JPH02163074A - 組換体サッカロミセス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、一般に、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）からの
ＤＮＡ配列のサツカロミセスにおいてのクローニングお
よび発現に関する。さらに詳しくは、本発明は、サツカ
ロミセス宿主細胞機能を補うす、カロミセス細胞におけ
るカンジダ遺伝子配列の発現、およびサツカロミセス細
胞におけるカンジダ・プロモータ／シグナル配列の制御
下での異種遺伝子の発現および分泌に関する。また、本
発明は、カンジダ・プロモータ／シグナル配列の制御下
でサツカロミセス細胞において発現および分泌された切
形ビイ・ペルトウシス（Ｂ、　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）Ｓ
　１サブユニツト蛋白よりなる対百日咳ワクチンに関す
る。

発明の要約 本発明の１の態様は、種々のカンジダ種に由来する機能
性ＤＮＡ配列よりなるサツカロミセス属の形質転換体宿
主微生物である。

本発明のもう１つの態様はレプリケータ領域、およびカ
ンジダに由来する機能性ＤＮＡ配列よりなる組換体プラ
スミドである。

また、本発明は酵母における発現系で用いる、シイ・ア
ルビカンス・グルコアミラーゼ遺伝子に由来するプロモ
ータ配列および酵母分泌シグナル配列を提供するもので
ある。

本発明のさらにもう１つの態様は、サツカロミセスにお
ける形質転換および発現に際しハイブリッド融合遺伝子
産生物を産生できる、酵母プロモータ、シイ・アルビカ
ンス・グルコアミラーゼ遺伝子および異種構造遺伝子か
らのシグナル配列よりなる組換体プラスミドを提供する
ものである。

また、本発明は、サツカロミセス属の宿主微生物を機能
性ＤＮＡ配列で形質転換し、次いで該機能性ＤＮＡ配列
が発現されるような適当な条件下で該形質転換宿主を培
養することよりなるカンジダに由来する機能性ＤＮＡ配
列を発現させる方法に関する。

なおさらにもう１つの本発明の態様は、（ａ）サツカロ
ミセス属の宿主微生物をカンジダ由来のＤＮＡ配列で該
カンジダＤＮＡが宿主微生物を補うことができるように
形質転換し、ここに該宿主微生物は公知の機能を欠くも
のであり；次いで（ｂ）該形質転換した宿主微生物にお
ける該機能の存在についてアッセイすることよりなるカ
ンジダに由来するＤＮＡ配列をその機能によって特徴付
ける方法である。

また、本発明はサツカロミセス属の形質転換した宿主微
生物を適当な培養培地中で培養することよりなり、ここ
に該宿主微生物はポリペプチドについてコード付けする
異種構造遺伝子と同相かつそれに対して適当な向きで直
接または間接に融合したカンジダに由来するプロモータ
およびまたは／またはシグナル配列よりなることを特徴
とするサツカロミセスにおいて異種ポリペプチドを産生
ずる方法に関する。該方法でシグナル配列を用いる場合
、該ポリペプチドは発現され酵母細胞宿主から分泌され
る。

かくして、本発明のさらなる態様は、本発明によるサツ
カロミセス宿主細胞から分泌された異種ポリペプチドま
たはそのフラグメントを含む。これらの分泌されたポリ
ペプチドのなかには、プロセッシングされないでそのｇ
ｐ１２０およびｇｐ４１成分となる組換体ＨＩＶ−１糖
蛋白ｇｐ１６０がある。

また、本発明は、百日咳に対する保護を刺激するワクチ
ンであって、免疫保護性かつ非毒性量のＳｌ−ＧＡ蛋白
よりなる該ワクチンに関する。かかるワクチンはかかる
蛋白単独、または他の抗原および／またはアジュバント
との組み合わせよりなる。加えて、本発明は、本発明の
ワクチンをヒトに段毎することよりなる百日咳に対しヒ
トを接種する方法も提供するものである。

図面の簡単な記載 第１図はフイ・アルビカンス・グルコアミラーセ遺伝子
のプロモータおよび／グナル配列のヌクレオチド配列を
表す。

第２図は実施例１０で使用する発現ベクターを表す。

第３図はシイ・アルビカンス・グルコアミラーセの７グ
ナル配列ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を表す。

第４図は実施例１１で使用する合成リンカ−のヌクレオ
チドおよびアミノ酸配列を表す。

第５図はＴＧＦ−αのＤＮＡおよびアミノ酸配列を表す
。

発明の詳細な記載 本発明の形質転換体宿主微生物は、カンシタに由来する
機能性ＤＮＡ配列が導入されたす、カロミセス属のいず
れの成員もいう。サツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が好ま
しい。なぜならば、それは最も研究された鎮痛の成員で
あり、かつＤＮＡ組換え目的に最も頻繁に使用されてい
る種だからである。

本発明の組換体プラスミドは、種カンジダ・アルビカン
ス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・
トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ　Ｌｒｏｐｉｃａｌｉｓ
）、カンジダ・ステラトイデア（Ｃａｎｄｉｄａ　Ｓｌ
ｅｌｌａｔｏｉｄｅａ）、カンジダ・シウドトロビカリ
ス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉ
ｓ）、カンジダ・パラブシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｐ
ａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・キリエロモンデ
ィ（Ｃａｎｄｉｄａｑｕｉｌｌｉｅｒｏｍｏｎｄｉ）、
カンジダ・ウティラス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｕｓ）
およびカンジダ・キルイシイ（Ｃａｎｄｉｄａｋｒｕｉ
ｓｉ）を包含するカンジダ属のいずれもの種に由来する
機能性ＤＮＡ配列よりなる。カンジダ・アルビカンスに
由来するＤＮＡが最も好ましい。

なぜならば、それは、カンシタ症を最も引き起こす傾向
にある属成員に由来するので本発明で用いた最初のＤＮ
Ａたからである。

「機能性ＤＮＡ配列」なる語句は、カンシタにおいて、
完全な遺伝子発現ユニ・、ト、構造遺伝子、プロモータ
、シグナル配列または調節領域として機能する、カンジ
ダに直接または間接に由来するＤＮＡの区分されるいず
れの領域も意味する。「完全な遺伝子発現ユニット」な
る語句は、構造遺伝子ならにびにその転写および翻訳に
必要なプロモータおよび調節領域を意味する。「プロモ
ータ」とは、ＲＮＡボリメラーセが結合することを可能
とし、転写が起こることを可能とする、構造遺伝子より
も上流のいずれの領域も意味する。「調節領域」とは、
遺伝子の転写を調節するいずれの領域も意味する。「構
造遺伝子」とは、ｍＲＮＡの合成の鋳型として働（ポリ
ペプチドについてのコーディング配列を意味する。「シ
グナル配列」とは、ストラクンヨン（ｓｔｒｕｃｔｉｏ
ｎ）遺伝子を宿主の分詑・路に標的化する構造遺伝子の
上流の領域を意味する。

また、本発明の組換体プラスミドはレプリケータ領域、
好ましくはサツカロミセスまたはカンジダ・レプリケー
タ領域よりなる。「レプリケータ領域」とは、宿主サツ
カロミセス微生物においてカンジダに由来する機能性Ｄ
ＮＡ配列を染色体外で維持するのに用いることができる
、好ましくは、サツカロミセスのごとき酵母またはカン
ジダから直接または間接に由来するいずれのＤＮＡフラ
グメントも意味する。特に好ましいプラスミドは、ブロ
ーチら（Ｂｒｏａｃｈ　ｅｔ　ａｌ、ＨＩＶ−、ジーン
（Ｇｅｎｅ）、旦：　１２１−１３３　（１９７９）に
よって記載されているもののごとき、サツカロミセス−
エシェリヒア・コリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ−Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）シャトルベクターよ
りなるものである。カンジダに由来する機能性ＤＮＡ配
列をクローニングすることによって本発明で用いること
ができるベクターの例は、例えば、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙ
ｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）、メリ
ーランド州、米国から公に入手可能な以下のプラスミド
である（括弧内はＡＴＣＣ受託番号）・ｐ１３１Ｔ−１
（３７０８７）　、ｐＢＴｌ−７（３７０８８）　、ｐ
ＢＴＩ−９（３７０８９）　、ｐＢＴｌ−１ｏ　（３７
０９０）　、ｐＬＣ５４４（３７０１３）　、ｐＲＢ３
　（３７０５９）　、ｐＲＢ４（３７０５８）　、ｐＲ
Ｂ５　（３７０Ｓｌ）　、ｐＲＢ８（３７１０９）　、
ｐＲＢ９　（３７０５７）　、ｐＲＢＩＯ（３７０５６
）、ｐＲ８１８（３７０９２）、ｐＲＢ２０　（３７０
５４）　、ｐＲＢ２１　（３７０５５）　、ｐＲＢ２２
　（３７０５３）　、ｐＲＢ１２（３７０６１）、ｐＲ
Ｂ１４　（３７０６３）、ｐＲＢ１５　（３７０６２）
　、ｐＲＢ１６　（３７０６０）　、ｐＲＢ１９　（３
７０６４）　、ＹＥｐ２　（３７０７６）　、ＹＲｐ　
１７　（３７０７８）　、ＹＥｐ１３（３７１１５）。

該カンジダＤＮＡ配列はりゲスビイら（Ｒｉｇｓｂｙｅ
ｔ　ａｌ、ＨＩＶ−、モレキュラー・アンド・セリュラ
ー・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ
ｌ、ＨＩＶ−、　　２　：　８５３８６２　（１９８２
）によって記載されているごとき公知技術によって調製
できる。

単離したカンシタＤＮＡは、次いで、１またはそれ以上
の制限酵素での処理によってさらにフラグメント化する
。

機能性カンジダＤＮＡ配列を含有するおよびエシェリヒ
ア・コリ・レプリケータ領域を含有する組換体プラスミ
ドはプラスミドを増幅するためにエシェリヒア・コリを
形質転換するのに用いることができる。かかる形質転換
および増幅は公知の技術によって達成することができる
。次いで、組換体プラスミドを公知技術によってイー・
コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）から回収する。

回収した組換体プラスミドは、次いで、サツカロミセス
属に属する宿主微生物を形質転換するのに用いることが
できる。かかる形質転換は閉環状酵母プラスミドへの組
換体プラスミドＤＮＡフラグメントのランダム挿入およ
び（ａ）ヒネンら（＋ｌ１ｎｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ、ＨＩ
Ｖ−、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデ
ミ−・オプ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）ＵＳＡ、　　７５　：　１９
２９−１９３３　（１９７８）によって記載されている
ごときそれによるスフェロプラストの形質転換；あるい
は、（ｂ）イト−ら（ｎｏ　ｅｔ　ａｌ、ＨＩＶ−、ジ
ャーナル・オブ・バクテリオロノー（Ｊ、　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ、ＨＩＶ−。

−Ｌ旦艷−：　１６３　（１９８３）によって記載され
るいるごとき酢酸リチウムまたは塩化リチウム法を用い
ることによって達成できる。また、カンシタからのＤＮ
Ａは、カンシタおよびサツカロミセスプロトプラストの
融合によって、サツカロミセス微生物に形質転換するこ
ともできる。導入したカンジダＤＮＡは、組換えによる
ごとくして、宿主す、カロミセス微生物の染色体ＤＮＡ
に組み込むことができるか、あるいは染色体外に止どめ
ることができる。かくして、さらにもう１つの方法の例
は、所望により、宿主染色体ＤＮＡ中の近接配列と相同
のフランキング配列を有し、それにより宿主の染色体Ｄ
ＮＡでの組換えを可能とするカンジダＤＮＡで直接宿主
サツカロミセス生物を形質転換することである。

本発明の方法によるカンジダに由来するプロモータ領域
およびングナル配列は、形質転換したサッカロミセス宿
主において、カンジダ、サツカロミセスまたは他の生物
、ウィルスまたは細胞からのコーディング配列を発現す
るのに用いることができる。プロモータのおよび／また
はシグナル配列の天然ヌクレオチド配列のすべてまたは
一部を所望のポリペプチドについてのコーディング配列
に直接融合し、それによりハイブリッド遺伝子を産生ず
ることによって、かかるプロモータおよび／またはシグ
ナル配列を、インシュリン、インターフェロン、成長ホ
ルモン細菌およびウィルス蛋白等についてコード付けす
る配列のごとき異種構造遺伝子に融合することができる
。例えば、１のかかるプロモータおよびシグナル領域は
シイ・アルビカンス・グルコアミラーゼ遺伝子に由来す
る。

この機能性ＤＮＡ配列は、プラスミドに挿入しおよび異
種構造遺伝子に融合した場合、ハイブリッド融合蛋白の
発現および分泌を可能とする。別法発現系は、所望の融
合遺伝子の発現および分泌についてのもう１つの酵母プ
ロモータおよびシイ・アルビカンス舎グルコアミラーゼ
遺伝子シグナル配列を使用する。かかるハイブリッド遺
伝子を含有するプラスミドによって形質転換されたサツ
カロミセス宿主微生物を適当な培養培地で培養した場合
、それらはポリペプチドを産生ずる。適当なプロモータ
およびシグナル配列の制御下、該ポリペプチドは培養培
地中に分泌され得る。

ここに開示したそれらのカンジダプロモータに加え、プ
ロモータ選択のために設計したサツカロミセスプラスミ
ドにおいてカンジダＤＮＡのランダムフラグメントをク
ローニングすることによってさらなるプロモータが発見
された。かかるプラスミドは、カサダバンら（Ｃａｓａ
ｄａｂａｎ　ｅｔ　ａｌ、ＨＩＶ−、メソッズ・イン・
エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ）、　　１００　：　２９３　３０８　（１９
８３）によって記載されているごとき公知の技術によっ
て設計できる。

カンジダに由来する構造遺伝子は、それらの天然カンジ
ダ・プロモータから、カンジダまたはサツカロミセスに
由来する異種プロモータから、あるいは他の生物に由来
するまたは合成オリゴヌクレオチドから産生され、かつ
サツカロミセスで機能する他の機能性異種プロモータか
ら、サツカロミセスにおいて発現できる。同様に、非カ
ンジダ起源の構造遺伝子は、そのシグナル配列と共にグ
ルコアミラーゼ遺伝子を包含する種々のプロモータから
発現され得る。

多くの公知サツカロミセス突然変異体はロイシンまたは
ヒスチジン生合成における特異的工程のごとき明確な機
能を欠く。この機能は、かかる突然変異体を、かかる機
能についてコード付けする遺伝子を含有するカンジダ由
来のＤＮＡ配列で形質転換すると供給される。特徴付け
られるべき機能が利用可能なサツカロミセス株をすでに
欠いているというのでなければ、かかる突然変異は紫外
線照射、化学的突然変異誘発、または遺伝子操作による
ごとき公知技術によって誘導できる。ある場合には、形
質転換宿主微生物によって示される機能は天然にはサツ
カロミセスに存在しないものである。例えば、宿主サツ
カロミセス・セレビシェ微生物は本発明の方法により機
能性ＤＮＡ配列によって形質転換して、ソルビトール利
用、（αメチル−Ｄ−グルコピラ／シト加水分解のごと
き）α−１−６−グルコシド結合のイソマルターゼ触媒
切断によるマルトース利用、α−１−４グルコシド結合
のグルコアミラーゼ触媒切断による可溶性デンプン利用
または抗菌類剤に対する耐性のごとき天然には保有され
ていない機能を示すことができる。

カンジダの全ゲノムをカバーするゲノムライブラリーの
開発により、カンジダに由来するＤＮＡの機能のキャラ
クタライゼーションが可能となる。

これにより、無性病原の遺伝学が過去において可能であ
ったよりもより詳しく分析でき、抗カンジダ剤の開発が
容易となる。カンジダ・アルビカンスに由来するＤＮＡ
のサツカロミセス・セレビシェにおける機能を特徴付け
る好ましい方法は、カンジダ遺伝子がよく特徴付けられ
た真核生物の背景において研究できるようなものである
。かくして、カンジダ・アルビカンスの遺伝学は、形質
転換サツカロミセス・セレビシェによって示された機能
の補足を介する遺伝子の単離によって研究できる。さら
なる突然変異体の選択可能性と共に豊富な利用可能なサ
ツカロミセス・セレビシェ突然変異体株はかかる補足を
行うことを可能とする。

従って、明確な生物化学反応を伴うもの、あるいは細胞
分割または細胞構造に関与するもののごとき、多数の機
能のいずれかの１つを伴うカンジダ・アルビカンス遺伝
子について選択することが可能である。選択された遺伝
子の同定についてのゲノムライブラリーおよび系の利用
可能性は、ある生物を経済的に有用とし、他の生物をひ
どい病原とする基本的な差異をいくらか解決する新しい
アプローチを提供する。

