JPH02149496A - 生体高分子の結晶成長停止方法 - Google Patents
生体高分子の結晶成長停止方法Info
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- JPH02149496A JPH02149496A JP30162388A JP30162388A JPH02149496A JP H02149496 A JPH02149496 A JP H02149496A JP 30162388 A JP30162388 A JP 30162388A JP 30162388 A JP30162388 A JP 30162388A JP H02149496 A JPH02149496 A JP H02149496A
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- crystal
- concn
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C30—CRYSTAL GROWTH
- C30B—SINGLE-CRYSTAL GROWTH; UNIDIRECTIONAL SOLIDIFICATION OF EUTECTIC MATERIAL OR UNIDIRECTIONAL DEMIXING OF EUTECTOID MATERIAL; REFINING BY ZONE-MELTING OF MATERIAL; PRODUCTION OF A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; SINGLE CRYSTALS OR HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; AFTER-TREATMENT OF SINGLE CRYSTALS OR A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; APPARATUS THEREFOR
- C30B7/00—Single-crystal growth from solutions using solvents which are liquid at normal temperature, e.g. aqueous solutions
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Materials Engineering (AREA)
- Metallurgy (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔概要〕
環境に過敏で変質し易い生体高分子の結晶成長停止方法
に関し、 生体高分子を成長させた後、必要とする時に結晶成長を
停止させることを目的とし、 生体高分子の溶液に不溶化剤を加えて生体高分子の結晶
化を行う際に、結晶を必要とする大きさにまで成長させ
た後、不溶化剤の濃度を急激に上昇せしめ、結晶成長を
停止させることにより生体高分子の結晶成長停止方法を
構成する。
に関し、 生体高分子を成長させた後、必要とする時に結晶成長を
停止させることを目的とし、 生体高分子の溶液に不溶化剤を加えて生体高分子の結晶
化を行う際に、結晶を必要とする大きさにまで成長させ
た後、不溶化剤の濃度を急激に上昇せしめ、結晶成長を
停止させることにより生体高分子の結晶成長停止方法を
構成する。
Ｃ産業上の利用分野〕
本発明は生体高分子の結晶成長停止方法に関する。
蛋白質や核酸などの生体高分子はバイオテクノロジーの
主役として注目を集めているが、特に酵素や抗体などの
蛋白質はその高度な分子識別能力のため、バイオセンサ
の形で応用研究が進められ、商品化も行われている。
主役として注目を集めているが、特に酵素や抗体などの
蛋白質はその高度な分子識別能力のため、バイオセンサ
の形で応用研究が進められ、商品化も行われている。
以下、代表的な生体高分子である蛋白質分子を例として
本発明を説明する。
本発明を説明する。
天然に存在し生物が利用している蛋白質は熱に対して不
安定であり、また有機溶媒により変成したり失活したり
することから工業的利用に当たっては問題が多い。
安定であり、また有機溶媒により変成したり失活したり
することから工業的利用に当たっては問題が多い。
そして、か＼る変成は蛋白質分子の立体構造が変化する
ために生じており、僅かの立体構造の変化によって活性
化は大きく左右されている。
ために生じており、僅かの立体構造の変化によって活性
化は大きく左右されている。
そのため、蛋白質工学やドラッグデザインなどの応用研
究に当たってはＸ線解析などによる立体＋７４造の決定
が不可欠であり、そのためには不純物を含まない蛋白質
の単結晶を完全な形で得ることが必要である。
