JPH02156898A - 抗低密度型ヘパラン硫酸プロテオグリカンモノクローン抗体、それを産生するハイブリドーマおよびこのモノクローン抗体を用いる低密度型ヘパラン硫酸プロテオグリカンの検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、低密度型Ｃ以下、ＬＤ型と略記する）ヘパラ
ン硫酸プロテオグリカンに対して特異性の高いモノクロ
ーン抗体、それを産生ずる細胞ならびに基底膜の異常ま
たは損傷を伴う腎炎、アルツハイマー病および動脈硬化
症の診断のために、そのモノクローン抗体を用いるＬＤ
型ヘパラン硫酸プロテオグリカンの検出方法に関するも
のである。

［従来の技術とその課題］ ヘパラン硫酸プロテオグリカン（以下ｒＨ３−ＰＧＪと
いう）は、動物の組織におけるその分布や機能の違いか
ら、細胞表層型および基底膜型の２種の系列に分類され
ている（Ｓｔｏｗ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８２：３２９６
−３３００　：Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ。

１０（１：９７５−９８０．１９８５ａ、１Ｑ８５ｂ　
　：　　Ｊａｌｋａｎｅｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ。

Ｃｅ１ｌ　　Ｂｉｏｌ、１Ｏ１：９７６−９８４　．１
９８５１゜基底膜型Ｈ３−ＰＧに対する抗体は、マウス
のＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏ１ｍ−５ｗａｒｍ腫瘍（
以下、ｒＥＨ３腫瘍」という）組織由来のものに対して
、最初に、ＢＭ−１種体として調製された（Ｈａｓｓｅ
ｌ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ、　７７　：　４４９４−４４９８．１９８０１゜こ
れらの抗体を用いた免疫組織化学的研究により、抗原は
、種々の組織中に普遍的に存在する成分Ｈ３−ＰＧであ
ることが示唆された（Ｈａｓｓｅｌｅｔ　ａｌ、、Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７７：４
４９４−４４９８゜１９８０　：　Ｋｉｍａｔａ　ｅｔ
　ａｌ、、Ｊ、Ｅｍｂｒｙｏｌ、Ｅｘｐ、Ｍｏｒｐｈ、
８９：２４３−２５７．１９８５　；　Ｔｈｅｓｌｅｆ
ｆ　ｅｔ　ａｌ、、Ｄｅｖ、Ｂｉｏｌ、８１：１８２−
１９２．１！１８１）。

しかしながら、その後、Ｅ　ＨＳ腫瘍に存在する［（Ｓ
−ＰＧは低密度型（以下、ｒＬＤ型」という）および高
密度型（以下、ｒＨＤ型」という）の２種の形状に分類
されることが判明しくＤｚｉａｄｅｋｅｔ　ａｌ、、Ｅ
ｕｒ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、Ｏｒｇａｎ、Ｊ、４：９０５
−９１２．１９８５；Ｆｕｊｉｗａｒａ　ｅｔ　ａｌ、
、Ｅｕｒ、、１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１４３　：１４５−
１５７゜１９８４；　ｔ（ａｓｅＬｌ　ｓｔ　ａｌ、、
Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、２６０　：　８０９８−８１
（１５，１９８５１、さらに、最近、ＬＤ型とＨＤ型と
はコア蛋白部分およびグリコサミノグリカンの糖鎖構造
のいずれにおいても異分子であることが、本発明者らに
よって明らかにされた（Ｋａｔｏ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２６２．７１８０−７１
８８（１９８７））。

すなわち、ＬＤ型１（Ｓ−ＰＧは１本のコア蛋白分子（
Ｍ　ｒ　＝４５０．０００：結合オリゴ糖鎖の量の差に
よりＭ　ｒ　＝　３６０．０００のものも含まれる）に
ヘパラン硫酸を結合した巨大なプロテオグリカンであり
、他方、ＨＤ型は４種の異なった分子サイズのコア蛋白
分子（Ｍ　ｒ　＝　３４．０００．２９．０００．２７
．　（］Ｉ）０．２１．０００）からなる小さなプロテ
オグリカンであり、そのほとんどにヘパラン硫酸および
コンドロイチン硫酸を結合しているものである。

このＬＤ型Ｈ５−ＰＧは、ヒトをはじめ多くの動物組織
の基底膜に特異的な成分であって、各種動物組織の構造
的、代謝的異常は基底膜の機能異常を引き起こすことが
インビトロの実験で証明されているので、各動物固有の
ＬＤ型Ｈ３−ＰＧの存在状況を検出することができれば
、基底膜異常を伴うヒトの疾病、例えば急性慢性腎炎、
動脈硬化症、種々の腫瘍、アルツハイマー病等の病理検
査の手段に活用できる点で有用である。

