JPH02154686A - シュークロースホスホリラーゼの製造法 - Google Patents
シュークロースホスホリラーゼの製造法Info
- Publication number
- JPH02154686A JPH02154686A JP30692188A JP30692188A JPH02154686A JP H02154686 A JPH02154686 A JP H02154686A JP 30692188 A JP30692188 A JP 30692188A JP 30692188 A JP30692188 A JP 30692188A JP H02154686 A JPH02154686 A JP H02154686A
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- carbonate
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、シュークロースホスホリラーゼの製造法に関
し、その目的とするところは高酵素活性のシュークロー
スホスホリラーゼを効率良く得ることにある。
し、その目的とするところは高酵素活性のシュークロー
スホスホリラーゼを効率良く得ることにある。
シュークロースホスホリラーゼは、無機リン酸の存在下
でシェークロースに作用してグルコース１リン酸とフラ
クトースを生成させる酵素であり、該酵素を例えばホス
ホグルコムターゼ及びグルコース６リン酸デヒドロゲナ
ーゼ等と組み合わせて、無機リン酸を定量する方法（例
えば特開昭６３−１４６８００号、特開昭６３−４９１
００号公報参照）あるいはシー−クロースの定量分析〔
アナライティカル・バイオケミストリー １４２ 、３
５６〜５６１（１９８４））等に適応することが出来、
診断用酵素剤等として今後その開発が期待される。
でシェークロースに作用してグルコース１リン酸とフラ
クトースを生成させる酵素であり、該酵素を例えばホス
ホグルコムターゼ及びグルコース６リン酸デヒドロゲナ
ーゼ等と組み合わせて、無機リン酸を定量する方法（例
えば特開昭６３−１４６８００号、特開昭６３−４９１
００号公報参照）あるいはシー−クロースの定量分析〔
アナライティカル・バイオケミストリー １４２ 、３
５６〜５６１（１９８４））等に適応することが出来、
診断用酵素剤等として今後その開発が期待される。
従来、ロイコノストック属、ンユードモナス（１、アセ
トバクター属等に属し、シュークロースホスホリラーゼ
生産能を有する細菌を培養し、該培養物よりシュークロ
ースホスホリラーゼを採取する方法が知られている。
トバクター属等に属し、シュークロースホスホリラーゼ
生産能を有する細菌を培養し、該培養物よりシュークロ
ースホスホリラーゼを採取する方法が知られている。
しかしながら、従来の培養法に於いては培養中に有機酸
等の生成に起因し培養ｐＨが５以下に低下し、その為ン
エークシースホスホリラーゼの収率が著しく低下する弱
点を有し、又培養ｐＨの低下を防ぐ為、アンモニア、水
酸化ナトリウム等のアルカリを添加する培養液のｐＨの
調節が行なわれているが、この培養法に於いてはｐＨ調
節の為コントローラーの付属した高１＋Ｔ［ｉな培養装
置を必要とすることの池、培養操作も煩雑となる笠の欠
点を有する。
等の生成に起因し培養ｐＨが５以下に低下し、その為ン
エークシースホスホリラーゼの収率が著しく低下する弱
点を有し、又培養ｐＨの低下を防ぐ為、アンモニア、水
酸化ナトリウム等のアルカリを添加する培養液のｐＨの
調節が行なわれているが、この培養法に於いてはｐＨ調
節の為コントローラーの付属した高１＋Ｔ［ｉな培養装
置を必要とすることの池、培養操作も煩雑となる笠の欠
点を有する。
本発明者等は、従来のシュークロースホスホリラーゼ生
産菌の培養法の諸欠点を解消すべく鋭意検討を重ねた結
果、炭酸塩、酢酸塩、塩酸塩及び硝酸塩より選ばれる少
