JPH02157656A - 固相法により赤血球抗体を探索し、同定する方法 - Google Patents

固相法により赤血球抗体を探索し、同定する方法

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JPH02157656A JP1264071A JP26407189A JPH02157656A JP H02157656 A JPH02157656 A JP H02157656A JP 1264071 A JP1264071 A JP 1264071A JP 26407189 A JP26407189 A JP 26407189A JP H02157656 A JPH02157656 A JP H02157656A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、選択した抗原パターンをもつ赤血球を抗体に
ついて試験すべき血清または血漿と接触させ、そして抗
ヒトグロブリン試薬と一緒に被覆した支持体上に移す、
固相法により赤血球抗体を発見および同定する方法並び
に前記方法を実施するための支持体およびキットに関す
る。
（従来の技術並びに発明が解決しようとする課題） 凝集゛反応は、応用が簡単であり、かつ応用範囲が広い
ため、最近数十年において血液型を決定する最も普通の
方法の１つとなった。しかしながら、１つの本質的な欠
点は、弱い反応を、例えば、陰性と誤って解釈しうる程
度に、稀釈の系列内で起こる反応の強さが変化するとい
うことにおいて、それは自動的にまたは視覚的に容易に
決定できるという客観的な停止点に欠けることである。
赤血球抗体を発見および同定する方法および交差サンプ
リングする固相法は、最近、凝集反応の代替法として示
唆された。
文献（１）ブラッグ（Ｐｌａｐｐ）ら、固相抗体スクリ
ーン（＾５ｏｌｄ　ｐｈａｓｅ　ａｎｔｌ　ｂｏｄｙ　
５ｃｒｅｅｎ）、アメリカン◆ジャーナル・オブークリ
ン会バソロジー（Ａｍ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｐａｔｈ、）、
８２（１９８４）　、７１９、文献（２）ベック（Ｂａ
ｃｋ）ら、予備注入試験のための半自動化固相付着アッ
セイ、メディカル会ラボラトリ−・サイエンス（Ｍｅｄ
、Ｌａｂ、Ｓｃｉ、）、４１（１９８４）、３７４　、
および文献（３）捕捉−Ｒ固相アッセイ系（Ｃａｐｔｕ
ｒｅ−Ｒｓｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　ａｓｓａｙ　ｓｙｓ
ｔｅｍ）　　イムノコル（１ｍａｕｎｏｃｏｒ）　、１
９８７年に従い、反応性固相層は、例えば、ポリスチレ
ンマイクロタイタープレート中のウェル（νｅ１１）の
壁土に固定化された、選択した抗原パターンをもつ赤血
球から成る。血清または血漿からの特異的抗体は、これ
らの赤血球に取り付けることができる。細胞への抗体の
供給（ｃｈａｒｇｉｎｇ）は、インジケーター細胞と呼
ばれるもの（ＩｇＧ供給した赤血球）を使用して、抗ヒ
トグロブリン（長持異的またはモノ特異的抗ヒトＩｇＧ
）により、供給および固定化した赤血球にインジケータ
ー細胞を結合することによって、可視化することができ
る。その結果、試験する試料中に十分な赤血球抗体が存
在するとき、ウェルの壁土の赤血球の二重層がつくられ
る。
陰性の結果は、ウェルの底上の取り付けられていないイ
ンジケーター細胞のボタンから明らかである。
前記文献（２）および文献（４）レイチェル（Ｒａｃｈ
ｅｌ）ら、固相抗グロブリン試験（Ａ　５ｏｌｌｄ　ｐ
ｈａｓｅａｎＮｇｌｏｂｕｔｌｎ　ｔｅｓｔ）、　　ト
ランスフユージシン（Ｔｒａｎｓｆ’ｕｓ１ｏｎ）、２
５（１９８５）、２４はヒトＩｇＧで被覆したウェルを
もつマイクロタイタープレートを使用する、交差サンプ
リングの固相法を記載している。赤血球は、赤血球に対
する抗体を含有することができる血清または血漿ととも
に、予備的にインキュベーションし、そして供給した赤
血球または供給しない赤血球を洗浄し、そして抗ヒト試
薬と一緒にＩｇＧ被覆したマイクロタイタープレートに
移す。ＩｇＧ型の抗体を供給した赤血球は、可視フィル
ムの形態の同相へ試薬の抗ヒトＩｇＧ構成成分により取
り付ける。ここで同様によく、供給されない赤血球は沈
降した細胞のボタンを形成する。
これらの方法において共通なことは、陽性の反応のパタ
ーンが特異的に調製された固相上に特異的に取り付けら
れたコーティングとして現れ、これに対して陰性の反応
は固相のコーティングの形成に導かないことである。種