一方、該ＨＫ−１０２抗体を用いて種の異なる動物、例
えばヒトの組織中のＬＤ型Ｈ５−ＰＧの存在分布の確認
が可能か否かについては、通常、マウス由来のＨＳ−Ｐ
Ｇと他種動物のＨＳ−ＰＧとは分子構造が異なると考え
られ、構造認識性（特異性）の高いＭｏ−Ａｂ／）（Ｋ
−１０２により交差反応が起こらないと考えられる。

しかし、本発明者らの知見によれば、驚くべきことに、
ヒトのアルツハイマー病患者の脳組織細胞所見において
、アミロイド繊維部分に、正常者にみられないＨＫ−１
０２の免疫組織染色像が確認された。このことは、ヒト
の基底膜の成分が疾病に伴い異性化し、構造的にマウス
のＨＳ−ＰＧと近似構造に変換されたことを示唆する。

したがって、ＨＫ−１０２を用い、ヒトの病理組織のＬ
Ｄ型ＨＳ−ＰＧを検出することにより、基底膜異常を伴
うヒトの疾病、例えば急性慢性腎炎、動脈硬化症１種々
の腫瘍、アルツハイマー病等の診断に有用な方法となり
つる。

本発明は、ＨＳ−ＰＧのＬＤ型に対して特異性の高いモ
ノクローン抗体を産生する細胞を見出し、このモノクロ
ーン抗体を調製し、これを用いて種々の組織におけるＨ
Ｓ−ＰＧのＬＤ型を検出する方法を提供することを目的
とする。

〔課題を解決するための手段１ 本発明は、ＬＤ型Ｈ３−ＰＧを含有する組織由来のＨＳ
−ＰＧを抗原として予め免疫したラットの脾細胞とマウ
スのミエローマ細胞との細胞融合により形成されたハイ
ブリドーマから産生される抗ＬＤ型Ｈ５−ＰＧモノクロ
ーン抗体、該モノクローン抗体を産生ずるハイブリドー
マ、および該モノクローン抗体を用いることを特徴とす
るＬＤ型Ｈ５−ＰＧの検出方法に関するものである。

以下、本発明を更に詳細に説明する。

本発明の目的を達成するための第一段階は、抗体を産生
する新規な単クローンハイブリドーマを確立することで
ある。このハイブリドーマを確立する方法の具体的詳細
は実施例で示すが、簡単には次の３工程から成る。

■、免疫 ２　細胞融合 ３　ハイブリドーマの選択と単りローン化灸現 本発明において、抗原として用いるＨ３−ＰＧとしては
、ＬＤ型Ｈ３−ＰＧを含有する組織、例えばマウスのＥ
Ｆ（Ｓ腫瘍組織、マウスの腎、血管、悩等の組織由来の
ものであれば、如何なるものでもよいが、特にＬＤ型Ｈ
３−ＰＧに富んだ組織由来のもの、例えばＥ　ＨＳ　ｌ
ｌｉ瘍組織組織由来３ＰＧを用いることが好ましい。

免疫動物としては、マウスおよびラットを用いるが、異
種抗原による免疫を行なうことが効率的であるので、マ
ウス抗原の場合にはラットを免疫動物として用いる。

通常、免疫は数回に分けて行うが、初回免疫はアジュバ
ントと共に投与することが好ましい。

アジュバントとしては、ミョウバン、結核死菌、核酸、
フロインドアジュバント等が使用される。

細胞融合 最終免疫後にリンパ節或は牌臓を摘出し、得られるリン
パ球を細胞融合に供する。一方、細胞融合に使用される
腫瘍細胞株としては、通常、マウスのＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　
／　ｃ由来のＰ　３−Ｎ５−１／１−Ａｇ４−１、Ｐｓ
　　Ｘ６３　　Ａｇ８　　Ｕｌ（Ｐ　−Ｕ　ｌ　）　、
　Ｐ　ｓ　　Ｘ　６３　　Ａ　ｇ　８　６５３、ＳＰ２
１０−Ａｇ　１４等を用いる。