本発明の方法を用いると、サツカロミセス突然変異を補
い、またはそれで形質転換したサツカロミセス株に新し
い特徴を付与する１またそれ以上の機能性シイ・アルビ
カンス遺伝子を担持するプラスミドを単離でき、かつ特
徴付けることができる。かかる機能性シイ・アルビカン
ス遺伝子はニス・セレビシェｔｒｐｌ突然変異を補う遺
伝子、ニス・セレビシェｈｉｓ３突然変異を補う遺伝子
、抗菌類剤ベノミルに対する高レベル耐性を付与する遺
伝子、ソルビトール上での増殖を可能とする遺伝子、イ
ソマルターゼ上での増殖を可能とする遺伝子、可溶性デ
ンプン上での増殖を可能とする遺伝子（すなわち、グル
コアミラーゼ遺伝子）、およびニス・セレビシェｇａｌ
ｌ突然変ｇをう酵素ガラクトキナーゼをコード付けする
遺伝子を包含できる。かかる遺伝子は、かかる遺伝子を
含有するプラスミドで首尾よ（形質転換されたサツカロ
ミセス宿主を単離するためのマーカーとして有用である
。また、シイ・アルビカンスのソルビトール、イソマル
ターゼおよび可溶性デンプン利用遺伝子の各プロモータ
は、かかるプロモータを含有するプラスミドで形質転換
したす、カロミセス微生物についての調節可能なプロモ
ータとしても有用である。シイ・アルビカンス機能性Ｄ
ＮＡ配列を含有するプラスミドは、医薬品、ワクチン抗
原およびホルモンのごとき、異種遺伝子産生物のサツカ
ロミセスにおける産生に有用である。

また、本発明によると、例えばＨＩＶ−１表面ｌｉ白（
ｇｐ　１６０）　、ビイ・ペルトウシス（Ｂ、　ｐｅｒ
ｔｕｓｓｉｓ）　トキシン・サブユニット（Ｓｌ）、形
質転換増殖因子−アルファ（ＴＧＦ−α）およびインタ
ーリューキン１β（ＩＬＩ−β）をコード付けする異種
遺伝子を酵母プロモータおよびシイ・アルビカンス・グ
ルコアミラーゼ遺伝子のシグナル配列の制御下、サツカ
ロミセスにおいて発現および分泌できる。選択された酵
母プロモータ、グルコアミラーゼシグナル配列および異
種構造遺伝子を含有するプラスミドは、選択されたサツ
カロミセス酵母細胞に形質転換できる。それにより、遺
伝子産生物はハイブリッドもしくは融合蛋白またはポリ
ペプチドとして発現され、プロセッシングされ、培地に
分泌される。融合蛋白の分泌は、大いに簡素化すべき蛋
白の精製を可能とし、行うべき蛋白のポスト−翻訳修飾
、例えばグリコジル化を可能とする。

また、本発明は百日咳くペルトウシス）に対するワクチ
ンに関する。ペルトウシス・トキシンは百日咳の病因に
おいて主要な役割を演じているビイ・ペルトウシスの蛋
白エキソトキシンであり、ビイ・ペルトウシスの主要保
護抗原であると信じられているしエイ・エイ・ワイスら
（Ａ、　Ａ、　Ｗｅｉｓｓｅｔ　ａｌ、ＨＩＶ−、アヌ
・レブ・マイクロパイオル（ＡｎｎＲｅｖ、　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ、ＨＩＶ−、４０　：　６６１　（１９８６
）参照］。ペルトウシス・トキシンはその分１を減少に
従って８１ないしＳ５と呼ばれる５種の非類似サブユニ
ットよりなるヘキサマー蛋白である［エム・タムラら（
Ｍ、　Ｔａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、ＨＩＶ−、バイオケ
ミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍ、ＨＩＶ−、　　２１　：
　５Ｓｌ６　（１９８２）参照］。ペルトウシス・トキ
シンは、そこではＢオリゴマー（サブユニットＳ２ない
しＳ５）が標的細胞膜におけるそのレセプターに該トキ
シンが結合する原因となり、かつＡ−プロモータ（Ｓｌ
サブユニツト）が酵素活性を含むというＡ−Ｂモデル構
造をとっている。

全ペルトウシス・トキシン・オペロンのヌクレオチドコ
ーディング配列は決定されている。例えば、全開示をこ
こに参照のために挙げるケイスら（Ｋｅｉｔｈ　ｅｔ　
ａｌ、ＨＩＶ−、１９８６年３月２６日出願の米国特許
出願８４３７２７号参照。さらに、ペルトウシス・トキ
シン・コーディング配列を含有するＤＮＡは公に入手可
能ないずれのビイ・ベルトランス株からも単離できる。

例えば、ビイ・ペルトウシスの種々の株は、商業的受託
所、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ンヨン、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メリーラ
ンド州、米国から入手可能である。かかる単離はケイス
ら（Ｋｅｉｔｈ　ｅｔａｔ、ＨＩＶ−、米国特許出願８
４３７２７号（前掲）の方法またはいずれの他の常法に
よって行うこともできる。

本発明は、Ｓｌ−ＧＡ蛋白は保護免疫原性応答の誘導能
を有するという発見に基づ（ものである。

かくして、本発明はＳｌ−ＧＡ蛋白、Ｓｌ−ＧＡ蛋白コ
ーディング配列、百日咳に対する保護を刺激するもので
あってＳｌ−ＧＡ蛋白の免疫保１ｆｆｉかつ非毒性量よ
りなるワクチンに関する。かかるワクチンはかかる蛋白
単独または他の抗原および／またはアジュバントとの組
み合わせよりなる。

加えて、本発明は、本発明のワクチンをヒトに投与する
ことを特徴とする百日咳に対しヒトを接種する方法に関
する。

本明細書中で用いる「免疫保護量」なる語は、かかる蛋
白をその同でヒト宿主に投与した後にペルトウシスに対
し十分な保護免疫応答を誘導するＳｌ−ＧＡ蛋白の量を
意味する。

ｒＳ　１−ＧＡ蛋白」なる語は、（ａ）カンジダ・アル
ビカンス・グルコアミラーゼ・／グナルペプチド・コー
ディング配列に、または（ｂ）カンジダ・アルビカンス
・グルコアミラーゼ遺伝子（ただし、かかる遺伝子はそ
のングナルベブチド・コーテング領域、およびいずれか
の機能性突然変異体のまたはその誘導体を包含する）内
のどこかに、同相で、融合したＳｌサブユニツトコ一デ
イング配列の１８６個のアミノ酸（成熟Ｓｌ蛋白のＮ末
端のアミノ酸２ないし１８７）よりなる組換体ＤＮＡフ
ラグメントによって形質転換された宿主サツカロミセス
細胞により発現されたペルトウシス・トキシン（ＰＴ）
Ｓｌサブユニット蛋白の可溶形を意味する。プラスミド
ｐＴｘｓ　１１についての１ａｃＺ転写および翻訳制御
下でのｒｓｌｄ遺伝子の生成およびその発現はロチトら
（Ｌｏｃｈｔｅｔ　ａｌ、ＨＩＶ−、インフエクンヨン
・アンド・イミューニティ（Ｉｎｆｅｃｔ、　　１ｍｍ
ｕｎ、　）、　　５５．　９６３　９６７　（１９８７
）に詳細に記載されており、その全開示をここに参照の
ために挙げる。

「機能性突然変異体および誘導体」なる語は、宿主細胞
、例えばサツカロミセス宿主細胞における発現に際し、
Ｓｌ−ＧＡ蛋白の生物学的活性、例えば溶解性およびペ
ルトウシスに対する保護免疫原性応答を保持する蛋白を
生じるＳｌ−ＧＡ蛋白コーディング配列のいずれの突然
変異または誘導によってもフード付けされるいずれの蛋
白も意味する。かかる突然変異体および誘導体の産生は
当業者の技量内のものである。Ｓｌ−ＧＡコーディング
配列のかかる機能性突然変異体および誘導体は、Ｓｌ−
ＧＡ蛋白と実質的に同一の生物学的活性を有するその化
学的修飾形態、例えばグリコンル化およびアルキル化形
態を含む。また、それらは、１またはそれ以上のアミノ
酸か再配列、付加、欠失または置換された、あるいは異
腫ポリペプチドがそれに融合または結合された突然変異
体および誘導体を含む。かくして、「８１〜ＧＡ蛋白コ
一デイング配列の機能性突然変異体および誘導体」なる
語は、天然のＳｌ−ＧＡ蛋白と実質的に同一の生物学的
活性を有する蛋白をコード付けする、Ｓｌ−ＧＡ蛋白コ
ーディング配列のもう１つの蛋白コーディング配列への
融合、ならびにアミノ酸の置換、欠失または付加を含む
Ｓｌ−ＧＡ蛋白コーディング配列のごときいずれのＳｌ
−ＧＡ蛋白コーディング配列も意味する。かかる機能性
突然変異体および誘導体は、例えば部位指向（ｓｉｔｅ
ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変異誘発、ランダム突然変異誘
発、ヌクレオチドまたはペプチド配列の化学的合成、天
然Ｓｌ−ＧＡ蛋白についてのコーディング配列の一部の
切形または欠失、前記のものの化学的（１１飾またはＳ
ｌ−ＧＡ蛋白コーディング配列の１以上のセグメントの
連鎖状化を用いて、当業者によって常法により調製され
る。また、Ｓｌ−ＧＡ蛋白コーディング配列のかかる機
能性突然変異体および誘導体は、天然Ｓｌ−ＧＡ蛋白と
実質的に同一の生物学的活性を有するその化学的修飾形
態、例えばグリコジル化およびアルキル化形態を含む。

また、本発明は該Ｓｌ−ＧＡ蛋白コーデイング配列を含
有するｃＤＮＡのごとき組換体ＤＮＡ分子に関する。か
かるｃＤＮＡは、ハンら（Ｈａｎ　ｅｔａｌ、ＨＩＶ−
、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ）、２
６１６１７−１６２５　（１９８７）の方法によるごと
く、Ｓ　１−ＧＡ蛋白を産生ずる細胞または培養物から
常法によって単離したｍＲＮＡの逆転写によるごとき常
法により調製できる。本発明の組換体ＤＮＡ分子のさら
なる具体例として、本発明のコーディング配列よりなる
組換体ＤＮＡベクターが提供される。このベクターは好
ましくは適当な発現制御配列に作動可能に連合した前記
コーディング配列を含有する。「適当な発現制御配列」
なる語は、構造遺伝子の転写および翻訳を調節する配列
を意味する。かかる発現制御配列は当該分野でよく知ら
れている。

本発明のなおさらなる態様は、本発明のベクターで形質
転換された宿主細胞である。かかる宿主細胞は培養培地
中で増殖でき、本発明のコーディング配列を発現するこ
とができる。かかる宿主細胞は、本発明の方法、すなわ
ち所望の宿主細胞を本発明のベクターで形質転換するこ
とによって調製される。かかる形質転換は通常の形質転
換技術を利用することによって達成される。適当である
宿主細胞は吐乳動物細胞、昆虫細胞、細菌細胞、植物細
菌および菌類細菌を含むが、それらに限定されるもので
はない。かくして、本発明はす、力ａｘミセス宿主細胞
が好ましいものの、いずれかの特定の宿主細胞にも限定
されるものではない。

また、本発明は、本発明の形質転換宿主を適当な培地中
で培養し、次いで蛋白を単離することよりなる本発明の
Ｓ　１−ＧＡコーディング配列によってコード付けされ
る蛋白を産生ずる方法に関する。

「適当な培地」とは、形質転換宿主が生存することを可
能とし、かつかかる宿主か本発明のコーディング配列を
回収可能な量で発現することを可能とする培地を意味す
る。用いるべき適当な培地は使用する宿主に依存するこ
とは当業者によく認識されるであろう。かく産生された
蛋白の単離は、宿主の培地溶解物から、または適当なら
ば、直接宿主の培養培地から行なわれ、前記したごとき
通常の蛋白単離技術によって行われる。

また、本発明はＳｌ−ＧＡ蛋白コーディング配列を含有
する合成ＤＮＡ分子に関する。「合成」なる語は組換技
術よりもむしろ合成技術によって調製されたＤＮＡ分子
を意味する。かかる技術は商業的に入手可能なＤＮＡ合
成器を用いるものであり、当該分野でよく知られている
。

本発明のワクチンはＳｌ−ＧＡ蛋白の免疫保護量かつ非
毒性量よりなる。かかるワクチンは好ましくはかかるＳ
ｌ−ＧＡ蛋白５〜２５μｇを含有するが、これらの量に
限定されるものではない。

望ましくはペルトウシス・トキシンと組み合わせて投与
される公知の他の抗原も本発明のワクチンに包含させる
ことができる。かかる添加成分は当業者に公知である。

好ましい添加成分は破傷風トキンドおよび／またはジフ
テリア・トキシドならびに糸状赤血球１疑果素（ＦＨＡ
）および／またはビイ・ペルトウシスのいずれの他の保
護抗原も包含する。

かくして、かかるワクチンの提供は本発明のもう１つの
態様、すなわち本発明のワクチンをヒトに投与すること
よりなるヒトをペルトウシスに対して免疫化する方法を
可能とする。

本発明のワクチンの投与の態様は、本発明の蛋白の免疫
保護量を宿主に投与するいずれの適当な経路も包含する
。しかしながら、該ワクチンは好ましくは筋肉内または
深部皮下経路を介して非経口投与する。所望ならば、経
口投与または他の非経口経路、すなわち皮肉、鼻孔内、
または静脈内のごとき他の投与態様を用いることもでき
る。

本発明のワクチンは、非毒性かつ滅菌した医薬上許容さ
れる担体中にＳｌ−ＧＡ蛋白の免疫保護量かつ非毒性量
を含有する医薬組成物として調製できる。ワクチンの投
与か非経口である場合、ワクチンに含まれる蛋白は、免
疫応答を引き出しおよび増強するための非特異的刺激源
として用いるために、所望により、いずれの通常のアジ
ユバントと混合しまたはそれに吸着させることもできる
。

かかるアジュバントは、とりわけ、水酸化アルミニウム
、リン酸アルミニウム、ムラミルジペチドおよびキール
（Ｑｕｉｌ）Ａのごときサポニン類を包含する。本発明
のワクチンの調製のさらなる別法例として、ワクチンに
含まれる蛋白をリポソームのごとき微粒子内にカプセル
化することができる。

本発明のワクチンのなおさらにもう１つの別法例におい
て、ワクチンに含まれる蛋白を免疫刺激マクロ分子、ま
たは破傷風トキシドと共に投与できる。別法として、好
ましくは生理学的ｐＨに緩衝化した本発明のワクチンの
蛋白を含有する水性懸濁液および溶液を経口摂取用に設
計できる。

医薬製剤とする場合、本発明のワクチンは単位投与形態
で存在さるのが好ましい。適当な治療上効果的な用量は
当業者ならば容易に決定できる。

本発明のワクチンに含有されるＳｌ−ＧＡ蛋白の有効量
は、通常のビイ・ペルトウシスの無細胞または成分ワク
チン中の抗原の有効量の範囲、すなわち、蛋白５〜２５
μｇである。この用量は、所望により、糸状赤血球凝集
素（ＦＨＡ）（約１０μｇ〜２５μｇ）および／または
凝集素あるいは他の抗原の種々の量と共に投与できる。

しかしながら、いずれかの特定の患者についての特別の
用量レベルは、患者の年令、一般的な健康、性、および
規定食；投与時間；投与経路；投与されるいずれかの他
の薬剤の相乗効果；および望まれる（♀護の程度を包含
する種々の因子に依存することは理解されるであろう。

もちろん、該投与は要すれば適当な間隔で繰り返すこと
ができる。好ましくは、各用量間に２ないし１２力月の
間隔を設け、後期においては所望によりブースター用量
にて、３種の用量を投与することができる。

以下の実施例において、本発明の特別の具体例がより詳
細に開示される。実施例１〜７は天然のサツカロミセス
宿主細胞の機能を補足する、サツカロミセスにおけるカ
ンジダ遺伝子の発現を説明する。実施例８および９はサ
ツカロミセスにおけるカンジダ遺伝子の発現を制御する
ためのカンジダ・レプリケータ領域の単離および使用を
説明する。実施例１０〜１３はサツカロミセスにおける
他の非酵母異種遺伝子についての発現および分泌系の一
部としてのカンジダ・シグナル配列の使用を説明するも
のである。実施例１３および１４は本発明のワクチンに
関するものである。

実施例１−シイ・アルビカンスからのＤＮＡの巣隅 Ａ、シイ・アルビカンスのゲノムライブラリーの組み立
て シイ・アルビカンス株７９２−１（ジェイ・ウォンーチ
ャン（Ｊ、　Ｋｗｏｎ−Ｃｈｕｎｇ）、ナショナル・イ
ンスティチュート・オブ・ヘルス（Ｎａｔｌ、　　１ｎ
ｓｔ。