なくとも１種の塩類を含有する培地に、シュークロース
ホスホリラーゼ生産菌を接種、培養すれば、培養時のｐ
Ｈ調節を行なうことなく、極めて効率良くシュークロー
スホスホリラーゼを得ることが出来ることを知り、本発
明を完成した。
産菌の培養法の諸欠点を解消すべく鋭意検討を重ねた結
果、炭酸塩、酢酸塩、塩酸塩及び硝酸塩より選ばれる少
なくとも１種の塩類を含有する培地に、シュークロース
ホスホリラーゼ生産菌を接種、培養すれば、培養時のｐ
Ｈ調節を行なうことなく、極めて効率良くシュークロー
スホスホリラーゼを得ることが出来ることを知り、本発
明を完成した。
即ち、本発明はシュークロースホスホリラーゼ生産能を
有する微生物を、炭酸塩、酢酸塩、塩酸塩及び硝酸塩よ
り選ばれる少なくとも１種の塩類を含有する培地に培養
し、該培養物よりシュークロースホスホリラーゼを採取
することを特徴とするシュークロースホスホリラーゼの
製造法である。
有する微生物を、炭酸塩、酢酸塩、塩酸塩及び硝酸塩よ
り選ばれる少なくとも１種の塩類を含有する培地に培養
し、該培養物よりシュークロースホスホリラーゼを採取
することを特徴とするシュークロースホスホリラーゼの
製造法である。
以下、本発明を詳述する。
本発明に使用されるシー−クロースホスホリラーゼ生産
能を有する微生物としては、如何なる起源のものでも良
いが、特に例えばロイフッストック属、シュードモナス
属、アセトバクター属等に属する細菌が望ましい。
能を有する微生物としては、如何なる起源のものでも良
いが、特に例えばロイフッストック属、シュードモナス
属、アセトバクター属等に属する細菌が望ましい。
上記したシュークロースホスホリラーゼ生産菌の具体例
としては、例えばロイフッストック属に属するメツセン
チロイデス（ＡＴＣＣ１２２９１）、シュードモナス属
に属するサツ力ロフィラ（ＡＴＣＣ１５９４６）、アセ
トバクター属に属するキシリナム（Ｊ、 Ｎａｔｌ、
Ｓｃｉ、 Ｃｏｖｍｃ、 Ｓｒｉ Ｌａｎｋａ
ｔｏ （２）、 ８０〜１６９（１９８２）］等が挙
げられる。
としては、例えばロイフッストック属に属するメツセン
チロイデス（ＡＴＣＣ１２２９１）、シュードモナス属
に属するサツ力ロフィラ（ＡＴＣＣ１５９４６）、アセ
トバクター属に属するキシリナム（Ｊ、 Ｎａｔｌ、
Ｓｃｉ、 Ｃｏｖｍｃ、 Ｓｒｉ Ｌａｎｋａ
ｔｏ （２）、 ８０〜１６９（１９８２）］等が挙
げられる。
次に上記シュークロースホスホリラーゼ生産菌を有する
微生物の培養手段を述べる。
微生物の培養手段を述べる。
先ず本発明に用いいられる培養培地としては、／ニーク
ロース、糖蜜等の炭素源、トリプトン、酵母エキス、肉
エキス、大豆粉、コーンステープリカー等の窒素源、リ
ン酸１カリウム、リン酸２カリウム、硫酸マグネシウム
、硫酸鉄等の無機塩、チアミン、アスコルビン酸等のビ
タミン等を含有する液体培養培地（培地ｐＨは６．０〜
８．０種度に調節する）が用いられる。
ロース、糖蜜等の炭素源、トリプトン、酵母エキス、肉
エキス、大豆粉、コーンステープリカー等の窒素源、リ
ン酸１カリウム、リン酸２カリウム、硫酸マグネシウム
、硫酸鉄等の無機塩、チアミン、アスコルビン酸等のビ
タミン等を含有する液体培養培地（培地ｐＨは６．０〜
８．０種度に調節する）が用いられる。
次ンこ、上記培地に炭酸塩、酢酸塩、塩酸塩及び１ｉ１
’ｌ酸塩より選ばれる少なくとも１種の塩類を添加する
。
’ｌ酸塩より選ばれる少なくとも１種の塩類を添加する
。
上記した炭酸塩としては、炭酸カルシウム、炭酸カリウ
ム、炭酸ナトリウム、炭酸アンモニウム等、酢酸塩とし
ては、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウ
ム、酢酸力ルンウム等、塩酸塩としては、塩化ナトリウ
ム、塩化アンモニウム・塩化力ルンウム、塩化カリウム
等、硝酸塩としては、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、