バイプリドーマの選択と単クローン化 ハイプリドーマの増殖の盛んな細胞培養上清を種々の分
析法（例えば旧Ａ、プラーク法、凝集反応、ＥＬＩＳＡ
等）で目的の抗体産生ハイブリドマを選択する。ハイプ
リドーマを得たならクローニングを行う。クローニング
の方法としてはＦＡＣ５（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ａ
ｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｃｅ１ｌ　５ｏｒｔｅｒｌ　を用い
たり、５ｏｆｔ　Ａｇａｒを用いてコロニーを拾い上げ
る方法の他に、一般によく用いられる限界希釈法等があ
る。クローニングはコロニーが一つのハイブリドーマか
ら形成されるような細胞濃度で行う。

限界希釈法では９６ウエルプレートの１ウエルあたり細
胞が１個以下になるように行う。どの方法を用いてもク
ローニングは２回繰返し行い、単一クローンとする。

抗Ｌ　Ｄ型ＨＳ　−Ｐ　Ｇモノクローン抗体の産生クロ
ーンを確立したなら抗体は大量にｉｎ　ｖｉｔｒ。

で培養するか、或はｉｎ　ｖｉｖｏで培養するかによっ
て産生される。ｉｎ　ｖｉｔｒｏで産生された抗体は他
の抗体の混入はないが抗体価は低い。ｉｎ　ｖｉｖｏで
産生された抗体は宿主抗体が若干混じるが、抗体価はｉ
ｎ　ｖｉｔｒｏに比し非常に高い。どちらの方法で抗体
を産生させるかは目的による。

上記方法により、抗ＬＤ型Ｈ５−ＰＧモノクロン抗体が
得られる。

ＬＤ型）ＴＳ−ＰＧの検出 抗ＬＤ型Ｈ５−ＰＧモノクローン抗体を用いて特異的に
ＬＤ型）Ｉｓ−ＰＧを検出するためには、常法に従って
酵素抗体法、蛍光抗体法、重金属抗体法、ビオチン−ア
ビジンシステム、ペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダー
ゼ法等によって行われる。

［発明の実施例］ 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は、本発明の範囲を何ら制限するものでは
ない。

なお、本発明において、試藁、器具等は、以下のものを
使用した。

・ミオシン フ ・ポリスチレン９６穴プレート・・・リンプロ（Ｌｉｎ
ｂｒｏ−Ｆｌｏｗ Ｌａｂ、　Ｈａｍｄｅｎ） 社製（ＵＳＡ） ・パーオキシダーゼ標識 Ｐｒｏｔｅｉｎ　　Ａ （テンマーク） イー・ワイ・ラボラトリーズ （Ｅ、Ｙ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ１社（ＴＪＳＡ）
製 ・ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギ ・・−カッペル研究所 ＩｇＧイムノグロブリン　　　（ＣａｐｐｅｌＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ 社（ＵＳＡ）製 ・ラットイムノグロブリンの・−・　マイルス（Ｍｉｌ
ｅｓモノクローン抗体タイビ　　　Ｌａｂｏ、）社（Ｕ
ＳＡ）ングキット　　　　　　　　　製 ・ヘパリチナーゼ　・・・　生化学工業社（日本）製・
抗ＢＭＩポリクローン抗体 Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　ｔ（ｅ
ａｌｔｈ　（ＵＳＡ）のＨａｓｓｅｌ、　Ｂａｒｒａｃ
ｈ　　およびＭａｒｔｉｎ博士より供与を受けた。

・ラミニンおよび１■型コラーゲン Ｅ）Ｉｓマウス腫瘍からＫｌｅｌｎｍａｎらの方法（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２１　：　６１８８−６１９
３．１９８５１により調製。

・抗コラーゲン血清 −Ｋｉｍａｔａらの方法（Ｊ、Ｅｍｂｒｙｏｌ、Ｅｘｐ
、Ｍｏｒｐｈ、８９：２４３−２５７．１９８５）によ
り、マウスＥＨ８Ｉｌｆｆｉ瘍ＩＶ型コラーゲンで免疫
したウサギから調製した。この抗血清はわずかにラミニ
ンと交叉反応を示したので、ラミニン標識セファロース
４Ｂカラムを通したところ、酵素免疫反応（ＥＬＩＳＡ
法）および免疫プロット法で調べても、他の基底膜成分
、ラミニン、Ｈ３−ＰＧｇよび他のコラーゲンとは反応
しなかった。

