JPH021560A - 水痘・帯状疱疹ウイルス感染症の検出薬及び検出方法 - Google Patents
水痘・帯状疱疹ウイルス感染症の検出薬及び検出方法Info
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- JPH021560A JPH021560A JP63274602A JP27460288A JPH021560A JP H021560 A JPH021560 A JP H021560A JP 63274602 A JP63274602 A JP 63274602A JP 27460288 A JP27460288 A JP 27460288A JP H021560 A JPH021560 A JP H021560A
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- monoclonal antibody
- cells
- antibodies
- zoster virus
- virus
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—DNA viruses
- C07K16/085—Orthoherpesviridae (F), e.g. pseudorabies virus or Epstein-Barr virus
- C07K16/088—Varicella-zoster virus
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は２種類のモノクローナル抗体を使用する水痘・
帯状庖疹ウィルス感染症の診断方法及び診断薬に関する
。
帯状庖疹ウィルス感染症の診断方法及び診断薬に関する
。
水痘・帯状庖疹ウィルス疾患は、発熱と発疹を伴って突
然発病する急性ウィルス病の１つである。
然発病する急性ウィルス病の１つである。
小児期に初感染し、発病後３〜４日間は水痘性で最後は
顆粒状の施皮を残して治癒するが、ウィルスはを髄後根
の神経節に潜在し、長年月の後再発すると帯状庖疹とし
ての症状を示す。
顆粒状の施皮を残して治癒するが、ウィルスはを髄後根
の神経節に潜在し、長年月の後再発すると帯状庖疹とし
ての症状を示す。
現在、水痘・帯状庖疹ウィルスと同じヘルペスウィルス
に属するヒト単純ヘルペスウィルスに対する抗体が診断
薬として知られている。しかしながら、この抗体はヒト
単純ヘルペスウィルスのみに反応し、水痘・帯状庖疹ウ
ィルスとは反応しない。従って、水痘・帯状庖疹ウィル
スを検出する診断薬が求められている。
に属するヒト単純ヘルペスウィルスに対する抗体が診断
薬として知られている。しかしながら、この抗体はヒト
単純ヘルペスウィルスのみに反応し、水痘・帯状庖疹ウ
ィルスとは反応しない。従って、水痘・帯状庖疹ウィル
スを検出する診断薬が求められている。
水痘・帯状庖疹ウィルスの糖蛋白質ＧＰに対するモノク
ローナル抗体が知られている。（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１２
９、３５７−３６８．１９８３等）。また該ウィルスの
ヌクレオカプシドＮＰに対するモノクローナル抗体も知
られている。しかしながらこれらの抗体を単独で用いて
該ウィルスが感染した細胞を検出しようとする場合、必
ずしも感度は十分でなく、明瞭な結果を得られない。
ローナル抗体が知られている。（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１２
９、３５７−３６８．１９８３等）。また該ウィルスの
ヌクレオカプシドＮＰに対するモノクローナル抗体も知
られている。しかしながらこれらの抗体を単独で用いて
該ウィルスが感染した細胞を検出しようとする場合、必
ずしも感度は十分でなく、明瞭な結果を得られない。
従って本発明は、水痘・帯状庖疹ウィルスに対するモノ
クローナル抗体を使用する、高感度で明瞭な、水痘・帯
状庖疹ウィルス感染症の新規な診断方法及び診断薬を提
供しようとするものである。
クローナル抗体を使用する、高感度で明瞭な、水痘・帯
状庖疹ウィルス感染症の新規な診断方法及び診断薬を提
供しようとするものである。
本発明者等は種々検討の結果、水痘・帯状庖疹ウィルス
の糖蛋白質に対するモノクローナル抗体及び該ウィルス
のヌクレオカプシドに対するモノクローナル抗体を混合
して使用することにより、該ウィルスが感染した細胞を
高感度で明瞭に検出することができるという全く新しい
他見を得、この発明を完成した。
の糖蛋白質に対するモノクローナル抗体及び該ウィルス
のヌクレオカプシドに対するモノクローナル抗体を混合
して使用することにより、該ウィルスが感染した細胞を
高感度で明瞭に検出することができるという全く新しい
他見を得、この発明を完成した。
従って、本発明は、水痘・帯状庖疹ウィルス糖蛋白質Ｇ
Ｐに対するモノクローナル抗体及び該ウィルスのヌクレ
オカプシドＮＰに対するモノクローナル抗体を、摘出さ
れた組織の細胞と接触せしめ、これら両抗体と前記ウィ
ルスが感染した細胞との特異的結合を検出することを特
徴とする水痘・帯状庖疹ウィルス感染症の診断方法；及
び水痘・帯状庖疹ウィルス糖蛋白質ＧＰに対するモノク
