JPH0215028B2 - - Google Patents
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- JPH0215028B2 JPH0215028B2 JP57084085A JP8408582A JPH0215028B2 JP H0215028 B2 JPH0215028 B2 JP H0215028B2 JP 57084085 A JP57084085 A JP 57084085A JP 8408582 A JP8408582 A JP 8408582A JP H0215028 B2 JPH0215028 B2 JP H0215028B2
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- JP
- Japan
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- amino acid
- hemoglobin
- polypeptide
- glycine
- test device
- Prior art date
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、例えば手動及び自動システム等にお
いて有用な診断試験組成物及び方法の分野に関
し、更に詳しくは、液体試料中のヘモグロビン配
糖体を定性及び定量測定する場合に有用な試験に
関する。
いて有用な診断試験組成物及び方法の分野に関
し、更に詳しくは、液体試料中のヘモグロビン配
糖体を定性及び定量測定する場合に有用な試験に
関する。
ヘモグロビン配糖体（HbA1）は、２個のαと
２個のβとの４個のポリペプチド鎖を含有した分
子を有する正常な成人ヘモグロビン（HbA）の
変形体であり、かくしてα2β2としても表示され
る。
２個のβとの４個のポリペプチド鎖を含有した分
子を有する正常な成人ヘモグロビン（HbA）の
変形体であり、かくしてα2β2としても表示され
る。
HbA1は、少なくとも３個の小成分：HbA1a、
HbA1b及びHbA1cから構成されている。３つの成
分は、全て、同一のアミノ酸配列を有している
が、異種の炭水化物を含んでいるようである。
HbA1b及びHbA1cから構成されている。３つの成
分は、全て、同一のアミノ酸配列を有している
が、異種の炭水化物を含んでいるようである。
ヘモグロビンA1cは、HbA1の主成分である：
それは、ヘモグロビン配糖体の約85％を占めてい
る。HbA1分子は、グルコース分子に結合された
β鎖の末端アミノ基を有する。この分子は、生体
中で、次の反応によつて合成される。
それは、ヘモグロビン配糖体の約85％を占めてい
る。HbA1分子は、グルコース分子に結合された
β鎖の末端アミノ基を有する。この分子は、生体
中で、次の反応によつて合成される。
ヘモグロビン配糖体の濃度は、正常な成人の血
中では、総ヘモグロビンの３〜６％の範囲である
が、糖尿病を治療しない場合には、HbA1cの濃度
が２倍もしくは３倍になるため、15％にも上昇し
得る。
中では、総ヘモグロビンの３〜６％の範囲である
が、糖尿病を治療しない場合には、HbA1cの濃度
が２倍もしくは３倍になるため、15％にも上昇し
得る。
HbA1c濃度と糖尿病治療との厳密な関係は、数
人の著者によつて明らかにされてきた〔H.F.
Bunnet al、Science、200、21−27（1978）等参
照〕。
人の著者によつて明らかにされてきた〔H.F.
Bunnet al、Science、200、21−27（1978）等参
照〕。
もし、糖尿病患者が、その糖尿病の治療がうま
くいつていない場合には、血漿中の、従つて赤血
球中のグルコース及び解糖系中間体の濃度は、そ
れらがグルコースの取り込みにインシユリンを要
しないゆえに、しばしば高く維持されるであろ
う。
くいつていない場合には、血漿中の、従つて赤血
球中のグルコース及び解糖系中間体の濃度は、そ
れらがグルコースの取り込みにインシユリンを要
しないゆえに、しばしば高く維持されるであろ
う。
細胞内のグルコースのこの上昇は、HbAの非
酵素的配糖化を促進する。このような状態にある
場合に、ヘキソースとタンパク質との共有結合の
安定性は、ヘモグロビン分子が比較的長寿命であ
ることに伴つて、HbA1濃度の上昇を導く。従つ
て、ヘモグロビンA1の濃度は、過去数週間に亘
る平均血糖値に反映することになる。
酵素的配糖化を促進する。このような状態にある
場合に、ヘキソースとタンパク質との共有結合の
安定性は、ヘモグロビン分子が比較的長寿命であ
ることに伴つて、HbA1濃度の上昇を導く。従つ
て、ヘモグロビンA1の濃度は、過去数週間に亘
る平均血糖値に反映することになる。
HbA1値の定期測定は、糖尿病患者に炭水化物
制限の度合の客観的かつ正確な判断をもたらし、
そして、医者に有効な治療法を判定させることが
できる。
制限の度合の客観的かつ正確な判断をもたらし、
そして、医者に有効な治療法を判定させることが