実施例 ＋１）Ｈ３−ＰＧの調製 ＥＨ５腫瘍をマウスに移植して増殖させ、これを摘出し
た。この腫瘍より、Ｊ、　Ｒ，ＨａｓｓｅｌＬらの方法
（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６０：８０９８−８１０
５．１９８５）およびＫａｔｏらの方法（Ｊ、Ｂｉｏｌ
、Ｃｈｅｍ、　２６２ニア１８０−７１８８．１９８７
１に従ってＨ３−ＰＧを精製し、採取した。

すなわち、新鮮な腫瘍組織を、４Ｍ　グアニジン−ＨＣ
ｌ、、５０ｍＭ　　トリス−Ｉ（（１２（ｐＨ７，４）
、１％（ｗ／ｖｌ　ＣＨＡ　Ｐ　Ｓ、プロテアーゼ阻害
剤（１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド）、
１０ｍＭＮ−エチルマレイミドおよびｌｏｍＭ　　ＥＤ
ＴＡからなる溶液にて抽出し、抽出液を塩化セシウム沈
降平衡遠心法（初期濃度ρ。＝１．３５ｇ／ｍ℃）で分
画した。

ボトム画分（ρ＞１．３５ｇ／ｍ氾）をプールし、７Ｍ
　尿素、５０ｍＭ　　ト　リス−）ＩＣＲ（ｐＨ７，４
）、０．５％（ｖ／ｖ）　　）−リドンＸ１００ｇよび
プロテアーゼ阻害剤（上記と同様）で平衡化したＤ　Ｅ
　Ａ　Ｅ　５ｅｐｈａｃｅｌカラムに供した。

カラムに結合した成分をＯ〜０．７５ＭＮａＣｆｆの直
線濃度勾配により溶出し、Ｈ５−ＰＧ画分を得た。

＋２１　Ｌ　Ｄ型およびＥ（Ｄ型Ｈ３−ＰＧの相互　離
は）で得たＨ３−ＰＧのカラム溶出物のうち、ヘキスロ
ン酸陽性の両分（０，３−０，６ＭＮａＣβ溶出画分）
をプールし、４Ｍ　グアニジン−ＨＣｌ、５０ｍＭ　　
トリス−Ｈｃｐｔ　　（ｐＨ７，４）　、１％ｈ／ｖｌ
　ＣＨＡ　Ｐ　Ｓおよびプロテアーゼ阻害剤（上記と同
様）で平衡化した５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−４Ｂカ
ラムに供した。

溶出画分（Ｋ、ｖ＝Ｏ−０，５）をプールし、さらにま
た塩化セシウム濃度勾配（ρ、＝１．５０ｇ／ｍｌ２）
で分画し、ＬＤ型およびＨＤ型の２つの成分を分離した
。

（３）度反凰ユ且１ ｍで得たＨＳ−ＰＧ画分（ＬＤおよびＨＤの混合物）を
４Ｍ　グアニジン−ＨＣｆｆおよび１００ｍＭ　　トリ
ス−ＨＣｌ２　（ｐＨ８，０）中で、ｌｏｍＭ　　ジチ
オスレイトールを添加して、５０°Ｃで２間接還元処理
した。次いで、終濃度３０　ｍ　Ｍになるよう固体ヨー
ドアセトアミドを添加した後、還元処理したＨＳ−ＰＧ
の標品を暗所で３時間室温下に放置した。

還元処理を行なったＨＳ−ＰＧおよび未処理のＨＳ−Ｐ
Ｇをエタノール沈殿法（Ｋｉｍａｔａ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２４９二１６４６−１６５３
．１９７４１　により脱塩し、沈殿物をそれぞれリン酸
緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した。

（４）訟 （３）で得られた還元処理したＨＳ−ＰＧおよび未処理
のＨＳ−ＰＧの混合物（各成分は、２５０μ℃のＰＢＳ
中に、タンパク含量として２００μｇの）Ｉｓ−ＰＧを
含有）を、等量のフロイント完全アジュバントと混合し
て、５週令のＷｉｓｔａｒ系ラットの皮下に注射して感
作した。次いで、２週間毎に計５回、上記と同様の注射
を行なった。

各注射後１週間目に採血し、血中の抗体価をＥＬＩＳＡ
法により調べた。５回の注射により高力価の抗体価（＞
５００００）になったので、６回目の注射後３日目に、
ラットを殺して肺臓を摘出し、常法により浮遊脾細胞を
得た。