ローナル抗体及び該ウィルスのヌクレオカプシドＮＰに
対するモノクローナル抗体を組み合わせて成る水痘・帯
状庖疹ウィルス感染症診断薬を提供しようとするもので
ある。
Ｐに対するモノクローナル抗体及び該ウィルスのヌクレ
オカプシドＮＰに対するモノクローナル抗体を、摘出さ
れた組織の細胞と接触せしめ、これら両抗体と前記ウィ
ルスが感染した細胞との特異的結合を検出することを特
徴とする水痘・帯状庖疹ウィルス感染症の診断方法；及
び水痘・帯状庖疹ウィルス糖蛋白質ＧＰに対するモノク
ローナル抗体及び該ウィルスのヌクレオカプシドＮＰに
対するモノクローナル抗体を組み合わせて成る水痘・帯
状庖疹ウィルス感染症診断薬を提供しようとするもので
ある。
〔具体的な説明］
本発明に使用するモノクローナル抗体の調製方法及び該
モノクローナル抗体を生産するハイプリドーマの調製方
法は後で実施例において具体的に記載する。
モノクローナル抗体を生産するハイプリドーマの調製方
法は後で実施例において具体的に記載する。
本発明において使用抗体は、水痘・帯状庖疹ウィルス糖
蛋白質ＧＰに対するモノクローナル抗体、及び該ウィル
スのヌクレオカプシドＮＰに対するモノクローナル抗体
であればいずれも使用することができるが、後に記載す
る方法により種々のハイブリドーマを調製し、それらが
生産するモノクローナル抗体を調べた結果、糖蛋白質Ｇ
Ｐに対するモノクローナル抗体としてはハイブリドーマ
Ｎ０８（微工研条寄第２１２３号）により生産されるモ
ノクローナル抗体が最も好ましく、またカプシドＮＰに
対するモノクローナル抗体としてはハイブリドーマＮｏ
、１７（微工研閑寄第２１２４号）により生産されるモ
ノクローナル抗体が最も好ましいことを見出した。これ
ら特定のモノクローナル抗体の内、前者は水痘・帯状庖
疹ウィルスが感染した細胞（標的細胞と称する）の細胞
質に強く結合し、そして後者は標的細胞の核に強く結合
する。従って、上記特定の２種類のモノクローナル抗体
を組み合わせて使用するのが最も好ましい。
蛋白質ＧＰに対するモノクローナル抗体、及び該ウィル
スのヌクレオカプシドＮＰに対するモノクローナル抗体
であればいずれも使用することができるが、後に記載す
る方法により種々のハイブリドーマを調製し、それらが
生産するモノクローナル抗体を調べた結果、糖蛋白質Ｇ
Ｐに対するモノクローナル抗体としてはハイブリドーマ
Ｎ０８（微工研条寄第２１２３号）により生産されるモ
ノクローナル抗体が最も好ましく、またカプシドＮＰに
対するモノクローナル抗体としてはハイブリドーマＮｏ
、１７（微工研閑寄第２１２４号）により生産されるモ
ノクローナル抗体が最も好ましいことを見出した。これ
ら特定のモノクローナル抗体の内、前者は水痘・帯状庖
疹ウィルスが感染した細胞（標的細胞と称する）の細胞
質に強く結合し、そして後者は標的細胞の核に強く結合
する。従って、上記特定の２種類のモノクローナル抗体
を組み合わせて使用するのが最も好ましい。
本発明の方法の実施に当たっては、前記２種類のモノク
ローナル抗体を混合して使用するが、その混合比には特
に制限はなく、およそ１：１程度で混合するのが好まし
い。
ローナル抗体を混合して使用するが、その混合比には特
に制限はなく、およそ１：１程度で混合するのが好まし
い。
検体は、例えば、患者の病巣基底部の感染細胞を綿棒で
採取し、そしてメタノール又はアセトン、好ましくはア
セトンで固定し、これを前記２種類のモノクローナル抗
体と接触せしめ、モノクローナル抗体をウィルス感染細
胞に特異的に結合せしめる。この場合、糖蛋白質に対す
るモノクローナル抗体は主として感染細胞の細胞質に結
合し、ヌクレオカプシドに対するモノクローナル抗体は
主として核に結合する。
採取し、そしてメタノール又はアセトン、好ましくはア
セトンで固定し、これを前記２種類のモノクローナル抗
体と接触せしめ、モノクローナル抗体をウィルス感染細
胞に特異的に結合せしめる。この場合、糖蛋白質に対す
るモノクローナル抗体は主として感染細胞の細胞質に結
合し、ヌクレオカプシドに対するモノクローナル抗体は
主として核に結合する。
結合した抗体の検出方法としては、この抗体自体に標識
を付しておき直接検出する方法、この抗体に対する標識
を付した２次抗体を用いて間接的に検出する方法等があ
るが、本発明においては前記２種類の抗体に同じ標識を
付して用いるのが最も好ましい。この場合の標識として
は、免疫測定に常用される種々の標識を用いて例えば、
酵素標識法（ＰＡＰ法）、アビジンビオチン標識法、蛍
光アビジン法を使用することができるが、蛍光顕微鏡下
で直接観察することができるフルオレッセインインチオ
シアネートを用いるのが最も好ましい。
を付しておき直接検出する方法、この抗体に対する標識
を付した２次抗体を用いて間接的に検出する方法等があ
るが、本発明においては前記２種類の抗体に同じ標識を
付して用いるのが最も好ましい。この場合の標識として
は、免疫測定に常用される種々の標識を用いて例えば、
酵素標識法（ＰＡＰ法）、アビジンビオチン標識法、蛍
光アビジン法を使用することができるが、蛍光顕微鏡下
で直接観察することができるフルオレッセインインチオ
シアネートを用いるのが最も好ましい。
両モノクローナル抗体をフルオレッセインイソチオシア