Ｈｅａｌｔｈ）、米国、の好意による）からのＤＮＡを
リグスビイら（Ｒｉｇｓｂｙ　ｅｔ　ａｔ、ＨＩＶ−に
よって記載されている方法（前掲）によって単離した。

この手法によって精製したＤＮＡは平均１００キロ塩基
対（ｋｂｐ）長であった。

ブローチら（Ｂｒｏａｃｈ　ｅｔ　ａｔ、ＨＩＶ−　、
前掲、によって記載されているサツカロミセス−エシェ
リヒア・コリ・シャトルベクター、ＹＥｐｌ　３［ＡＴ
ＣＣ３７１１５］においてゲノムライブラリーを組み立
てた。リグスビイら（Ｒｉｇｓｂｙ　ｅｔ　ａｌ、ＨＩ
Ｖ−、前掲、によって提供されているデータに基づいて
のシイ・アルビカンスのゲノムサイズの計算により、シ
イ・アルビカンスのゲノムサイズは約２ｘｌＯ’ｋｂｐ
であることが示唆される。従って、確率９９％でシイ・
アルビカンスの各配列が少なくともこのライブラリーで
１回現れるゲノムライブラリーを提供するのは１０ｋｂ
ｐのインサートを担持する約８０００の独立した形質転
換体が必要である。これは、マニアティスら（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、ＨＩＶ−、［モレキュラーΦク
ローニングーア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバ−
・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ）　　（１９８２）によって
開示されている方法によって計算した。

該ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ５ａｕ３Ａで部分的
に消化し、５〜２０％シコ糖グラジエント中、遠心によ
って分画した。１０ｋｂｐの範囲内のＤＮＡフラグメン
トを含有する画分をプールし、結ぶのに用いた。唯一の
Ｂａｍ８１部位にてプラスミドＹＥｐ１３　　ＤＮＡを
切断し、次いでアリカリホスファターゼで処理して自己
結紮を防止した。等濃度（１０μＱ反応混合物中、２０
０ｎｇ）のシイ・アルビカンスおよびＹＥｐ１３ＤＮＡ
を結んだ。

ルリアブロス（Ｌ　Ｂ）における３７℃での４５分間の
発現時間が可能となる修飾を施したレーデルベルグおよ
びコーヘン（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ｃｏｈｅｎ
）、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、ＨＩＶ−　　１１９　：１０７２
　１０７４　（１９７４）の方法により、イー・コリ株
ＭＣ１０６１（カサダバンら（Ｃａｓａｄａｂａｎ　ｅ
ｔ　ａｌ、ＨＩＶ−　、ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、ＨＩＶ−　、１３８　：　１７９−２０７　
（１９８０））およびＨＢＩＯＩ　（ポリバールら（Ｂ
ｏｌｉｖａｒ　ｅｔａｌ、ＨＩＶ−、ジーン（Ｇｅｎｅ
）、２：９５−１１３（１９７９）を該結んだ混合物で
形質転換した。

アンピンリン５０μｇ／ｘ　Ｑを含有するＬＢ平板上で
少量の試料を平板培養することによって、独立した形質
転換体の数を見積もった。同時に、残存する試料を、ア
ンピシリン５０μｇ／ｊＩＱを含有するＬＢブロスに接
種し、ＤＮＡの単離に用いるため一部インキユーベート
した。平板培養の結果、約１６０００の独立したクロー
ンが得られたことが示された。インサートを含有する形
質転換体のパーセントを見積もるために、１００の形質
転換体をアンピシリンおよびテトラサイクリンに対する
耐性についてテストした。ＢａｍＨ１部位はテトラサイ
クリン耐性遺伝子（ｔｅｔＲ）中にあるので、挿入され
たＤＮＡと共にプラスミドを含有する形質転換体はテト
ラサイクリンに対して感受性であってアンピシリンに対
して耐性であり、一方、インサートなくしてプラスミド
を含有する形質転換体は両抗生物質に対して耐性である
はずである。得られた結果は、すべての形質転換体はテ
トラサイクリンに対して感受性であってアンピシリンに
対して耐性であることを示し、形質転換体の少なくとも
９９％はシイ・アルビカンスの挿入されたＤＮＡを含有
するプラスミドを担持することが示唆された。

この元の培養物の一部を接種物として用い、マニアティ
スら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、ＨＩＶ−　、前
掲、の方法によって、小規模または大規模いずれかにて
、イー・コリの一昼夜ＬＢ−アンピシリン培養物からＤ
ＮＡを調製した。

（１）一般的手法 ニス・セレビシェにおける発現によってシイ・アルビカ
ンスのクローン化ＤＮＡ配列を単離するために、ニス・
セレビシェの遺伝子的に明確なハブロイド株をＤＮＡ媒
介形質転換についての宿主として用いた。ａ）ジャーマ
ンら（Ｓｈｅｒｍａｎ　ｅｔａｌ、ＨＩＶ−、「メソッ
ズ・イン・イースト・ジェネティッス・ラボラトリ−・
マニュアル（Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＹｅａｓｔ　Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　
ｊ　、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−
（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）　　（１９８２）によって記載されている
ごときスフェロプラスト法によって、またはイト−ら（
ｌＬｏ　ｅｔ　ａｔ、ＨＩＶ−　、前掲、によって記載
されている塩化リチウムまたは酢酸リチウム法によって
形質転換を行った。１つを除（すべての必要な補足物を
含有する最小項ｔｉｌｌ（酵母窒素ベース−デイフコ（
Ｄｉｒｃｏ）　、ＹＮＢ）上で酵母を平板培養した。

特異的突然変異の野性型対立遺伝子を含有するプラスミ
ドでの明確なニス・セレビシェ突然変異体の形質転換に
より、形質転換宿主が非形質転換突然変異体に対して制
限的な条件下で増殖することが可能となる。以下の実施
例においては、ＬＥＵ２遺伝子を最初の選択可能なマー
カーとして用いた。次いで、形質転換酵母を添加型の培
地上に継代培養して、ニス・セレビシェ宿主株に元来欠
けている他の機能を発現する形質転換体を選択した。

ジャーマンら、前掲、の方法を用い、かつこのＤＮＡを
用い、所望の形質転換体のＤＮＡ調製を行い、公知の技
術によってイー・コリを形質転換することによって、ニ
ス・セレビシェからプラスミドを回収し、さらに分析用
に用いた。かかるさらなる実験は：ａ）元の形質転換酵
母細胞で見い出されたのと同一の表現型を与える遺伝子
の存在を確認するための酵母の形質転換；ｂ）ハイブリ
ッドプラスミドにおけるシイ・アルビカンスのＤＮＡの
存在を確認するためのハイブリダイゼーション分析；お
よびＣ）シイ・アルビカンスＤＮＡフラグメントの構造
上および機能上のさらなる分析を含む。

（２）ニス・セレビシェのｔｒｐｌ突然変異ヲ補うカン
ジダ・アルビカンス遺伝子の単離ニス・セレビシェ株Ｄ
ＢＹ７４６のスフェロプラスト（α、ｈｉｓ３−ＩＳ　
１ｅｕ２−３、Ｉｅｕ２−１１２、ｕｒａ３−５２、ｔ
ｒｐｌ−２８９）のスフェロプラストを、シイ・アルビ
カンス・ライブラリーから単離したＤＮＡで形質転換し
た。ニス・セレビシェ株ＤＢＹ７４６は米国、カリフォ
ルニア州、バークレイ　（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）　、カリ
フォルニア大学、生物物理部および医学部、酵母遺伝ス
トックセンター（Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｌｏ
ｃｋＣｅｎｔｅｒ）から得た。ロインン以外はすべての
必要な補足物を含有する最小培地（デイフコＹＮＢ）上
で細胞を平板培養した。形質転換酵母細胞はプラスミド
コード付けＬＥＵ２遺伝子を発現した。

Ｌｅｕ”細胞をこれらの平板から収穫し、ロイ７ンおよ
びトリプトファンをともに欠く最小培地上で平板培養し
た。調査した５００の形質転換体のうち、２がこれらの
平板上で増殖した。

これらの２の形質転換体のロイシンおよびトリプトファ
ンを欠く培地上での増殖はｔｒｐｌ突然変異の復帰によ
るよりもむしろシイ・アルビカンスＤＮＡインサートの
存在によることをテストするために、形質転換体を非選
択酵母エキス・ペプトン・デキストロース（ＹＥＰＤ）
培地中で１０世代増殖させ、次いですべての補足物を含
有する最小培地上で平板培養した。次いで、トリプトフ
ァンのみ欠く、またはロイシンのみ欠く最小培地上でコ
ロニー゛をレプリカ平板培養した。

すべての場合、プラスミドを喪失した細胞から生起した
コロニー、すなわちＬｅｕはまたトリプトファンを必要
とし、これはＬＥＵ２およびＴＲＰ１対立遺伝子の共分
離を示す。

ジャーマンらの方法、前掲、によって調製した酵母ＤＮ
Ａ調製物の少量でイー・コＩＪＨＢＩＯＩを形質転換し
、形質転換体をアンピシリン耐性について選択すること
によって２の形質転換単離体からプラスミドを回収した
。該形質転換体イー・コリ細胞はテトラサイタリン感受
性であり、これは該プラスミドがｔｅｔ”遺伝子中にイ
ンサートを含有することを示す。２のプラスミドをｐＡ
Ｒ８４−１およびｐＡＲ８４−２と名付けた。

マニアナイスら、前掲、の方法によって各々のプラスミ
ドＤＮＡを調製し、ニス・セレビシェ株ＤＢＹ７４６を
形質転換するのに用いた。ロイシンを欠くが補足ヒスチ
ジン、トリプトファンおよびウラシルを含有する培地上
で形質転換細胞の選択を行った。Ｌｅｕ”形質転換細胞
をトリプトファンについての原栄養性ついてテストした
。形質転換体の８８ないし１００％間のものが非選択マ
ーカーＴＲＰ”を発現し、ｐＡＲ８４−１およびｐＡＲ
８２−２は共にニス・セレビシェｔｒｐｌ突然変異を補
足する遺伝子を含有することが確認され、かつカンジダ
に由来する機能性ＤＮＡ配列はす、カロミセスで発現で
きることが示された。

Ｃ，プラスミドのさらなるキャラクタライゼーション 組換体プラスミド、におけるＤＮＡインサートの、シイ
・アルビカンスのゲノムＤＮＡへの特異的ハイブリダイ
ゼーションについてテストするため、小規模調製につい
てのジャーマンらの方法（前掲）により、非形質転換お
よび形質転換ニス・セレビシェ株ＤＢＹ７４６からのＤ
ＮＡを単離した。また、プラスミドを有するまたはそれ
なしのイー・コリのＤＮＡをマニアナイスらの方法（前
掲）によって調製した。

ＤＮＡ試料を制限酵素ＨｉｎｄＩｎおよびＢｇｌ■で消
化した。シイ・アルビカンス株７９２−１、ニス・セレ
ビシェ株ＤＢＹ７４６、プラスミドＹＥｐ１３、および
プラスミドｐＡＲ８４−２の消化したＤＮＡをアガロー
スケル電気泳動に（”ｔし、サザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ）　、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ーＵ、　Ｍｏ１．Ｒｉｏｔ、ＨＩＶ−　、９８　：　５
０３−０Ｓｌ７　（１９７５）の手法によってニトロセ
ルロースフィルターに移した。次いで、該フィルターを
、順次、まず３１ｐ標識ＹＥｐ１３ＤＮＡでハイブリダ
イズして用いたベクターがシイ・アルビカンスのゲノム
ＤＮＡにハイブリダイズするか否かをテストし、第２に
、３ｔｐ標識ｐＡＲ８４−２ＤＮＡでハイブリダイズし
て新しいプラスミドがシイ・アルビカンスのゲノムＤＮ
Ａにハイブリダイズするか否かを決定した。

マニアティスらの方法（前掲）により、６５°Ｃにて、
６ｘＳＳＣおよび３Ｘデンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）
（ｌｘデンハルトは０．０２％フィコール４００．０．
０２％ポリビニルピロリドン３６０および００２％牛血
清アルブミン）を含有する溶液で３時間ニトロセルロー
スフィルターで予備ハイブリクイズした。ハイブリダイ
−ジョン溶液は、マニアティスらの方法（前掲）に従い
ニックトランスレーションによって調製した３ｆｆｉｐ
標識ＤＮＡプローブを添加した以外は同一であった。ハ
イブリダイゼーションは６５°Ｃで１８時間行った。ハ
イブリダイゼーションの後、フィルターを６５℃で２ｘ
ＳＳＣで洗浄した。次いで、該フィルターをＸ線フィル
ムに暴露した。

ｐＡＲ８４−２ＤＮＡはやはりシイ・アルビカンスのゲ
ノムＤＮＡにハイブリクイズしたが、ｙＥｐ＋ａ　　Ｄ
ＮＡはニス・セレビシェのゲノムＤＮＡのみにハイブリ
クイズした。ｐＡＲ８４２のニス・セレビシェ・ゲノム
ＤＮＡへのハイフリタイセーンヨンは、プラスミドの一
部であるニス・セレビシェＬＥＵ２遺伝子によるもので
ある。

シイ・アルビカンスへのハイブリダイゼーションはカン
ジダインサートがカンジダのゲノム配列に相同であるこ
とによる。

アガロースゲル上での制限消化物の電気泳動によって各
プラスミドにおけるインサートのサイズを見積もった。

ｐＡＲ８４−１はダイ・アルビカンスＤＮＡの１５ｋｂ
ｐフラグメントを含有し、一方ｐＡＲ８４−２は１０．
４ｋｂｐフラグメントを含有する。

ニス・セレビシェｔｒｐｌ突然変異を補う’ｉイ・アル
ビカンスＤＮＡフラグメントの単離について用いたのと
同じ方法を用い、他の機能性シイ・アルビカンス遺伝子
を担持するプラスミドを単離し、以下の実施例２〜７に
記載するごと（にキャラクタライゼーションを行った。

ニス・セレビシェのｈｉｓ３はイミダゾールグリセロー
ルホスフェートデヒドロゲナーゼをコード付けする。ニ
ス・セレビシェのｈｉｓ３突然変異を補足するシイ・ア
ルビカンス遺伝子のＭ［を実施例１の手法に従って行っ
た。ロイシンおよびヒスチジンを欠く培地上でＬｅｕ”
酵母形質転換体を平板培養した。生起するコロニーを選
択した。

実施例１の方法に従って、イー・コリＨＢＩＱ１の形質
転換によって、前記した選択コロニーから、ニス・セレ
ビシェのｈｉｓ３突然変異を補足するダイ・アルビカン
ス遺伝子を含有するプラスミドを回収した。実施例１の
方法に従って、プラスミドＤＮＡをイー・コリ形質転換
体から単離し、ｐＡＲ８４−３と名付けた。

ニス・セレビシェのｈ　ｉ　ｓ　３突然１５’Ｂヲ補ｊ
７するシイ・アルビカンス遺伝子を含有するプラスミド
ｐＡＲ８４−３を実施例１の手法に従ってニス・セレビ
シェ株ＤＢＹ７４６に形質転換した。

前記した方法に従って、宿主ニス・セレビシェ微生物を
プラスミドｐＡＲ８４−３で形質転換し、選択した。次
いで、これらの微生物をｈｉｓ３遺伝子の発現について
テストした。

シイ・アルビカンス・ベノミル（ｂｅｎｏｍｙｌ）面１
性遺伝子は、抗菌類剤ベノミル（メチル　１−（ブチル
カルバモイル）−２−ペンズイミタゾール力ルバマート
）に対する高レベルの耐性を与える。

シイ・アルビカンスの株はニス・セレビシェよりもベノ
ミルに対して耐性である。かくして、この遺伝子は、以
下のごとく、形質転換ニス・セレビシェ株に新しい特徴
を与える。

ニス・セレビシェ株ＪＷＧ２−２Ｃ（α。

Ｌｅｕ２−３、］ｅｕ２−１１２）を宿主として用いる
以外は実施例１の手法に従い、シイ・アルビカンス・ベ
ノミル耐性遺伝子の単離を行った。

ニス・セレビシェ株ＪＷＧ２−２Ｃはニス・セレビシェ
株ＤＣ５（Ｌｅｕ２−３，１ｅｕ２−１１２゜ｈｉｓ３
．ｇａ１２．ｃａｎｌ−１，１）とニス台セレビシェ株
ＹＭ１４６　＜ａ、ｇａ　Ｉ　１Δ１５２゜ｔｒｐｌ−
２８９，ｕｒａ３−５２．　ｒｈｏ）との交差に由来す
るものであった。ニス・セレビシェ株ＤＣ５はジェイム
ス・アール・ブローチ（ＪａＩ＋ｌｅｓ　Ｒ，Ｂｒｏａ
ｃｈ）　、Ｓ、Ｕ、Ｎ、Ｙ、、ストニブルツク（Ｓｔｏ
ｎｙｂｒｏｏｋ）　、二ニーヨーク、米国から得た。