できる。
異なつた方法が、ヘモグロビン配糖体（クロマ
トグラフ操作のゆえに、フアースト・ヘモグロビ
ンとも呼ばれる）を測定するために開発されてき
た。これらの方法は比色法、等電集束法（iso−
electric focusing）及びクロマトグラフ法に基づ
く。
トグラフ操作のゆえに、フアースト・ヘモグロビ
ンとも呼ばれる）を測定するために開発されてき
た。これらの方法は比色法、等電集束法（iso−
electric focusing）及びクロマトグラフ法に基づ
く。
フリユキガー〔R.Flu¨ckiger and K.H.Win−
terhalter、FEBS Letters、71、356（1976）〕の
比色法によれば、溶血物は、100℃で、0.4Nシユ
ウ酸に処理される。これらの条件下で、HbAは、
定量的に５−ヒドロメチルフルフラール（５−
HMF）を放出し、これが２−チオバルビツール
酸で発色される色（443nｍでの読み）によつて
測定されることができる。この方法は、多くの欠
点、例えば、試料分析に高温（100℃）及び長時
間（４時間）を要すること、再現性に乏しいこと
（５−HMFの不安定性による）及び特異性に乏
しいこと（遊離した糖にも反応する）等の欠点を
有する。この方法は、常用試験法として不適当で
あると思われる。
terhalter、FEBS Letters、71、356（1976）〕の
比色法によれば、溶血物は、100℃で、0.4Nシユ
ウ酸に処理される。これらの条件下で、HbAは、
定量的に５−ヒドロメチルフルフラール（５−
HMF）を放出し、これが２−チオバルビツール
酸で発色される色（443nｍでの読み）によつて
測定されることができる。この方法は、多くの欠
点、例えば、試料分析に高温（100℃）及び長時
間（４時間）を要すること、再現性に乏しいこと
（５−HMFの不安定性による）及び特異性に乏
しいこと（遊離した糖にも反応する）等の欠点を
有する。この方法は、常用試験法として不適当で
あると思われる。
最近、ピー・ジー・ラエツテイら．、
〔AmericanJ.of Hematology、４、367−374
（1978）〕はヘモグロビンA1を測定するためにポ
リアクリルアミドゲルの厚板の上で行なう等電集
束法の改良型を提案した。この方法では、600n
ｍで走査すると、完全に分離した２つのピークが
観察され、これらのピークは、定量測定のために
正確に積分することができる。この方法は、高い
特異性と再現性を有することが主張されている
が、アンホリン（ampholines）等の高価な試薬
及び高価な装置（そのゲルは、100nｍのスリツ
トを備えた分光光度計により走査され、また、線
形移動装置を備えていなければならず、しかも、
両ピーク下面積は、ミニコンピユータによつて積
分されなければならない。）を必要とする。従つ
て、この方法は良好な比較法であると言えよう
が、中規模の実験室の財政的な許容範囲を超える
ものである。
〔AmericanJ.of Hematology、４、367−374
（1978）〕はヘモグロビンA1を測定するためにポ
リアクリルアミドゲルの厚板の上で行なう等電集
束法の改良型を提案した。この方法では、600n
ｍで走査すると、完全に分離した２つのピークが
観察され、これらのピークは、定量測定のために
正確に積分することができる。この方法は、高い
特異性と再現性を有することが主張されている
が、アンホリン（ampholines）等の高価な試薬
及び高価な装置（そのゲルは、100nｍのスリツ
トを備えた分光光度計により走査され、また、線
形移動装置を備えていなければならず、しかも、
両ピーク下面積は、ミニコンピユータによつて積
分されなければならない。）を必要とする。従つ
て、この方法は良好な比較法であると言えよう
が、中規模の実験室の財政的な許容範囲を超える
ものである。
いくつかの研究が初期に行なわれていたが、現
在用いられているイオン交換クロマトグラフ法は
トリベリの基本方法に基づいている〔L.
Trivelliet al.、N.Eng.J.Medicine、284、353
（1971）〕。この方法では透析された血液溶血物が
弱酸性陽イオン交換樹脂（バイオ・レツクス
70）が充填された２cm×17.5cmのカラムに添加さ
れる。HbA1a、HbA1c及びHbA1cは、シアン化物
（10ｍＭのKCN）を含有するリン酸ナトリウム緩
衝液（42ｍＭのリン酸塩、PH6.70）を用いて溶出
される。続いて、更に高濃度の展開液（150ｍＭ
のリン酸塩、PH6.42）を用いてHbAを溶出した
後、HbA1％は、２つの溶出液の吸光度（552nｍ
での読み）間の比として計算できる。この方法
は、十分に信頼されるものであるが、展開液で樹
脂を平衡にするために数日を、４℃で溶血物を透
析するのに数時間を、また、３時間の溶出時間を
要する。これら全ての理由から、この方法は、日
常の臨床試験には不適である。
在用いられているイオン交換クロマトグラフ法は
トリベリの基本方法に基づいている〔L.