ネートにより標識する場合、標識された抗体中のフルオ
レッセインイソチオシアネートと抗体蛋白質とのモル比
を約２．５〜３．５とするのが特に好ましく、フルオレ
ッセインの比率が低過ぎる場合には標的細胞の染色が不
十分となり、それを明瞭に検出することが困難となる。
ネートにより標識する場合、標識された抗体中のフルオ
レッセインイソチオシアネートと抗体蛋白質とのモル比
を約２．５〜３．５とするのが特に好ましく、フルオレ
ッセインの比率が低過ぎる場合には標的細胞の染色が不
十分となり、それを明瞭に検出することが困難となる。
他方、フルオレッセインイソチオシアネートの比率が高
過ぎるとモノクローナル抗体の変性が進み、モノクロー
ナル抗体の活性が低下し、やはり標的細胞の明瞭な検出
が困難となる。第１図は適切な比率で標識されたモノク
ローナル抗体により染色された感染細胞の写真であり、
第２図は過剰に標識されたモノクローナル抗体により染
色された感染細胞の写真である。
過ぎるとモノクローナル抗体の変性が進み、モノクロー
ナル抗体の活性が低下し、やはり標的細胞の明瞭な検出
が困難となる。第１図は適切な比率で標識されたモノク
ローナル抗体により染色された感染細胞の写真であり、
第２図は過剰に標識されたモノクローナル抗体により染
色された感染細胞の写真である。
前記の好ましい比率で標識されたモノクローナル抗体を
調製するには、抗体蛋白質とフルオレッセインイソチオ
シアネートとをおよそ１６０：１〜２００：１の重量比
で反応せしめるのが好ましい。
調製するには、抗体蛋白質とフルオレッセインイソチオ
シアネートとをおよそ１６０：１〜２００：１の重量比
で反応せしめるのが好ましい。
最も好ましくは、約２０〜２５■／ ｍｌｌの濃度の抗
体蛋白質溶液と約１■／ ｍｌの濃度のフルオレッセイ
ンイソチオシアネート溶液とを調製し、該蛋白質溶液と
フルオレッセインイソチオシアネート溶液とをおよそ８
：ｌの容量比で混合して反応せしめる。
体蛋白質溶液と約１■／ ｍｌの濃度のフルオレッセイ
ンイソチオシアネート溶液とを調製し、該蛋白質溶液と
フルオレッセインイソチオシアネート溶液とをおよそ８
：ｌの容量比で混合して反応せしめる。
この反応媒体としてはｐＨ約９．５の炭酸緩衝液が好ま
しく、反応は低温、例えば２°Ｃ〜８°Ｃにおいて撹拌
しながら１０〜２０時間行うのが好ましい。
しく、反応は低温、例えば２°Ｃ〜８°Ｃにおいて撹拌
しながら１０〜２０時間行うのが好ましい。
この様にして得られた塩基性の炭酸緩衝液中の標識化抗
体を中性リン酸緩衝液で平衡化されたカラムにより精製
することにより中性リン酸緩衝液中標識化抗体溶液を得
る。好ましくは、この標識化抗体溶液に対比染色用色素
としてエバンスブルーを約ｏ、ｏｏｉ％添加する。こう
することにより、本発明の抗体が結合しなかった細胞又
は細胞の部分がエバンスブルーにより染色されて赤色を
呈し、これにより、本発明の抗体により染色された部分
が鮮明に検出される。
体を中性リン酸緩衝液で平衡化されたカラムにより精製
することにより中性リン酸緩衝液中標識化抗体溶液を得
る。好ましくは、この標識化抗体溶液に対比染色用色素
としてエバンスブルーを約ｏ、ｏｏｉ％添加する。こう
することにより、本発明の抗体が結合しなかった細胞又
は細胞の部分がエバンスブルーにより染色されて赤色を
呈し、これにより、本発明の抗体により染色された部分
が鮮明に検出される。
実施±１ ハイブリドーマの一！１
ヒト胚繊維芽細胞（ＨＥＬ）に水痘・帯状庖疹ウィルス
Ｋａｗａｇｕｃｈ ４株を感染せしめ細胞変性効果の出
現を確認した後、細胞層をリン酸緩衝液で洗浄し、細胞
を剥がした。細胞を超音波破壊した後、細胞破砕液をそ
のまま一８０°Ｃにて保存し、抗原として使用した。免
疫はフロイント完全アジュバントと共に１回当たり０．
５ ｄをマウスの腹腔に注射することにより行った。１
力月後、同量の前記抗原をアジュバントなしで腹腔内に
投与することにより追加免疫を行った。この追加免疫後
３日目に肺臓を摘出し細胞融合に伴した。
Ｋａｗａｇｕｃｈ ４株を感染せしめ細胞変性効果の出
現を確認した後、細胞層をリン酸緩衝液で洗浄し、細胞
を剥がした。細胞を超音波破壊した後、細胞破砕液をそ
のまま一８０°Ｃにて保存し、抗原として使用した。免
疫はフロイント完全アジュバントと共に１回当たり０．
５ ｄをマウスの腹腔に注射することにより行った。１
力月後、同量の前記抗原をアジュバントなしで腹腔内に
投与することにより追加免疫を行った。この追加免疫後
３日目に肺臓を摘出し細胞融合に伴した。
すなわち、肺臓細胞を培地で洗浄した後、塩化エンモニ
ウム溶液により赤血球を破壊した。残ったリンパ球をさ
らに２回培地で洗浄した後、骨髄腫細胞ＳＰ ２ ／
１０− Ａｇ１４とｌ０＝１の割合で混合し、遠心分離
を行った。混合した細胞にポリエチレングリコールＮｏ
、４０００を加えて細胞融合を行った。融合した細胞を
ＨＡＴ（ヒボキサンチン−アミノプテリン−チミジン）
を含む培地で選択した。
ウム溶液により赤血球を破壊した。残ったリンパ球をさ
らに２回培地で洗浄した後、骨髄腫細胞ＳＰ ２ ／
１０− Ａｇ１４とｌ０＝１の割合で混合し、遠心分離
を行った。混合した細胞にポリエチレングリコールＮｏ
、４０００を加えて細胞融合を行った。融合した細胞を
