JPH02150498A - 新規リパーゼａｋｓ及び該リパーゼを有効成分として含有する洗浄剤組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔利用分野〕 本発明は洗浄剤組成物に関し、さらに詳細にはその有効
成分が洗浄力の優れたリパーゼを含有する洗浄用組成物
に関する。

〔従来技術〕

繊維の黄ばみ原因の１つであるトリグリセライドの除去
は、汚垢成分中の脂質の中では特に洗浄しにくいものと
されていた。そのためリパーゼを洗剤組成物として応用
し、洗浄力を増強しようとする試みは古くから行われて
いる。

例えば、リゾーブス属、キャンディダ属、アスペルギル
ス属、ムコール属及びバンクレアス由来の各リパーゼを
応用する報告があるが、その活性が中性及び微アルカリ
性でのみ発現し、さらには衣料用重質洗剤の主体である
陰イオン界面活性剤の存在下での安定性が悪い事より十
分な活性を示すことが出来ない。このことから、洗浄力
の増強はほとんど望めない〔ジャーナル・オブ・アプラ
イド・バイオケミストリー（Ｊ、＾ｐｐ１．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、）＋　２巻、２１８〜２２９頁（１９８０）　）
。　更には、アクロモバクタ−属、キャンデイダ属、ム
コール属及びパンクレアスの各リパーゼに対する陰イオ
ン界面活性剤の影響を試験した結果においても、全ての
リパーゼが強くその活性を阻害されると報告されている
〔油化学、第２３巻、９８〜１０４頁（１９７４）　）
。

又、リパーゼを配合した洗剤による洗浄力試験において
は、キャンデイダ属、リゾープス属、シュードモナス属
、ムコール属及びパンクレアスの各リパーゼについて報
告されているが、ｐＨ７での効果に比べｐＨ１０での効
果が殆ど無い〔油化学、第３５巻、第４号、６１〜６７
頁（１９８６）　）。

近年ｐＨ１０においても有効な活性を示すリパーゼ及び
そのリパーゼを配合した洗浄剤組成物に関する報告もさ
れている（特開昭６３−３９５７９．特開昭６３−７８
０００．特開昭６３−１３２９９８　）が、有効な洗浄
力を得るためには多量のリパーゼが必要であり、さらに
は他の洗剤成分と特定量で組み合わせた組成でないと十
分な洗浄力が発揮出来ない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従来のリパーゼを洗浄剤へ通用することを困難としてい
た上記に述べたような洗浄剤の主成分である陰イオン界
面活性剤によるリパーゼ活性の阻害、洗浄剤の使用条件
、例えばｐｉ（１０以上における活性の不十分さ、又そ
のリパーゼの使用量が多いための不経済性等を解決する
ことが望まれていた。

本発明はこのような状況下で、洗浄剤組成物によりその
活性がほとんど阻害されず、洗浄条件下でも十分活性を
発現し、油脂汚れ等を分解除去することで洗浄力を増強
出来るリパーゼを有効成分とする洗浄剤組成物を開発し
、提供することを目的とする。

〔問題点を解決するための手段及びその作用〕本発明者
等は、洗剤及びその主成分である各種界面活性剤やビル
グーに対し安定で、かつアルカリ領域においても活性を
十分発揮するリパーゼを得るために、広（自然界からリ
パーゼを産生ずる微生物を検索・分離し、そのリパーゼ
の界面活性剤、洗剤に対する性質を検討したところ、シ
ュードモナス属に属する一菌株がその目的に合う新規な
リパーゼを産生ずることを見い出し、本酵素を洗剤に適
用することにより本発明を完成した。本発明者等はこの
新規なリパーゼをリパーゼＡＫＳと命名した。