（５）細胞融合およびハイブリドーマの選択こうして得
たラット脾細胞の細胞浮遊液（１，５Ｘ１０８細胞）と
マウスのミエローマＮＳ−１細胞をｌｏ：１の割合で混
合し、ポリエチレングリコール４０００を用いて細胞融
合を行った。次いで、この細胞を１．５Ｘ１０５細胞／
ウエルになるようにＲＰＭＩ培地（１０％牛脂児血清お
よびヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン含有）
に浮遊させ、９６穴の培養プレートに幡種した。

ハイブリドーマの培養上清をＥＬＩＳＡ法により調べ、
免疫原として用いたＨＳ−ＰＧに対して陽性反応を示し
たハイブリドーマを常法によりクローン化し、さらに限
定希釈法で二次クローニングを行なった。

本実施例において、ＥＬ、ＩＳＡ法は、Ｒｅｎ、ｎａｒ
ｄらの方法［Ａ、　Ｂ、　Ｂ、、−ハ巨、　３９９　（
１９８１１１に従って行なった。

（６）スクリーニング （５）により得られたクローン細胞が産生ずる抗体につ
いて、　ＥＬＩＳＡ法に従いスクリーニングを行い、Ｌ
Ｄ型ＨＳ−ＰＧを識別する細胞株を探した。　　ＥＬＩ
ＳＡ法は、Ｒｅｎｎａｒｄらの方法を若干改良して行な
った。

すなわち、Ｖｏｌｌｅｒ’Ｓ　　緩衝液中に、　（２）
で調製したＬＤ型Ｈ３−ＰＧ、［（Ｄ型Ｈ３−ＰＧ、ラ
ミニン、ＩＶ型コラーゲン（タンパクとして各０．　１
μｇを含有）をそれぞれ含有する抗原溶液を９６穴ポリ
スチレンプレートの各ウェルに添加し、プレートを４℃
で１晩インキエベートした。次いで、溶液を、１００ｕ
ｎＰＢＳおよび１％（Ｖ／Ｖ）ＢＳＡからなる溶液に置
換した後、３７℃で１時間インキュベートし、抗体溶液
が非特異的に結合することをブロッキングした。さらに
、ウェルをＰＢＳおよび０，０５％（ｖ／ｖｌ　ツイー
ン２ｏからなる溶液（ＰＢＳ／ツイーン）２００μ℃で
３回洗浄した。

なお、ＬＤ型Ｈ３−ＰＧのコア蛋白分子を識別対象とす
る場合には、各ウェルは、ブロッキングする前に０．０
１ミリ単位のへバリチナーゼ１００ｕＩ２　（ｌ　００
ｍＭトリス−ＨＣｌ２　（ｐＨ’Ｌ　２）、５ｍＭ酢酸
カルシウムおよびプロテアーゼ阻害剤含有）からなる溶
液で処理して（Ｋａｔ。

ｅｔ　ａｌ、、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１４８　：
　４７９−７８４．１９８５）用いた。

次に、プレートの各ウェルに　（５）で得られたハイプ
リドーマ培地（ｐ）（を７．４にトリスＨＣβで調製）
１００μ℃を添加し、２時間室温にてインキュベートし
た後、ＰＢＳ／ツイーンで３回洗浄し、１００μβのパ
ーオキシダーゼ標識抗ラットＩ　ｇ　（Ｇ　＋Ｍ）血清
（終希釈度１：５００　　ＰＢＳ／ツイーン）を各ウェ
ルに加え、プレートを室温にて１時間インキュベートし
た。

それぞれのハイブリドーマの反応性は、パーオキシダー
ゼの結合量を０．０３％ｆＶ／ｖ）過酸化水素を含む０
．Ｏ１％ｆｗ／ｖ）　ｏ−フェナンスロリンを用いて、
発色量で測定した。ポジティブコントロールとしては、
免疫したラットから得た血清をＰＢＳで１０００倍に希
釈した、希釈ラット抗ＨＳ−ＰＧ抗血清を用いた。非特
異的な発色は、これらの条件下ではほとんどみられなか
った。

その結果、ＨＫ−８４および）（Ｋ−１０２と命名した
２つの細胞株がＬＤ型Ｈ３−ＰＧおよびヘパリチナーゼ
処理Ｈ３−ＰＧ　（ＬＤのコア蛋白分子）を識別し、Ｈ
Ｄ型１（Ｓ−ＰＧ、ラミニン、ＩＶ型コラーゲンとは反
応しないことがわかった。