ＨＡＴ（ヒボキサンチン−アミノプテリン−チミジン）
を含む培地で選択した。
ＨＡＴ培地で生育したコロニーについて、培養上清を間
接蛍光抗体法により調べた。すなわち、水痘・帯状庖疹
ウィルスをヒト胚繊維芽細胞に感染せしめて細胞変性効
果を確認した後、培養上清を加えて３７°Ｃにて６０分
間インキュベートし、洗浄した。次に、２次抗体として
抗マウスＩｇＧ −フルオレッセインイソチオシアネー
トを加え、３７゛Ｃにて３０分間インキュベートした後
、リン酸緩衝液で洗浄した。蛍光顕微鏡で観察し、上清
か特異的染色を示したコロニーについて水痘・帯状庖疹
ウィルスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとした
。こうして、該ウィルスの糖蛋白質ＧＰ３を認識する抗
体を産生ずるハイプリドーマＮｏ、 ８、及び該ウィル
スのヌクレオカプシドを認識する抗体を産生ずるハイプ
リドーマＮα１７を得た。
接蛍光抗体法により調べた。すなわち、水痘・帯状庖疹
ウィルスをヒト胚繊維芽細胞に感染せしめて細胞変性効
果を確認した後、培養上清を加えて３７°Ｃにて６０分
間インキュベートし、洗浄した。次に、２次抗体として
抗マウスＩｇＧ −フルオレッセインイソチオシアネー
トを加え、３７゛Ｃにて３０分間インキュベートした後
、リン酸緩衝液で洗浄した。蛍光顕微鏡で観察し、上清
か特異的染色を示したコロニーについて水痘・帯状庖疹
ウィルスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとした
。こうして、該ウィルスの糖蛋白質ＧＰ３を認識する抗
体を産生ずるハイプリドーマＮｏ、 ８、及び該ウィル
スのヌクレオカプシドを認識する抗体を産生ずるハイプ
リドーマＮα１７を得た。
なお、この実施例に使用した出発材料細胞はいずれも当
業者が容易に入手できるものであり、この実施例に記載
した方法により、当業者は容易に同様の反応性を有する
２つのタイプの抗体のいずれかを生産するハイプリドー
マを得ることができる。
業者が容易に入手できるものであり、この実施例に記載
した方法により、当業者は容易に同様の反応性を有する
２つのタイプの抗体のいずれかを生産するハイプリドー
マを得ることができる。
前記のバイブリド−７Ｎｏ、 ８は、ＶＺＶ−ＭＡｂ−
ｃｌ Ｂとして、工業技術院微生物工業技術研究所に、
微工研条寄第２１２３号（ＦＨＲＭ ＢＰ−２１２３）
としてブダペスト条約に基づき国際寄託されており、バ
イブリド−？ Ｎｏ、１７は、ＶＺＶ−ＭＡｂ−ｃｌ１
７として、同様に微工研条寄第２１２４号（ＦＥＲ門Ｂ
Ｐ−２１２４）としてブダペスト条約に基づき国際寄託
されている。
ｃｌ Ｂとして、工業技術院微生物工業技術研究所に、
微工研条寄第２１２３号（ＦＨＲＭ ＢＰ−２１２３）
としてブダペスト条約に基づき国際寄託されており、バ
イブリド−？ Ｎｏ、１７は、ＶＺＶ−ＭＡｂ−ｃｌ１
７として、同様に微工研条寄第２１２４号（ＦＥＲ門Ｂ
Ｐ−２１２４）としてブダペスト条約に基づき国際寄託
されている。
１脂±ｌ モノクロ−ルー の−一１＋前記ハイブリド
ーマの各々を次のＤＭＥＭ−ＮＣＴＣ１０９培地中で培
養した。
ーマの各々を次のＤＭＥＭ−ＮＣＴＣ１０９培地中で培
養した。
ＤＭＥＭ ” ’ １０００ｄ
ＮＣＴＣ１０９１５０厩 ＮＥＡ八 （”１００）
１５成１００ｍＭピルビン酸
１ｍ１３％グルタミン １５ ｍ
ｌ溶液１ ＋ｎ １５ｍＮゲルタ
マイシン（１０ｎ＋ｇ／ｄ） １．５ｍ（１）
ＤＭＥＭ Ｄ門ＥＭ粉末 １パツクＮａ１ｌＣＯ
” ２．０ ｇＬ−グルタミン
０．５８４ ｇピルビン酸ナトリウム
０．１１０ｇペニシリンＧ
Ｉ ＸＩＯ’ １０ストレプトマイシン ０．
１ｇ力価蒸留水 全体が１０００ｄになる量（
２）溶液Ｉ オキサロ酸 １００ｍＭウシ−インシュ
リン ２０１Ｕ／ｍｆｆ１上記培地にウシ胎児
血清を１５％添加。
ＮＣＴＣ１０９１５０厩 ＮＥＡ八 （”１００）
１５成１００ｍＭピルビン酸
１ｍ１３％グルタミン １５ ｍ
ｌ溶液１ ＋ｎ １５ｍＮゲルタ
マイシン（１０ｎ＋ｇ／ｄ） １．５ｍ（１）
ＤＭＥＭ Ｄ門ＥＭ粉末 １パツクＮａ１ｌＣＯ
” ２．０ ｇＬ−グルタミン
０．５８４ ｇピルビン酸ナトリウム
０．１１０ｇペニシリンＧ
Ｉ ＸＩＯ’ １０ストレプトマイシン ０．
１ｇ力価蒸留水 全体が１０００ｄになる量（
２）溶液Ｉ オキサロ酸 １００ｍＭウシ−インシュ
リン ２０１Ｕ／ｍｆｆ１上記培地にウシ胎児
血清を１５％添加。
ＢＡＬＢ／ Ｃマウスに０．５ ｍｆｌ ７匹のプリス
タンを腹腔中に注射し、３週間後、上記の様にして培養
したハイブリドーマ細胞ｌＸｌ０’を腹腔に注入した。
タンを腹腔中に注射し、３週間後、上記の様にして培養
したハイブリドーマ細胞ｌＸｌ０’を腹腔に注入した。
その後、１〜２週間後に腹腔を採取した。得られた腹水
を遠心して細胞を除去し、上清を硫酸アンモニウム沈澱
法により精製した。２０％〜４０％飽和の沈澱画分を得
、これを０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，５）に溶解し
た。
を遠心して細胞を除去し、上清を硫酸アンモニウム沈澱
法により精製した。２０％〜４０％飽和の沈澱画分を得