このリパーゼＡＫＳ生産菌は以下の如き菌学的性質を有
する。

（１）形態 （ａ）細胞の形　　：桿菌 （ｂ）細胞の大きさ；約０．５μ×１．０〜３．５μ（
Ｃ）多形性の有無：なし くｄ）運動性　　　：あり、極ベン毛 （ｅ）胞子　　　　：なし くｆ）ダラム染色性：陰性 （頗抗酸性　　　：陰性 （２）各培地における生育状態 （ａ）肉汁寒天平板培養： 円形、平滑、金縁、扁平状〜凸円状、 不遇・明、混光、はぼ白色〜黄味灰色 働）肉汁寒天斜面培養： 中程度生育、糸状、扁平、不透明、 はぼ白色〜黄味灰色 （Ｃ）肉汁波体培養： 中程度生育、上部でよく生育し、もろい皮膜を形成する
。

（ｄ）肉汁ゼラチン穿刺培養： ゼラチンを液化する。

（ｅ）リドマスミルク： アルカリ性、ペプトン化する。

（３）生理学的性質 （ａ）硝酸塩還元性　　：陽性 伽）脱窒反応　　　　；陰性 （ｃ）ＭＲテスト　　　：陰性 （ｄ）　Ｖ　Ｐテスト　　　：陰性 （ｅ）インドールの生成：陰性 （ｆ）硫化水素の生成　：陰性 （鎖デンプンの加水分解：陰性 （ハ）クエン酸塩の利用：　Ｋｏｓｅｒの培地とＣｈｒ
ｉｓｔｅｎｓｅｎの培地で陽性。

（ｉ）無機窒素源の利用：硫酸アンモニウムと硝酸ナト
リウムを利用する。

（ｊ）色素の生成　：ＫｉｎｇＡ培地で色素生成なし。

Ｋｉｎｇ　Ｂ培地で弱く明るい茶色 の水溶性色素を生成する。

（ロ）ウレアーゼ　：陰性 （１）オキシダーゼ：陽性 に）カタラーゼ　：陽性 （ｎ）生育の範囲：ｐＨ４〜８で生育する。３７°Ｃで
生育するが４°Ｃ１４２°Ｃでは生育し ない。

（０）酸素に対する態度：好気性 ψ）０−Ｆテスト；好気条件下でグルコースから酸を生
成する。

（Ｑ）ｉｔ！ｉからの酸及びガスの生成：アラビノース
、キシロース、グルコース、マンノース、フラクトース
、ガラクトース、麦芽糖、ショ糖、乳糖、トレハロース
、ソルビット、マンニット、イノジット、グリセリンか
ら酸を生成するが、ガスは生成しない。デンプンからは
酸もガスも生成しない。

以上の性質を（Ｂｕｃｈａｎａｎ、　Ｒ，Ｅ、　ａｎｄ
　Ｇｉｂｂｏｎｓ。

Ｎ、Ｅ、　：　Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ
　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃ−ｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ＋　８ｔｈ、ｅｄ、、　Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉ
ｌｋｉｎｓ　Ｃｏ、。

（１９７４）　）、〔坂崎利−訳：医学細菌同定の手び
き（２版）、近代出版、（１９７４）　）等を参考にし
て検索すると■グラム陰性、■桿菌、■好気性、■極ベ
ン毛による運動性、■カタラーゼ陽性、■オキシダーゼ
陽性、■好気的条件下で酸を生成することからシュード
モナス属に分類される。従って本生産菌株をシュードモ
ナス・エスピーＮＯへに１０２（Ｐ１０２（Ｐｓｅｕｄ
ｏ　ｓｐ、　Ｎｏ、八に１０２）と命名した。