なお、ＨＫ−８４細胞および）ＩＫ−１０２細胞は、公
知の細胞株である。

これらの細胞株が産生ずるモノクローン抗体は、マイル
ス・ラボラトリーズ・インコーホレーテッド（以下「マ
イル又社」という。）のモノクローナルタイピングキッ
トを用いて分析し、クラス丁ｇＧｚａと同定された。

Ｋａｔｏらの方法（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１４８
　：　４７９−７８４゜１９８５１　に従って、　（２
］で得られたＨ５−ＰＧのＬＤ型（タンパクとして１μ
ｇ含有）を１ミリ単位のヘパリチナーゼを用いて、３７
°Ｃで１時間処理した。処理後の消化物（ＬＤ型Ｈ３−
ＰＧのコア蛋白分子）を５％の分離用ゲル（Ｌａｅｍｍ
ｌｉ。

Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌａｎｄ、　ｌ　、　２２７　：６８
０−６８５．１９７０）を用いて、非還元状態で、ＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。

電気泳動後、タンパクはＴｏｗｂｉｎらの方法（Ｐｒｏ
ｃＮａｔｌ−Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７６：４３５
０−４３５４．１９７９１に従って、ニトロセルロース
膜に移転させた。

次いで、この膜を０．１５Ｍ　　ＮａＣｌ２．５０ｍＭ
　　トリス−ＨＣＰ　（ｐＨ７，４）（ＴＢＳ）および
１％（ｗ／ＶＩ　　Ｂ　Ｓ　Ａの混合物中に、３７°Ｃ
で１Ｆｆ？間浸漬した後、室温で２時間、　（６）で見
出したＨＫ−８４およびＨＫ−１０２の各ハイブリドー
マ培地とインキュベートした。

続いて、この膜を３回ＴＢＳおよび０．０２％ｆｖ／ｖ
）　　ツイーン２０　（ＴＢＳ／ツイーン）で洗浄後、
パーオキシダーゼ標識抗う・ントＩｇ（Ｇ＋Ｍ）（終希
釈度１：５００　　ＴＢＳ／ツイーン）で室温にて１時
間処理した。さらに、ＴＢＳ／ツイーンで４回洗浄後、
結合したパーオキシダーゼをＴＢＳに０．０３％ｆｖ／
ｖｌ過酸化水素を含有した０、０５％（ｗ／ｖ］　４−
クロロ−１−ナフトール溶液を用いて発色させた。

タンパクの検出は、ＳＤＳゲルを用い同時に泳動後、ク
マジーブルーＲ２５０で染色して行なった。

その結果、ＨＫ−８４およびＨＫ−１０２は、ＬＤ型１
（Ｓ−ＰＧココア白分子のＭ　ｒ　＝　４５０．０００
および３６０．０００のいずれをも識別することがわか
った・ （８）モノクローン抗体によるＬＤ型）Ｉｓ−ＰＧのＶ
８−プロテアーゼフラグメントの検出（２）で得られた
Ｈ５−ＰＧのＬＤ型（タンパクとして４μｇ含有）を■
８プロテアーゼ（プロテオグリカン：プロテアーゼ　１
００：１　　乾燥重量比）と５０ｍＭトリス−ＨＣｆｆ
　（ｐＨ７，４）中、３７°Ｃで５時間インキュベート
して処理した。次いで、処理後の消化物を、５−１５％
のグラジェントゲルを用いたＳＯＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動に供した。

続いて、　（７）で行なったと同様に、イムノブロッテ
ィングを行なった。

タンパクの検出は、同時にＳＤＳゲル泳動後、クマジー
ブルーＲ２５０て染色して行なった。

ミオシン重ｉｉ　（Ｍ　ｒ　＝　２００．０００　）　
、ホスホリラーゼｂ　（Ｍ　ｒ　＝９４．０ＯＯ）　、
アルブミン（Ｍｒ＝６７．０００）　、卵白アルブミン
（Ｍ　ｒ　＝４３．０００）　、脱炭酸酵素（Ｍｒ＝　
３０．０００　）　トリプシンインヒビター（Ｍ　ｒ　
＝　２０．０００　）　、　ａ−ラクトアルブミン（Ｍ
　ｒ　＝　１４．０００）を免疫反応陽性バンドの分子
量を決定する標準マーカ〜として用いた。

ＨＫ−８４は、ＬＤ型Ｈ３−ＰＧのＶ、プロテアーゼ処
理により得られたＭ　ｒ　＝　１８０．０００．１５０
．０００　　、　１２０．０００、９２．０００．８０
．０００、６４．００口、　のフラグメントを識別し、
ＨＫ−１０２は、Ｉ（Ｋ８４が認識するフラグメントお
よび該フラグメントよりさらに小さなフラグメントであ
るＭｒ＝５１．０００．４４．０００．３７．０００お
よび３１，０００をも識別した。