々の反応のパターンを視的にまたは分光光度測定的に読
んで、客観的な「はい」または「いいえ」に到達するこ
とができる。
しかしながら、現在まで記載された固相法の欠点（Ｉｇ
Ｇ供給インジケーター細胞及びＩｇＧ被覆ウェル）は、
Ｉｇ（２型の赤血球抗体のみを実証することができ、こ
れらの方法の応用の範囲をきびしく制限することである
。
本発明の目的は、＋ｇＧ型の赤血球抗体を発見しかつＩ
ｇＧ供給赤血球を検出することができるばかりでなく、
かつまたＩｇＭおよびＩｇＡ抗体を発見し、そして補体
供給された赤血球を検出することができる固相法の範囲
内の赤血球抗体を発見および同定する方法ならびにこの
方法を実施するための手段を提供することである。
（課題を解決するための手段並びに発明の効果）この目
的は、本発明によれば、選択した抗原パターンをもつ赤
血球を抗体について試験すべき血清または血漿と接触さ
せ、そして抗ヒトグロブリン試薬と一緒に被覆した支持
体上に移す、固相法により赤血球抗体を発見および同定
する方法において、多特異的抗ヒトグロブリンを使用し
て探索または同定の細胞を移すか、あるいは自動制御の
場合において、固有の細胞を移すこと、および前記支持
体をタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇで被覆することを
特徴とする方法により、達成される。
この目的を達成するための明らかな方法を発見するため
に実施されてきた多数の試みが失敗したことを考慮する
と、使用する多特異的抗ヒトグロブリンのすべての構成
成分を、支持体上のタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇの
コーティングにより取り付け、魅力的な多特異的抗ヒト
グロブリンを固相法において初めて使用可能とすること
ができたことは、新規でありかつ驚（べきことであった
。
以後例示するように、本発明による方法は、ここで既に
述べた既知の方法により検出できない１系列の抗体を検
出するために使用することができる。
こうして、例えば、次の抗体は既知の試験系により検出
されない： 文献（１）　１ｇＭ型の、例えば、抗Ｌｅ”　、抗Ｌｅ
″抗Ｌｅ”＋ゝおよび抗Ｋｎ”　　（表２）、文献（２
）　１ｇＭ型の、例えば、抗Ｌｅ’　、抗Ｌｅ’抗Ｌ　
ｅ＠　＋　ｈおよび抗Ｋｎ”　　（表４）、文献（ａ）
　ｒｇＭ型の、例えば、抗Ｋｅｌｌ（表２）文献（４）
　１ｇＭ型の、例えば、抗Ｌｅ”　、および抗Ｌｅゝ　
（表１）、および 文献（５）シンポジウム、ロリ（Ｒｏｌｉｈ）ら、固相
付着アッセイ：従来の血液銀行の試験 の代替法（Ｓｏｌｌｄ　Ｐｈａｓｅ　Ａｄｈｅｒｅｎｃ
ｅＡｓｓａｙ：Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ　ｔｏ　Ｃｏ
ｎｖｅｎｔｌｏｎａｌＢｌｏｏｄ　Ｂａｎｄ　Ｔｅ５ｔ
ｓ）　、ラボラトリ−・メディシン（Ｌａｂ　Ｗｅｄ）
　１Ｂ（ｔ９８５）、７６６：１ｇＭ型の、例えば、抗
Ｌｅ”および抗Ｌｅゝ　（表■）。
次の試験において使用する支持体はポリスチレンのマイ
クロタイタープレートであるが、固相法に関連して既知
の他の型の支持体または支持体材料を使用することがで
きる。支持体上のタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇのコ
ーティングは、例えば、前記タンパク質を等張の塩化ナ
トリウム溶液または適当な緩衝液中に溶解し、そしてそ
れを適当な支持体の表面と接触させることによって、調
製することができる。被覆溶液中のタンパク質の濃度は
０．１〜２０＋ｔ／ｍｌの範囲であることができる。支
持体がマイクロタイタープレートであるとき、はぼｌＯ
〜１００　声ｊ／ウェルの被覆溶液は実際的であること
が明らかにされた。はぼ１４〜２０時間放置後、被覆溶
液は吸引し、そしてウェルを蒸留水で２〜５回洗浄し必
要に応じて防腐剤をそれに添加する。そのようにして被
覆された支持体は、直ちに使用するか、あるいは乾燥し
、そして適当に貯蔵する。
赤血球は、必要に応じて抗体を供給し、そして多特異的
抗ヒトグロブリン中に再懸濁し、これらのすぐに使用で
きる支持体、例えば、マイクロタイタープレートにのみ
添加して試験を実施しなくてはならない。
次の実施例によって、本発明をさらに説明する。
（実施例） 実施例１ 支持体のタンパク質による被覆 細胞壁から精製し、そして凍結乾燥した本質的に塩不含
の粉末状タンパク質入を、等張性塩化ナトリウム溶液中
に溶解した。被覆溶液の濃度は０−５ｊｔ／ｍｌであっ