本菌株は微生物工業技術研究所に寄託されその寄託番号
は微工研菌寄第１０３８２号である。

本菌株を培養し、リパーゼＡＫＳを生産するに際し使用
する培地として、まず炭素源としては可溶性澱粉等の多
糖類、デキストリン、マルトース等の二糖頚、グルコー
ス等の単ｙＭ類が上げられ、窒素源としてはコーンステ
イープリカー、ペプトン、肉エキス、カゼイン、アミノ
酸、酵母エキス等が上げられる。無機塩及び微量栄養源
としてはリン酸、マグネシウム、カリウム、鉄、カルシ
ウム、亜鉛等の塩類の他、ビタミン、非イオン界面活性
剤、消泡剤等の菌の生育やリパーゼＡＫＳの生産を促進
するものであれば必要に応じて使用出来る。培養は好気
的条件で、培養温度は菌が発育しリパーゼＡＫＳが産生
ずる範囲であれば良く、好ましくは２５〜４０″Ｃであ
る。培養時間は条件により異なるがリパーゼＡＫＳが最
も産生される時間まで培養すれば良いが通常１〜３日程
度である。

リパーゼＡＫＳ培養終了後培養液より菌体及び固形分を
分離し、培養ろ液を採取する。

培養ろ液よりリパーゼＡＫＳを得るには通常酵素精製に
用いられるあらゆる方法が使用出来る。

例えばエタノール、アセトン、イソプロピルアルコール
等の有機溶媒による処理、硫安１食塩等による塩析、透
析、限外ろ過性、イオン交換クロマトグラフィー等によ
る各種精製法を行うことが出来る。以下に実際例を示す
。尚、活性測定はリパーゼＡＫＳの酵素化学的性質の項
で述べる方法を使用した。

リパーゼＡＫＳの製造 ぶどうＩＪ！　２％、コーンステイープリカー２％、尿
素０．３％、リン酸二カリウム０．５％及び大豆油２％
を含む液体培地５０（１＋＋ｊ！を２１容坂ロフラスコ
に取り、１２１“Ｃｌ２Ｏ分間滅菌した後、シュードモ
ナス・エスピーＮ（Ｌ　Ａに１０２を１白金耳接種し、
３０°Ｃに２４時間、振巾５ｃｍ毎分１３０回の往復振
盪培養機で培養した。

この培養液を、０．３％のアデカノールＬＧ１２６を加
えて殺菌した同培地５００１を含む８００　ｆ容培養器
に接種し、３０°Ｃで通気量２００　Ｎ　／分、撹拌２
４Ｏｒｐｍの条件下で４８時間通気培養した。

培養後、連続遠心機にて菌体を除去し、更にろ過により
清澄なリパーゼ液４５０１を得た。この液のリパーゼ活
性は１３００ｕ／ｍ１であった。

更に限外ろ過膜により４５ｆにＰ１縮後５　’Ｃに冷却
した。このリパーゼ濃縮液の活性は６３４０ｕ／ｍｆで
あった。

一１５°Ｃに冷却したエチルアルコール１５０１を徐々
に添加し生じた沈澱をろ別し、冷アセトンで脱水後、減
圧下に乾燥してリパーゼＡＫＳ粉末４８０ｇを得た。こ
のリパーゼＡＫＳ粉末のリパーゼ活性は２６００００　
ｕ　／　ｇであった。

囮索囮ヱ旌件質 （１）作用ｐＨ： ｐ）１３〜１１に至る広いｐＨで６０％以上の活性を示
す（第１図に示す）。

（２）作用温度： ６０°Ｃ付近に至適温度を有し、８０’Ｃでも６０％以
上の活性を示す（第２図に示す）。

（３）安定ｐＨの範囲： ｐＨ４以上で９０％以上の安定性を示す（第３図に示す
）。

（４）熱安定性： ２０〜７０°Ｃの範囲でほとんど失活しない（第４図に
示す）。

（５）金属塩の影響： １．２ｍＭの各種金属塩中でほとんど活性に影響しない
（第１表に示す）。

（６）活性測定法： ０．２Ｍのトリス・塩酸緩衝液（ｐｔ１８）　４　ｍｆ
ｔをオリーブ油エマルジョン５　ｍｌに加え、更に酵素
溶液１ｄを加えて３７°Ｃで３０分間反応させ、アセト
ン・エタノール混液（１：１）１０　ｍｅを加えて反応
を停止する。さらにアセトン・エタノール混液（１：１
）１０　ｍｌ、０．０５Ｎの水酸化ナトリウム溶液１５
ＩｎＩｌを加えたのち、０゜０５Ｎの塩酸で滴定する。

