JPH02145941A

JPH02145941A - 細胞分析装置

Info

Publication number: JPH02145941A
Application number: JP63298117A
Authority: JP
Inventors: Isao Yamazaki; 功夫山崎; Hiroshi Oki; 博大木; Akira Miyake; 亮三宅; Norio Kaneko; 金子　紀夫; Hideyuki Horiuchi; 堀内　秀之
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1988-11-28
Filing date: 1988-11-28
Publication date: 1990-06-05

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、細胞分析装置に係り、特に、細胞懸濁液を毛
細管流路に流し、またはノズルから噴出し、個々の細胞
に光を照射し細胞からの散乱光または蛍光により細胞分
析する装置において多項目分析をするのに好適な細胞分
析装置に関するものである。

〔従来の技術〕

従来から、細胞を流しながら光計測をし、細胞分析をす
る装置、いわゆるフローサイトメータでは、細胞懸濁液
を測定部に安定に、しかも目詰まりなく流すために層流
状態の急激な縮流を利用して、細胞懸濁液を生理食塩水
で包み込むようにして流す方式を採用している。

この方式はシースフロ一方式と呼ばれ、シースフローで
細胞懸濁液を十分に絞り込むと、懸濁している細胞は一
列に並んだ細胞列となる。その細胞の個々の形状、大き
さ９種類を分析するために、細胞にレーザ光などの連続
光を照射し、細胞から発する散乱光強度と、予め蛍光標
識を付けておいた特定の細胞から発する蛍光強度とを測
定している。散乱光強度は、集光する角度により細胞の
異なる情報を反映し、蛍光は染料の種類や状態によって
波長が異なるので検出波長によって異なる情報を反映す
る。したがって、散乱光の集光範囲や蛍光の検出波長を
複数組用いることにより、細胞の複数の情報が得られる
。

これらの情報を含んだ信号を信号処理系でアナログデジ
タル変換したのち、計算機で統計処理して細胞の形状、
大きさ２種類を分析する。

測定を行っている最中にどのような信号が得られている
かを監視する方法としては、例えば特開昭５０−７５４
７３号公報記載の技術が知られている。

すなわち、２つの蛍光量の信号をサンプルホールド回路
を通してオシロスコープのＸ軸およびＹ軸に接続するも
のであった。サンプルホールド回路は１つの蛍光量の信
号が一定の値を越えた場合にサンプルし、次に再び信号
が一定の値を越えるまではサンプルした電圧値を保持す
る。この方法によれば、個々の細胞に対する２つの信号
の相関をオシロスコープ上の点として観察でき、同じ種
類の細胞からの信号点は近くに集まるので５細胞の種類
毎の個数の違いを視覚的に捕えることができる。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記従来技術は、サンプルホールド回路の出力信号をオ
シロスコープのＸ軸およびＹ軸に入力するものであり、
２つの信号の情報しか表示できなかった。また、オシロ
スコープ上の光点の明るさは光っている時間に比例する
ため、細胞の通過する不規則な時間間隔によって光点強
度が変化して精度が悪くなるということについて配慮さ
れていなかった。

そこで、これらの問題を解決するために、アナログ信号
を監視せずにアナログディジタル変換した信号を計算機
で統計処理した結果を表示して監視する方法があるが、
この方法では統計処理に時間を要するため、測定しなが
ら信号を監視することができなかった。測定しながら信
号を監視するためには高価な高速の計算機を用いるか、
または計算速度が間に合うように単位時間に測定する細
胞の数を減らさなければならなかった。

本発明は、上記従来技術の問題点を解決するためになさ
れたもので、オシロスコープ上の光点の輝度を変化させ
て、正確に、しかも詳しい分析ができる。安価で高精度
の信号監視系を備えた細胞分析装置を提供することを、
その目的とするものである。