ニス・セレビシェ株ＹＭ１４６はマーク・ジョンソン（
Ｍａｒｋ　Ｊｏｈｎｓｏｎ）　＋　ワシントン州立大学
、プルマン（Ｐｕｌｌｍａｎ）　、ワシントン、米国か
ら得た。

ロイシン以外のすべての必要な補足物を含有し、かつベ
ノミル（５０μｇ／ｍ　Ｑ　）も含有するする最小培地
（デイフコＹＮＢ）上でＬｅｕ”形質転換細胞を平板培
養した。いくつかのベノミル耐性コロニーが得られた。

ベノミル耐性を与える酵素についてコード付ｉｔするシ
イ・アルビカンス遺伝子を含有するプラスミドを実施例
１の手法に従って回収した。ジャーマンら（Ｓｃｈｅｒ
ｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、ＨＩＶ−の小規模法（前掲）に従
い、プラスミドＤＮＡを個々のイー・コリ形質転換体か
ら単離した。回収したプラスミド中のシイ・アルビカン
ス・インサートのサイズをアガロースゲル電気泳動によ
って見積もった。

実施例１の手法に従い、シイーアルビカンス働ベノミル
耐性遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡをイー・フリ形
質転換体から単離し、これを用いてニス・セレビシェ株
ＪｗＧ２−１１Ｄ　（α。

ｈｉｓ３．ｔｒｐｌ−２８９，Ｌｅｕ２−３＋Ｉｅｕ−
１１２，ｇａ　ｌ　１Δ１５２）を形質転換シタ。ニス
・セレビシェ株ＪＷＧ２−１１１］；！！ス・セレビシ
ェ株ＪＷＧ２−２Ｃと同様の方法によって得たものであ
った。

前記した方法に従い、シイ・アルビカンス・ベノミル耐
性遺伝子を含有するプラスミドで形質転換したニス・セ
レビシェ微生物を前記したととくに選択した。ベノミル
を含有する培地上で平板培養することによって、実施性
１の手法に従い、形質転換宿主における該プラスミドの
存在を確認した。ｐｃＡｂｅｎ１７、ｐＣＡｂｅｎ３お
よびｐＣＡｂｅｎ１５と名付けた３種の独立した単離体
を制限マツピングによってさらに分析し、すべてがシイ
・アルビカンスからの同一の５．８キロ塩基対（ｋｂｐ
）ＤＮＡフラグメントを含有することが判明した。

シイ・アルビカンス・ソルビトール利用遺伝子は炭素源
ソルビトール上での増殖を可能とする。

シイ・アルビカンスの株はソルビトール上で増殖できる
が、ニス・セレビシェおよび他種のサツカロミセスはこ
の糖を利用できない。かくして、この遺伝子は形質転換
ニス・セレビシェ株に以下のごとくに新しい特性を与え
る。

シイ書アルビカンス・ソルビトール利用遺伝子の単離は
、ニス・セレビシェ株Ｊ　ＷＧ　２−２　Ｃを宿主とし
て用いた以外は実施例１の手法に従って行った。ロイシ
ンおよびグルコース以外の必要なすべての補足物を含有
し、かつ２％ンルビトールも含有する最小培地（デイフ
コＹＮＢ）上でＬｅｕ”形質転換体を平板培養した。

ソルビトール利用能を与える酵素についてコード付けす
るシイ・アルビカンス遺伝子を含有するプラスミドを実
施例１の手法に従って回収した。

ジャーマンらの小規模法（前掲）に従ってプラスミドＤ
ＮＡを個々のイー・コリ形質転換体から単離し、回収し
たプラスミドのシイ・アルビカンス・インサートのサイ
ズをアガロースゲル電気泳動によって見積もった。

実施例１の方法に従い、シイ・アルビカンス・ソルビト
ール利用遺伝子を含有するプラスミドを前記したイー・
コリ形質転換体から単離し、これを用いてニス・セレビ
シェ株ＪＷＧ２−１１Ｄを形質転換した。

シイ・アルビカンス・ソルビトール利用遺伝子を含有す
るプラスミドで形質転換したニス・セレビシェの宿主細
胞を前記したごとくに選択した。

実施例１の方法に従って形質転換宿主における該プラス
ミドの存在を確認した。ｐｃＡｓｏｒ２およびｐＣＡｓ
ｏｒ９と名付けた２種の独立した単離体のＤＮＡを制限
マツピングによってさらに分析した。ｐＣΔ５ｏｒ２は
シイ・アルビカンスからの４．５ｋｂｐＤＮＡインサー
トを含有することが判明し、一方ｐｃＡｓｏｒ９はｐＣ
Δ５ｏｒ２シイ・アルビカンスＤＮＡインサートに対す
る相同性をほとんど示さないシイ・アルビカンスからの
４．８ｋｂｐＤＮＡインサートを含有することが判明し
た。

ニス・セレビシェ株ＪＷＧ２−１１　Ｄを宿主として用
いる以外は実施例１の手法に従い、ニス・セレビシェｇ
ａｌｌ突然変異を補足するシイ・アルビカンス・ガラク
トキナーゼ遺伝子の単離を行った。ロイシンおよびグル
コースを除くすべての必要な補足物を含有し、かつ２％
ガラクトースも含有する最小培地（デイフコＹＮＢ）上
でＬｅｕ”形質転換体を平板培養した。

ガラクトキナーゼについてフード付けするシイ・アルビ
カンス遺伝子を含有するプラスミドを実施例１０手法に
従ってイー・コリにおいて回収した。

実施例１の方法に従って、プラスミドＤＮＡをイー・コ
リ形質転換体から単離した。

シイ・アルビカンス・ガラクトキナーゼ遺伝子を含有す
る該プラスミドＤＮＡを前記したごとくにイー・コリ形
質転換体から単離し、これを用いｒ実施例１の方法に従
ってニス・セレビシェ株ＪＷＧ２−１１Ｄを形質転換し
た。

シイ・アルビカンス・ガラクトキナーゼ遺伝子を含有す
るプラスミドで形質転換した宿主ニス・セレビシェ微生
物を前記したこと（に選択し、該形質転換宿主中におけ
る該プラスミドの存在を実施例１の方法に従って確認し
た。ｐＣＡｇａ　Ｉ　ｌ−１およびｐｃＡｇａｌｌ−４
と名付けた２種の独立した単離体を制限マツピングによ
ってさらに分析し、ｐｃＡｇａｌｌ　　１における７ｋ
ｂｐシイ・アルビカンスＤＮＡインサートはｐＣＡｇａ
ｌｌ−４における１　３ｋｂｐインサートの内部部分と
同一であることが明らかとされた。

プラスミドｐｃＡｇａｇｉ−４でまたはそれなしで株Ｊ
ＷＧ２−１１Ｄにおけるガラクトキナーゼのレベルを測
定することによって、ニス・セレビシェ形質転換体にお
けるガラクトキナーゼを７−ド付けするシイ・アルビカ
ンスＤＮＡ配列の存在をさらに証明した。プツトら（Ｂ
ｕｔｔ　ｅｔ　ａｌ）、ＰＮＡＳ−ＵＳＡ、旦、３３３
２−３３３６（１９８４）の方法によって測定した酵素
活性はｐＣＡｇａｌｌ−４を含有するガラクトース誘導
培養物においてのみ検出された。

以下のごと（、シイ・アルビカンス・ガラクトキナーゼ
遺伝子のプロモータはニス・セレビシェ陽性レギュレー
タ、ＧＡＬ−４遺伝子産生物によって陽性的に活性化さ
れることが示された。ｐＣＡｇａ　ｌ　ｌ−４を含有す
る株ＪＷＧ２−１１Ｄを、ニス・セレビシェＧＡＬ−４
遺伝子を含有する２μｍＬｅｕ２シャトルベクターを含
有するもう１つのニス・セレビシェ株（遺伝子型・α−
ｔｒｐｔ−２８９，１ｅｕ２−３，１ｅｕ２−１１２゜
ｇａ　Ｉ　１−１５２．ｕ　ｒａ３−５２）に対合させ
た。得られた二倍体をロイシンおよびトリプトファンを
共に欠く培地上で維持した。ガラクトキナーゼの誘導レ
ベルはＧＡＬ−４遺伝子を発現するプラスミドの存在に
おいてかなり高かった。この結果は、ｐｃＡｇａｌｌ−
４におけるシイ・アルビカンス配列はニス・セレビシェ
調節蛋白に応答スるガラクトース調節プロモータを含有
することを示す。

酵素イソマルターゼはα−１−６−ゲルコンド結合を切
断し、微生物がそれを発現してα−メチルーＤ−グルコ
ピラノシドとして公知である（例えば、イソマルターゼ
）炭素源上で増殖するのを可能とする。シイ・アルビカ
ンス株はこのＭ’ｆｌ上で増殖できるが、ニス・セレビ
シェのほとんどの株は元来この糖を利用できない。この
酵素はサツカロミセスの他の種で発見された。かくして
、イソマルターゼについてコード付けするシイ・アルビ
カンス遺伝子は形質転換ニス・セレビシェ宿主に新しい
特性を付与する。

シイ・アルビカンス・イソマルターゼ遺伝子の単離は実
施例１の手法に従って行った。ロイシン以外のすべての
必要な補足物を含有し、かつ２％α−メチル−〇−グル
コピラノシドも含有する最小培地（デイフコＹＮＢ）上
でＬｅｕ”形質転換体を平板培養した。

イソマルターゼについてコード付けするシイ・アルビカ
ンス遺伝子を含有するプラスミドを実施例１の手法に従
って回収した。プラスミドＤＮＡを実施例１の方法に従
って個々のコー・コリ形質転換体から単離した。

シイ・アルビカンス・イソマルターゼ遺伝子ヲ含有する
プラスミドを前記したイー・コリ形質転換体から単離し
、これを用いて実施例１の方法によりニス・セレビシェ
株ＪＷＧ２−１１Ｄを形！転換した。

シイ・アルビカンス・イソマルターゼ遺伝子ヲ含有する
プラスミドで形質転換した宿主ニス・セレビシェ微生物
を前記したごと（に選択し、該形質転換宿主における該
プラスミドの存在を実施例１の方法により確認した。

シイ・アルビカンス・グルコアミラーゼ遺伝子は、可溶
性デンプン上での増殖を可能とする酵素についてコード
付けする。シイ・アルビカンス株はかかる可能性デンプ
ンを基質として利用できるが、ニス・セレビシェはこの
炭素源を元来利用できない。この酵素、グルコアミラー
ゼはサツカロミセスの池の種において見い出されている
。かくして、（α−１−４−グルコシド結合を切断する
）グルコアミラーゼについてコード付けするシイ・アル
ビカンス遺伝子はニス・セレビシェ宿主に新しい特性を
付与する。

シイ・アルビカンス・グルコアミラーゼ遺伝子の単離は
、ニス・セレビシェ株Ｊ　ＷＧ　２−２　Ｃを宿主とし
て用いた以外は実質的に実施例１の手法に従って行った
。ロイシンおよびグルコースを除くすべての必要な補足
物を含有し、かつ２％可溶性デンプンも含有する最小培
地（デイフコＹＮＢ）上でＬｅｕ”形質転換体を平板培
養した。サテライトコロニーは元の大きなコロニーに隣
接して増殖を開始したので、イー・コリ形質転換体はお
そらくグルコアミラーゼを分泌していたのであろう。

シイ・アルビカンス・グルコアミラーゼ遺伝子を含有す
るプラスミドを実施例１の手法に従ってイー・コリから
回収し、プラスミドＤＮＡを個々のイー・コリ形質転換
体から単離した。

前記したイー・コリ形質転換体から単離したシイ・アル
ビカンス・グルコアミラーゼ遺伝子を含有するプラスミ
ドＤＮＡを用いて実施例１の方法に従ってニス・セレビ
シェ株ＪＷＧ、２−１１Ｄを形質転換した。

前記した方法に従ってプラスミドで形質転換した宿主ニ
ス・セレビシェ微生物を前記したごとくに選択した。該
形質転換宿主中における該プラスミドの存在を実施例１
の方法に従って確認した。

ｐｓＴＡ２７−１、ｐｓＴＡｌ−３およびｐｓ”ｒＡ１
５−１と名付けた３種の独立した単離体を制限マツピン
グによってさらに分析し、Ｉ）ＳＴＡ２７−１およびｐ
ｓＴＡｌ−３は同一のシイ・アルビカンスＤＮＡインサ
ートを含有するが、一方ｐＳＴＡ１５−１はおそら（異
なるシイ・アルビカンスＤＮＡインサートを含有するこ
とが明らかにされた。

３種の異なるニス・セレビシェ株、第１の株（遺伝子型
：α、Ｉｅｕ２−、？＋＋ｓｌ）、第２の株（遺伝子型
：ａ、Ｉｅｕ２．ｈｉｓｌ）および第３の株（遺伝子型
：ａ、１ｅｕ２．ｈｉｓｌ）への形質転換（イト−ら（
Ｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、前掲）によってプラスミドｐｓ
ＴＡ２７−１を導入した。また、同一の３種株をいずれ
のシイ・アルビカンス配列モ欠く親ベクタープラスミド
ＹＥｐ１３て形質転換した。すべての６種の形質転換株
の増殖を、０５％マルトオリゴ糖（Ｍｏｓ）（ファンス
テイールーラボラトリーズ・インコーホレイテッド（Ｐ
ｈａｎｓｔｉｅｌ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ
、ＨＩＶ−を唯一の炭素源として含有する完全な（Ｙ　
Ｅ　Ｐ）培地上でテストした。

この化合物、ＭｏＳはアルファー１，４−グルコシド結
合によって連鎖となったグルコースポリマーの混合物よ
りなる。それは、グルコース、マルトースおよびマルト
トリオースを欠き、かくしてサツカロミセス・セレレビ
シエ株によって炭素源として使用され得ない高次のオリ
コマ−よりなる。これは；１）これらの多糖類はニス・
セレビシェ細胞に侵入しない、および２）ニス・セレビ
シェ株はＭｏｓを細胞外で分解できる酵素活性（アミラ
ーゼまたはグルコアミラーゼ）を分泌しないという事実
による。

プラスミドＹＥｐ１３で形質転換したすべての３種の株
はＭｏｓ含有含有上地上殖しないのに対し、プラスミド
ｐＳＴＡ２７−１を担持する同一の３種株、ならびに／
イ・アルビカンス株７９２１（ジエイｅウォンーチュン
（ｊ、　Ｋｗｏｎ−Ｃｈｕｎｇ）、ナンヨナル・インス
ティテユート・オブ・ヘルス（Ｎａｔｌ、　　Ｉｎｓ、
、　ｌ１ｅａｌＬｈ）米国の好意による）はこの培地上
で増殖する。この結果は、ｐＳＴＡ２７１においてクロ
ーン化された／イ・アルピノコンスＤＮＡフラグメント
はＭｏｓを利用可能な炭素源に分解できる酵素をコード
付けする遺伝子を担持することを示す。

この遺伝子はニス・セレビシェで発現され、その産生物
は培地中に分泌される。

形質転換されたニス・セレビシェ宿主によるシイ・アル
ビカンス・グルコアミラーゼの発現および分泌を確認す
るために、すべての６種の形質転換ニス・セレビシェ株
の培養培地、ならびにシイ・アルビカンス株７９２−１
の培養培地をシーレら（Ｓｅａｒｌｅ　ｅｔ　ａｌ、Ｈ
ＩＶ−、エフ・イー・エム・ニス・マイクロバイオロジ
ー・レターズ（ＦＥＭＳ　ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＬ
ｅｔｔｅｒｓ）　＋　１上１，２１１−２１２　（１９
６８１）によって記載されている方法に従ってグルコア
ミラーゼ活性の存在についてテストした。ＹＥｐ１３で
形質転換したニス・セレビシェ株の培養培地はいずれの
検出可能なグルコアミラーゼ活性も欠くのに対し、シイ
・アルビカンス株７９２−１の培養培地およびｐｓＴＡ
２７−１を含有するニス・セレビシェの培養培地は認識
できるグルコアミラーゼの量を含有することが判明した
。事実、プラスミドｐｓＴＡ２７−１を担持するニス・
セレビシェ株はシイ・アルビカンス株７９２−１の１５
ないし３０倍のグルコアミラーゼ活性をそれらの培養培
地中に分泌することか判明した。　以下のごと（、ｐｓ
ＴＡ２７−１で形質転換したニス・セレビシェ株によっ
て分泌されたグルコアミラーゼ活性をさらに特徴付けし
、シイ・アルビカンス株７９２−１によって分泌された
ものと比較した： ａ、ニス・セレビシェ株によって分泌された酵素のｐＨ
最適値は４５と６．０の間であると決定され、シイ・ア
ルビカンスによって分泌された酵素のものと同一である
。