硝酸アンモニウム、硝酸カルシウム等が好適に用いられ
る。
ム、炭酸ナトリウム、炭酸アンモニウム等、酢酸塩とし
ては、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウ
ム、酢酸力ルンウム等、塩酸塩としては、塩化ナトリウ
ム、塩化アンモニウム・塩化力ルンウム、塩化カリウム
等、硝酸塩としては、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、
硝酸アンモニウム、硝酸カルシウム等が好適に用いられ
る。
前記した培地中、炭酸塩、酢酸塩、塩酸塩及び硝酸塩よ
り選ばれる少なくとも１種の塩類の添加量は、培養液の
ｐＨが５．０以上、好ましくは５．５〜８．０の範囲に
維持されるように、該培地中０．０５％（Ｗ／Ｖ ）以
上、好まシくハ０．１〜５．０ （Ｗ／Ｖ）程度添加
するのが良く、又添加時期としては培養途中でも良いが
、培地の調製時に添加するのが望ましい。
り選ばれる少なくとも１種の塩類の添加量は、培養液の
ｐＨが５．０以上、好ましくは５．５〜８．０の範囲に
維持されるように、該培地中０．０５％（Ｗ／Ｖ ）以
上、好まシくハ０．１〜５．０ （Ｗ／Ｖ）程度添加
するのが良く、又添加時期としては培養途中でも良いが
、培地の調製時に添加するのが望ましい。
又、本発明に於ける培養法としては、通常の振盪培養、
撹拌培養、通気培養、静置培養等の適宜な液体培養手段
により、培養ｐＨ５，０〜８，０の範囲で、培養時間５
〜２５時間程度培養する。
撹拌培養、通気培養、静置培養等の適宜な液体培養手段
により、培養ｐＨ５，０〜８，０の範囲で、培養時間５
〜２５時間程度培養する。
上記シュークロースホスホリラーゼ生産菌を培養し、該
培養物よりン二一クロースホスホリラーゼを採取するに
は、例えばシュークロースホスホリラーゼ生産菌を培養
して得た培養菌体を常法により破砕抽出して該酵素の抽
出液を得、これをポリエチレンイミン、硫酸マンガンあ
るいはプロタミン硫酸等により除核酸を行ない、イオン
交換体による吸着溶出法、ゲル濾過法、ハイドロキシア
パタイトを用いた吸着溶出法、疎水クロマトグラフィー
等を適宜選択し組み合わせて行なうことにより精製し、
これを必要により濃縮することにょり精製酵素を得るこ
とが出来る。
培養物よりン二一クロースホスホリラーゼを採取するに
は、例えばシュークロースホスホリラーゼ生産菌を培養
して得た培養菌体を常法により破砕抽出して該酵素の抽
出液を得、これをポリエチレンイミン、硫酸マンガンあ
るいはプロタミン硫酸等により除核酸を行ない、イオン
交換体による吸着溶出法、ゲル濾過法、ハイドロキシア
パタイトを用いた吸着溶出法、疎水クロマトグラフィー
等を適宜選択し組み合わせて行なうことにより精製し、
これを必要により濃縮することにょり精製酵素を得るこ
とが出来る。
本発明によれば、シュークロースホスホリラーゼ生産能
を有する微生物を、炭酸塩、酢酸塩、塩酸塩及び硝酸塩
より選ばれる少なくとも１種の塩類を含有する培地で培
養することンこより、簡易な操作で効率良く、定量用酵
素剤ないしは診断用酵素剤として有用なシュークロース
ホスホリラーゼを得ることが出来、本発明は産業上極め
て有意義である。
を有する微生物を、炭酸塩、酢酸塩、塩酸塩及び硝酸塩
より選ばれる少なくとも１種の塩類を含有する培地で培
養することンこより、簡易な操作で効率良く、定量用酵
素剤ないしは診断用酵素剤として有用なシュークロース
ホスホリラーゼを得ることが出来、本発明は産業上極め
て有意義である。
以下、実施例により本発明を具体的に示す。
実施例１
シェークロース ２．０％（Ｗ／Ｖ）、酢酸ナトリウム
２．０％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス １．０％（Ｗ／ｖ
）、トリプト／（デイフコ社製）１．０％（Ｗ／ｖ）、