活性表示法は、上記条件下１分間当り１μｍｏｌｅに相
当する脂肪酸を遊離する酵素量を１単位とした。

（７）界面活性剤に対する性質： 各種陰イオン界面活性剤（０，０５％濃度）によりほと
んど影響を受けない。逆に、非イオン界面活性剤により
活性が増大する傾向がある（第５図及び第６図に示す）
。

（８）洗剤に対する性質： 洗剤中においてリパーゼＡＫＳは十分な活性を示す（第
７図に示す）。さらには各種洗剤の標準使用濃度付近で
は、活性が増大する（第８図に示す）。

（９）各種ビルグーに対する性質： 標準使用量の３倍濃度においても全く活性は影響されな
い（第９図に示す）。

θ０）リパーゼ活性に及ぼすプロテアーゼの影響：市販
洗剤中には、その標準使用洗剤濃度で０．０８〜０．１
６単位のプロテアーゼが配合されている場合があるが、
その濃度以上のプロテアーゼによってもリパーゼ活性は
影響されない（第１０図及び第１１図に示す）。

尚、プロテアーゼの活性は下記の方法に従った。

ミルクカゼイン）容液（１，５ｇのミルクカゼインに０
．ＩＮの水酸化ナトリウム溶液を加えて加熱溶解後、Ｏ
，ＩＮの塩酸でｐ　Ｉ＋　１０に調製したのち更にＯ，
ＬＭのホウ酸緩衝液２０ｄを加え、その復水で１００　
ｍｌとする。）１ｒｎ１に酵素液ｌＩｄを加え、３７°
Ｃで１時間反応する。０．４Ｍのトリクロロ酢酸溶液２
ｄを加えて反応を停止し、ろ過する。ろ液ｌ−に０．４
Ｍ炭酸ナトリウム溶液２　ｍｌを加え、更にうすめたフ
ォリン溶液（ｌ→５）１ｍｆｆｉを加えて３７°Ｃで２
０分放置後、波長６６０ｎｍの吸光度を測定する。１分
間に１μｍｏｌの千ロジンに相当する吸光度を増加させ
る酵素量を１単位とする。

（以下余白） 第　　１　　表 次いで本発明を実施例により更に詳細に説明する。尚、
洗浄力評価方法は下記に記載する方法に従った。

（１）トリオレイン汚染布の調製 脱脂した綿布（５ｃｍ　Ｘ　５　ｃｍ　）に、クロロホ
ルムに溶解したトリオレイン（以下、Ｔｏと言う）１５
■を浸ませ、２０°Ｃにて減圧乾燥した。

（２）洗浄方法 トリオレイン汚染布５枚を、標準使用濃度の５倍の市販
洗剤液２００ｍ１に加え、３０°Ｃに６０分間静置、予
浸する。

その後、６０ｍｇのＣａＣ１，を含む８００ｍｆｆ１の
水を加え、Ｔｅｒｇ−０−Ｔｏｍｅｔｅｒを使用し、１
０分間、　１１００ｒｐで洗浄する。この時の洗剤濃度
は各種洗剤の標準使用濃度となる。

洗浄後、１１の水で２回、３０°Ｃ，５分間すすぎを行
ったのち、２０°Ｃで風乾した。

（３）洗浄力の評価方法 洗浄前後のＴＯ量をＴＬＣ−ＦＩＤ→こより定量し、以
下の計算式により洗浄力を表す。

ＡＫＳを配合した洗剤、更にトップに特開昭６３−３９
５７９のリパーゼＡＭＬを配合した洗剤も同時に試験し
た。リパーゼＡＫＳ及びリパーゼＡＭＬの配合量はいず
れも４０００単位とした。この結果を第１２図に示す。