〔課題を解決するための手段〕

上記目的を達成するために、本発明に係る細胞分析装置
の構成は、細胞懸？１ｉａ油を加圧して光学焦点上へ送
り込む細胞フロー系と、この細胞フロー系から流下して
いく流れの中に浮遊している細胞に強力な光を照射して
その細胞から放射される複数の種類の光を検出する照射
測定光学系と、この照射測定光学系からの信号により細
胞の種類、大きさ、形状などを分析する信号処理系とを
備えた細胞分析装置において、前記照射測定光学系から
の信号電圧のピークを検出して一定時間継続する一定電
圧のパルス信号を出力する回路と、そのパルス信号が出
力されている間型圧を保持しているサンプルホールド回
路の信号を出力する回路とを設けたものである。

より詳しくは、細胞ｌｌ！濁液を加圧して光学焦点上へ
送り込む細胞フロー系と、この細胞フロー系から流下し
ていく流れの中に浮遊している細胞に強力な光を照射し
てその細胞から放射される複数の種類の光を検出する照
射測定光学系と、この照射測定光学系からの信号により
細胞の種類、大きさ、形状などを分析する信号処理系と
を備えた細胞分析装置において、前記照射Ｋｌ’ｌ定光
学蓄光学系信号電圧のピークを検出するピーク検出回路
と。

信号のレベルを判定していくつかの場合に分ける判別回
路と、前記ピーク検出回路からの信号によって動作し前
記判別回路からの信号によって継続時間または電圧が変
化するパルス信号を作り出すパルス信号発生回路とを備
え、このパルス信号発生回路からの信号を取り出す端子
を設けたものである。

〔作用〕

上記技術的手段の働きを次に述べる。

ピーク検出回路は、散乱光強度または蛍光強度の信号が
ピークに達した瞬間、すなわち細胞が検出領域の中心を
通過する瞬間を検出し、ピーク検出信号を発生する。

判別回路は、測定している複数の散乱光および蛍光の信
号のうちいくつかに対して、あらかじめ設定した範囲の
中に信号レベルが入っているがどうかを判定してハイレ
ベルまたはローレベルの判別信号を出す。

パルス信号発生回路は、ピーク検出回路からピーク検出
信号が入力した場合に１個のパルス信号を発生する。そ
のパルス信号は、判別回路からの信号がハイレベルの場
合は継続時間が長いか、または電圧が高い、ローレベル
の場合は継続時間が短いか、または電圧が低い。

サンプルホールド回路は、複数の散乱光および蛍光の信
号のそれぞれに接続されており、ピーク検出回路のピー
ク検出信号によってそれぞれの信号のピーク値をサンプ
ルし、パルス発生回路からパルス信号が出ている間、電
圧を保持する。複数の散乱光および蛍光の信号のうち２
つが選ばれ。

サンプルホールド回路を通ってそれぞれオシロスコープ
のＸ軸およびＹ軸へ入力する。また、パルス発生回路の
パルス信号は、オシロスコープの輝度変調端子（Ｚ軸）
に入力する。それによって。

オシロスコープはパルス信号が加わっている間だけ光る
ため、個々の細胞の信号強度を表わす光点の明るさは、
パルス信号の継続時間と電圧とによって決まり、前記判
別回路で同じ領域と判別された信号に対しては同じ明る
さとなる。

測定は短時間に多数の細胞を流して行うので。

オシロスコープ上には多数の光点が呪われるが。

同じ条件の細胞に対しては一つ一つの光点の強度が等し
いため、オシロスコープ上の光点群の明るさが細胞の個
数を正確に表わし、精密な監視が可能となる。また、選
別回路で設定された条件の中の細胞を表わす光点は明る
く、設定された条件の外の細胞を表わす光点は暗く光る
ため、異なる種類の細胞からの信号の分布の違いを光点
の明るさの違いから判断することができ、より詳しい信
号の監視が可能になる。

〔実施例〕

以下、本発明の各実施例を第１図ないし第７図を参照し
て説明する。

第１図は、本発明の一実施例に係る細胞分析装置の構成
図、第２図は、第１図の装置の動作を説明するタイミン
グチャート、第３図は、パルス発生回路で発生するパル
スの形を示す説明図、第４図、第５図、第６図は、いず
れも、第１図の装置による分析例を示すオシロスコープ
画面における光点分布図である。