リン酸２カリウム１．５％（Ｗ／Ｖ）及び水からなる培
地（ｐＨ７，０） １００ ｍｌを２００ ｍｌ容量の
三角フラスコに入れて、１２０°Ｃ１１５分間滅菌した
ものに、ビタミン・ミルラル溶液〔チアミン塩ａ塩０．
１％（Ｗ／Ｖ）、アスコルビン酸０．５％＜Ｗ／Ｖ）、
硫酸マグネシウム４．０％（Ｗ／Ｖ）、硫酸第一鉄０．
１％（Ｗ／Ｖ）及び硫酸マンガン２．０％（Ｗ／Ｖ ）
を水に溶解し、メンブランフィルタ−で除菌濾過したも
の〕を １．０％（Ｖ／Ｖ）となるように添加した培地
に、ロイコノストック・メツセンチロイデス（ＡＴＣＣ
１２２９１）の肉汁寒天斜面培地より ３白金耳接種し
、これを恒温器で３０″Ｃで１４時間静置培養した。
２．０％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス １．０％（Ｗ／ｖ
）、トリプト／（デイフコ社製）１．０％（Ｗ／ｖ）、
リン酸２カリウム１．５％（Ｗ／Ｖ）及び水からなる培
地（ｐＨ７，０） １００ ｍｌを２００ ｍｌ容量の
三角フラスコに入れて、１２０°Ｃ１１５分間滅菌した
ものに、ビタミン・ミルラル溶液〔チアミン塩ａ塩０．
１％（Ｗ／Ｖ）、アスコルビン酸０．５％＜Ｗ／Ｖ）、
硫酸マグネシウム４．０％（Ｗ／Ｖ）、硫酸第一鉄０．
１％（Ｗ／Ｖ）及び硫酸マンガン２．０％（Ｗ／Ｖ ）
を水に溶解し、メンブランフィルタ−で除菌濾過したも
の〕を １．０％（Ｖ／Ｖ）となるように添加した培地
に、ロイコノストック・メツセンチロイデス（ＡＴＣＣ
１２２９１）の肉汁寒天斜面培地より ３白金耳接種し
、これを恒温器で３０″Ｃで１４時間静置培養した。
この様にして得た培養液４ ｍｅを遠心分離して菌体を
集菌し、得られた菌体を０．０５ ＭＫＨ２ＰＯ、ｔ
−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６，５） ４ ｙＪに懸濁し
、遠心分離して洗浄菌体を調製した。
集菌し、得られた菌体を０．０５ ＭＫＨ２ＰＯ、ｔ
−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６，５） ４ ｙＪに懸濁し
、遠心分離して洗浄菌体を調製した。
次にこの洗浄菌体をリゾチーム（生化学工業社製）０．
５％（Ｗ／ Ｖ ） 、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０００，
１％（Ｖ／Ｖ ） 、ｔｏ ｍＭ エチレンジアミン４
酢酸２ナトリウムを含有する０、０３ Ｍ ＫＨ２ＰＯ
４ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６，５） ４ ｔｒｔｔに懸
ン蜀した。そして３７°Ｃで３０分間ｂｏ温して溶菌し
、更にエチレンイミン・ポリマー（東京化成工業社製）
を終濃度が０．００５％（Ｖ／Ｖ）になるように添加し
て除核酸を行なったのち、遠心分離して上清（粗酵素液
）を採取した。
５％（Ｗ／ Ｖ ） 、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０００，
１％（Ｖ／Ｖ ） 、ｔｏ ｍＭ エチレンジアミン４
酢酸２ナトリウムを含有する０、０３ Ｍ ＫＨ２ＰＯ
４ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６，５） ４ ｔｒｔｔに懸
ン蜀した。そして３７°Ｃで３０分間ｂｏ温して溶菌し
、更にエチレンイミン・ポリマー（東京化成工業社製）
を終濃度が０．００５％（Ｖ／Ｖ）になるように添加し
て除核酸を行なったのち、遠心分離して上清（粗酵素液
）を採取した。
上清の酵素活性を測定した結果、培養液１ ＃Ｉｔ当た
りのンユークｐ−スホスホリラーゼ活性は１．６９単位
であった。
りのンユークｐ−スホスホリラーゼ活性は１．６９単位
であった。
なお、対照として上記の培地組成より酢酸ナトリウムの