第１２図からも明らかなようにリパーゼＡＫＳを配合し
た洗剤は他の市販洗剤のみの洗浄力やリパーゼＡＭＬを
配合した洗剤よりも洗浄力が高いことが判る。

実施例２ 実施例１と同様にして、市販洗剤としてトップを用い、
リパーゼＡＫＳの添加量を変化させて洗浄力評価を行っ
た。その結果を第２表に示す。

（以下余白） 実施例１ 上記に述べた洗浄力評価方法に従い、各種市販洗剤を用
いリパーゼによる洗浄試験を実施した。

市販洗剤としてトップ（商品名、ライオン製）、Ｈｉ−
１ツブ（商品名、ライオン製）、アタック（商品名、花
王製）を使用し、トップにリパーゼ第２表 第３表に示す洗浄剤組成物を調製し、洗浄力を評価した
。尚、各々の濃度は各洗浄液中の濃度で示す。

（以下余白） 〔発明の効果］ 本発明のリパーゼＡＫＳ配合の洗浄剤組成物は従来の洗
浄剤に比べその配合されるリパーゼが界面活性剤、洗剤
中でも安定に十分活性を発揮し、又界面活性剤の種類に
よってはその活性が増大する性質をもち、更に洗剤成分
の配合量による影響を受けないため、洗剤組成物として
有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図、第３図及び第４図はそれぞれリパーゼ
ＡＫＳの至適ｐＨ曲線、至適温度曲線、ｐｌ＋安定曲線
及び温度安定曲線を示すものである。第５図は、リパー
ゼＡＫＳの活性に及ぼす陰イオン界面活性剤の影響を示
す図であり、第６図は、リパーゼの種類による陰イオン
界面活性剤の影響の差を示す図である。第５図及び第６
図においてＡはＡＯ３（α−オレフィンスルホン酸ナト
リウムの略である。）、ＢはＬＡＳ　（直鎖アルキルベ
ンゼンスルホン酸ナトリウムの略である。）、ＣはＤＢ
Ｓ　（ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ハード
型の略である。）ＤはＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナトリウ
ムの略である。）Ｅはポリオキシエチレンアルキルフェ
ニルエーテル硫酸ナトリウム、Ｆはタウロコール酸ナト
リウム、Ｇはラウリルトリメチルアンモニウムクロライ
ド、Ｈはラウリルベタイン、■はトリトンＸ−１００、
Ｊはスパン６０、Ｋはポリオキシエチレン高級アルコー
ルエーテル、Ｌはポリオキシエチレンノニルフェニルエ
ーテルである。第７図はリパーゼの種類による各種洗剤
の影響の差を示す図である。第８図はリパーゼＡＫＳの
活性に及ぼす各種洗剤の濃度の差による影響を示す図で
あり、ａは米国洗剤の場合を示し標準使用濃度は０．２
％で、ｂは日本洗剤の場合を示し標準使用濃度は０．１
３３％である。第９図はリパーゼＡＫＳの活性に及ぼす
各種ビルグーの濃度の差による影響を示す図であり、ａ
はメタケイ酸ナトリウムの場合を示し標準使用濃度は０
．０１３５％で、ｂは炭酸ナトリウムの場合を示し標準
使用濃度は０．０１３５％で、Ｃは硫酸ナトリウムの場
合を示し標準使用濃度は０．０４０５％で、ｄはカルボ
キシメチルセルロースナトリウムの場合を示し標準使用
濃度は０．００１３５％で、ｅはゼオライトの場合で標
準使用濃度は０．０２６％である。尚、第８図及び第９
図においての各洗剤及びビルグーの標準使用量を↓で示
す。第１０図及び第１１図はリパーゼＡＫＳの活性に及
ぼすプロテアーゼの影響を示すものであり、第１０図は
洗剤を含有しない場合を示し、第１１図は洗剤を０．１
３３％含有する場合を示す。第１２図は実施例１の結果
を示す。 第　１２

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）リパーゼＡＫＳを有効成分として含有する洗浄剤
   組成物。