第１図において、ｌは、アルゴンレーザなどの光源、２
は、透明な７０−セル、３はノズル、６は、フローセル
２内を貫通する毛細管部で、これらで細胞フロー系を構
成している。８，１０はレンズ、１１．１２は二色柱鏡
、１３．１５は光学フィルタで、これらと光源１とで照
射測定光学系を構成している。９，１４，１６，１７は
光検出器、１８，１９，２０，２１はプリアンプ、２２
゜２３は対数増幅回路、２４は、信号のレベルを判定す
る判別回路、２５は、照射測定光学系からの信号電圧の
ピークを検出するピーク検出回路、２６は、そのピーク
検出回路２５からの信号によって動作し、前記判別回路
２４からの信号によって継続時間または電圧が変化する
パルス信号を作り出すパルス発生回路、２７，２８，２
９，３０はサンプルホールド回路、３１．３２はスイッ
チ、３３はオシロスコープ、３４は、その画面である。

第１図に示すように、細胞を懸濁した液（以下細胞ｍ濁
液という）の流れ４は、ノズル３を通って透明なフロー
セル２の中に注入されろ。フローセル２には保護液５も
注入され、毛細管部６の中で保護液５が細胞懸濁液４を
包み込んで流れる非常に細いシースフローが形成される
。毛細管６中で細胞懸濁液の流れ４は光源１からの細く
て強い光線７に照射される。

細胞は、光線７が照射されると散乱光および蛍光を放射
する。光線７に対して前方に放射される前方散乱光はレ
ンズ８で集められ、光検出器９で検出される。光８７に
対して直角方向に放射される散乱光および蛍光はレンズ
１０で集められ、光検出器１７，１４．１６で検出され
る。光検出器１６で検出するものは、二色性鎧１１で反
射し光学フィルタ１５を透過した赤色蛍光である。光検
出器１４で検出するのは、別の二色性鏡１２で反射し光
学フィルタ１３を透過した緑色蛍光である。

光検出器１７で検出するのは、側方散乱光である。

細胞が光線７の照射位置を通過するとき、光検出器１７
，９，１４．１６からはパルス的な信号が出力され、そ
れぞれプリアンプ１８，１９゜２０．２１で増幅される
。ピーク検出回路２５は、第２図のタイミングチャート
で示されるように、プリアンプ１９の出力信号がピーク
になる瞬間を検出し、パルス発生回路２６に出力する。

判別回路２４はプリアンプ１８および１９の信号を入力
してそれぞれの信号が第２図のＹｌ、Ｙ２およびＸｉ、
Ｘ２で示されるしきい値３５に入っているかどうかを判
定し、両方の信号がしきい値の間に入っている場合はハ
イレベルを、そうでない場合にはローレベルを出力する
。しきい値ＸＩ、Ｘ２゜Ｙｌ、Ｙ２は自由に設定できる
。

パルス発生回路２６は、長さを自ぽ口こ変えられる２種
類のパルスを発生することができ、ピーク検出回路２５
から信号が入力した瞬間に判別回路２４からの信号がハ
イレベルかローレベルかによりどちらかのパルスを発生
する。

プリアンプ２０．２１の出力は、サンプルホールド回路
２９．３０に入力する前に対数増幅回路２２．２３を通
り、低いレベルの信号が増幅される。サンプルホールド
回路２７，２８，２９゜３０は、それぞれの信号のピー
ク値を取り込み、パルス発生回路２６からパルスが出て
いる間電圧を保持し、パルスが終了後リセットされる。