Trivelliet al.、N.Eng.J.Medicine、284、353
（1971）〕。この方法では透析された血液溶血物が
弱酸性陽イオン交換樹脂（バイオ・レツクス
70）が充填された２cm×17.5cmのカラムに添加さ
れる。HbA1a、HbA1c及びHbA1cは、シアン化物
（10ｍＭのKCN）を含有するリン酸ナトリウム緩
衝液（42ｍＭのリン酸塩、PH6.70）を用いて溶出
される。続いて、更に高濃度の展開液（150ｍＭ
のリン酸塩、PH6.42）を用いてHbAを溶出した
後、HbA1％は、２つの溶出液の吸光度（552nｍ
での読み）間の比として計算できる。この方法
は、十分に信頼されるものであるが、展開液で樹
脂を平衡にするために数日を、４℃で溶血物を透
析するのに数時間を、また、３時間の溶出時間を
要する。これら全ての理由から、この方法は、日
常の臨床試験には不適である。
この高価で、しかも、時間を要する方法を簡略
にした製品を提供せんとする読みがなされてき
た。HbA1クロマトグラフ測定を、テリベリの方
法におけるよりも短時間で、しかも、低コストで
実施できる器具が、イソラブ会社（ドロワー4350
アクロン、オハイオ）、バイオ・ラツド・ラボラ
トリーズ（2200ウエストアベ．、リツチモンド、
カリフ．）及びヘレナ・ラボラトリーズ（ピー・
オー・ボツクス752、ボーマント、テキサス）か
ら、市場において、現在入手可能となつている。
これらの市販品においても尚、原理は一般的に、
リン酸緩衝液、更にはシアン化カリウムを含有し
ていてもよい展開液を使用した、陽イオン交換樹
脂からの試料の溶出にある。カラムは、トリベリ
の基本方法と比較して非常に小さく、従つて、試
料も少量でありまた、適宜な緩衝液で既に平衡化
された樹脂が予め充填されている。溶血物は適当
な試薬を用いて、全血から極めて迅速に得られ
る。溶出は、HbAが（第２工程中で）溶出され
るか否かによつて、30分間あるいは１時間必要と
なる。
にした製品を提供せんとする読みがなされてき
た。HbA1クロマトグラフ測定を、テリベリの方
法におけるよりも短時間で、しかも、低コストで
実施できる器具が、イソラブ会社（ドロワー4350
アクロン、オハイオ）、バイオ・ラツド・ラボラ
トリーズ（2200ウエストアベ．、リツチモンド、
カリフ．）及びヘレナ・ラボラトリーズ（ピー・
オー・ボツクス752、ボーマント、テキサス）か
ら、市場において、現在入手可能となつている。
これらの市販品においても尚、原理は一般的に、
リン酸緩衝液、更にはシアン化カリウムを含有し
ていてもよい展開液を使用した、陽イオン交換樹
脂からの試料の溶出にある。カラムは、トリベリ
の基本方法と比較して非常に小さく、従つて、試
料も少量でありまた、適宜な緩衝液で既に平衡化
された樹脂が予め充填されている。溶血物は適当
な試薬を用いて、全血から極めて迅速に得られ
る。溶出は、HbAが（第２工程中で）溶出され
るか否かによつて、30分間あるいは１時間必要と
なる。
日常の臨床化学で用いられる最も普通の分析法
（簡略化された）は、従つて次の工程から成る。
（簡略化された）は、従つて次の工程から成る。
(1) 全血試料が溶血される；
(2) 小量の溶血物（例えば、50又は100μl）が、
適宜な緩衝液で平衡化された弱陽イオン樹脂を
充填するクロマトグラフ用カラムの最上部に注
入される； (3) ヘモグロビン（HbA1）の急速移動分画が、
シアン化カリウムを含有してもよいリン酸ナト
リウム緩衝液を用いて溶出される；及び (4) その後、緩慢移動分画（HbA）が、シアン
化カリウムを含有してもよいリン酸ナトリウム
及び塩化ナトリウムを含有する、更に高濃度の
溶出用緩衝液を用いて溶出される。
適宜な緩衝液で平衡化された弱陽イオン樹脂を
充填するクロマトグラフ用カラムの最上部に注
入される； (3) ヘモグロビン（HbA1）の急速移動分画が、
シアン化カリウムを含有してもよいリン酸ナト
リウム緩衝液を用いて溶出される；及び (4) その後、緩慢移動分画（HbA）が、シアン
化カリウムを含有してもよいリン酸ナトリウム
及び塩化ナトリウムを含有する、更に高濃度の
溶出用緩衝液を用いて溶出される。
溶出液は、分光光度計によつて、蒸留水又は緩
衝液と比較され、例えば415nｍで読みとられる。
急速移動のヘモグロビン（フアースト・ヘモグロ
ビン）の百分率（Hbs％）は次式により計算され
る： A415HbA1／A415HbA1＋A415HbA×100＝Hbs％ これに対し、緩慢移動分画を集める代りに、溶
血物の一部が適当な容量の溶出用緩衝液で希釈さ
れたものを用いても可能である。この場合、溶出
液（HbA1）及び上記した溶液（総Hb）の両者
は、分光光度計によつて、蒸留水と比較され、測
定される。Hbs％は次式により計算される： A415HbA1／A415総Hb×100＝Hbs％ これらの市販品は、日常的な臨床化学下でヘモ
グロビン配糖体を分析するための一方法を提供す
るものであつたが、これらは再現性及び正確性に
乏しいため、批判の対象となつていた。この方法
に基づく市販品の問題点は、得られたフアース
ト・ヘモグロビンの百分率（％）が、10〜37℃ま
で直線的に増加する、ということを示していた
〔D.Dixon et al.、Clin.Chem.24 2073（1978）〕。
これは周辺の温度の上昇に伴い、２つのピーク
（HbA1及びHbA）が次第に接近し、分離が不完
全となることに起因している。
衝液と比較され、例えば415nｍで読みとられる。
急速移動のヘモグロビン（フアースト・ヘモグロ
ビン）の百分率（Hbs％）は次式により計算され