ｂ、ニス・セレビシェ分泌酵素の温度最適値は６０’Ｃ
であることか’Ｉ’１１明し、シイ・アルビカンス分ｉ
・酵素のものと同一である。

ｃ、ＹＥｐ１３またはＩ）ＳＴＡ２７−１いずれかで形
質転換した前記ニス・セレビシェ株（遺伝子型：ａ、Ｉ
ｅｕ２．ｈｉｓｌ）に由来する培徐培地の一部およびシ
イ・アルビカンス株７９２１の一部をＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によって分析した。分子ｆｆ１９
４にクルトン以上の散在蛋白バンドがｐＳＴＡ２７−１
培地で形質転換した前記ニス・セレビシェ株に存在する
か、ＹＥｐ１３で形質転換した株に由来する培地からの
ものには存在しなかった。同一ではないにせよ、同様の
蛋白バンドか、非常に少量だが、／イ・アルビカンス株
７９２−１に由来する培地で検出される。

考え併せると、これらの結果は、ｐＳＴＡ２７１におい
てクローン化した／イ・アルビカンスＤＮＡのフラグメ
ントはグルコアミラーゼをフード付けするシイ・アルビ
カンス遺伝子を担持し、この遺伝子は酵母ニス・セレビ
シェで発現され、この遺伝子の産生物はニス・セレビシ
ェ細胞によって培養培地中に分泌されることが示される
。

実施例８および９は異種宿主ニス・セレビシェ微生物に
おける組換体プラスミドの自律複製を支持するいくつか
のシイ・アルビカンス・レプリケータ領域の単離および
使用を報告する。

Ａ、材料および方法 エシェリヒア・コリ株ＳＦ８　（Ｃ６００゜１ｅｕＢ、
ｔｈｒ、ｐｒｏ、Ｂｌ、ｒｋ−、ｍｋｒｅｃＢＣ−，１
ｏｐＨ，ｌｉｑ”）［カメロンら（Ｃａｍｅｒｏｎ　ｅ
ｔ　ａｔ、ＨＩＶ−　、ビイ・エヌｅエイ・ニス（ＰＮ
ＡＳ）、ＵＳＡ、□、３４１６．３４２０（１９７５）
］を細菌の形質転換およびプラスミドの増殖に用いた。

必要に応じて補足したＬＢ（豊富培地）またはＭＳ（最
小培地）上で細菌を増殖させた［（ミラー（Ｍｉｌｌｅ
ｒ）、「分子遺伝学における実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔｓ　Ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）
Ｊ、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（
Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｉ（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）　、：、−ヨーク、４３１−４３３　（１
９７２）］。サツカロミセス・セレビシェ株４８３　（
遺伝子型：ａ、１ｅｕ２−３．Ｉｅｕ２−１１２．ｈｉ
ｓ４−Ｓｌ９、ｃａｎｌａ）を酵母形質転換についての
宿主として用いた。この株はマイケル・カルバートソン
（Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｃｕ１ｂｅｒｔｓｏｎ）　、ライス
コンシン大学、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）　、ウィス
コンシン州から得た。酵母培養は必要に応じてヒスチジ
ン（２μｇ／Ｉ　Ｑ　）およびロイシン（２μｇ／　履
Ｑ）を補足したＹＰＧ　（豊富培地；１％酵母エキス、
１％ペプトン、２％グルコース）またはＹＮＢ　（最小
培地；デイフコＹＮＢ）上で増殖させた。

プラスミドＭ８Ｓｌ［ボルマンら（Ｇｏｒｍａｎ　ｅｔ
ａｌ、ＨＩＶ−、モレキュラー・アンド・ジェネラル・
ジェネティックス（Ｊｏｔ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、
ＨＩＶ−　＋　　１８３＋　　３０６−３１３　（１９
８１）］を使用した。シイ・アルビカンス株７９２−１
をゲノムＤＮＡ源として用いた。

閉環状プラスミドＤＮＡを、クロラムフェニコールで増
幅したＭＳ−グルコース増殖イー・コリ培養物から調製
した。実質的にはフレウェル（Ｃｌｅｗｅｌｌ）　、ジ
ャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ、ＨＩＶ−　、　　１１０．　６６７　６７６
（１９７２）によって記載されているごとき清澄溶解物
法により、ＤＮＡを抽出し、精製した。

ビルンボイムおよびドリイ（Ｂｉｒｍｂｏｉｍ　　ａｎ
ｄＤｏｌｙ）、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎ
ｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、ＨＩＶ−　、ヱ、１Ｓｌ３−１５
２３　（１９７９）の手法を用い、酵母形質転換および
予備ゲル分析で用いる粗製イー・コリ・プラスミド調製
物を作成した。細菌培養物１０ｘＱ　（２ｘ　１０”細
胞）は粗製プラスミドＤＮＡ１〜２μｇを生じた。

細菌形質転換体をプラスミドの存在について迅速にスク
リーニングするために、同一の方法によって調製した単
一コロニーミニ−溶解物を用いた。

ニス・セレビシェからの合計ＤＮＡの回収のため、ジャ
ーマンらの小規模法（前掲）を用いた。

リグビイら（Ｒｉｇｂｙ　ｅｔ　ａｌ、ＨＩＶ−　、ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、　
Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、ＨＩＶ−。

１１鼻、２３７−２Ｓｌ　（１９７７）の方法によって
シイ・アルビカンスＤＮＡを調製した。　すべての用い
たゲル分析およびハイブリダイゼーション手法はマニア
ティスらの方法（前掲）に従った。

ダゲートおよびエーリッヒ（Ｄａｇｅｒｔ　ａｎｄ　Ｅ
ｈｒｌｉｃｈ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）　、６．２３−２
８　（１９７９）によって修飾されたカルシウム−熱シ
ヨツク法を用いてイー・コリを形質転換した。酵母形質
転換について用いた手法は実質的にはベッグズ（Ｂｅｇ
ｇｓ）、ネイチ＋−（ｌｌａｔｕｒｅ）　、２７５．１
０４−１０９（１９７８）によって記載されているもの
であり、低濃度のプラスミドＤＮＡ（１０”スフェロプ
ラスト当り０．５−１．０μｇ）を用いる以外はスフェ
ロプラスト形成についてβ−グルクロニダーゼスルファ
ターゼ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）　）を用いた。

Ｂ、結果 １、プラスミドの組み立て ドウガイスジツクら（Ｄｕｇａｉｃｚｙｋ　ｅｔ　ａｌ
、ＨＩＶ−、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　）　、９６．１
７１−１８４　（１９７５）の方法によって、制限エン
ドヌクレアーゼＰｓｔＩで完全に消化した合計カンジダ
ＤＮＡとＰｓｔＩ−切断Ｍ８ＳｌプラスミドＤＮＡとを
、カンジダインサートを含有するプラスミドの最高回収
を与えると見積もった濃度で混合し、Ｔ４ポリヌクレオ
チドリガーゼで結んだ。この手法により、結紮により該
ＤＮＡＧＭ８Ｓｌの唯一のＰｓｔ１部位に入れた。該結
んだ混合物を用いてイー・コリ株ＳＦ８をロイシン原栄
養性に形質転換した。

次いで、Ｌｅｕ”″形質転換体をアンピシリン感受性に
ついてスクリーニングした。挿入フラグメントによるａ
ｍｐ’遺伝子の中断の結果、薬剤耐性が喪失した。かく
して、ａｍｐ’コロニー（Ｌｅｕ”細菌形質転換体の５
．８％）を、カンジダからの配列を含有するプラスミド
をおそらくは持つものとして選択した。これらのハイブ
リッドプラスミドを続いて単離体番号を付すｐＣＡで命
名した。

２、酵母の形質転換 酵母レプリケータ配列を含有するプラスミドは高頻度で
酵母を形質転換し、これは真核生物細胞におけるプラス
ミドの自律複製を反映する。プラスミドか機能性レプリ
ケータを欠く場合は、やはり形質転換させるであろうが
、低頻度であろう。

おそらくは、この低頻度の安定な形質転換は相同組換に
よるプラスミドｌｅｕ”遺伝子の染色体ＤＮＡへの取り
込みを反映するものであろう。カンジダ染色体レプリケ
ータが酵母において機能的である場合、それらを含有す
るハイブリッドプラスミドは高頻度で酵母を形質転換で
きる能力によって特徴付けてきる。

４１のｐＣＡプラスミドを１ｅｕ２ニス・セレビシェを
Ｌｅｕ”に形質転換するそれらの能力について個々にテ
ストした。テストした４１のｐＣＡプラスミドのうち５
が高頻度の形質転換を示した。これらの結果は、かかる
プラスミドはニス・セレビシェ中で自律的に複製できる
ことを示す。

３、プラスミドＤＮＡのニス・セレビシェにおける検出 もし高頻度形質転換が自律的なプラスミドの複製を可能
とするカンジダ配列の存在を示すならば、ｐＣＡプラス
ミドからのＤＮＡで形質転換した不安定なＬｅｕ”酵母
から閉環状分子を回収できるはずである。

合計酵母ＤＮＡを親酵母株および形質転換酵母株から抽
出し、１．０％アガロースゲル中で電気泳動シ、ニトロ
セルロースペーパーに移シた。次いで、該ＤＮＡをＰ３
！−標識ｐＢＲ３２２プローブでハイブリダイズした。

このプローブは酵母染色体ＤＮＡとの相同性を有しない
。形質転換培養物カラのＤＮＡをニトロセルロースフィ
ルターに移し、Ｐ３′−標識ｐＢＲ３２２で／％イブリ
ダイズした。このプローブにハイブリダイズするＤＮＡ
配列は高頻度形質転換を与える５のｐＣＡプラスミドの
うちｌで形質転換した、ならびに対照プラスミドｐＹＰ
４２　（ボルマンら（Ｇｏｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、前
掲）で形質転換したニス・セレビシェの抽出物中で検出
できた。

４１１プラスミドＤＮＡでのイー・コリの形質転換 ハイブリダイゼーション技術によって分析した酵母プラ
スミド調節物もＩｅｕＢ、イー・コリをＬｅｕ’に形質
転換する能力について調べた。

ロイシン欠乏培地上で選択した細菌コロニーをミニ−溶
解物のアガロースゲル電気泳動によってプラスミドの存
在についてスクリーニングした。ハイブリダイゼーショ
ンによってプラスミドを含有することが示された５の酵
母抽出物はプラスミドＤＮＡを含有するＬｅｕ”″イー
・コリを生じた。

５の高頻度形質転換ｐＣＡプラスミドのうち１のプラス
ミドＤＮＡを、ニス・セレビシェ宿主を通じての移行に
よりイー・コリから単離したプラスミドと比較した。４
．０キロ塩基対（ｋｂ＋ｐ）シイ・アルビカンス・イン
サートを含有するプラスミドは同一であることが判明し
た。

サツカロミセスを形質転換するのに用いるブラスミドの
自律維持で有用なカンジダの他のレプリケータ領域はカ
ワムラら（Ｋａｗａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、ＨＩＶ−　
（前掲）、フスら（Ｈｓｕ　ｅｔ　ａｌ、ＨＩＶ−　（
前掲）；またはティクホミロバら（Ｔｉｋｈｏｍｉｒｏ
ｖａ　ｅｔ　ａｌ、ＨＩＶ−　（前掲）の方法に従って
単離することができる。かかるレプリケータ領域を含有
するプラスミドは本実施例に記載した方法によって調製
できる。

形質転換 シイ・アルビカンス・レプリケータ領域およびシイ・ア
ルビカンス・コーディング配列を含有するプラスミドは
実施例１と８の方法を組み合わせることによって調製で
きる。かかるプラスミドを用いて、実施例１の方法に従
い、ニス・セレビシェを形質転換でき、形質転換したニ
ス・セレビシェ宿主によるシイ・アルビカンス・コーデ
ィング配列の発現は実施例１の方法により検出できる。

マウス（トムセン（Ｔｈｏｍｓｅｎ）、１９８３、力−
ルスベルグφリサーチーコミューニケ−／ヨン（Ｃａｒ
ｓｂｅｒｇ　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、ＨＩＶ−、４８
：５４５）、小麦、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ）　（イエスら（Ｉｎｎｉｓｅｔａｌ、ＨＩＶ−
、１９８５、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２８：
２１）、およびニス・シアスタテイカス（Ｓ。

ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）　（ヤマシタおよびフクイ（
Ｙａｍａｓｈｉｔａａｎｄ　Ｆｕｋｕｉ）、１９８３、
アブリフ・パイオル・ケム（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、
　Ｃｈｅｍ、ＨＩＶ−、４７　：　２６８９）からのグ
ルコアミラーゼについての遺伝子はニス・セレビシェで
発現された場合に培地中に分ｉ・されることが示されて
いる。シイ・アルビカンスまたは形質転換したニス・セ
レビシェ宿主によって産生された場合、シイ・アルビカ
ンス酵素グルコアミラーゼは培地中に分泌される。今回
、実施例７に記載したごとくに単離された、やはりＳＴ
Ａ遺伝子と呼ばれるシイ・アルビカンス・グルコアミラ
ーゼ遺伝子は、蛋白分泌において機能する新規プロモー
タおよびシグナル・ペプチドについてのＤＮＡ配列を提
供することが判明した。シグナル・ペプチドを細胞質蛋
白の分泌に使用することは、例えば１９８２年６月２２
日に発行されたンルハビイーら（Ｓｉｌｈａｖｙ　ｅＬ
　ａｌ、ＨＩＶ−の米国特許第４３３５３３６号に開示
されており、それを参照されたい。

このグルコアミラーゼ遺伝子シグナル・ペプチドは形質
転換されたカンジダ、サツカロミセスまたは池の酵母細
胞によって発現された天然のまたは異種蛋白の分泌につ
いての系に使用できる。この発現系は合成蛋白のポスト
−または共−翻訳修飾に導く、分泌経路に至る異種蛋白
を標的とする。

シイ・アルビカンス・グルコアミラーゼ遺伝子のプロモ
ータおよびシグナル配列はともに第１図に同定されてい
る。第３図はシグナルペプチドを単独で示す。該シグナ
ルペプチドは分泌経路に至る異種蛋白の標的化を可能と
する。か（して、それは、それ自身のプロモータの制御
下または異種酵母プロモータの制御下において、組換体
蛋白の培養培地への分泌を可能とする系の発現に使用で
きる。

以下の実施例１０〜１３はカンジダ・アルビカンスのこ
の機能性ＤＮＡ配列の種々の使用、例えば、ニス・セレ
ビシェにおいて異種蛋白を発現しおよび分泌するための
シイ・アルビカンス・プロモータおよびシグナル配列の
使用、およびかる発現および分泌についての他の酵母プ
ロモータに関するシイ・アルビカンス・シグナル配列の
使用を示す。

これらの実施例においては一般に、異種蛋白またはペプ
チドのこのグルコアミラーゼ遺伝子のプロモータ／シグ
ナルペプチド領域へのインフレーム翻訳融合を可能とす
るイー・コリ・ベクターを組み立てる。次いで、異種遺
伝子に融合した、これらのハイブリッド遺伝子の組立体
（例えば、もう１つの酵母プロモータの制御下にあるグ
ルコアミラーゼ・プロモータおよびシグナルペプチド領
域またはシグナルペプチド）を好ましくは酵母細胞への
形質転換のためのイー・コリ／サツカロミセス・シャト
ルプラスミド・ベクターへ移入する。

レビシエにおける発現および分ｌ必 ／イ・アルビカンス・グルコアミラーゼ・プロモータお
よび／グナルベブチドを使用する発現系ｉ；！、ＨＩＶ
−１ウイルスのウィルス・エンベロープ糖蛋白ｇｐ１６
０を産生するのに使用されたことがある。ｇｐ１６０は
優れたエイズのワクチンおよび治療で使用するインサー
トの抗原の１つであり、ＨＩＶ感染の検出用診断剤とし
て用いることができる。

Ａ　イー・コリ・プラスミド・ベクターの組み立て イー・コリ・プラスミドｐＵｃ１３［ジエイ・ビエラら
（Ｊ、　Ｖｉｅｒａ　ｅｔ　ａｌ、ＨＩＶ−、ジーン（
Ｇｅｎｅ）　、±９　：　２５９−６８　（１９８２）
］を制限酵素Ａｃｃ＋およびＨＩｎｄ［［での共消化に
よって直線化した。該直線化したプラスミドを以下のご
とく組み立てたＴａｇｌないしＨｉ　ｎｄｌｌｌＤＮＡ
フラグメントに結んだ：　（分泌酵素、グルコアミラー
ゼをコード付けする）酵母カンジダ・アルビカンスＳＴ
Ａ遺伝子のプロモータおよびシグナルペプチドよりなる
Ｔａｇｌないしｒ’ｎｕ４ｔｌｌＤＮＡフラグメントを
クローン化ノ貞伝子から精製した。このＤ　Ｎ　Ａフラ
グメントのヌクレオチド配列を第１図に示す。