みを除いた培地で上記操作と全く同様に培養した場合は
、培養途中のｐＨが５，０以下に代下し、得られた粗酵
素液の７二−クロースホスホリラーゼ活性は０．５３単
位／ ｍｅと低値であった。
みを除いた培地で上記操作と全く同様に培養した場合は
、培養途中のｐＨが５，０以下に代下し、得られた粗酵
素液の７二−クロースホスホリラーゼ活性は０．５３単
位／ ｍｅと低値であった。
なお、酵素活性の測定は下記の通りである。
基質シｓ−−りＧＩ Ｘを０．０５ Ｍ ＫＨ２Ｐ
Ｏ４−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６，８）中に溶かして基質
濃度を１６０ ｍＭに調製する。この基質液３．０ｘｒ
ｌに、前記緩衝液に溶解した濃度０．０１ Ｍ ＥＤＴ
Ａ −２ナトリウム溶液０．０３ ｄ、 １％（Ｗ／Ｖ
） ＮＡＤＰ（オリエンタル酵母社製）溶液０．１肩
／、 ０．０１％（Ｗ／Ｖ ）グルコース−１，６−２
リン酸（ペーリンガーマン・・イム社製）溶液０．１
ｍｌ、ｌ Ｍ塩化−２グネシウムｍ液０．０５ ｍｌ、
ホスホグルコムターゼ（ベーリンガーマンハイムａ製＞
ｏ、ｏｔ屑１１グルコース６リン酸デヒドロゲナー
ゼ（オリエンタル酵母社製）Ｑ、Ｑ１肩／を加え、２５
°Ｃで約５分間予備加温する。酵素液０．０２ ｄを加
え、波長３４０ｎｍ での １分間当たりの吸光度変
化を測定する。
Ｏ４−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６，８）中に溶かして基質
濃度を１６０ ｍＭに調製する。この基質液３．０ｘｒ
ｌに、前記緩衝液に溶解した濃度０．０１ Ｍ ＥＤＴ
Ａ −２ナトリウム溶液０．０３ ｄ、 １％（Ｗ／Ｖ
） ＮＡＤＰ（オリエンタル酵母社製）溶液０．１肩
／、 ０．０１％（Ｗ／Ｖ ）グルコース−１，６−２
リン酸（ペーリンガーマン・・イム社製）溶液０．１
ｍｌ、ｌ Ｍ塩化−２グネシウムｍ液０．０５ ｍｌ、
ホスホグルコムターゼ（ベーリンガーマンハイムａ製＞
ｏ、ｏｔ屑１１グルコース６リン酸デヒドロゲナー
ゼ（オリエンタル酵母社製）Ｑ、Ｑ１肩／を加え、２５
°Ｃで約５分間予備加温する。酵素液０．０２ ｄを加
え、波長３４０ｎｍ での １分間当たりの吸光度変
化を測定する。
なお対照は、本酵素液０．０２ｍ／の代わりに０．０１
Ｍ ＨＥＰＥＳ −ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７）を０．
０２ｍ１添加したものである。
Ｍ ＨＥＰＥＳ −ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７）を０．
０２ｍ１添加したものである。
３４０ ｎｍ での酵素反応液及び対照の１分間当た
りの吸光度の変化の差より、生成したグルコース１リン
酸を定量した。
りの吸光度の変化の差より、生成したグルコース１リン
酸を定量した。
そして力価の表示は２５”Ｃ，１分間当たり １マイク
ロモルのグルコース１リン酸を生成する酵素量を１単位
とした。
ロモルのグルコース１リン酸を生成する酵素量を１単位
とした。
実施例２
シュークロース２．０％（Ｗ／Ｖ）、炭酸カル／ラム０
．３％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス１．０％（Ｗ／Ｖ ）
、 ト リ フ゛ ト ン １．０ ％ （Ｗ／Ｖ
） 、 リン酸２カリウム １．５％（Ｗ／Ｖ ）
及び水からなる培地（ｐＨ６，９） １００ ｍｌ！
’、ｆｆ ２００ ｍｌ容量の三角フラスコンこ入りて
、［２０°Ｃ１１５分間滅菌したのち、これにビタミン
・ミルラル溶液〔チアミ／塩酸塩０．１％（Ｗ／ｖ）、
アスコルビン酸０．５％（Ｗ／Ｖ）、硫酸マグネシウム
４．０％（Ｗ／ｖ）、硫酸第一鉄０．１％（Ｗ／Ｖ
）及び硫酸マンガフ２．０％（Ｗ／Ｖ ）を水に溶解し
、メンブランフィルタ−で除菌濾過したもの〕を１．０