、これを０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，５）に溶解し
た。
１詣±１ 盈徽抗止坐訓星
前記硫酸アンモニウム沈殿により精製したモノクローナ
ル抗体の同炭酸緩衝液中溶液を３５■／−以上の蛋白質
濃度に調整し、その２．５ ｍｌｌを同炭酸緩衝液で平
衡化したｐｏ−ｔｏカラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５
）に適用し、次に同炭酸緩衝液３．５ ｍｆｌを通して
３．５ ｍｆｌの溶出液を回収した。次に、この抗体液
の蛋白質濃度が約２０〜２５ｍｇ／ｍｌとなるように同
炭酸緩衝液により調整した。
ル抗体の同炭酸緩衝液中溶液を３５■／−以上の蛋白質
濃度に調整し、その２．５ ｍｌｌを同炭酸緩衝液で平
衡化したｐｏ−ｔｏカラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５
）に適用し、次に同炭酸緩衝液３．５ ｍｆｌを通して
３．５ ｍｆｌの溶出液を回収した。次に、この抗体液
の蛋白質濃度が約２０〜２５ｍｇ／ｍｌとなるように同
炭酸緩衝液により調整した。
この場合、蛋白質濃度は吸光度により測定し、Ａ２Ｂ。
／１．４＝蛋白質濃度とした。
一方、フルオレッセインイソチオシアネート粉末１ ｍ
ｇを炭酸緩衝液（０，５Ｍ ＮａＣ０ｘ−ＮａｌｌＣＯ
ｓ） （ｐＨ９，５）１ｍｊ！に）容解し、１μｇ／Ｉ
のフルオレッセインイソチオシアネート溶液を調製した
。
ｇを炭酸緩衝液（０，５Ｍ ＮａＣ０ｘ−ＮａｌｌＣＯ
ｓ） （ｐＨ９，５）１ｍｊ！に）容解し、１μｇ／Ｉ
のフルオレッセインイソチオシアネート溶液を調製した
。
次に、このフルオレッセインイソチオシアネー１−溶液
１２５ｕＩ（０，１２５ｍｇ）に対して前記の抗体液１
０００μ／ （２５〜３０ｍｇ）の割合で両溶液を混合
し、４°Ｃ１暗所で約１５時間撹拌することにより両者
を反応せしめた。
１２５ｕＩ（０，１２５ｍｇ）に対して前記の抗体液１
０００μ／ （２５〜３０ｍｇ）の割合で両溶液を混合
し、４°Ｃ１暗所で約１５時間撹拌することにより両者
を反応せしめた。
次に、０．０１Ｍリン酸緩衝液（０，１ＭＮａＣ６及び
０．０２％ＮａＮ３を含有、ｐＨ７、２）で平衡化した
ＰＤ−１０のカラムに前記反応混合物を加え、次に前記
リン酸緩衝液により溶出を行い、黄色の画分を採取する
ことにより標識された抗体を含む抗体画分を回収した。
０．０２％ＮａＮ３を含有、ｐＨ７、２）で平衡化した
ＰＤ−１０のカラムに前記反応混合物を加え、次に前記
リン酸緩衝液により溶出を行い、黄色の画分を採取する
ことにより標識された抗体を含む抗体画分を回収した。
この場合、遊離のフルオレッセインイソチオシアネート
はカラム中に残る。次に、前記の回収した抗体画分をＱ
ＡＥ Ｚｅｔａｐｒｅｐ （イオン交換体）カラムに加
え、このカラムに５０ｍ１の０．０１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７，２） （０，１Ｍ ＮａＣｊ！含有）を通ずこ
とによってフルオレッセインイソチオシアネー１〜及び
未反応の抗体を溶出して除去した。次に、このカラムに
０．５ Ｍ Ｎａ（Ｊ！を含有する０、０１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，２） ３５〜４０ｍ！を通すことにより
標識化抗体を溶出し回収した。これらの両分をリン酸緩
衝液（０，Ｉ Ｍ Ｎａ（Ｊ！ 、 ０．０２％ＮａＮ
５． ｐＨ７，２）により１０倍稀釈し、波長５２０〜
２５０ｎｍの範囲で吸光スペクトルを測定した。この結
果、フルオレッセインイソチオシアネート（Ｆ）を示す
４９５ｎｍ付近と、蛋白質（Ｐ）を示す２８０ｎｍ付近
にピークが認められた。このピーク値に基づいて、蛋白
質濃度＝ Ａｚｓｏ Ｘｏ、７５ Ａ４９５ Ｘｏ、
２２７Ｆ／Ｐ比−Ａ４９Ｓ Ｘ２．３４／蛋白質濃度に
より、Ｆ／Ｐ比（フルオレッセインイソチオンアネート
と蛋白質の比）を求め、これが２．５〜３．５にあるこ
とを確認した。
はカラム中に残る。次に、前記の回収した抗体画分をＱ
ＡＥ Ｚｅｔａｐｒｅｐ （イオン交換体）カラムに加
え、このカラムに５０ｍ１の０．０１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７，２） （０，１Ｍ ＮａＣｊ！含有）を通ずこ
とによってフルオレッセインイソチオシアネー１〜及び
未反応の抗体を溶出して除去した。次に、このカラムに
０．５ Ｍ Ｎａ（Ｊ！を含有する０、０１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，２） ３５〜４０ｍ！を通すことにより
標識化抗体を溶出し回収した。これらの両分をリン酸緩
衝液（０，Ｉ Ｍ Ｎａ（Ｊ！ 、 ０．０２％ＮａＮ
５． ｐＨ７，２）により１０倍稀釈し、波長５２０〜
２５０ｎｍの範囲で吸光スペクトルを測定した。この結
果、フルオレッセインイソチオシアネート（Ｆ）を示す
４９５ｎｍ付近と、蛋白質（Ｐ）を示す２８０ｎｍ付近
にピークが認められた。このピーク値に基づいて、蛋白
質濃度＝ Ａｚｓｏ Ｘｏ、７５ Ａ４９５ Ｘｏ、