以下の配列 Ｐｎｕ４１１１　　　　　　Ｂｇｌｕ　　　　　　　ｌ
１ｉｎｄｌＣＧＣＴＣＣＡＧＡＴＣＴＡ ＣＧＡＧＧＴＣＴＡＧＡＴＴＣＧＡ を有する合成二本鎖オリコヌクレオチトを前記Ｔａｇｌ
ないしＦ　ｎ　ｕ　４１−（１フラグメノトに結んだ。

ゲル精製の後におけるこの結紮による産生物（Ｔａｇｌ
ないし）ｉｉｎｄＩＩＩＤＮＡフラグメント）それ自（
本をＡ　ｃ　ｃ　ｌ　／　Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ　ｊｌ
Ａ化ｐＵｃ１３ＤＮＡに結んだ。該結紮混合物を用いて
（、Ａ　Ｔ　ＣＣ３３６２！５またはＡＴＣＣ３９６０
７としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ンから入手可能な）イー・コリ株ＭＭ２９４を形質転換
した。

形質転換体をＬＢプラス・アンピッリンの１７．板上で
選択し、ＴａｇｌないしＦ　ｎ　ｕ　４　Ｉｔ　ｌフラ
グメントに相同な配列を含有する放射能標識プローブを
用いるコロニーフィルターハイブリダイゼーションによ
って分析した。適当な形質転換体からのプラスミドＤＮ
Ａを制限酵素およびヌクレオチド配列分析に付した。こ
れらの分析から得た選択プラスミドｐａｌ−１８（ｐＲ
ＩＴ１３０４６）は酵母ＳＴＡ遺伝子の全プロモータ領
域、ならびにグルコアミラーゼ蛋白の最初の２２個のＮ
Ｈ。

末端アミノ酸についてコード付けするＤＮＡ配列を含有
し、この分泌蛋白のシグナルペプチドを示す。シグナル
ペプチド切断部位に直ぐに続いて、唯一のＢｇｌＩＩ制
限切断部位が前記した合成オリゴヌクレオチドの一部と
して導入されている。

シグナルペプチドならびに外来性蛋白のもの双方のリー
ディングフレームに関するような外来性遺伝子のコーデ
ィング配列（またはその一部）のＢｇｌＩｌへのクロー
ニングは、該組立体が一旦酵母プラスミドに移入され、
酵母細胞に導入されると、グルコアミラーゼＳＴＡ遺伝
子プロモータを介してのハイブリッド遺伝子の発現およ
びグルコアミラーゼ・／グナル配列を介しての分を必経
路に至る外来性蛋白の標的化を可能とする。

ＨＩ　Ｖ突然変異体ＢＨＩＯのゲノムクローン［エル・
ラノトナーら（Ｌ、　Ｒａｔｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、Ｈ
ＩＶ−、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３１３　：　２
７７−２８４　（１９８５）］を制限酵素Ａｓｐ７１８
およびＸｂａｌて消化した。約２５５０塩基対のＡｓｐ
７１８ないしＸｂａｌＤＮＡフラグメントをゲル精製し
た。このフラグメントはアミノ酸Ｖａ１４２で出発する
エンベロープ糖蛋白ｇｐ１６０　（ｅｎｖ遺伝子）のコ
ーディング配列を含み、該ｅｎｖ遺伝子の翻訳停止コド
ン（ＴＡＡ）を越えて数百ヌクレオチド伸びる。このフ
ラグメントをマニアティスら（前掲）に従ってマングビ
ーンヌクレアーセで処理してそれを平滑末端とした。

前記したブララスミドｐｌＴ−１８（ｐＲＩＴ１３０４
６）を制限酵素ＢｇｌＩ［での消化によって直線化し、
突出５°末端を満たすためにデオキジヌクレオチドトリ
フオスフェート（ｄＮＴＰ）の存在においてクレノーポ
リメラーゼｌで処理した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて
該フラグメントおよびプラスミドを結んだ。イー・コリ
細胞を該結紮混合物で形質転換した。形質転換体をコロ
ニーフィルターハイブリダイゼーションによって分析し
た。選択した形質転換体から抽出したプラスミドＤＮＡ
について制限酵素およびＤＮＡ配列分析を行った。

これらの分析により、プラスミドｐＴＩ−１８／ｇｐ１
６０　（ｐＲＩＴ１３０４７）を含有する形質転換体の
選択が可能となった。このプラスミドは、ＳＴＡ遺伝子
シグナル配列にイン・フレームにて融合し、かつ該ＳＴ
Ａ遺伝子プロモータ領域に先行された、前記にて定義し
たＨＩＶｅｎｖ遺伝子フラグメントを含有する。該シグ
ナル配列、コーディング領域と該ｅｎｖ遺伝子コーディ
ング配列間の関連結合のＤＮＡおよびアミノ酸配列を以
下に示す。

ＧｅＣＧＣＴ　　　　　ＣＣＡ　　　　ＧＴＡ　　　　
　ＣＣＴＡｌａ　　　　　Ａｌａ　　　　　Ｐｒｏ　　
　　Ｖａｌ　　　　　Ｐｒ。

グルコアミラーゼシグナルＢｇｌＩ［［／Ａｓｐ７１８
結合ペプチド切断部位 プラスミドｐＴＩ−１８／ｇｐ１６０　（ｐＲＩＴ１３
０４７）の関連部分を以下の方法で酵母ベクターに移入
した。該プラスミドを制限酵素ｘｂａｌおよびＥｓｐＩ
で消化した。約２９５０塩基対のＸｂａｌないしＥｓｐ
ｌＤＮ、Ａフラグメントをゲル精製した。（Ｘｂａ部位
で出発し、Ｅｓｐ１部位に向けて進行する）このフラグ
メントトは以下の要素を含有するニブラスミドｐＵＣｌ
　３のポリリンカー配列に由来する数塩基対；ＳＴＡ遺
伝子プロモータを表す３５５塩基対；グルコアミラーゼ
蛋白のシグナルペプチドについてコード付けする６６塩
基対；（Ｖａ１４２で出発し、その天然のＴＡＡ翻訳停
止コドンで終了する）前記したｅｎｖ遺伝子のコーディ
ング配列、続いての非翻訳３°フランキング配列の７０
塩基対。

このＤＮＡフラグメントを５′突出末端を満たすために
ｄＮＴＰの存在においてタレノーポリメラーゼ！酵素で
処理した。予め５ａｌｌで消化し、クレノーポリメラー
ゼ■およびｄＮＴＰで処理したｅｎｖ遺伝子についての
発現／分泌カセットを除き、第２図に示した成分を含有
する酵母ベクターに該フラグメントを結んだ。該結紮混
合物をイー・コリに形質転換した。アンピシリン耐性形
質転換体をコロニーフィルターハイブリダイゼーション
によってスクリーニングした。

選択した形質転換体から抽出したプラスミドＤＮＡを制
限酵素マツピングおよびＤＮＡ配列分析によって分析し
た。この分析から得られたブラスミ　ドｐＱＵＧ３／ｇ
ｐ１６０　　（ｐＲＩＴ１３０４９）はすぐ後に２μｍ
プラスミド遺伝子Ｄ［エイ・スットンら（Ａ、　５ｕｔ
ｔｏｎ　ｅｔ　ａｔ、ＨＩＶ−、モレキユラー・アンド
・セリュラー・バイオロジー（Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、　）、５　：　２７００−２７８０　（１９
８５）コに由来する酵母転写停止配列が続（ｅｎｖ遺伝
子についての発現／分泌カセットを含有し、それを、第
２図に図式化する。プラスミドｐＱＵＧ３／ｇｐ　１６
０　（ｐＲＩＴ　ｌ　３０４９）を形質転換によってニ
ス拳セレビシェ株（遺伝子型：Ｍａ　ｔαｕｒａ３　１
ｅｕ２　　ａｄｅｌ　　ｇｌｎｌ）に導入した。酵母形
質転換体をグルタミンの不存在において増殖するそれら
の能力について選択した。

プラスミドｐＱＵＧ３／ｇｐ　１６０　（ｐＲｌＴ１３
０４９）で形質転換したニス・セレビシェ株（遺伝子型
＋Ｍａｔα　ｕｒａ３　１ｅｕ２ａｄｅｌ　　ｇｌｎｌ
）の酵母細胞を選択培地中で増殖させた。細胞を後期対
数期または前期静止期に収穫し、りん酸緩衝化セーライ
ン（ＰＢＳ）緩衝液（２５ｍＭ　ＮａＰＯ，，１５０ｍ
ＭＮａＣＱ、１）Ｈ７，４）中で洗浄し、１：ＩＯない
し１：２０の元の培養容量のＰＢＳおよび１ｍＭフェニ
ルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ、シグマ（
Ｓｉｇｍａ））中に懸濁した。

ガラスピーズの存在下で激しく攪拌することによって細
胞を溶解した。破壊した細胞懸濁液を低速度（１０００
ｘｇ、１０°、４°Ｃ）で遠心して非破壊細胞および細
胞デブリを除去した。上澄みを保持し、これは粗製細胞
抽出物（Ｃ）を表す。

画分Ｃの一部を４°Ｃにて１時間３００００ｘｇで遠心
し、粗製膜ペレソ）（ＰＩ−３０）および可溶性細胞質
画分を表す上澄み（Ｓｔ−３０）を得た。画分Ｐｉ−３
０を、１ｍＭＰＭｓＦ緩衝液を含むＰＢＳ中に懸濁し、
洗剤最終濃度１％のトリトンｘ−ｔｏｏで抽出した。該
洗剤抽出２１３０画分を４°Ｃ，３００００ｘｇにて１
時間遠心した。上澄み画分（Ｓ２−３０）を保持した。

加えて、画分ＣおよびＳｌ−３０の一部を１％トリリド
ンｘ−ｔｏｏで抽出した。

この細胞分画法からの種々の試料をウィルスエンベロー
プ糖蛋白に方向付けられる抗体に対して免疫学的に反応
性の物質の存在についてアッセイを行った。この分析に
おいては、ｇｐ蛋白の部分、例えば外部ｇｐ１２０糖蛋
白および／またはその内部ｇｐ４１部位に方向付けられ
る種々の商業的に入手可能な単クローンおよび多クロー
ン抗体を利用し、種々のエライザ（ＥＬＩＳＡ）サンド
イワナテスト法を用いた。いくつかのアンセイにおいて
は、エイズ患者からのヒト血清も用いた。抗ｇｐ１２０
ならびに抗ｇｐ４１抗体双方と反応する物質が洗剤抽出
にのみによる画分Ｃ（粗製細胞抽出物）中に検出され、
これはテストした酵母株によるｅｎｖ遺伝子の発現およ
びｇｐ１６０の合成を示し、合成蛋白と細胞脂質および
／または膜との連合を示唆する。この交差反応性物質の
約８０％は洗剤抽出の可溶化膜両分（Ｓｌ−３０）中に
回収され、この物質と細胞脂質および／または膜との連
合が確認される。抗−ｇｐ１２０ならびに抗＝ｇｐ４１
両抗体に対するこの物質の反応性は、すべてではないが
そのほとんどが、ブロセ、シングされていないｇｐ１６
０前駆体蛋白の形態であることを示唆する。免疫プロッ
ティング法によるこの物質の分析によって、この仮説が
確認される。

Ｄ、ＨＩＶｇｐ１６０の粗製細抽出物中における検出 ＨＩＶ−ｅｎｖ抗原部位の存在について画分Ｓ２−３０
を捕獲エライザ（ＥＬＩＳＡ）法によって分析した。Ｈ
ＩＶｇｐ４１の合成ペプチド（バイオクロム（Ｂｉｏｃ
ｈｒｏｍ　＃　Ｄ　７３２３　）に対するヒツジ抗体を
ＰＢＳ　　５μｇ／肩ｇの濃度でＮＵＮＣ免疫プ免疫プ
レートラマイクロタイタブレートさせ；抗体５０μ／ｘ
Ｑを４℃で一部インキユベートした。プレートを、ＰＢ
Ｓおよび０．１％トウィーン２０で各ウェルの内容物の
６倍置換を行うことによって洗浄し、３７°Ｃで飽和緩
衝液１００μＱ　　（ＰＢＳ＋０．１％トウィーン＋１
％ウシ血清アルブミン＋４％新生子ウシ血清）とともに
１時間インキュベートした。次いで、該プレートを前記
のごと（洗浄し、個々のウェルをＰＢＳ＋１％トリトン
中の３２−３０の連続的希釈物とともにインキュベート
した。抗原５０μｇを室温で２時間インキュベートした
。該プレートを前記のごとく洗浄し、ＨＴＶｇｐ１２０
　（デュポン＃９２８４／７０５４）に対する単クロー
ン抗体とともにインキュベートした。飽和緩衝液中抗体
１μＱ／ｍＱの濃度を用いた。５０μＱウエルを３７°
Ｃで１時間インキュベートした。プレートを前記のごと
く洗浄し、ビオチン標識抗−マウス免疫グロブリン試薬
（アメルスハム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）　ＲＰ　Ｎ　Ｉ　
Ｏ２１）およびストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖ
ｉｄｉｎ）　−ベルオキシターゼ複合体（アメルスハム
（Ａｍｅｒｓｈａｍ）　ＲＰ　Ｎ　１０Ｓｌ）を製造業
者の指示通りに用いて単りローン抗−ＨＩＶｇｐ１２０
抗体の結合を明らかとした。得られた力価測定曲線は）
（ＩＶｅｎｖ抗原部位の存在を示した。

Ｅ、ト１１Ｖｇｌ）１６０収率の最適化プラスミドｐＱ
Ｕ６３／ｇｐ　ｌ　６０　（ｐＲｌＴ１３０４９）を含
有するニス・セレビシェ株（遺伝子型：Ｍａｔα　ｕｒ
ａ３　１ｅｕ２ａｄｅｌｌ　　ｇｌｎｌ）の３０°Ｃに
維持した標準的な攪拌タンク容器中での２０〜３０時間
継続するバッチ発酵によって蛋白ｇｐ１６０を産生じた
。

豊富培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％ガラク
トース−ＹＥＰ）を塩基添加によってｐＨ５，０に維持
した。接種物（１０％ｖ　／　ｖ　）を３０°ＣにてＹ
ＥＰおよび２％グルコース上で２４時間増殖させた。

酵母の増殖は速く、６５０ｎｍにおけるその光学密度（
０，Ｄ、、、、ＨＩＶ−に関連して測定した。指数期間
の最高倍加は約３時間であった。

指数増殖期の間、ｇｐ１６０は急速に合成され、前記し
た捕獲エライザ（ＥＬＩＳＡ）法を用いて約１２時間の
増殖の後に測定した。合成は約２０時間において６００
μｇ／ｊ！１２発酵ブロスの最高に達し、その際ｇｐ１
６０の急速な減少が検出された。

ｇｐ１６０ａ度減少の開始は基質ガラクトースの枯渇に
一致する。ガラクトース代謝はＣｏ１のマススペクトル
測定（各２０秒間）およびファーメンタ−・オフ−ガス
における酸素濃度によって間接的に追跡した。ガラクト
ースの枯渇は約２０時間のファーメンタ−・オフ−ガス
における％ＣＯ３の急速な減少に関連する。

かくして、ファーメンタ−中での％Ｃｏ、の減少の直前
における培養物の収穫はニス・セレビシェにおけるｇｐ
１６０の良好な収率を得るのにきわめて重大である。

Ｆ、ｇｐ１６０の精製およびミセル調製１５０ｍＭ　Ｎ
ａＣＱ　、１ｍＭｚチＬ／７ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ
）および１ｍＭ　ＰＭＳＦ　（緩衝ｉ＆　Ａ　）を含有
するＨ７．０の２５ｍＭＩＪン酸塩よりなる１容量の緩
衝液の存在下で、形質転換酵母細胞の１容量をディノミ
ル（Ｄｙｂｏｍｉｌ）装置中で破砕した。懸濁液を１１
００Ｏｘにて１０分間遠心し、非破壊細胞および細胞デ
ブリよりなるベレットを捨てた。一方、上澄みを３００
０Ｏｘｇで３０分間遠心し、ベレットを元の容量の緩衝
ＭＡ中、１％トリトンｘ−ｔｏｏで抽出した。３０００
Ｏｘｇ（３０分）での遠心の後、ｇｐ１６０含有上澄み
を２０％ポリエチレングリコール−４００で処理してｇ
ｐｌｓｏを沈澱させた。ＰＥＧベレットを、１５０ｍＭ
ＮａＣ１２および１％トリトンｘ−ｔｏｏを含有し、１
．５ＭＣ５Ｃ（２および４ＭグアニジンＨＣ’Ｑを補足
した５０ｍＭ）リス緩衝液ｐＨ７，２中に溶解した。こ
の溶液をチタニウム５０，２０−ター中、４５０００ｒ
ｐｍで６５時間超遠心した。