究に当たってはＸ線解析などによる立体＋７４造の決定
が不可欠であり、そのためには不純物を含まない蛋白質
の単結晶を完全な形で得ることが必要である。
［従来の技術］
蛋白質を結晶化させるには蛋白質溶液を過飽和に導き）
容解度を低下させることが必要であり、次の内の何れか
の方法が採られている。
容解度を低下させることが必要であり、次の内の何れか
の方法が採られている。
（１）中性塩の添加による溶液のイオン強度の増大（塩
析法） （２））合液中の塩の除去によるイオン強度の減少（脱
塩法） （３）打機溶媒の添加による溶液の誘電率の減少こ−で
、中性塩としては硫酸アンモニウムが最も一般的であり
、燐酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム
、塩化セシウムなどが用いられている。
析法） （２））合液中の塩の除去によるイオン強度の減少（脱
塩法） （３）打機溶媒の添加による溶液の誘電率の減少こ−で
、中性塩としては硫酸アンモニウムが最も一般的であり
、燐酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム
、塩化セシウムなどが用いられている。
また、有機溶媒としては各種のアルコール、ケトン、環
状エーテル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムア
ミド、アセトニトリルなどが用いられている。
状エーテル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムア
ミド、アセトニトリルなどが用いられている。
次に、蛋白質溶液から蛋白質を結晶化さゼる具体的な方
法としては、 （１）静置バラ千法 （２）自由界面拡散法 （３）透析法 （４）透析拡散法 （５）蒸気拡散法 （６） ｅＬ締縮 法どが知られている。
法としては、 （１）静置バラ千法 （２）自由界面拡散法 （３）透析法 （４）透析拡散法 （５）蒸気拡散法 （６） ｅＬ締縮 法どが知られている。
（生化学実験講座、第１巻ＩＩＩ、 ６〜１７頁、
１９７６）然し、蛋白質の結晶化は非常にデリケートで
あって、溶液の対流や結晶の沈降なども結晶の成長には
障害となり、良質の結晶を得ることは困難である。
１９７６）然し、蛋白質の結晶化は非常にデリケートで
あって、溶液の対流や結晶の沈降なども結晶の成長には
障害となり、良質の結晶を得ることは困難である。
そのため、宇宙の微少重力の環境の下で結晶化を行うこ
とが試みられている。
とが試みられている。
こ〜で、今までの技術では蛋白質溶液からの蛋白質の結
晶成長は溶液中の成分濃度や結晶化方法などの初期条件
で決まり、また成長速度は液温に依存しており、結晶成
長が始まってしまうと、これを停止させることは困難で
ある。
晶成長は溶液中の成分濃度や結晶化方法などの初期条件
で決まり、また成長速度は液温に依存しており、結晶成
長が始まってしまうと、これを停止させることは困難で
ある。
このことは、宇宙の微少重力の下で結晶成長を行う際に
問題であり、宇宙での結晶成長が終わった後、母液に残
った溶質が地上に帰還する際に宇宙で成長した結晶の表
面に再び成長してしまう。
問題であり、宇宙での結晶成長が終わった後、母液に残
った溶質が地上に帰還する際に宇宙で成長した結晶の表
面に再び成長してしまう。
このため、宇宙で成長させた結晶をそのま−の状態で地
上に持ち帰るためには信頼性の高い結晶成長停止方法が
必要となる。
上に持ち帰るためには信頼性の高い結晶成長停止方法が
必要となる。
発明者等は先に結晶化の停止方法として結晶の周囲の母
液を吸水性繊維を用いて取り除く方法を提案しているが
、更に多様な装置にも適用できる一般的な成長停止方法
が必要であった。
液を吸水性繊維を用いて取り除く方法を提案しているが
、更に多様な装置にも適用できる一般的な成長停止方法
が必要であった。
（発明が解決しようとする課題］
以上記したように蛋白質工学やドラッグデザイン等の応
用研究に当たっては高次の構造決定が必要であり、その
ためには不純物を含有しない生体高分子の単結晶の成長
が必要である。
用研究に当たっては高次の構造決定が必要であり、その
ためには不純物を含有しない生体高分子の単結晶の成長
が必要である。
そのため、微少重力下など熱対流や結晶の沈降などの影
古を伴わない環境の下で結晶成長が行われているが、こ
のようにして得た結晶をそのま＼地上に持ち帰るには昔
遍的な結晶成長停止法が必要であり、これを実用化する
ことが課題である。
古を伴わない環境の下で結晶成長が行われているが、こ
のようにして得た結晶をそのま＼地上に持ち帰るには昔
遍的な結晶成長停止法が必要であり、これを実用化する
ことが課題である。
〔課題を解決するための手段］
上記の課題は生体高分子の溶液に不溶化剤を加えて生体
高分子の結晶化を行う際に、結晶を必要とする大きさに