オシロスコープ３３の輝度変調端子（Ｚ軸）には、パル
ス発生回路２６からの信号が接続される。

水平偏向端子（Ｘ軸）および垂直偏向端子（Ｙ軸）には
、それぞれスイッチ３１．３２で選択されたピークホー
ルド回路の出力が接続される。

第１図に示す実施例の細胞分析装置の典型的な使用法に
ついて説明する。

試料として、赤血球を溶血した血液に、２種類のモノク
ローナル抗体にそれぞれ緑色蛍光色素と赤色蛍光色素を
標識した試薬を反応させたものを用いる。モノクローナ
ル抗体は、細胞膜上の特定の物質（抗ＪＸ）にのみ反応
するものであり、これを用いることにより細胞股上の特
定の抗原の有無を調べることができる。この試料を、毎
秒５０００個程度０細胞が流れるように濃度を′＃４整
して用いる。

まず、スイッチ３１．３２で、オシロスコープのＸ４！
ＩｉＩにはサンプルホールド回路２８の信号、すなわち
前方散乱光を、Ｙ軸にはサンプルホールド回路２７の信
号、すなわち側方散乱光を選択する。

すると、オシロスコープの画面３４上には、典型的な場
合、第４図のような光点分布が呪われる。

明るい光点群を符号３６．３７，３８．３９で表わすと
、３６は血小板、３７はリンパ球、３８は多核白血球、
３９は単球が大部分を占める。次に、判別回路２４のし
きい値３５を設定する。例えば第４図のようにＸｉ、Ｘ
２．Ｙｌ、Ｙ２を設定すれば、しきい値３５の中の点は
リンパ球３７となり、リンパ球３７の場合は判別回路２
４からハイレベルを、それ以外の場合はローレベルを出
力することになる。パルス発生回路２６で発生するパル
ス長さを、判別回路２４の信号がハイレベルの場合は１
００μｓ、ローレベルの場合は１０μＳと設定し、スイ
ッチ３１．３２を切り換えてオシロスコープ３３のＸ軸
にサンプルホールド回路２９の信号、すなわち緑色蛍光
を、Ｙ軸にサンプルホールド回路３０の信号、すなわち
赤色蛍光を入力すると、オシロスコープの画面３４上に
は第５図のような光点分布が現われる。第５図において
、光点群４０は緑色蛍光染料で標識したモノクローナル
抗体に対応する抗原と、赤色蛍光染料で標識したモノク
ローナル抗体に対応する抗原のどちらも持たない細胞群
、光点群４１は前者は持たないが後者は持つ細胞群、光
点群４３は前者は持つが後者は持たない細胞群、光点群
４２は両押とも持つ細胞群である。それぞれの中で、明
るい点はリンパ球であり、暗い点はリンパ球以外の細胞
である。光点の明るさの違いから、リンパ球の分布とそ
れ以外細胞の分布とを識別することが可能である。

パルス発生回路２６で発生するパルス長さを常に１０μ
ｓと設定した場合のオシロスコープの画面３４上の光点
分布を第６図に示す。この場合は、１つ１つの光点が全
て同じ明るさであるため、光点群の明るさが正確に細胞
の個数を表わす。

この実施例の場合は、しきい値３５の領域を自由に変え
られるので、どの領域の細胞群が抗体を持っているかを
調べることができ、詳しい分析ができる。また、光点群
の明るさを細胞の個数に正確に対応させることができる
ので、正確な分析ができる。さらに、蛍光強度は対数増
幅回路で弱い信号を増幅しているので、弱い信号でも分
析できる。特に、パルス信号でオシロスコープ３３を光
らせるため、信号が来ていない場合には画面３４が光ら
ず、分析のための雑音とならない。また、信号がない場
合にオシロスコープの原点が光って画面を損傷すること
がなく、装置の長寿命化を図ることができる。

この装］ｎは、さらにアナログデジタル変換器と計算機
に接続して詳しい分析を行うことができるが、あらかじ
め大まかな分析をしておくことにより計算機での分析を
効果的に行うことができる。

特に、この装置での分析は実時間で行えるため短時間で
行え、緊急を要する分析が可能である。

第３図は、パルス発生回路２６で発生するパルスの形を
示すものである。Ａは第１図の実施例で示したようにパ
ルスの継続時間を変化させるものである。この場合はパ
ルスの継続時間をいくらでも長くできるため、光点の明
るさの比を大きくとることができる。パルスが継続して
いる間に別の細胞が通過しても無視される。Ｂは、パル
スの継続時間は一定に保ち、電圧を変化させる例である
。