た。マイクロタイタープレートのウェルの各々に、１０
０Ｊ１１のこの彼！！ｌ？ａ液を添加した。接地した被
覆キャビネット中で１６時間放置後、溶液を吸引し、そ
してウェルを防腐剤を含有する蒸留水で３回洗浄した。
被覆したプレートを乾燥し、そしてアルミニウムのパウ
チ中に溶接した。
実施例２ 試験 探索、同定または患者のための供与体（自己対照）の赤
血球の１％の懸濁液をＬＩＳＳ中で調製した。１００　
ｊｇの患者供与体の血清または血漿および１００　ｐｉ
の赤血球懸濁液をマイクロタイタープレートのウェルの
各々に添加した。プレートにふたをし、そして培養ボッ
クス内で３７℃において３０分間震田およびインキュベ
ーションした。
次いで、プレートを１３００Ｇで２分間遠心した。
細胞を５〜７回クレーム（Ｃｏｏｍｂｓ）溶液で洗浄し
て取り付けられなかった抗体を除去し、そして塩溶液を
デカンテーションした。赤血球を、マルチチャンネルの
ピペットで、次の成分から構成された長持異的抗ヒトグ
ロブリンの１００　ｘｉを添加することによって、再懸
濁した：抗ＩｇＧ　、力価１　：　２５Ｂ 抗１ｇＭ　、力価ｌ：１６ 抗１ｇＡ　、力価ｔ：ｌ［ｉ 抗Ｃ３ｂ１力価１：３２ 抗Ｃ３ｄ、力価ｌ：３２ ツイーン２０．０．１％。
１００１１ｊの懸濁した細胞をマルチヤンネルのピペッ
トで、実施例１に記載されているように調製したマイク
ロタイタープレート中のウェルの各々に添加した。この
ようにして処理したプレートを、読み取り前に、室温に
おいて４５分間放置した。
実施例３ 本発明による試験の感度 本発明による試験手順の感度を従来の抗グロブリン試験
の感度と比較するために、既知の特異性の系統的に稀釈
した抗体の停止点をＡＢ血清において平行して決定した
。試験の停止点は、明白に可視の反応を示した最高の稀
釈として解釈した。３つの探索の細胞および既知の抗原
組成の８つの同定細胞のパネルを試験したとき、抗原陽
性細胞と反応した抗体のみを同一と考えた。表１から明
らかなように、本発明による試験手順は通常２〜４倍感
度があり、そして反応の強度の評価は本質的に高い値を
生じた。
表１：感受性 実施例４ 供与体の抗体の日常の探索および同定 抗体の探索および同定試験は、１６０の血液−供与体の
血清および１３６９の供与体の血漿について平行に実施
した。多数の抗体を種々の同定細胞のパネルで同定した
。表２は結果を表す。
表２＝日常の供与体抗体の探索および同定実施例５ 患者の血清の試験 本発明による手順を、従来の抗体の探索および同定のた
めの試験管と比較して、患者の血ｔｉＩ中の抗体を発見
する能力について、３ケ月間試験した。Ｂ８の調帯の血
清を包含する、合計８４８の血清を自己対照（ｎ”４９
１）を使用しておよび自己対照（ａｕｔｏｃｏｎｔｒｏ
ｌ）（ｒｒ３５７）を使用しないで試験した。表３およ
び４はすべての結果を示す〇表３：患者の血清中の抗体 表４＝ 患者の血清中の自己抗体

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、選択した抗原パターンをもつ赤血球を抗体について
    試験すべき血清または血漿と接触させ、そして抗ヒトグ
    ロブリン試薬と一緒に被覆した支持体上に移す、固相法
    により赤血球抗体を発見および同定する方法において、
    多特異的抗ヒトグロブリンを使用して探索または同定の
    細胞を移すか、あるいは自動制御の場合において、固有
    の細胞を移すこと、および前記支持体をタンパク質Ａま
    たはタンパク室Ｇで被覆することを特徴とする方法。 ２、前記支持体はマイクロタイタープレートであること
    を特徴とする、上記第１項記載の方法。 ３、前記支持体はポリスチレンから作られていることを
    特徴とする、上記第１または２項記載の方法。 ４、特異的構成成分の抗ＩｇＧ、抗ＩｇＭ、抗ＩｇＡ、
    抗Ｃ＿３ｂおよび抗Ｃ＿３ｄを含有する抗ヒトグロブリ
    ン調製物を使用することを特徴とする、上記第１〜３項
    のいずれかに記載の方法。 ５、その表面にタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇのコー
    ティングを有することを特徴とする、上記第１〜４項の
    いずれかに記載の方法を実施するための支持体。 ６、上記第５項記載の支持体および多特異的抗ヒトグロ
    ブリン試薬を含有することを特徴とする、上記第１〜４
    項のいずれかに記載の方法を実施するためのキット。
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