％（Ｖ／Ｖ）となるように添加したものに、ロイコノス
トック・メツセンチロイデス（ＡＴＣＣ１２２９１）の
肉汁寒天斜面培地より ３白金耳接種し、これな恒温器
に入れて３０°Ｃで１２時間静置し酊培養を行なった。
．３％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス１．０％（Ｗ／Ｖ ）
、 ト リ フ゛ ト ン １．０ ％ （Ｗ／Ｖ
） 、 リン酸２カリウム １．５％（Ｗ／Ｖ ）
及び水からなる培地（ｐＨ６，９） １００ ｍｌ！
’、ｆｆ ２００ ｍｌ容量の三角フラスコンこ入りて
、［２０°Ｃ１１５分間滅菌したのち、これにビタミン
・ミルラル溶液〔チアミ／塩酸塩０．１％（Ｗ／ｖ）、
アスコルビン酸０．５％（Ｗ／Ｖ）、硫酸マグネシウム
４．０％（Ｗ／ｖ）、硫酸第一鉄０．１％（Ｗ／Ｖ
）及び硫酸マンガフ２．０％（Ｗ／Ｖ ）を水に溶解し
、メンブランフィルタ−で除菌濾過したもの〕を１．０
％（Ｖ／Ｖ）となるように添加したものに、ロイコノス
トック・メツセンチロイデス（ＡＴＣＣ１２２９１）の
肉汁寒天斜面培地より ３白金耳接種し、これな恒温器
に入れて３０°Ｃで１２時間静置し酊培養を行なった。
次に、ンユークロース ２．０％（Ｗ／Ｖ）、炭酸カル
／ラム ０．５％（Ｗ／Ｖ）、酵ｍエキス１．０ ％
（Ｗ／Ｖ） 、 ）！ｊ−％ ト ン ｔ、
ｏ ％ ＜Ｗ／Ｖ）、゛リン酸２カリウム １．５％
（Ｗ／Ｖ ）及び水からなる培地（ｐＨ６，９） ２
１を撹拌式小型培養装置（いわしや社製）の培養槽に入
れて、１２０”Ｃ、２０分間滅菌したのち、これにビタ
ミン・ミルラル溶液〔チアミン塩酸塩０ 、 ｔ％（Ｗ
／Ｖ）、アスコルビン酸０．５％（Ｗ／Ｖ）、硫酸マグ
ネシウム ４．０％（Ｗ／Ｖ）、硫酸第一鉄０．１％（
Ｗ／Ｖ ）及び硫酸マンガン２．０％（Ｗ／Ｖ）を水に
溶解してメンブランフィルタ−で除菌濾過したもの］を
Ｌ、０％（Ｖ／Ｖ）となるように添加したものに、上
記種培養により得られた種菌液２％（Ｖ／Ｖ）を接種し
、３０°Ｃで１４時間通気することなく撹拌深部培養を
行なった。
／ラム ０．５％（Ｗ／Ｖ）、酵ｍエキス１．０ ％
（Ｗ／Ｖ） 、 ）！ｊ−％ ト ン ｔ、
ｏ ％ ＜Ｗ／Ｖ）、゛リン酸２カリウム １．５％
（Ｗ／Ｖ ）及び水からなる培地（ｐＨ６，９） ２
１を撹拌式小型培養装置（いわしや社製）の培養槽に入
れて、１２０”Ｃ、２０分間滅菌したのち、これにビタ
ミン・ミルラル溶液〔チアミン塩酸塩０ 、 ｔ％（Ｗ
／Ｖ）、アスコルビン酸０．５％（Ｗ／Ｖ）、硫酸マグ
ネシウム ４．０％（Ｗ／Ｖ）、硫酸第一鉄０．１％（
Ｗ／Ｖ ）及び硫酸マンガン２．０％（Ｗ／Ｖ）を水に
溶解してメンブランフィルタ−で除菌濾過したもの］を
Ｌ、０％（Ｖ／Ｖ）となるように添加したものに、上
記種培養により得られた種菌液２％（Ｖ／Ｖ）を接種し
、３０°Ｃで１４時間通気することなく撹拌深部培養を
行なった。
この様にして得た培養液４肩ｔを遠心分離して菌体を集
菌し、得られた菌体な０．０５ Ｍ沿ｂＰＣ） ４Ｎａ
ＯＨ緩衝液（ｐＨ６，５） ４ ｍｅに懸濁した後、
遠心分離して洗浄菌体を調製した。
菌し、得られた菌体な０．０５ Ｍ沿ｂＰＣ） ４Ｎａ
ＯＨ緩衝液（ｐＨ６，５） ４ ｍｅに懸濁した後、
遠心分離して洗浄菌体を調製した。
次にこの洗浄菌体をリゾチーム（生化学工業社製）０．
５％（Ｗ／Ｖ ） 、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０００，１
％（Ｖ／Ｖ ） 、１０ ｍＭ ”チレンジアミン４酢
酸２ナトリウムを含有する０、０５ Ｍ ＫＨ２ＰＯ４
−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６，５） ４ ｄに懸濁した
。そして３７°Ｃで３０分間加温して溶菌し、更にエチ
レンイミ／・ポリマー（東京化成工業社製）を終濃度が
０．００５％（Ｖ／Ｖ）になるように添加して除核酸を