まで成長させた後、不溶化剤の濃度を急激に上昇せしめ
、結晶成長を停止させる生体高分子の結晶成長停止方法
を用いることにより実現することができる。
高分子の結晶化を行う際に、結晶を必要とする大きさに
まで成長させた後、不溶化剤の濃度を急激に上昇せしめ
、結晶成長を停止させる生体高分子の結晶成長停止方法
を用いることにより実現することができる。
先に記したように、蛋白質を結晶化させるには各種の方
法があるが、何れも蛋白質溶液を過飽和に導き、溶解度
を低下させて結晶核を発生させている。
法があるが、何れも蛋白質溶液を過飽和に導き、溶解度
を低下させて結晶核を発生させている。
発明者等は生体高分子の結晶成長の特徴について鋭意検
討した結果、不溶化剤を添加して蛋白質の溶解度を減少
させ結晶成長を行わせる場合に、生体高分子溶液の不溶
化剤濃度と結晶成長との間に特異な関係の存在すること
を見出した。
討した結果、不溶化剤を添加して蛋白質の溶解度を減少
させ結晶成長を行わせる場合に、生体高分子溶液の不溶
化剤濃度と結晶成長との間に特異な関係の存在すること
を見出した。
すなわち、硫安（（Ｎ＋−１４）２ＳＯ４）は塩析法に
おいて一般的に用いられる不溶化剤であるが、第１図は
これをマツコラ鯨骨格筋由来のミオグロビン溶液に添加
して蛋白質を結晶化させた場合の例を示すものであって
、横軸には硫安濃度（％飽和）を、また縦軸には発生し
た結晶の個数を示している。
おいて一般的に用いられる不溶化剤であるが、第１図は
これをマツコラ鯨骨格筋由来のミオグロビン溶液に添加
して蛋白質を結晶化させた場合の例を示すものであって
、横軸には硫安濃度（％飽和）を、また縦軸には発生し
た結晶の個数を示している。
すなわち、硫安濃度が７０％飽和までは結晶核の発生は
起らないが、これ以上の濃度では発生数は増加してゆく
。
起らないが、これ以上の濃度では発生数は増加してゆく
。
然し、約９５％飽和濃度を境として発生数は減少してゆ
き９５％飽和濃度では発生しなくなる。
き９５％飽和濃度では発生しなくなる。
すなわち、不溶化剤の濃度がその不溶化剤によって決ま
る臨界濃度を越すと非晶質の沈澱は生ずるもの＼結晶核
の発生はなく、また結晶の成長も行われなくなる。
る臨界濃度を越すと非晶質の沈澱は生ずるもの＼結晶核
の発生はなく、また結晶の成長も行われなくなる。
発明者等はこの性質を利用し、結晶化が行われている生
体高分子溶液に不溶化剤の粉末あるいは不溶化剤の濃溶
液を加え、不溶化剤の濃度を臨界濃度以上とすることに
より結晶成長を停止させるものである。
体高分子溶液に不溶化剤の粉末あるいは不溶化剤の濃溶
液を加え、不溶化剤の濃度を臨界濃度以上とすることに
より結晶成長を停止させるものである。
実施例１：
次の３種類の溶液を準備した。
■ マ・ンコウ鯨骨格筋由来のミオプロ１フ５重埜％を
１７１５モル の燐酸緩衝液（ｐｔｌ ７．２でＮａＪ
ＰＯ−とＫ）ＩｇＰＯ，の混 液）に溶解して不溶物を
濾過した液。
１７１５モル の燐酸緩衝液（ｐｔｌ ７．２でＮａＪ
ＰＯ−とＫ）ＩｇＰＯ，の混 液）に溶解して不溶物を
濾過した液。
■ ｌ／１５モルの燐酸緩衝液（ｐＨ７，２でＮａ、Ｈ
ＰＯ４とＫＨ２ＰＯ４の混液）。
ＰＯ４とＫＨ２ＰＯ４の混液）。
■ 飽和硫安溶液に５モルのＮ ａ Ｏｔｌ溶液を微量
加えてｐＨを７．２にした液。
加えてｐＨを７．２にした液。
この液を■、■、■の順序に混合してミオグロビンの濃
度が１％で硫安の濃度が７２％、７５％および７８％飽
和の液を作った。
度が１％で硫安の濃度が７２％、７５％および７８％飽
和の液を作った。
この各法１ｍｌを２０°Ｃの恒温槽の中に５日間に亙っ
て静置したところ、それぞれ平均して３．３０および６
０個の結晶が成長した。
て静置したところ、それぞれ平均して３．３０および６
０個の結晶が成長した。
ニーで、結晶の平均粒径は０．０５〜０．７ｍｍであっ
た。
た。
次に、この３種類の溶液に硫安の粉末を少しづつ加えな
がら結晶が壊れないように緩くりと撹拌し、硫安の濃度
を約９５％飽和にした後、再び２０°Ｃの恒温槽の中に
２遇間に亙って静置した。
がら結晶が壊れないように緩くりと撹拌し、硫安の濃度
を約９５％飽和にした後、再び２０°Ｃの恒温槽の中に
２遇間に亙って静置した。
その結果、３種類の溶液とも結晶の数および大きさは全
く変化しておらず、結晶の成長が停止していることが証
明できた。
く変化しておらず、結晶の成長が停止していることが証
明できた。
実施例２：
実施例１と同様にミオグロビンの濃度が１％で硫安の濃
度が７２％、７５％および７８％飽和の液を作り、この
各法１ ｍ！！、を２０°Ｃの恒温槽の中に５日間に亙
って静置したところ、実施例１と同様に、それぞれ平均
して３，３０および６０個の結晶が成長した。
度が７２％、７５％および７８％飽和の液を作り、この
各法１ ｍ！！、を２０°Ｃの恒温槽の中に５日間に亙
って静置したところ、実施例１と同様に、それぞれ平均