（前記した捕獲エライサ（ＥＬＩＳＡ）法で検出される
）ｇｐ１６Ｑ含有画分をプールし、ＰＢＳに対して透析
濾過し、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）　５Ｍ−５０限外膜
上で濃縮した。次いで、透析濾過したｇｐ１６０画分を
１０〜４０％ショ糖グラジェント上に重ね、４００００
ｒｐｍにて一晩、５Ｗ４１ｏ−ター中で遠心した。トリ
トン処理の後エライザ（ＥＬＩＳＡ）陽性となるミセル
含有画分をプールし、免疫化実験で用いた。

本発明のグルコアミラーゼ発現／分泌系を経由して得ら
れるこの酵母合成ＨＩＶ−ｇｐ１６０エンベロープ糖蛋
白はワクチンの候補としての能力を有する。本発現系に
よって可能となったポストまたは共−修飾は、蛋白の三
次構造を形成し、それは一方において関連免疫応答を誘
導し得る。

というのは、抗体の重要な部分が配座エピトープに方向
化されるからである。ｇｐ　１６０における高いシステ
ィン含量および°可能なＮ−結合グリコシル化部位の頻
繁な生起は、ジスルフィド架橋およびグリコジル化によ
る分子の抗原特性のさらなる修飾を示唆する。かくして
、グルコアミラーゼシグナルペプチドを用いる発現系に
おけるｇｐ１６０の分泌経路に向けての標的化は、構造
的かつ抗原性的に天然のエンベロープ糖蛋白スパイクに
かなり類縁するように見える分子を生成する。本発明の
発現系を介して得られるｅｎｖ−ｇｐ１６０糖蛋白の構
造付特徴は、酵母［例えば、ビイ・ジエイ・バールら（
Ｐ、Ｊ、　Ｂａｒｒ　ｅｔ　ａｔ、ＨＩＶ−、前掲参照
］における、またはイー・コリ［例えば、ニス・デイ・
プットニイら（Ｓ、　Ｄ、　　Ｐｕｔｎｅｙ　ｅｔ　ａ
ｌ、ＨＩＶ−、サイエンス（Ｓｃ　１ｅｎｃｅ）、２３
４　：１３９２−９６　（１９８６）参照］における非
分泌系を介して発現されたエンベロープ蛋白を欠く。

例えば、本発現系においては、酵母合成ｇｐ１６０はブ
ロセッシナグされないままそのｇｐ１６０およびｇｐ４
１糖蛋白成分となる。かくして、両蛋白は膜と結合した
ままである。これは、ｇｐ４１と８９１２０間の切断の
結果、２つの分子が解離し、はとんどのｇｐ１２０分子
か培地上澄み中に分泌されるという哺乳動物細胞で報告
されている状況［例えば、エム・ビイ・キドニイら（Ｍ
、　Ｐ。

Ｋｉｄｎｅｙ　ｅｔ　１１１．）　、バイオテクノロジ
ー（Ｂｉ。

ｔｅｃｎｏｌｏｇｙ）、４　ニア９０−７９５　（１９
８６）］とは異なる。ｇｐ４１の疎水性膜内外領域を介
しての細胞膜に対する結合は、ミセルのごとき粒子構造
への取り込み、脂質への結合によるリポソームへの取り
込み、または洗剤キイール（Ｑｕｉｌ）　Ａへの結合に
よる免疫刺激複合体（Ｉ　ＳＣ０Ｍ５）への取り込みに
役に立ち得る。これにより、リポソームおよびｌＳＣ０
Ｍ５のアジュバント特性によって、ならびにウィルス表
面に類似するこれらの構造の表面における配位提示を可
能とすることによって、分子の免疫原性を増加させるこ
とができる。

グルコアミラーゼシグナル配列を用いてＴＧＦα分泌に
ついてのベクターを組み立てるのに用いるプラスミドは
、高コピー酵母シャトルベクターｐＹｓＫ１ｏ：２　Ｃ
ローゼンベルグら（Ｒｏｓｃｎｂｅｒｇｅｔ　　ａｌ、
ＨＩＶ−、シエネテソイク・エンンニアリング（Ｇｅｎ
ｅｔｉｃ　Ｅｎｇｅｎｅｅｒｉｎｇ）、８°１Ｓｌ（１
９８６）］をベースとする。すべてのものは、選択マー
カーを提供する酵母ｔｒｐｌ遺伝子の８２３ｂｐのＥｃ
ｏＲＩ−Ｐｓ　ｔ　Ｉフラグメント［ランバーおよびカ
ーボン（Ｔｓｕｍｐｅｒ　ａｎｄ　Ｃａｒｂｏｎ）　、
ジーン（Ｇｅｎｅ）、１０　：　１５７　（１９８０）
］　、酵母における複製開始点を提供する酵母２−ミク
ロン環の２０ｋｂ　　ＥｃｏＲＩ−Ｐｓ　ｔ　Ｉフラグ
メント［ハートレイおよびドナルドソン（Ｉｌａｒｔｌ
ｅｙ　ａｎｄ　Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ）、ネイチ＋　−（
Ｎａｔｕｒｅ）、２８６　：　８６０　（１９８０）］
、イー・コリにおける複製および選択を提供するｐＢＲ
３２２の一部［「クローニング・ベクターズ（Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒｓ）Ｊ　、ボウエルズ（Ｐｏｕｗ
ｅｌｓ）、エンガー（Ｅｎｇｅｒ）、バルク（Ｖａｌｋ
）編（１９８５）］およびｐＢＲ３２２のＨｉ　ｎｄＩ
ＩＩおよびＢａｍＨＩ部位間に仲人された酵母プロモー
タターミネータ・モジュールを含有する。

ＢａｍＨｌおよびＰｖｕｌ１間のｐＢ３２２配列は欠失
されている。

これらの組み立てにおいて使用するプロモータは、ｐＹ
ｓＫ１２からのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲ１フラグメント［
プツトら（Ｂｕｔｔ　ｅｔ　ａｌ、ＨＩＶ−、プロシー
ディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、　）　ＵＳＡ、旦↓：３３３２　（１９８４）；ロ
ーゼンベルグら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｔ、　
）、前掲；ゴルフ７ら（Ｇｏｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、Ｈ
ＩＶ−、ジーン（Ｇｅｎｅ）、４８：１３（１９８６）
］　として由来するＣＵＰＩの４３１ｂｐＢａｍＨＩ−
Ｒｓａｌフラグメント［カリンら（Ｋａｒｉｎ　　ｅｔ
　ａｌ、ＨＩＶ−、ビイ・エヌ・エイ・ニス−（ＰＮ八
へ）ＵＳＡ、ｌ１：　３３７　（１９８４）］またはプ
ラスミドｐＹＳＫ　ｌ　３からのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲ
１フラグメント［ローゼンベルグら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒ
ｇａｔ　ａｌ、ＨＩＶ−、前掲：ボルマンら（Ｇｏｒｍ
ａｎ　ｅｔ　ａｔ、ＨＩＶ−、前掲］として由来する１
、１ｋｂＴＤＨ３プロモ一タ配列［ホランドおよびホラ
ンド（Ｈｏｌｌａｎｄ　ａｎｄＨｏｌｌａｎｄ）、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　
Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、ＨＩＶ−、２５５　：　２５９
６（１９８０）］のいずれかである。転写ターミネータ
はＣＹＣｌ遺伝子の３６１ｂｐＫｐｎｌ　−ＨｌｎｄＩ
ＩＩ［スミスら（Ｓｍｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ、ＨＩＶ−、
セル（Ｃｅｌｌ）、１旦ニア５３　（１９７９）］であ
る。

配列５’　　ＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧＣＣＡＴＧＧＣＣ
ＡＧＴＣＧＡＣＧＴＡＧＴＴＡＡＧＴＡＧＧＴＡＣＣ・
３゛　を有する合成リンカ−が、プロモータおよびＣＹ
Ｓ　ｌ停止フラグメント間の領域に存在する。この合成
配列は、すべての３つのリーディングフレームにおける
翻訳停止コドンの上流の唯一の制限部位Ｘｈｏｌ、ＮＣ
ＯＩおよび５ａｌｌを含有する。

Ｂ、ｐＹｓＫ１４０およびｐＹｓＫ１４２の組み立て グルコアミラーゼ遺伝子のシグナル切断の部位を、実施
例７における分泌されたグルコアミラーゼのアミ／末端
アミノ酸配列決定によって決定した。グルコアミラーゼ
遺伝子コーディング領域の５°末端のＤＮＡ配列および
対応するアミノ酸配列をプロセッシングの部位と共に第
３図に示す。

シグナル配列に対応する合成オリゴヌクレオチド配列お
よび制限酵素部位を含有するフランキングヌクレオチド
を合成した。この配列を第４図に示す。ベース上の星印
は制限エンドヌクレアーゼ切断部位を導入するようにさ
れたチャージ（ｃｈａｒｇｅ）を示す。シグナル配列は
最後の星印の後で終了する。ＸｋｏｌおよびＮｃｏｌで
切断した前記のベースとなるベクターにこの二重標準フ
ラグメントを挿入してｐＹＳＫ　（ＣＵＰ　ｌプロモー
タ）およびｐＹＳＫ　１４２　（ＴＤＨ３プロモータ）
を得た。

現合成グルコアミラーゼシグナル配列は３′末端にアミ
ノ酸Ａｓｎ　　Ａｌａ　　Ａｌａ　　Ｐｒｏ　　につい
てのコドンを含有してプロセッシング部位を提供する（
第３図参照）。切断部位の３°側における２個のアミノ
酸ＡｌａおよびＰｒｏの存在は適当な切断にとって不可
欠であろう。しかしながら、この結果、本シグナル配列
の利用によって分泌されたいずれの蛋白の５″末端にお
いても２個の過剰アミノ酸が存在する。Ａｓｎ　　Ａｌ
ａコドンの後で直接融合することを可能とするプラスミ
ドが組み立てられている。これらのベクターで作られた
融合蛋白の５′末端における分泌およびプロセッシング
は本シグナル配列と同程度に有用であることが予想され
る。

Ｃ，ｐＹｓＫ１ＳｌおよびｐＹｓＫ１５２の組み立て 成熟ヒト形質転換増殖因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ
　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）　（Ｔ　Ｇ　Ｆ　−ａ
　）のｃＤＮＡ配列に対応する合成オリゴヌクレオチド
［デルンチクら（Ｄｅｒｙｎｃｋ　ｅｔ　ａｌ、ＨＩＶ
−、セル（Ｃｅｌｌ）、３８：２８７　（１９８４）］
プラス５°および３″末端における付加塩基を合成し、
４の保存的塩基変化を起こして制限エンドヌクレアーゼ
部位を提供した。

この配列を第５図に示す。ＴＧＦ−α配列のＮｃｏＩな
いし５ａｌｔ部分をＮｃｏｌおよびＳａｌ［切断のｐＹ
ｓＫ１４０およびｐＹｓＫ１４２に挿入して、各々、ｐ
ＹｓＫ１ＳｌおよびｐＹｓＫ’１５２を得た。得られた
組立体はグルコアミラーゼシグナルの出発点における開
始ＡＴＧコドン、およびＴＧＦ−αペプチドの出発点に
おけるインフレームＡＴＧ（Ｍｅｔ）コドンを提供する
。

Ｄ、酵母培養におけるＴＧＦ−αの発現および分泌 標準的な技術［ジーマンら（Ｓｃｈｅｒｍａｎ　ｅｔ　
ａｌ、ＨＩＶ−、酵母遺伝学における方法（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｉｎ　ＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓ）　、コール
ド番スプリング修ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ）、（１９８６）］を用い、プラスミドＤ
ＮＡ　（２−１０μｇ／ｘｉ２）を使用してニス・セレ
ビシェ株Ｆ７６２　（Ｍａ　ｔａ、ｔ　ｒｐｌ　　１、
ｕｒａ３　５２）を形質転換し、トリプトファン原栄養
性について選択した。株Ｆ７６２はメリーランド州、バ
ルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）、ジ目ンズ・ホプキン
ス・−メディカル・スクール（Ｊｏｈｎｓ　Ｈｏｐｋｉ
ｎｓ　Ｍｅｄｉｃａｌ　５ｃｈｏｏｌ）、分子生物学お
よび遺伝学部のフィリップ・ハンター（Ｐｈｉｌｌｉｐ
Ｈｕｎｔｅｒ）から入手した。選択した形質転換体の培
養物を、２％グルコースおよびウラシル（２０μｇ／ｕ
Ｑ＞を含有するＹＮＢ　（デイフコ（Ｄｉｒｃｏ））中
で増殖させた。ＣＵＰｌプロモータを利用するプラスミ
ドについては、１００マイクロモルの硫酸銅を含ませた
。後期対数期および静止期に培養物を収穫した。細胞を
回転し、培地および細胞を共に保持した。細胞ペレット
を洗浄し、０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）中、ガ
ラスピーズで破壊し、次いで懸濁液を５０００ｘｇで遠
心してガラスピースおよび細胞デブリを除去した。次い
で、分子ｆｆ１２０００カツトオフのチュービング（ｔ
ｕｂｉｎｇ）を用い、可溶性細胞抽出物および培養物流
動体を２％酢酸に対して一晩透析した。

Ｅ、ＴＧＦ−αの生物学的アッセイ 透析した細胞溶解物および培養物流動体を３種の方法に
よってＴＧＦ−α活性について分析した。

（１）　Ｔ　Ｇ　Ｆ　−ａ　／　Ｅ　Ｇ　Ｆラジオレセ
プターアッセイ １０％ｃｏ雰囲気中、３７°Ｃにて、１０％ＦＣ８を含
有するＤＭＥＭ中の２４−ウェル組織培養皿で、Ａ４３
１Ａヒト類表皮癌細胞（１ｘｌＯ’）を−晩平板培養し
た。４℃にて、結合緩衝液（ハンクスの平衡塩溶液、１
ｍｇ／ＲＱウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびｌＯｍ
ＭＨｅｐｅｓ。

ｐＨ７，４）で細胞を３回洗浄した。ｌ　ｎｍ”ＪＴＧ
Ｆ−αおよびテストすべき種々の濃度の試料または表皮
発育因子（ＥＧＦ）標準物を含有する結合緩衝液（１０
０μＱ）を同時に添加し、４０Ｃで１時間インキコベー
トした。１０００倍過剰のＥＧＦて冷競合（ｃｏｌｄ　
ｃｏｍｐｅｔｉｅｉｏｎ）を行った。

クロラミンＴ法を用いてＴＧＦ−αをヨウ素標識化した
。ＢＳＡを含まない水冷結合緩衝液で細胞を洗浄した。

３７℃にて、０．５ＭＮａＱ）ｌの０．５酎で細胞を３
０分間可溶化した。ガンマカウンターを用い、結合した
放射能を測定した。

（２）器壁独立性増殖アッセイ １０％子ウシ血清（Ｆｅ２）ｋよび０．５％バクトーア
ガール（デイフコ（Ｄｉｒｃｏ））を含有する最小必須
培地（ＤＭＥＭ）０．８ｘＱ中の正常なラット腎臓腺維
芽細胞（ＮＫＲ−４９Ｆ）インジケータ細胞（５０００
）を凍結乾燥した実験試料の一部と混合し、次いで４ｍ
ＭＨＣＣおよび２ｍｇ／１１２ＢｓＡを含有する緩衝液
に溶解した。３５ｍｍ組織培養皿（コスタ−（Ｃｏｓｔ
ｅｒ）、ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒ　ｉｄｇｅ）、マサ
チューセノツ州）中の１０％ＦＣ３および０．６％寒天
を含有するＤＭＥＭの０．８ＲＱボトム層に該細胞を加
えた。プレートを３７°Ｃ１１０％ＣＯ雰囲気中で８〜
１０日間インキニベートシた。形成サレタコロニーをｐ
−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレットで一晩染色
し、バラシュおよびロム（Ｂａｕｓｃｈ　ａｎｄ　Ｌｏ
ｍｂ）イミメージ分析にて計数した。直径６０μｍ以上
のコロニーを検出するようにシステムをプログラムした
。

