクショ
   ン、または形質導入すること、および （ｄ）工程（ａ）のベクターに含まれているマーカーが
   発現するように選択された条件下で工程（ｃ）において
   形質転換、トランスフェクションまたは形質導入した第
   ２宿主細胞の培養を培養することによって、第１宿主細
   胞が転位因子を含むか否かを決定すること、 からなり、第１宿主細胞および第２宿主細胞が形質転換
   、トランスフェクションまたは形質導入され得るもので
   あることを条件とするスクリーニング方法。 ２、組換えＤＮＡクローニングベクターがさらに、発現
   したリプレッサー機能の存在下で第２宿主細胞において
   機能的である第２選択マーカーを含む請求項１に記載の
   スクリーニング方法。 ３、組換えＤＮＡクローニングベクターがさらに、第１
   宿主細胞において機能的である第３選択マーカーを含む
   請求項２に記載のスクリーニング方法。 ４、組換えＤＮＡクローニングベクターがプラスミドで
   ある請求項３に記載のスクリーニング方法。 ５、プラスミドが、 λバクテリオファージｃＩ８５７のリプレッサー機能を
   コードする遺伝子を含有するＤＮＡセグメント、 直列的に機能するλバクテリオファージＰ＿ＲおよびＰ
   ＿Ｌプロモーター、 アプラマイシン耐性付与遺伝子である、該直列的リプレ
   ッシブルプロモーターによって作動する選択マーカー、 プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起源である第１複製
   起源、 アンピシリン耐性付与遺伝子である第２選択マーカー、 プラスミドｐＨＪＬ４００のＳＣＰ２＾＊誘導体複製起
   源である第２複製起源、および チオストレプトン耐性付与遺伝子である第３選択マーカ
   ー を含有する請求項４に記載のスクリーニング方法。 ６、プラスミドが第１図に示されるプラスミドｐＣＺＡ
   １２６である請求項５に記載のスクリーニング方法。 ７、第１宿主細胞がストレプトマイセス・リビダンスＣ
   Ｔ２であり、第２宿主細胞が大腸菌である請求項６に記
   載のスクリーニング方法。 ８、転位因子を挿入した組換えＤＮＡクローニングベク
   ターを含有する宿主細胞の選択方法であって、 （ａ）（１）リプレッサー機能をコードする遺伝子を含
   有するＤＮＡセグメント、 （２）該リプレッサー機能が発現する場合は第２宿主細
   胞において機能的でなく、該リ プレッサー機能が発現しない場合は第２ 宿主細胞において機能的であるリプレッ シブルプロモーター、 （３）発現が該リプレッシブルプロモーターによって作
   動される選択マーカー、 （４）第２宿主細胞において機能的である複製起源、お
   よび （５）第１宿主細胞において機能的である第２複製起源 を含有する組換えＤＮＡクローニングベクターによって
   転位因子含有第１宿主細胞を形質転換、トランスフェク
   ションまたは形質導入すること、 （ｂ）第２宿主細胞においてリプレッサー機能をコード
   する遺伝子を含有する該ＤＮＡセグメント中に転位因子
   を導入するのに適している条件下、工程（ａ）において
   形質転換、トランスフェクションまたは形質導入された
   宿主細胞を培養すること、および （ｃ）工程（ｂ）において培養された宿主細胞から単離
   された組換えＤＮＡクローニングベクターＤＮＡによっ
   て第２宿主細胞の培養を形質転換、トランスフェクショ
   ンまたは形質導入し、工程（ａ）のベクターに含まれて
   いるマーカーが発現するように選択された条件下で培養
   すること からなり、第１および第２宿主細胞が形質転換、トラン
   スフェクションまたは形質導入され得るものであること
   を条件とする選択方法。 ９、組換えＤＮＡクローニングベクターがさらに発現さ
   れたリプレッサー機能の存在下で第２宿主細胞において
   機能的である第２選択マーカーを含む請求項８に記載の
   選択方法。 １０、組換えＤＮＡクローニングベクターがさらに第１
   宿主細胞において機能的である第３選択マーカーを含む
   請求項９に記載の選択方法。 １１、組換えＤＮＡクローニングベクターがプラスミド
   である請求項１０に記載の選択方法。 １２、プラスミドが、 λバクテリオファージｃＩ８５７のリプレッサー機能を
   コードする遺伝子を含有するＤＮＡセグメント、 直列的に機能するλバクテリオファージＰ＿ＲおよびＰ
   ＿Ｌプロモーター、 アプラマイシン耐性付与遺伝子である、該直列的リプレ
   ッシブルプロモーターによって作動する選択マーカー、 プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起源である第１複製