２２７Ｆ／Ｐ比−Ａ４９Ｓ Ｘ２．３４／蛋白質濃度に
より、Ｆ／Ｐ比（フルオレッセインイソチオンアネート
と蛋白質の比）を求め、これが２．５〜３．５にあるこ
とを確認した。
この抗体液にエバンスブルー約０．００１％（最後濃度
）を対比染色用色素として加えて標識抗体液とした。
）を対比染色用色素として加えて標識抗体液とした。
この様にして前記２種類のモノクローナル抗体の標識抗
体液を得、これらを１：１の容量比で混合して試薬とし
た。
体液を得、これらを１：１の容量比で混合して試薬とし
た。
尖施炎土
水痘・帯状庖疹ウィルスに感染している患者の病巣基底
部から綿棒により感染細胞を採取し、これを３枚のスラ
イドグラスに２ケ所ずつ塗布し、風乾した後、アセトン
により固定し、アセトンを藤発せしめた。これらの３枚
のスライドグラス上の固定細胞に、スライドグラスＡに
ついては、ハイブリドーマＮｏ。８（実施例１）により
生産されたモノクローナル抗体を実施例３により標識し
たものを、スライドグラスＢについてはハイブリドーマ
Ｎｏ、１７ （実施例１）により生産されたモノクロー
ナル抗体を実施例３により標識したものを、そしてスラ
イドグラスＣについては、両標識モノクローナル抗体の
混合物を滴加し、そして３７°Ｃにて３０分間インキュ
ベートした。洗浄液ＰＢＳ （−）（リン酸緩衝液）に
より過剰の試薬を洗浄除去した後、乾燥し、封入液を滴
下した後カバースリンブをかぶせ、蛍光顕微鏡で観察し
た。
部から綿棒により感染細胞を採取し、これを３枚のスラ
イドグラスに２ケ所ずつ塗布し、風乾した後、アセトン
により固定し、アセトンを藤発せしめた。これらの３枚
のスライドグラス上の固定細胞に、スライドグラスＡに
ついては、ハイブリドーマＮｏ。８（実施例１）により
生産されたモノクローナル抗体を実施例３により標識し
たものを、スライドグラスＢについてはハイブリドーマ
Ｎｏ、１７ （実施例１）により生産されたモノクロー
ナル抗体を実施例３により標識したものを、そしてスラ
イドグラスＣについては、両標識モノクローナル抗体の
混合物を滴加し、そして３７°Ｃにて３０分間インキュ
ベートした。洗浄液ＰＢＳ （−）（リン酸緩衝液）に
より過剰の試薬を洗浄除去した後、乾燥し、封入液を滴
下した後カバースリンブをかぶせ、蛍光顕微鏡で観察し
た。
その結果、ハイブリドーマＮｏ、 ８由来の標識化抗体
により染色した細胞は細胞質がわずかに染色され、また
ハイブリドーマＮｏ、 １７由来の標識化抗体により染
色した細胞は核がわずかに染色され、いずれも染色はあ
まり明瞭でなかったのに対して、両抗体番こより染色し
た細胞は細胞質及び核の両者が染色され、全体として掻
めて明瞭に染色された。
により染色した細胞は細胞質がわずかに染色され、また
ハイブリドーマＮｏ、 １７由来の標識化抗体により染
色した細胞は核がわずかに染色され、いずれも染色はあ
まり明瞭でなかったのに対して、両抗体番こより染色し
た細胞は細胞質及び核の両者が染色され、全体として掻
めて明瞭に染色された。
なお、水痘・帯状庖疹ウィルスにより感染されていない
細胞を用いて同様に処理した結果、いずれの抗体又は抗
体混合物によっても細胞は蛍光染色されなかった。
細胞を用いて同様に処理した結果、いずれの抗体又は抗
体混合物によっても細胞は蛍光染色されなかった。
両抗体により染色された細胞の蛍光顕微鏡写真を第１図
に示す。
に示す。
ん組州■ 並逝Ｊキット
（１）実力面倒３により調製されたそれぞれの標識化抗
体２ｄずつを別々のアンプルに充填して診断用二［ン１
とした。このものは５ ’（４に”７貯ｉａ’ｔ−るご
とがでζ＼る。この試薬ｔ４仲川前乙、′例えば同［１
ずつＺ捏合する。
体２ｄずつを別々のアンプルに充填して診断用二［ン１
とした。このものは５ ’（４に”７貯ｉａ’ｔ−るご
とがでζ＼る。この試薬ｔ４仲川前乙、′例えば同［１
ずつＺ捏合する。
（２）実施例３に、１、すＡＩ：＋製１．たイ４′１そ
′れの標識化抗体２ ｍｉずつを別々のアング／１．／
ＬＺ、Ｊ６．填１−５．た俊浬枯乾燥し、診断用ギノ
トと１−５．た。、１．のちの（ｊ常温で貯蔵３゛るこ
とかできる。使用自前ａ：、、例えば２ｄの蒸留水によ
り溶解し、その溶液に１例えば同州−ずつ混合した後使
用する。
′れの標識化抗体２ ｍｉずつを別々のアング／１．／
ＬＺ、Ｊ６．填１−５．た俊浬枯乾燥し、診断用ギノ
トと１−５．た。、１．のちの（ｊ常温で貯蔵３゛るこ
とかできる。使用自前ａ：、、例えば２ｄの蒸留水によ
り溶解し、その溶液に１例えば同州−ずつ混合した後使
用する。
（３）実施例３により調製１．た２種類の控１．０（化
抗体を同Ｖず−Ｈ捏合（，７，２ｍρずつ゛アンプル！
、：’充槙。
抗体を同Ｖず−Ｈ捏合（，７，２ｍρずつ゛アンプル！
、：’充槙。
して診断用試十とし、５た。このちのは５ ”Ｃに？’
、 ！ｔ；藏１することができる。
、 ！ｔ；藏１することができる。
（４）実施例３により調製し５だ２種類の標識化１）Ｌ
体を同量ずつ混合し、２ ｍＱず−７）アンプルυ、二
充填ｊ〜た律凍鮎乾燥１．７た。このものロー常温で！
１１藏、′１゛るこ、・−ができる。ごね４は使用直ｎ
ｌに、例えば２ Ｉｌｌρの蒸留水Ｃ１゛より溶解した
後、その溶液を使用１″る。
体を同量ずつ混合し、２ ｍＱず−７）アンプルυ、二