行なったのち、遠心分離して上清（粗酵素液）を採取し
た。
５％（Ｗ／Ｖ ） 、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０００，１
％（Ｖ／Ｖ ） 、１０ ｍＭ ”チレンジアミン４酢
酸２ナトリウムを含有する０、０５ Ｍ ＫＨ２ＰＯ４
−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６，５） ４ ｄに懸濁した
。そして３７°Ｃで３０分間加温して溶菌し、更にエチ
レンイミ／・ポリマー（東京化成工業社製）を終濃度が
０．００５％（Ｖ／Ｖ）になるように添加して除核酸を
行なったのち、遠心分離して上清（粗酵素液）を採取し
た。
上清の酵素活性を６１１１定した結果、培養液１ ａｔ
当たりのシュークロースホスホリラーゼ活性は２．５単
位であった。
当たりのシュークロースホスホリラーゼ活性は２．５単
位であった。
なお、対照として上記の培地組成より炭酸力ルンウムの
みを除いた培地で上記操作と全く同様に培養した場合は
、培ａｐＨが５．０以下に低下し、得られた粗酵素液の
シュークロースホスホリラーゼ活性は０．５１単位／ｄ
であった。
みを除いた培地で上記操作と全く同様に培養した場合は
、培ａｐＨが５．０以下に低下し、得られた粗酵素液の
シュークロースホスホリラーゼ活性は０．５１単位／ｄ
であった。
Claims (1)
- シュークロースホスホリラーゼ生産能を有する微生物を
、炭酸塩、酢酸塩、塩酸塩及び硝酸塩より選ばれる少な
くとも１種の塩類を含有する培地に培養し、該培養物よ
りシュークロースホスホリラーゼを採取することを特徴
とするシュークロースホスホリラーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30692188A JPH02154686A (ja) | 1988-12-06 | 1988-12-06 | シュークロースホスホリラーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30692188A JPH02154686A (ja) | 1988-12-06 | 1988-12-06 | シュークロースホスホリラーゼの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02154686A true JPH02154686A (ja) | 1990-06-14 |
Family
ID=17962871
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30692188A Pending JPH02154686A (ja) | 1988-12-06 | 1988-12-06 | シュークロースホスホリラーゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02154686A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7413886B2 (en) | 2003-06-06 | 2008-08-19 | Kao Corporation | Process for producing phosphorylase |
-
1988
- 1988-12-06 JP JP30692188A patent/JPH02154686A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7413886B2 (en) | 2003-06-06 | 2008-08-19 | Kao Corporation | Process for producing phosphorylase |
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