る： A415HbA1／A415HbA1＋A415HbA×100＝Hbs％ これに対し、緩慢移動分画を集める代りに、溶
血物の一部が適当な容量の溶出用緩衝液で希釈さ
れたものを用いても可能である。この場合、溶出
液（HbA1）及び上記した溶液（総Hb）の両者
は、分光光度計によつて、蒸留水と比較され、測
定される。Hbs％は次式により計算される： A415HbA1／A415総Hb×100＝Hbs％ これらの市販品は、日常的な臨床化学下でヘモ
グロビン配糖体を分析するための一方法を提供す
るものであつたが、これらは再現性及び正確性に
乏しいため、批判の対象となつていた。この方法
に基づく市販品の問題点は、得られたフアース
ト・ヘモグロビンの百分率（％）が、10〜37℃ま
で直線的に増加する、ということを示していた
〔D.Dixon et al.、Clin.Chem.24 2073（1978）〕。
これは周辺の温度の上昇に伴い、２つのピーク
（HbA1及びHbA）が次第に接近し、分離が不完
全となることに起因している。
本発明は、分離用組成物を通すことによつて、
ヘモグロビンのような混合物のイオン交換クロマ
トグラフ分離を行なうための改良された方法を提
供するものであつて、以下で十分に述べるよう
に、クロマトグラフ分析されるべき試料の供給に
先立ち、クロマトグラフ系に少なくとも１種のア
ミノ酸及び／又は少なくとも１種のポリペプチド
である両性電解質を包含せしめたことを特徴とす
る。分離液は、溶出ピークに間隔をもたせ、ある
いは望ましくない溶出を防止して、溶出成分
（類）の測定を一層正確なものとする。本発明で
記載されるような分離用組成物を使用して分析が
行なわれる場合には、HbA1とHbAとの分離が改
善されるので、得られた結果は、広範囲な温度、
即ち少なくとも15〜35℃の範囲内で影響を受けな
い。
ヘモグロビンのような混合物のイオン交換クロマ
トグラフ分離を行なうための改良された方法を提
供するものであつて、以下で十分に述べるよう
に、クロマトグラフ分析されるべき試料の供給に
先立ち、クロマトグラフ系に少なくとも１種のア
ミノ酸及び／又は少なくとも１種のポリペプチド
である両性電解質を包含せしめたことを特徴とす
る。分離液は、溶出ピークに間隔をもたせ、ある
いは望ましくない溶出を防止して、溶出成分
（類）の測定を一層正確なものとする。本発明で
記載されるような分離用組成物を使用して分析が
行なわれる場合には、HbA1とHbAとの分離が改
善されるので、得られた結果は、広範囲な温度、
即ち少なくとも15〜35℃の範囲内で影響を受けな
い。
本発明によれば、それゆえヘモグロビン配糖体
のような化合物のクロマトグラフ測定のための方
法が提供される。一具体例としては、ヘモグロビ
ン配糖体のクロマトグラフ測定に関する本発明の
方法として、次の工程を有する形式がある。
のような化合物のクロマトグラフ測定のための方
法が提供される。一具体例としては、ヘモグロビ
ン配糖体のクロマトグラフ測定に関する本発明の
方法として、次の工程を有する形式がある。
(1) クロマトグラフ分離に好適なイオン交換物質
のカラムに、ヘモグロビン含有血液溶血物を適
用する； (2) ヘモグロビン配糖体を含有する溶血物の第１
分画を、展開溶液を用いて溶出する； (3) かくして溶出された第１分画を集める； (4) より緩慢に移動するヘモグロビンを含有する
第２分画を、同一又は異種の展開溶液を用いて
溶出する； (5) かくして溶出された第２分画を集める； (6) 第１分画中に存在するヘモグロビン配糖体の
量を測定する；及び (7) ヘモグロビン配糖体である総ヘモグロビンの
百分率（％）が測定できるように、第２分画中
に存在し、より緩慢に移動するヘモグロビンの
量を測定する、以上の方法において、次の改良
点を有する； (8) ヘモグロビン含有血液溶血物をカラムに適用
するに先立ち、少なくとも１種のアミノ酸及
び／又は少なくとも１種のポリペプチドである
両性電解質を含有した分離用組成物の溶液を前
記カラムに適用する付加工程から成ることを特
徴とする方法。
のカラムに、ヘモグロビン含有血液溶血物を適
用する； (2) ヘモグロビン配糖体を含有する溶血物の第１
分画を、展開溶液を用いて溶出する； (3) かくして溶出された第１分画を集める； (4) より緩慢に移動するヘモグロビンを含有する
第２分画を、同一又は異種の展開溶液を用いて
溶出する； (5) かくして溶出された第２分画を集める； (6) 第１分画中に存在するヘモグロビン配糖体の
量を測定する；及び (7) ヘモグロビン配糖体である総ヘモグロビンの
百分率（％）が測定できるように、第２分画中
に存在し、より緩慢に移動するヘモグロビンの
量を測定する、以上の方法において、次の改良
点を有する； (8) ヘモグロビン含有血液溶血物をカラムに適用
するに先立ち、少なくとも１種のアミノ酸及
び／又は少なくとも１種のポリペプチドである
両性電解質を含有した分離用組成物の溶液を前
記カラムに適用する付加工程から成ることを特
徴とする方法。
別の具体例としては、ヘモグロビン配糖体の測
定に関する本発明の方法として、次の工程から成
る態様がある： (1) クロマトグラフ分離に好適なイオン交換物質
のカラムに、ヘモグロビン含有血液溶血物を適
用する； (2) ヘモグロビン配糖体を含有する溶血物の分画
を、展開溶液を用いて溶出する； (3) 前記ヘモグロビン含有血液溶血物の一部を、
適当な容量の溶出用展開液で希釈する； (4) 溶出分画中に存在するヘモグロビン配糖体の
量を測定する； (5) ヘモグロビン配糖体である総ヘモグロビンの
量が測定するために、前記の希釈されたヘモグ