充填ｊ〜た律凍鮎乾燥１．７た。このものロー常温で！
１１藏、′１゛るこ、・−ができる。ごね４は使用直ｎ
ｌに、例えば２ Ｉｌｌρの蒸留水Ｃ１゛より溶解した
後、その溶液を使用１″る。
実−施例、！５１
１シｎ床診断により水痘・帯状庖疹ウィルス感染症（１
コ一罹７代１１．ている、′とが薙ｌ（忍された２２３
人の患者についと１．１１；１記実施例Ｌｌ ４’：記
載した・１゛ツトを用いで実施例４１．こ記載した方法
Ｇ、′−準じでント発明の方法６５′、！、る診断ろＩ
行っ〕：・７その結果、２１５人の患者Ｃ７つＦ’ｊ陽
１１［、’：判ｌｌ’Ｒｆｉ ｈ １． ’ｂ’ＲＤ、
診断結：！４！： （、：１ ｔ４ ｔ ル陽性率は９
６％以十であ１．た。
コ一罹７代１１．ている、′とが薙ｌ（忍された２２３
人の患者についと１．１１；１記実施例Ｌｌ ４’：記
載した・１゛ツトを用いで実施例４１．こ記載した方法
Ｇ、′−準じでント発明の方法６５′、！、る診断ろＩ
行っ〕：・７その結果、２１５人の患者Ｃ７つＦ’ｊ陽
１１［、’：判ｌｌ’Ｒｆｉ ｈ １． ’ｂ’ＲＤ、
診断結：！４！： （、：１ ｔ４ ｔ ル陽性率は９
６％以十であ１．た。
第１図は、本発明の方法により最適じ標識された千ノク
ロ・〜ナル抗体心こより￥ａ色された細胞を示づ゛蛍光
顕微鏡写！１１、であ−、（、生や１の形態を表１−図
面で５．′代わる耳白、である８ 第２図は、過剰に標識され人−十ノクローナル抗体Ｕよ
り卆色された細胞の蛍光顕微鏡写真であ、、。 マ＼７牛物の形態４表ｉ” ｌ；’？Ｉ １Ｔｌｉ Ｑ
、−代わる写真である。
ロ・〜ナル抗体心こより￥ａ色された細胞を示づ゛蛍光
顕微鏡写！１１、であ−、（、生や１の形態を表１−図
面で５．′代わる耳白、である８ 第２図は、過剰に標識され人−十ノクローナル抗体Ｕよ
り卆色された細胞の蛍光顕微鏡写真であ、、。 マ＼７牛物の形態４表ｉ” ｌ；’？Ｉ １Ｔｌｉ Ｑ
、−代わる写真である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、水痘・帯状庖疹ウィルス糖蛋白質ＧＰに対するモノ
クローナル抗体及び該ウィルスのヌクレオカプシドＮＰ
に対するモノクローナル抗体を、摘出された組織の細胞
と接触せしめ、これら両抗体と前記ウィルスが感染した
細胞との特異的結合を検出することを特徴とする水痘・
帯状庖疹ウィルス感染症の診断方法。 ２、前記糖蛋白質ＧＰに対するモノクローナル抗体がハ
イブリドーマＮｏ．８（微工研条寄第２１２３号）によ
り生産されるモノクローナル抗体であり、そして前記ヌ
クレオカプシドＮＰに対するモノクローナル抗体がハイ
ブリドーマＮｏ．１７（微工研条寄第２１２４号）によ
り生産されるモノクローナル抗体である、請求項１に記
載の方法。 ３、標識された両モノクローナル抗体を用いることを特
徴とする請求項１に記載の方法。４、前記標識がフルオ
レッセインイソチオシアネートである請求項３に記載の
方法。 ５、フルオレッセインイソチオシアネートとモノクロー
ナル抗体とのモル比が２．５〜３．５である、請求項４
に記載の方法。 ６、標識されたモノクローナル抗体にエバンスブルーを
添加して使用する、請求項２〜５のいずれか１項に記載
の方法。 ７、水痘・帯状庖疹ウィルス糖蛋白質ＧＰに対するモノ
・クローナル抗体及び該ウィルスのヌクレオカプシドＮ
Ｐに対するモノクローナル抗体を組み合わせて成る水痘
・帯状庖疹ウィルス感染症診断薬。 ８、前記糖蛋白質ＧＰに対するモノクローナル抗体がハ
イブリドーマＮｏ．８（微工研条寄第２１２３号）によ
り生産されるモノクローナル抗体であり、そして前記ヌ
クレオカプシドＮＰに対するモノクローナル抗体がハイ
ブリドーマＮｏ．１７（微工研条寄第２１２４号）によ
り生産されるモノクローナル抗体である、請求項７に記
載の診断薬。 ９、前記両モノクローナル抗体が混合されている請求項
７又は８に記載の診断薬。 １０、前記両モノクローナル抗体が標識されている請求
項７又は８に記載の診断薬。 １１、前記標識がフルオレッセインイソチオシアネート
である請求項１０に記載の診断薬。 １２、フルオレッセインイソチオシアネートとモノクロ
ーナル抗体とのモル比が２．５〜３．５である、請求項
１１に記載の診断薬。 １３、標識されたモノクローナル抗体にエバンスブルー
が添加されている、請求項第１０〜１２のいずれか１項
に記載の診断薬。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63274602A JP2652959B2 (ja) | 1987-12-15 | 1988-11-01 | 水痘・帯状疱疹ウイルス感染症の検出薬及び検出方法 |
| EP88311887A EP0321249B1 (en) | 1987-12-15 | 1988-12-15 | Agent for and method of diagnosis of varicella zoster virus infection |
| DE3852875T DE3852875T2 (de) | 1987-12-15 | 1988-12-15 | Mittel und Verfahren zur Diagnose von Varicella zoster-Virusinfektion. |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62-315254 | 1987-12-15 | ||