この）ＴＫ−８４およびＨＫ−１０２の反応性の相違か
ら、Ｆ（Ｋ−８４のエピトープが、６４．０００のフラ
グメントか、それより小さいフラグメントに分解すると
きに放出されるペプチド上に存在することがわかる。

（９）免騙Ｊわ賢家舊 ４週令のＣ５７ブラツクマウスの組織を凍結切片（６μ
ｍ厚さ）として固定を施さずに調製した。これをＨＫ−
８４およびＨＫ−１０２のハイプリドーマ培地または希
釈した抗マウスＩＶ型コラゲン抗体（ＰＢＳで１．３０
に希釈）とインキュベートした。これをＫｉｍａｔａら
の方法（Ｊ、ＥｍｂｒｙｏｌＥｘｐ、　Ｍｏｒｐｈ、　
８９　：　２４３−２５７．１９８５）に従って免疫蛍
光染色した。ポジティブコントロールとしてＥＨ３腫瘍
切片を上述のように染色した。ネガティブコントロール
としてＲＰＭＩおよび１０％（Ｖ／Ｖｌ牛脂児血清、ま
たはＰＢＳで３０倍に希釈した希釈非免疫ラット血清を
ハイブリドーマ培地に代えて用いた。

４週令のＣ５７ブラツクマウスから得た種々組織（骨格
筋、心筋、肺、全脂（含大脳、中脳、小脳）および腎）
各１ｇを７Ｍ　尿素、０．１５ＭＮａＣｌ２．５０ｍＭ
　　トリス−ＨＣｌ２　（ｐＨ７，４）、０．５％（Ｖ
／Ｖ）　　ｌ−リドンＸ−１００およびプロテアーゼ阻
害剤からなる溶液７．５ｍｇ。

でガラスホモゲナイザーにてホモゲナイズした後、上記
と同様の溶液にて４℃、１２時間の抽出を２回行なった
。

抽出物をＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ　５ｅｐｈａｃｅｌカラム（１
，５％３ｃｍ）に供し、結合成分を、抽出溶液にＩＭに
なるようにＮａＣβを加え、カラム容量の２倍量で溶出
した。溶出物をエタノール沈殿後、１０ｍＭトリス−Ｈ
ＣＱ　（ｐＨ７，０）、ｌ　ＯｍＭＫＣｆｆ、３ｍＭ　
　ＭｇＣρ２およびフェニルメチルスルホニルフルオリ
ドからなる溶液２ｍ℃に渚解した。

この試料を２００ｕｇのＤＮａｓｅＩを用いて３７°Ｃ
で１５分処理し、次いて、エタノール沈殿によりＤＮＡ
フラグメントを除去した。この試料（ヘキスロン酸とし
て各２ｎモル）を１０ミリ単位のヘパリチナーゼで３７
°Ｃ１時間消化処理した後、５％−１５％のグラジェン
トゲルを用いたＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
に供し、さらに、　（７）で行なったと同様のイムノブ
ロッティングを行なった。

ポジティブコントロールとしてＥＨ３腫瘍切片１ｇを上
述と同様にして調製したものを用い、また、アフィニテ
ィー精製した抗ＢＭＩポリクローン抗体（ＴＢＳ／ツイ
ーンで１：２０００に希釈）を基底膜Ｈ３−ＰＧのプロ
ーブとして用い、パーオキシダーゼ標識　Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ　Ａ　（Ｔ　Ｂ　Ｓ　／ツイーンで１：１Ｏ００に希
釈）で検出した。免疫反応陽性バンドの分子量の決定は
、　（８）と同様に行なった。

これらの免疫蛍光染色の結果、［（Ｋ−８４および［（
Ｋ−１０２の産生するモノクローン抗体を用いると、マ
ウスの組織では、骨格筋線維周囲の基底膜（ｅｎｄｏｍ
ｙｓｉｕｍｌ、心筋細胞周囲の基底膜、肺の肺胞気管支
基底膜が染色され、血管壁内皮の基底膜は全組織で強く
染色され、特に脳ではこれらは特徴的な像を呈した。ま
た、大脳と小脳の間に有為な違いは観察されなかった。