ロビン含有血液溶血物中の総ヘモグロビンの量
を測定する、以上の方法において、次の改良点
を測定する； (6) ヘモグロビン含有血液溶血物をカラムに適用
するに先立ち、少なくとも１種のアミノ酸及
び／又は少なくとも１種のポリペプチドである
両性電解質を含有した分離用組成物の溶液を前
記カラムに適用する付加工程から成ることを特
徴とする方法。
定に関する本発明の方法として、次の工程から成
る態様がある： (1) クロマトグラフ分離に好適なイオン交換物質
のカラムに、ヘモグロビン含有血液溶血物を適
用する； (2) ヘモグロビン配糖体を含有する溶血物の分画
を、展開溶液を用いて溶出する； (3) 前記ヘモグロビン含有血液溶血物の一部を、
適当な容量の溶出用展開液で希釈する； (4) 溶出分画中に存在するヘモグロビン配糖体の
量を測定する； (5) ヘモグロビン配糖体である総ヘモグロビンの
量が測定するために、前記の希釈されたヘモグ
ロビン含有血液溶血物中の総ヘモグロビンの量
を測定する、以上の方法において、次の改良点
を測定する； (6) ヘモグロビン含有血液溶血物をカラムに適用
するに先立ち、少なくとも１種のアミノ酸及
び／又は少なくとも１種のポリペプチドである
両性電解質を含有した分離用組成物の溶液を前
記カラムに適用する付加工程から成ることを特
徴とする方法。
本発明は、日常の条件下で、ヘモグロビン配糖
体の正確な分析を簡便かつ迅速に行なう試験器具
をも提供する。この目的のために、この器具は、 ヘモグロビン含有血液溶血物のクロマトグラフ
分離に好適な、例えば弱酸性陽イオン交換樹脂の
ようなイオン交換物質を予め充填した、少なくと
も１個のカラムと； 溶出用展開液と、取り換え可能な粉体又はすぐ
に使用できる溶液の形で存在し得る、少なくとも
１種のアミノ酸及び／又は少なくとも１種のポリ
ペプチドである両性電解質を含有する分離用組成
物とを各々収納する、少なくとも１個の容器と； を一括して組合せて構成される。望ましくは、溶
血用溶液及び既知％のヘモグロビン配糖体を含有
する対照液の容器があつてもよい。
体の正確な分析を簡便かつ迅速に行なう試験器具
をも提供する。この目的のために、この器具は、 ヘモグロビン含有血液溶血物のクロマトグラフ
分離に好適な、例えば弱酸性陽イオン交換樹脂の
ようなイオン交換物質を予め充填した、少なくと
も１個のカラムと； 溶出用展開液と、取り換え可能な粉体又はすぐ
に使用できる溶液の形で存在し得る、少なくとも
１種のアミノ酸及び／又は少なくとも１種のポリ
ペプチドである両性電解質を含有する分離用組成
物とを各々収納する、少なくとも１個の容器と； を一括して組合せて構成される。望ましくは、溶
血用溶液及び既知％のヘモグロビン配糖体を含有
する対照液の容器があつてもよい。
好ましい実施例の説明
以下の説明では、明確化を図るために特殊な用
語が用いられているが、これらの用語は本発明を
説明するために選択された特別な具体例にのみ用
いられているのであつて本発明の範囲を減縮もし
くは限定するものではない。
語が用いられているが、これらの用語は本発明を
説明するために選択された特別な具体例にのみ用
いられているのであつて本発明の範囲を減縮もし
くは限定するものではない。
本発細書において用いられている両性電解質と
いう用語は、分子中に少なくとも１個の酸性基及
び少なくとも１個の塩基性基を有するものを意味
する。本発明において用いることのできる両性電
解質としては、酸性基としてカルボキシル基を有
し、塩基性基としてアミノ基を有する、グリシ
ン、アラニン、バリン、ロイシン、グリシルグリ
シンのようなアミノ酸、ポリペプチド又はこれら
の混合物が挙げられる。本発明において用いるア
ミノ酸又はポリペプチドとしては、等電点が約４
〜９、好ましくは約5.5〜6.5の範囲にある物質を
使用できる。アミノ基のPHは約７〜11に変化する
が、好ましくは約９〜10である。炭素原子数は２
以上で、その上限は物質の溶解度によつてのみ限
定され、好ましくは約２〜６であろう。
いう用語は、分子中に少なくとも１個の酸性基及
び少なくとも１個の塩基性基を有するものを意味
する。本発明において用いることのできる両性電
解質としては、酸性基としてカルボキシル基を有
し、塩基性基としてアミノ基を有する、グリシ
ン、アラニン、バリン、ロイシン、グリシルグリ
シンのようなアミノ酸、ポリペプチド又はこれら
の混合物が挙げられる。本発明において用いるア
ミノ酸又はポリペプチドとしては、等電点が約４
〜９、好ましくは約5.5〜6.5の範囲にある物質を
使用できる。アミノ基のPHは約７〜11に変化する
が、好ましくは約９〜10である。炭素原子数は２
以上で、その上限は物質の溶解度によつてのみ限
定され、好ましくは約２〜６であろう。
両極性イオンは、20ｍＭ／以上溶解度の限界
まで、好ましくは0.2M／以上の濃度範囲で、
水に溶解されることが好ましい。この両性電解質
を含有する、ある容量の分離用溶液は、先行技術
に従つて、予め平衡化された弱酸性陽イオン樹脂
が述填されているクロマトグラフ用カラムに、上
部から注入され、そして、カラムは流し続けられ
て分離液が完全に溶出される。
まで、好ましくは0.2M／以上の濃度範囲で、
水に溶解されることが好ましい。この両性電解質
を含有する、ある容量の分離用溶液は、先行技術
に従つて、予め平衡化された弱酸性陽イオン樹脂
が述填されているクロマトグラフ用カラムに、上
部から注入され、そして、カラムは流し続けられ
て分離液が完全に溶出される。
溶出液は廃棄され、さらに、前処理されたカラ
ムは、通常の方法によつて、クロマトグラフ
HbA1測定のために利用される。