| JP31525487 | 1987-12-15 | ||
| JP63274602A JP2652959B2 (ja) | 1987-12-15 | 1988-11-01 | 水痘・帯状疱疹ウイルス感染症の検出薬及び検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH021560A true JPH021560A (ja) | 1990-01-05 |
| JP2652959B2 JP2652959B2 (ja) | 1997-09-10 |
Family
ID=26551104
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63274602A Expired - Lifetime JP2652959B2 (ja) | 1987-12-15 | 1988-11-01 | 水痘・帯状疱疹ウイルス感染症の検出薬及び検出方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0321249B1 (ja) |
| JP (1) | JP2652959B2 (ja) |
| DE (1) | DE3852875T2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5710248A (en) * | 1996-07-29 | 1998-01-20 | University Of Iowa Research Foundation | Peptide tag for immunodetection and immunopurification |
| US6849407B2 (en) | 2000-08-31 | 2005-02-01 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Detection of varicella-zoster virus |
| US20110262895A1 (en) * | 2008-08-07 | 2011-10-27 | Harding Robert E | Methods for the diagnosis of varicella zoster virus infection |
| CN108181467B (zh) * | 2018-02-06 | 2019-03-12 | 长春祈健生物制品有限公司 | 一种稳定的用于fama法检测的抗原片的制备方法 |
| CN117106070B (zh) * | 2019-11-11 | 2024-06-11 | 珠海泰诺麦博制药股份有限公司 | 抗水痘-带状疱疹病毒的抗体 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0148644A3 (en) * | 1984-01-06 | 1987-06-03 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | A novel fusion partner and its products |
| EP0198086B1 (en) * | 1984-09-28 | 1991-01-16 | Teijin Limited | Mouse human hybridoma producing antivirus human antibody, process for its preparation, and antivirus human monoclonal antibody |
| GB8426467D0 (en) * | 1984-10-19 | 1984-11-28 | Technology Licence Co Ltd | Monoclonal antibodies |
-
1988
- 1988-11-01 JP JP63274602A patent/JP2652959B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-15 DE DE3852875T patent/DE3852875T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-12-15 EP EP88311887A patent/EP0321249B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2652959B2 (ja) | 1997-09-10 |
| DE3852875D1 (de) | 1995-03-09 |
| EP0321249A2 (en) | 1989-06-21 |
| DE3852875T2 (de) | 1995-09-21 |
| EP0321249B1 (en) | 1995-01-25 |
| EP0321249A3 (en) | 1991-05-15 |
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