   起源、 アンピシリン耐性付与遺伝子である第２選択マーカー、 プラスミドｐＨＪＬ４００のＳＣＰ２＾＊誘導体複製起
   源である第２複製起源、および チオストレプトン耐性付与遺伝子である第３選択マーカ
   ー を含有する請求項１１に記載の選択方法。 １３、プラスミドがプラスミドｐＣＺＡ１２６である請
   求項１２に記載のスクリーニング方法。 １４、第１宿主細胞がストレプトマイセス・リビダンス
   ＣＴ２であり、第２宿主細胞が大腸菌である請求項１３
   に記載の選択方法。 １５、組換えＤＮＡクローニングベクター中に転位因子
   を捕獲し、該転位因子を単離する方法であって、 （ａ）（１）リプレッサー機能をコードする遺伝子を含
   有するＤＮＡセグメント、 （２）該リプレッサー機能が発現する場合は第２宿主細
   胞において機能的でなく、該リ プレッサー機能が発現しない場合は第２ 宿主細胞において機能的であるリプレッ シブルプロモーター、 （３）発現が該リプレッシブルプロモーターによって作
   動される選択マーカー、 （４）第２宿主細胞において機能的である複製起源、お
   よび （５）第１宿主細胞において機能的である第２複製起源 を含有する組換えＤＮＡクローニングベクターによって
   転位因子含有第１宿主細胞を形質転換、トランスフェク
   ションまたは形質導入すること、 （ｂ）第２宿主細胞においてリプレッサー機能をコード
   する遺伝子を含有する該ＤＮＡセグメント中に転位因子
   を導入するのに適している条件下、工程（ａ）において
   形質転換、トランスフェクションまたは形質導入された
   宿主細胞を培養すること、 （ｃ）工程（ｂ）において培養された宿主細胞から単離
   された組換えＤＮＡクローニングベクターＤＮＡによっ
   て第２宿主細胞の培養を形質転換、トランスフェクショ
   ンまたは形質導入し、工程（ａ）のベクターに含まれて
   いるマーカーが発現するように選択された条件下で培養
   すること、および （ｄ）形質転換、トランスフェクションまたは形質導入
   し、工程（ｃ）の条件下で培養した第２宿主細胞から単
   離した組換えＤＮＡクローニングベクターＤＮＡから転
   位因子を単離すること からなる捕獲および単離方法。 １６、組換えＤＮＡクローニングベクターがさらに発現
   されたリプレッサー機能の存在下で第２宿主細胞におい
   て機能的である第２選択マーカーを含む請求項１５に記
   載の捕獲および単離方法。 １７、組換えＤＮＡクローニングベクターがさらに第１
   宿主細胞において機能的である第３選択マーカーを含む
   請求項１６に記載の捕獲および単離方法。 １８、組換えＤＮＡクローニングベクターがプラスミド
   である請求項１７に記載の捕獲および単離方法。 １９、プラスミドが、 λバクテリオファージｃＩ８５７のリプレッサー機能を
   コードする遺伝子を含有するＤＮＡセグメント、 直列的に機能するλバクテリオファージＰ＿ＲおよびＰ
   ＿Ｌプロモーター、 アプラマイシン耐性付与遺伝子である、該直列的リプレ
   ッシブルプロモーターによって作動する選択マーカー、 プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起源である第１複製
   起源、 アンピシリン耐性付与遺伝子である第２選択マーカー、 プラスミドｐＨＪＬ４００のＳＣＰ２＾＊誘導体複製起
   源である第２複製起源、および チオストレプトン耐性付与遺伝子である第３選択マーカ
   ー を含有する請求項１８に記載の捕獲および単離方法。 ２０、プラスミドがプラスミドｐＣＺＡ１２６である請
   求項１９に記載の捕獲および単離方法。 ２１、第１宿主細胞がストレプトマイセス・リビダンス
   ＣＴ２であり、第２宿主細胞が大腸菌である請求項２０
   に記載の捕獲および単離方法。 ２２、ＤＮＡ配列の１本の鎖が以下の配列：【遺伝子配
   列があります。】 （式中、 Ａはデオキシアデニルであり、 Ｃはデオキシシチジルであり、 Ｇはデオキシグアニルであり、 Ｔはチミジルである） を含有する転位因子ＩＳ４９３を含有している組換えＤ
   ＮＡ化合物。 ２３、請求項２２に記載のＩＳ４９３配列を含有する組
   換えＤＮＡクローニングベクター。 ２４、プラスミドである請求項２３に記載の組換えＤＮ
   Ａクローニングベクター。 ２５、第２図に示すプラスミドｐＣＺＡ１４１、第３図
   に示すプラスミドｐＣＺＡ１５０、第３図に示すプラス
   ミドｐＣＺＡ１５１、第４図に示すプラスミドｐＣＺＡ
   １５２、第４図に示すプラスミドｐＣＺＡ１５３、第５
   図に示すプラスミドｐＣＺＡ１５４または第５図に示す
   ｐＣＺＡ１５５である請求項２４に記載の組換えＤＮＡ
   クローニングベクター。