して３，３０および６０個の結晶が成長した。
次に、これに硫安などの不溶化剤を加えずに、そのま−
２０°Ｃの条件で２週間に亙って放置しておいたところ
、結晶の数はそれぞれ１０．７０および１５０個程度に
増加し、その大きさも最大で１．２ ｎｕｎ程度に増加
していた。
２０°Ｃの条件で２週間に亙って放置しておいたところ
、結晶の数はそれぞれ１０．７０および１５０個程度に
増加し、その大きさも最大で１．２ ｎｕｎ程度に増加
していた。
（発明の効果〕
本発明によれば、蛋白質など生体高分子の結晶成長に当
たって、結晶化の途中で不溶化剤の濃度を上昇させるこ
とにより結晶成長を停止させることができる。
たって、結晶化の途中で不溶化剤の濃度を上昇させるこ
とにより結晶成長を停止させることができる。
また、この方法の実施により地上はもとより宇宙空間な
どの別の環境において成長させた結晶をその上に新しい
結晶を成長させることなしに信転性よく回収することが
できる。
どの別の環境において成長させた結晶をその上に新しい
結晶を成長させることなしに信転性よく回収することが
できる。
第１図は不溶化剤の濃度と結晶数々の関係図である。
Claims (1)
- 生体高分子の溶液に不溶化剤を加え、該生体高分子の
結晶化を行う際に、結晶を必要とする大きさにまで成長
させた後、不溶化剤の濃度を急激に上昇せしめ、結晶成
長を停止させることを特徴とする生体高分子の結晶成長
停止方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63301623A JP2712427B2 (ja) | 1988-11-29 | 1988-11-29 | 生体高分子の結晶成長停止方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63301623A JP2712427B2 (ja) | 1988-11-29 | 1988-11-29 | 生体高分子の結晶成長停止方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02149496A true JPH02149496A (ja) | 1990-06-08 |
| JP2712427B2 JP2712427B2 (ja) | 1998-02-10 |
Family
ID=17899173
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63301623A Expired - Lifetime JP2712427B2 (ja) | 1988-11-29 | 1988-11-29 | 生体高分子の結晶成長停止方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2712427B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6117232A (en) * | 1995-03-01 | 2000-09-12 | Sumitomo Metal Industries, Ltd. | Crystallization control method for organic compound and crystallization control solid-state component employed therefor |
-
1988
- 1988-11-29 JP JP63301623A patent/JP2712427B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6117232A (en) * | 1995-03-01 | 2000-09-12 | Sumitomo Metal Industries, Ltd. | Crystallization control method for organic compound and crystallization control solid-state component employed therefor |
| US6123769A (en) * | 1995-03-01 | 2000-09-26 | Sumitomo Metal Industries, Ltd. | Crystallization control method for organic compound and crystallization control solid-state component employed therefor |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2712427B2 (ja) | 1998-02-10 |
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