ムは、通常の方法によつて、クロマトグラフ
HbA1測定のために利用される。
提示された例は、発明を例示するものである。
当業者は、望まれる限り多様化し、代替し、かつ
変更しても可能であろう。
当業者は、望まれる限り多様化し、代替し、かつ
変更しても可能であろう。
例 １
この例で記述される実験において、クロマトグ
ラフ用カラムは液体試料中に存在するヘモグロビ
ン配糖体の定量測定を可能とするために、調製さ
れ、かつ、試験された。
ラフ用カラムは液体試料中に存在するヘモグロビ
ン配糖体の定量測定を可能とするために、調製さ
れ、かつ、試験された。
カラムの調製
内径11mm高さ68mmのプラスチツク製カラムに、
予めリン酸ナトリウム緩衝液（50ｍＭ、PH6.8）
と平衡化された800mgの陽イオン樹脂〔バイオ−
レツクス70（バイオ・ラツド社製）、ナトリウム
塩、200〜400メツシユ〕を充填した。
予めリン酸ナトリウム緩衝液（50ｍＭ、PH6.8）
と平衡化された800mgの陽イオン樹脂〔バイオ−
レツクス70（バイオ・ラツド社製）、ナトリウム
塩、200〜400メツシユ〕を充填した。
分析操作
一群のカラムを、いかなる処理も行なわずに、
従来技術に従つて使用した。残るカラムは１mlの
グリシン溶液で処理した。即ち、本発明に従い、
カラムの上部にこの溶液を加え、樹脂内を通過さ
せた。
従来技術に従つて使用した。残るカラムは１mlの
グリシン溶液で処理した。即ち、本発明に従い、
カラムの上部にこの溶液を加え、樹脂内を通過さ
せた。
次に、溶血100μ（血液１容量部とブリツジ
（Brij）35溶液15容量、0.33％）を各系列のカ
ラムの上部から加えた。急速移動分画を、シアン
化カリウム（50ｍＭリン酸塩、７ｍMKCN）を
含有するリン酸ナトリウム緩衝液2.5ml（PH6.8）
で溶出した。ヘモグロビンのみを含有する溶液
（溶血20μ＋緩衝液５ml）も同様に調製した。
溶出液及び上記溶液の両者を、蒸留水を対照とし
て、分光光度計により415nｍで測定した。HbA1
比を次式により計算した： A415急速移動分画／A415総Hbs×10＝HbA1％ 15〜35℃の温度範囲内で両カラム系（グリシン
溶液非処理及び処理）を用いて試験した。
（Brij）35溶液15容量、0.33％）を各系列のカ
ラムの上部から加えた。急速移動分画を、シアン
化カリウム（50ｍＭリン酸塩、７ｍMKCN）を
含有するリン酸ナトリウム緩衝液2.5ml（PH6.8）
で溶出した。ヘモグロビンのみを含有する溶液
（溶血20μ＋緩衝液５ml）も同様に調製した。
溶出液及び上記溶液の両者を、蒸留水を対照とし
て、分光光度計により415nｍで測定した。HbA1
比を次式により計算した： A415急速移動分画／A415総Hbs×10＝HbA1％ 15〜35℃の温度範囲内で両カラム系（グリシン
溶液非処理及び処理）を用いて試験した。
結 果
異なる温度下で実施して、血液試料中に見出さ
れたフアースト・ヘモグロビンの％を第１表に掲
載した。
れたフアースト・ヘモグロビンの％を第１表に掲
載した。
第１表 ℃ 本発明 従来法
15 5.38 4.44
20 5.43 5.38
25 5.39 7.35
30 5.45 9.42
35 5.90 15.10
結 論
第１表のデータは、本発明による方法で得られ
た結果は、事実上、温度により左右されないこと
を示している。
た結果は、事実上、温度により左右されないこと
を示している。
例 ２
この例で報告する実験は、例１と同様の方法に
よつて行つた。但し、異なる樹脂、展開液及び両
性電解質を使用したことは除く。
よつて行つた。但し、異なる樹脂、展開液及び両
性電解質を使用したことは除く。
要素調製
プラスチツク製の小型カラム（内径４mm高さ
150mm）に、予めリン酸ナトリウム緩衝液（30ｍ
Ｍ、PH6.7）で平衡化した約150mgの陽イオン樹脂
〔アンベライトCG50（ローム・アンド・ハース
社製）、２型〕を充填した。
150mm）に、予めリン酸ナトリウム緩衝液（30ｍ
Ｍ、PH6.7）で平衡化した約150mgの陽イオン樹脂
〔アンベライトCG50（ローム・アンド・ハース
社製）、２型〕を充填した。
分析操作
例１と同様に、一部のカラムには更に処理を施
すことはせず、また一部のカラムには、本発明に
従い、2.0mlの８ｇ／dlアラニン溶液で処理した。
すことはせず、また一部のカラムには、本発明に
従い、2.0mlの８ｇ／dlアラニン溶液で処理した。
この場合展開液を、７ｍＭのナトリウムアジド
を含有するリン酸緩衝液（30ｍＭ）としたこと以
外は例１で記したと同様に、両カラム系を用い
て、溶血試料の試験を行なつた。
を含有するリン酸緩衝液（30ｍＭ）としたこと以
外は例１で記したと同様に、両カラム系を用い
て、溶血試料の試験を行なつた。
結 果
異なる温度下で実施して、試料中に見出された
フアースト・ヘモグロビンの％を第２表に掲載し
た。
フアースト・ヘモグロビンの％を第２表に掲載し
た。
第２表 ℃ 本発明 従来法
15 10.40 9.18
20 10.75 10.84
25 10.82 13.36
30 10.96 16.10
35 11.66 19.79
結 論
第２表のデータも同様に、本発明による操作に
よつて得られた結果の温度不依存性を示し、従来
法の操作が適用される場合には、周囲の温度によ
つて、結果が大きく左右されることを示してい
る。
よつて得られた結果の温度不依存性を示し、従来
法の操作が適用される場合には、周囲の温度によ
つて、結果が大きく左右されることを示してい
る。
ここでは、特別な例が記述されているが、本発