この場合は、パルス時間が短くてすむため、短時間に多
数の細胞が通過しても無視されることなく分析できる。

このように、本実施例によれば、オシロスコープ上の光
点の輝度を自由に変化させて分析ができるので、正確に
、しかも詳しい分析ができる。

第７図は１本発明の他の実施例に係る細胞分析装置の制
御回路部の構成図である。図中、第１１図と同一符号の
ものは同等部分であるから、その説明を省略する。

第７図の実施例では、判別回路２４Ａは、プリアンプ１
８．１９の信号のレベルを複数に分けて、複数の判別出
力端子４４のいずれか１つに出力する。乗算器４６は、
選択スイッチ４５で選んだ信号領域の１つと、ピーク検
出回路２５の出力との論理積をとり、その出力によりパ
ルス発生回路４７から一定長さ、一定電圧のパルスを発
生する。

パルス信号は、パルス出力端子４８から出力され。

オシロスコープのＺ軸（輝度変調端子）に人力される。

第７図の実施例によれば、先の実施例と同様の効果が期
待され、特に、選択スイッチ４５を切り換えることによ
り、各領域の細胞の分析を迅速に行うことができる。

〔発明の効果〕

以上述べたように、本発明によれば、オシロスコープ上
の光点の輝度を変化させて、正確に、しかも詳しい分析
ができる。安価で亮精度の信号監視系を備えた細胞分析
装置を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の一実施例に係る細胞分析装置の構成
図、第２図は、第１図の装置の動作を説明するタイミン
グチャート、第３図は、パルス発生回路で発生するパル
スの形を示す説明図、第４図、第５図、第６図は、いず
れも、第１図の装置による分析例を示すオシロスコープ
画面における光点分布図、第７図は１本発明の他の実施
例に係る細胞分析装置の制御回路部の構成図である。１・・・光源、２・・・フローセル、４・・・細胞懸濁
液、８゜１０・・・レンズ、１１．１２・・・二色性鏡
、９，１４゜１６．１７・・・光検出器、２４，２４Ａ
・・・判別回路、２５・・・ピーク検出回路、２６．４
７・・・パルス発生回路、２７，２８，２９，３０・・
・サンプルホールド回路、３３・・・オシロスコープ、
３４・・・画面。

Claims

【特許請求の範囲】１、細胞懸濁液を加圧して光学焦点上へ送り込む細胞フ
ロー系と、この細胞フロー系から流下していく流れの中
に浮遊している細胞に強力な光を照射してその細胞から
放射される複数の種類の光を検出する照射測定光学系と
、この照射測定光学系からの信号により細胞の種類、大
きさ、形状などを分析する信号処理系とを備えた細胞分
析装置において、前記照射測定光学系からの信号電圧の
ピークを検出して一定時間継続する一定電圧のパルス信
号を出力する回路と、そのパルス信号が出力されている
間電圧を保持しているサンプルホールド回路の信号を出
力する回路とを設けたことを特徴とする細胞分析装置。２、細胞懸濁液を加圧して光学焦点上へ送り込む細胞フ
ロー系と、この細胞フロー系から流下していく流れの中
に浮遊している細胞に強力な光を照射してその細胞から
放射される複数の種類の光を検出する照射測定光学系と
、この照射測定光学系からの信号により細胞の種類、大
きさ、形状などを分析する信号処理系とを備えた細胞分
析装置において、前記照射測定光学系からの信号電圧の
ピークを検出するピーク検出回路と、信号のレベルを判
定していくつかの場合に分ける判別回路と、前記ピーク
検出回路からの信号によつて動作し前記判別回路からの
信号によつて継続時間または電圧が変化するパルス信号
を作り出すパルス信号発生回路とを備え、このパルス信
号発生回路からの信号を取り出す端子を設けたことを特
徴とする細胞分析装置。