腎では、ボウマン王女、糸球体、尿細管のすべての基底
膜が強く染色された。

これらの組織を、マウスの１Ｖ型コラ一ゲン抗体を用い
て染色した場合、）ＩＫ−８４およびＨＫ１０２の産生
する抗体を用いた場合と完全に一致して染色された。

１−Ｖ型コラーゲンは、全ての基底膜の構成成分である
ことが特徴的であることから、ＨＫ−８４およびＨＫ−
１０２の産生する抗体に対する抗原が全ての基底膜に存
在していることが示唆された。

また、イムノブロッティングの結果から、ヘパリチナー
ゼ処理により、ＬＤ型Ｈ５−ＰＧのコア蛋白分子と同一
の、Ｍ　ｒ　＝　４５０．０００の巨大なコア蛋白分子
が全ての組織から得た試料の主要なバンドとして検出さ
れた。

さらに、組織特異的な違いがみられるバンドもあり、骨
格筋、心筋では、約Ｍ　ｒ　＝　３６０．０００の２本
のバンドが、肺では、Ｍ　ｒ　＝　３６０．０００の１
本のバンドが、腎では、Ｍ　ｒ　＝　３６０．０００お
よび２８０．０００の２本のバンドが検出された。

（１０）糸球　の　製とＨＳ　−Ｐ　Ｇの　析糸球体は
Ｋｏｂａｙａｓｈｉらによる段階的ふるい分は技法（Ｊ
、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５８：１２０５１−１２０
５７．１９８３）により単離した。

すなわち、以下のようにして行なった。

まず、出発材料としてＣ５３ブラツクマウス２０匹から
得た４０個の腎を用い、これらの標品は、少なくとも７
０％の純粋な糸球体を含有していることを、位相差顕微
鏡で確認した。

次いで、尿素およびトリトンＸ−１００により糸球体抽
出を行ない、抽出液をＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ　５ｅｐｈａｃｅ
ｌカラム（０，ｓｘｉ、５ｃｍ）に　（９）と同様に供
した。結合した成分を溶出し、　（９）と同様にして、
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動およびイムノブ
ロッティングを行なった。

その結果、糸球体標品においては、Ｍｒ＝３６０、００
０および２８０．０００の２本のバンドが検出された。

以上の実施例の結果から、本発明により、ＬＤ型Ｈ３−
ＰＧを特異的に識別するモノクローン抗体が得られ、ま
た、このモノクローン抗体を用いた免疫蛍光染色法によ
り、マウスの骨格筋、心筋、肺、脳、腎のすべての組織
の基底膜が染色され、さらに、免疫プロッティング法に
より、これらの組織の全プロテオグリカン画分に、ＬＤ
型Ｈ５−ＰＧの分子サイズと一致するＨ３−ＰＧのコア
蛋白分子が共通に存在することを見出した。

このことから、本発明のモノクローン抗体は、ＬＤ型Ｈ
３−ＰＧを特異的に識別し、これを用いることにより、
組織におけるＬＤ型Ｈ３−ＰＧを特異的に検出できるこ
とがわかった。

［発明の効果］ 本発明によれば、ＬＤ型Ｈ５−ＰＧのみを認識するモノ
クローン抗体およびそれを産生するハイブリドーマを提
供でき、これを用いることによりＬＤ型Ｈ３−ＰＧを特
異的に検出することができる。

したがって、ＬＤ型Ｈ５−ＰＧを検出することにより、
基底膜異常を伴うヒトの疾病、例えば急性慢性腎炎、動
脈硬化症、種々の腫瘍、アルツハイマー病等の診断に有
用な方法となりつる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）低密度型ヘパラン硫酸プロテオグリカンを含有す
   る組織由来のヘパラン硫酸プロテオグリカンを抗原とし
   て予め免疫したラットの脾細胞とマウスのミエローマ細
   胞との細胞融合により形成されたハイブリドーマから産
   生される抗低密度型ヘパラン硫酸プロテオグリカンモノ
   クローン抗体。
2. （２）低密度型ヘパラン硫酸プロテオグリカンを含有す
   る組織由来のヘパラン硫酸プロテオグリカンを抗原とし
   て予め免疫したラットの脾細胞とマウスのミエローマ細
   胞との細胞融合により形成されたハイブリドーマであっ
   て、抗低密度型ヘパラン硫酸プロテオグリカンモノクロ
   ーン抗体を産生するハイブリドーマ。
3. （３）請求項１に記載のモノクローン抗体を用いること
   を特徴とする低密度型ヘパラン硫酸プロテオグリカンの
   検出方法。