明の細目での多くの変形例は、本発明の範囲を逸
脱することなく実施できるものである。
明の細目での多くの変形例は、本発明の範囲を逸
脱することなく実施できるものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ (A) クロマトグラフ分離に好適なイオン交換
物質のカラムに、ヘモグロビン含有血液溶血物
を適用する； (B) ヘモグロビン配糖体を含有する溶血物の第１
分画を、展開溶液を用いて溶出する； (C) かくして溶出された第１分画を集める； (D) より緩慢に移動するヘモグロビンを含有する
第２分画を、同一又は異種の展開溶液を用いて
溶出する； (E) かくして溶出された第２分画を集める； (F) 第１分画中に存在するヘモグロビン配糖体の
量を測定する；及び (G) ヘモグロビン配糖体である総ヘモグロビンの
百分率が測定できるように、第２分画中に存在
し、より緩慢に移動するヘモグロビンの量を測
定する； 以上の工程から成る、ヘモグロビン配糖体のク
ロマトグラフ測定に関する方法であつて、 該方法に、 (H) ヘモグロビン含有血液溶血物をカラムに適用
するに先立ち、少なくとも１種のアミノ酸及
び／又は少なくとも１種のポリペプチドである
両性電解質を含有した分離用組成物の溶液を前
記カラムに適用する； 工程を付加して成ることを特徴とするヘモグロ
ビン配糖体の測定方法。 ２ 少なくとも１種のアミノ酸が、約４〜９の等
電点を有する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 少なくとも１種のアミノ酸が約5.5〜6.5の等
電点を有する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ 少なくとも１種のアミノ酸が、グリシンであ
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５ 少なくとも１種のアミノ酸が、アラニンであ
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６ 少なくとも１種のアミノ酸が、バリンである
特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７ 少なくとも１種のアミノ酸が、ロイシンであ
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ８ 少なくとも１種のアミノ酸が、グリシンとア
ラニンとの組合せである特許請求の範囲第１項記
載の方法。 ９ 少なくとも１種のポリペプチドが、約４〜９
の等電点を有する特許請求の範囲第１項記載の方
法。 １０ 少なくとも１種のポリペプチドが、約5.5
〜6.5の等電点を有する特許請求の範囲第１項記
載の方法。 １１ 少なくとも１種のポリペプチドが、グリシ
ルグリシンである特許請求の範囲第１項記載の方
法。 １２ 少なくとも１種のアミノ酸が、グリシン
で、かつ、少なくとも１種のポリペプチドが、グ
リシルグリシンである特許請求の範囲第１項記載
の方法。 １３ 少なくとも１種のアミノ酸が、グリシンと
アラニンとの組合せで、かつ、少なくとも１種の
ポリペプチドが、グリシルグリシンである特許請
求の範囲第１項記載の方法。 １４ (A) クロマトグラフ分離に好適なイオン交
換物質のカラムにヘモグロビン含有血液溶血物
を適用する； (B) ヘモグロビン配糖体を含有する溶血物の分画
を、展開溶液を用いて溶出する； (C) 前記ヘモグロビン含有血液溶血物の一部を、
適当な容量の溶出用展開液で希釈する； (D) 溶出分画中に存在するヘモグロビン配糖体の
量を測定する； (E) 前記の希釈されたヘモグロビン含有血液溶血
物中の総ヘモグロビンの量を測定する； 以上の工程から成る、ヘモグロビン配糖体のク
ロマトグラフ測定に関する方法であつて、 該方法に、 (F) ヘモグロビン含有血液溶血物をカラムに適用
するに先立ち、少なくとも１種のアミノ酸及
び／又は少なくとも１種のポリペプチドである
両性電解質を含有した分離用組成物の溶液を前
記カラムに適用する； 工程を付加して成ることを特徴とするヘモグロ
ビン配糖体の測定方法。 １５ 少なくとも１種のアミノ酸が、約４〜９の
等電点を有する特許請求の範囲第１４項記載の方
法。 １６ 少なくとも１種のアミノ酸が約5.5〜6.5の
等電点を有する特許請求の範囲第１４項記載の方
法。 １７ 少なくとも１種のアミノ酸が、グリシンで
ある特許請求の範囲第１４項記載の方法。 １８ 少なくとも１種のアミノ酸が、アラニンで
ある特許請求の範囲第１４項記載の方法。 １９ 少なくとも１種のアミノ酸が、バリンであ
る特許請求の範囲第１４項記載の方法。 ２０ 少なくとも１種のアミノ酸が、ロイシンで
ある特許請求の範囲第１４項記載の方法。 ２１ 少なくとも１種のアミノ酸が、グリシンと
アラニンとの組合せである特許請求の範囲第１４
項記載の方法。 ２２ 少なくとも１種のポリペプチドが、約４〜
９の等電点を有する特許請求の範囲第１４項記載
の方法。 ２３ 少なくとも１種のポリペプチドが、約5.5
〜6.5の等電点を有する特許請求の範囲第１４項
記載の方法。 ２４ 少なくとも１種のポリペプチドが、グリシ
ルグリシンである特許請求の範囲第１４項記載の
方法。 ２５ 少なくとも１種のアミノ酸が、グリシン
で、かつ、少なくとも１種のポリペプチドが、グ
リシルグリシンである特許請求の範囲第１４項記
載の方法。 ２６ 少なくとも１種のアミノ酸が、グリシンと
アラニンとの組合せで、かつ、少なくとも１種の
ポリペプチドが、グリシルグリシンである特許請
求の範囲第１４項記載の方法。 ２７ ヘモグロビン含有血液溶血物のクロマトグ
ラフ分離に好適なイオン交換物質で予め充填され
た少なくとも１個のクロマトグラフ用カラムと； 溶出用展開液と、少なくとも１種のアミノ酸及
び／又は少なくとも１種のポリペプチドである両
性電解質を含有する分離用組成物とを、各々収納
する少なくとも１個の容器； とが一括して組合わされた、ヘモグロビン配糖体
のクロマトグラフ測定のための試験器具。 ２８ 少なくとも１種のアミノ酸が、約４〜９の
等電点を有する特許請求の範囲第２７項記載の試
験器具。 ２９ 少なくとも１種のアミノ酸が約5.5〜6.5の
等電点を有する特許請求の範囲第２７項記載の試
験器具。 ３０ 少なくとも１種のアミノ酸が、グリシンで
ある特許請求の範囲第２７項記載の試験器具。 ３１ 少なくとも１種のアミノ酸が、アラニンで
ある特許請求の範囲第２７項記載の試験器具。 ３２ 少なくとも１種のアミノ酸が、バリンであ
る特許請求の範囲第２７項記載の試験器具。 ３３ 少なくとも１種のアミノ酸が、ロイシンで
ある特許請求の範囲第２７項記載の試験器具。 ３４ 少なくとも１種のアミノ酸が、グリシンと
アラニンとの組合せである特許請求の範囲第２７
項記載の試験器具。 ３５ 少なくとも１種のポリペプチドが、約４〜
９の等電点を有する特許請求の範囲第２７項記載
の試験器具。 ３６ 少なくとも１種のポリペプチドが、約5.5
〜6.5の等電点を有する特許請求の範囲第２７項
記載の試験器具。 ３７ 少なくとも１種のポリペプチドが、グリシ
ルグリシンである特許請求の範囲第２７項記載の
試験器具。 ３８ 少なくとも１種のアミノ酸が、グリシン
で、かつ、少なくとも１種のポリペプチドが、グ
リシルグリシンである特許請求の範囲第２７項記
載の試験器具。 ３９ 少なくとも１種のアミノ酸が、グリシンと
アラニンとの組合せで、かつ、少なくとも１種の
ポリペプチドが、グリシルグリシンである特許請
求の範囲第２７項記載の試験器具。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57084085A JPS58201065A (ja) | 1982-05-20 | 1982-05-20 | ヘモグロビン配糖体の測定方法及びその測定用試験器具 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57084085A JPS58201065A (ja) | 1982-05-20 | 1982-05-20 | ヘモグロビン配糖体の測定方法及びその測定用試験器具 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58201065A JPS58201065A (ja) | 1983-11-22 |
| JPH0215028B2 true JPH0215028B2 (ja) | 1990-04-10 |
Family
ID=13820653
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57084085A Granted JPS58201065A (ja) | 1982-05-20 | 1982-05-20 | ヘモグロビン配糖体の測定方法及びその測定用試験器具 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58201065A (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61114161A (ja) * | 1984-11-08 | 1986-05-31 | Jeol Ltd | アミノ酸分画装置 |
| IT1206003B (it) * | 1987-05-18 | 1989-04-05 | Menarini Sas | Soluzione di controllo della funzio nalita' della colonna cromatografica a scambio ionico di apparecchiature hplc (cromatografia liquida ad alta prestazione), e relativo procedimento di preparazione |
| JPH08233824A (ja) * | 1994-12-19 | 1996-09-13 | Bio Rad Lab Inc | カラム再生をしないクロマトグラフィによる糖化ヘモグロビンの連続測定法 |
| JP4511847B2 (ja) * | 2004-02-16 | 2010-07-28 | 積水化学工業株式会社 | ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5698658A (en) * | 1980-01-11 | 1981-08-08 | Sogo Seibutsu Igaku Kenkyusho:Kk | Method of simple fractional determination of glucosidated hemoglobin in blood |
-
1982
- 1982-05-20 JP JP57084085A patent/JPS58201065A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS58201065A (ja) | 1983-11-22 |
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