（３）放射性同位元素標識免疫測定 製造業者の指示に従い、商業的に人手可能なＴＧＦ−α
ＲＩＡキット（バイオテープ（Ｂｉｏｔａｐｅ））を用
いてアッセイを行った。

Ｆ、酵母中で産生されたＴＧＦ−αの活性静止期に達し
た１２時間後に収穫した振盪フラスコ培養物中のプラス
ミドｐＹｓＫ１ＳｌおよびｐＹｓＫ１５２によって産生
されたＴＧＦ−αの活性を測定した。培地中で得られた
最大収率はＯＤ、、。−２，０で約２次９／リツトルで
あった。合計活性の９５％以上が細胞抽出物と比較して
培地中で見い出された。

第１表 見積ったＴＧＦ−α活性（μｇ／１０”細胞）プラスミ
ド　　　　培地　　　　　細胞抽出物ＥＧＦ競合結合ア
ッセイ： ｐＹｓＫ１Ｓｌ　　２，８７　　　　０．１４３ｐＹｓ
Ｋ１５２　　２．７０　　　　０．１３５ソフト寒天ア
ッセイ： ｐＹｓＫ１Ｓｌ　　０．７１８　　　０．００６ｐＹｓ
Ｋ１５２　　０．６１７　　　０．００５放射性同位元
素標識免疫測定 ｐＹｓＫ１Ｓｌ　　２．３１ ｐｙｓｘ１５２　　２．２４ Ｇ、ＴＧ凡二生凶慧層 発酵ブロスを遠心して細胞を除去し、次いで濾過した。

氷酢酸を用いて濾液のｐＨを２．７に調整し、次いで、
ポンプを用い、２００　Ｎ（１７分の波速にて、０．１
％トリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）に平衡化したワット
マン（Ｔｈａｔｍａｎ）パルティジル（Ｐａｒｔ　ｉｓ
目）ＯＤＳ−３カラム（カラム寸法：４８ｘ　６５０　
ｒｎｒｎｓ　４０　６０　ｕ　ｍ充填）通した。負荷の
後、２カラム容量の各０．１％ＴＦＡ、および５％ｉ−
プロパツール１０．１％ＴＦＡでカラムを洗浄した。４
０％ｉ０％ミープロパツール１１％ＴＦＥで粗製ＴＧＦ
−αを溶出した。

溶出物（４Ｑ）を真空中で濃縮してイソプロパツールを
除去し、凍結乾燥した。粉末（約６００ｍｇ）を１．０
Ｍ酢酸３１１Ｑに再溶解し、次いで遠心した。上澄みを
バイオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ）　Ｐ　−１０カラム（２，
６ｘ　１２０ｃｍ）に負荷し、４００μＱ／分にて１．
０Ｍ酢酸で溶出した。５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によっ
て画分を分析した。ＴＧＦ−αを含有する画分を一緒に
プールし、凍結乾燥した。

９０分におけるグラジェント１６％アセトニトリル１０
．０５％ＴＦＡないし２６％アセトニトリル１０．０５
％ＴＦＡを用い、粉末（１４ｍｇ）をＶｙｄａｃＣ＋ａ
カラム（１０ｍｍｘ２５０ｍｍ）に負荷した。画分を収
集し、ＨＰＬＣによって分折した。回収は約３０％の合
計活性約であった。

蛋白を含有する３つのプールを作成し、ＥＧＦ／ＴＧＦ
ラジオレセプターアッセイ、アミノ酸組成決定、および
配列決定法に付した。

すべての３種の蛋白は生物学的に活性であり、Ｎ−末端
における鎖長が異なることが判明した。

配列は、ＴＧＡ−ａ　（５０％）　、Ｍｅ　ｔ−ＴＧＦ
α（１８％）およびＧｌｙ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−ＴＧＦ−
α（２２％）のものであった。アミノ酸組成決定および
セレプター結合アッセイの比較により、各々は１．０Ｅ
ＧＦ当量の特異的活性を有することが示された。

実施例１２−ＩＬＩ−βおよびＩ　Ｌ　ｌ−ａの発現お
よび分泌 ヒトｔｔ、ｔ−βはプロセッシングされ、かつ成熟し、
グルコシル化されていないバイオ活性な１７Ｋｄカルボ
キシル−末端フラグメントとして分泌される、大きな（
３１Ｋｄ）前駆体ポリペプチドとして種々の細胞型にお
いて発現される。ＩＬｌ−βは正常に分泌されるが、そ
れはシグナルペプチドを欠（。

実施例１１と同様の方法で、プラスミドｐＹＳＫ１４０
およびｐＹｓＫ１４２における誘導可能なＣＵＰＩまた
は構成的ＴＤＨ３プロモータいずれかと組合せた、シイ
・アルビカンスのクローン化グルコアミラーゼ遺伝子に
由来するシグナル配列を用いてニス・セレビシェにおけ
るヒト組換体インターリューキン−１βの合成および分
泌を定方向化した。（クレノーポリメラーゼで平滑末端
としたＢａｎ１フラグメントに担持された）ＩＬｌ−β
の真性成熟形についてコード付けするｃＤＮＡを、実施
例１１に記載したごとくに、ｐＹｓＫ１４０およびｐＹ
ｓＫ１４２の唯一のＳｍａ１部位（第４図参照）のグル
コアミラーゼングナル配列に融合し、酵母に形質転換し
た。

各組立体は生物学的に活性なＩＬＩ−βの効果的な分泌
を指示する。発現された蛋白の９５％以上が細胞外であ
り、ウェスタンプロット法によって測定されるごと＜　
２ｍｇ／Ｑ以上の蓄積レベルとなる。ＴＤＨ３グルコア
ミラーゼシグナル配列ＩＬＩ−β発現カセットの単一コ
ピーをニス・セレビシェ株の染色体ＶのＵＲＡ３座にお
けるゲノムへ取り込んだ結果、非選択的条件下（豊富培
地）、振盪フラスコ中で静止期まで増殖させた場合に約
６ｍｇ／Ｑの産生物を分泌する株（ＧＬ４６：ＭＡＴβ
　Ｉｅｕ２−３．２−１１２　　ｔｒｐＨａｄｅ２−１
　　ｈｉｓ３−１１．３−１５ｃａｎｌ　　１００　　
ｕｒａ３　１ＬＩ−β）が得られる。得られた細胞外産
生物の量は、多重取り込みを含有する株を組み立ておよ
び／または生育バッチ培養で細胞を増殖させることによ
って増加させることができる。

酵母におけるＩＬＩ−βの分泌形は約等モル量の２種の
蛋白種（１７Ｋｄおよび２２Ｋｄ）よりなる。トウニカ
マイシン（ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ）の存在および非存
在で行った瞬間標識追跡実験、続いてのイムノブレシピ
テーションにより、該２２Ｋｄ［はグリコジル化形態の
分子であることが明らかとなった。可能なＮ一連結グリ
コシル化部位はアミノ末端近くに位置する。２種の細胞
外形態（グリコジル化および非グリコジル化）の様相に
ついての理由は明らかでない。動的データは、新しく分
泌された産生物は、主として、蛋白分解切断またはエン
ドグリフジダーゼいずれかを介して１７Ｋｄ形態まで変
換され得る２２Ｋｄのグリコジル化種よりなる。シグナ
ル配列の無いＣＵＰＩ誘導可能プロモータに対するＩＬ
Ｉβ配列の直接融合の結果、低相培養の培地中で蓄積す
る１７Ｋｄ細胞外形態、プラス単一の１７Ｋｄ細胞外種
が発現される。

精製された細胞外ＩＬＩ−βは一次シグナルペブチド切
断部位ならびに酵母において認識され得るいずれの二次
部位をも決定するために現在配列決定が行われている。

実施例１１に概略を記載した方法と同様の方法を用い、
シイ・アルビカンスのクローン化グルコアミラーゼ遺伝
子に由来するシグナル配列を用いて、ニス・セレビシェ
におけるヒト組換体インターリューキン−１αの合成お
よび分泌を方向付けた。

実施例１３−ビイ・ペルトウ／ストキシンＳｌ百日咳に
対するワクチンとして用いられ得る有望な保護抗原であ
るペルトウシス・トキシンは５種の異なるサブユニット
よりなるヘキサマー蛋白である。サブユニットの１つ（
Ｓｌ）は、蛋白の毒性かそれに起因する酵素活性を発現
する。しかしながら、他のサブユニ、トがないと、Ｓｌ
は毒性活性を欠く。Ｓｌ遺伝子の発現および組換体産生
物の分泌は、他のベルトウンストキンンサブユニノトか
らの汚染な（して、本サブユニ、トの産生および精製を
容易とする。

ベルトウシストキシンのＳｌサブユニットのシストロン
は、分泌グルコアミラーゼで融合蛋白として、またはグ
ルコアミラーゼシグナルペプチドを用いて非融合である
がブロモ・７シングされた蛋白いずれかとしてニス・セ
レビシェにおいて発現された。

Ａ　プラスミド組立体およびニス・セレビシェ・クロー
ン Ｓｌの７グナルペプチド切断部位に続く第２アミノ酸で
始まり、はとんと完全な成熟Ｓｌ蛋白をコード付けする
天然ＴＡＣ，翻訳停止コドンまで伸びるＤＮＡフラグメ
ントをカンジダ・アルビカンス・グルコアミラーゼ遺伝
子のシグナルペプチドコーディング配列に相同にて融合
した。該融合コーディング配列にはＳＴＡ遺伝子のプロ
モータおよび転写開始部位を包含するグルコアミラーゼ
遺伝子の５′非コ一デイング配列が先行する（第１図り
照）。第２図のベクターの要素マイナスｅｎ■発現カセ
ットを含有するイー・コリ／ニス・セレビシェシャトル
ベクターに該発現カセットを移入してプラスミドｐＲＩ
Ｔ１３０７２を得た。プラスミドｐＲＩＴ１３０７２は
、Ｓｌ発現カセットがｅｎｖ発現発現アセを置き換え、
該カセットの右側の結紮部位がＥｓｐｌ／５ａ１１部位
の代りにＸｂａｌ／Ｓａ１部位であることを除き、第２
図のベクターのすべての成分を含有する。ｐＲＩＴ１３
０７２をニス・セレビシェ株（遺伝子型：Ｍａｔα　Ｉ
ｅｕ２　ｕｒａ３　　ａｄｅｌｇ　ｌ　ｎ　１）に形質
転換した。形質転換した酵母クローン、７４５．１　　
［ｐＲＩＴ１３０７２］をさらなる実験用に選択した。

Ｓｌ蛋白の１８６個のアミノ酸（成熟蛋白のアミノ酸２
ないし１８７）をコード付けする５ａｕ３ａＤＮＡ制限
フラグメントをＳＴＡ遺伝子のコーディング配列に挿入
した（第１図参照）。該インサートをグルコアミラーゼ
蛋白のカルボキシル末端近くに位置する作成りａｍＨ１
制限部位に導入した。得られたハイブリッド遺伝子は融
合グルコアミラーゼ−８１蛋白を発現するはずである。

全発現カセットは前記したに同様のイー・コリ／ニス・
セレビシェ・シャトルプラスミドベクターに担持されて
いる。得られたプラスミド、ｐＲＩＴ１３０７３をニス
・セレビシェ株（遺伝子型Ｍａｔα　１ｅｕ２　ｕｒａ
３　ａｄｅｌｇｌｎｌ）に導入し、形質転換したクロー
ン、７４５．１　　［ｐＲＩＴ１３０７３］を引き続い
ての分析用に選択した。

Ｂ１発現 りｏ−ン７４５．１　１ｐＲＩＴ１３０７２］　で合成
されたＳｌサブユニツトは抗−ベルトゥシストキシン単
クローン抗体８２Ｆ８を用いる全細胞抽出物のウェスタ
ンプロットで容易に検出できた。

５ＤＳ−ＰＡＧＥにおける組換体蛋白の電気泳動移動度
はホルデテラ・ペルトウシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌ　１ａ
ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ホロトキシン（ｈｏｌｏｔｏｘｉ
ｎ）から精製したＳｌサブユニ、トの移動度と同様であ
り、これはグルコアミラーゼ／グナルペブチドは除去さ
れ、Ｓｌサブユニツトは酵母細胞においてブロモ。

タンプされたことを示す。シグナルペプチド切断は、通
常、小胞体膜を通過しての合成蛋白の移動の間または後
に起こる。従って、プロセッシングされたＳｌサブユニ
ツトは酵母細胞抽出物の粗製膜画分と結合して９りおよ
び／または培養培地中に分泌される。酵母細胞抽出物を
分画遠心分離によって分別し、異なる画分をＳｔの存在
について分析した。Ｓｌサブユニットは抽出物の３００
００Ｘｇ遠心の後、もっばら不溶性物質に結合していた
。ペレット化画分は１％ＳＤＳまたは４Ｍ尿素で可溶化
できた。多数の他の洗剤［デオキシコール酸ナトリウム
（ＤＯＣ，ジグ７　（Ｓｕｇｍａ））、トリトンｘ１０
０．３−［（３−コールアミドプロピル）−ジメチルア
ンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ、
シダ？　（Ｓｕｇｍａ））およびツウィテルゲン（ｚｗ
ｉｔｅｒｇｅｎ）］を酵母膜からＳｌ蛋白を抽出する試
みにおいてテストした。

Ｓｔの可溶化に顕著な効果を有するものはなかった。

分画の前後で、細胞抽出物を含有する陰性対象およびＳ
ｌをＮＡＤグルコヒドラーゼ活性の存在について分析し
た。顕著な酵素活性を含有する画分は無かったが、それ
らのすべてはＳｌのＮＡＤグルフヒドラーゼ活性を強力
に抑制した。培地中には、ウェスタンプロットまたは酵
素活性分析によって検出されるＳｌ蛋白は無かった。

クローン７４５．１　［ｐＲＩＴ１３０７３コをグルコ
アミラーゼ−８１融合蛋白（すなわち、Ｓｌ−ＧＡ蛋白
）の存在について分析した。１０ｍＭＮａＰｏ、、１％
マルトトリオース、ｐＨ６，５を含有する反応緩衝液中
、３７°Ｃで基質マルトトリオースから遊離されたグル
コースの里を測定することによってグルコアミラーゼ酵
素活性をテストした。培地ｔＸＣ当たり１分間に放出さ
れたニコチンアミドの量（ピコモル）を測定スることに
よって、Ｓｌ（ＮＡＤ−グルコヒドラーゼ）活性を測定
した。発現カセットを含有しない親ベクターは培養培地
または抽出物中で検出可能なグルコアミラーゼまたはＳ
ｌ活性を示さなかった。

１度グルコアミラーゼ発現カセット（Ｓ　Ｔ　Ａ遺伝子
）を含有する親ベクターは、培養培地中および細胞抽出
物中ともにグルコアミラーゼ活性を示したが、Ｓｌ活性
は示さなかった。対照的に、ｐＲＩＴ１３０７３を担持
する酵母株、グルコアミラーゼＳｌ融合発現カセットを
含有するベクターは、培地中および抽出物中ともにグル
コアミラーゼ活性を示し、培地中でＳｌ活性を示した。

かくして、プラスミドｐＲＩＴ１３０７３で形質転換し
たニス・セレビシェ細胞はグルコアミラーゼおよびＳｌ
−特異的ＮＡＤ−グルコヒドラーゼ活性を発現する蛋白
を合成し、それを培地上澄み中に分泌する。この結果は
、Ｓｌの酵素的に活性な部分は首尾よくグルコアミラー
ゼに融合され、酵母中で合成され、培地上澄み中に分泌
されることを示唆する。

これらの結果は、ビイ・ベルトウシストキシンのＳｌサ
ブユニットはグルコアミラーゼまたはＳＴＡ遺伝子プロ
モータの制御下、酵母中で合成され、グルコアミラーゼ
シグナルペプチドを経由して酵母膜に分泌されるか、ま
たはグルコアミラーゼとの融合蛋白として培養培地中に
移送されることを示す。後者（すなわち、融合グルコア
ミラーゼ−Ｓｌ蛋白）の場合、Ｓｌサブユニツトは酵素
的に活性である。

Ｃ−魚度保護盾独 ＣＦＡ中の３１−ＧＡ　（ｐＲＩＴ１３０７３）（ニス
・セレビシェのｐＰＩＴ１３０７３での形質転換から実
施例１３、パートＢで調製したＳｌ−グルコアミラーゼ
融合蛋白）３５μｇまたはグルコアミラーゼ（Ｇ　Ａ）
を第０日に、ＩＦＡ中のものを第３０および５８日に二
回、２匹のマウス各々に注射した。用いたＧＡおよびＳ
ｌ−ＧＡ（ｐＲＩＴｌ　３０７３）　融合蛋白はニス・
セレビエ中で合成され、マウスへの注射に先立ってＤＥ
ＡＥ−セルロースクロマトグラフィーによるごとき変性
しない方法で培地上澄みから部分的に精製した。第５４
日および７５日にマウスから血液を採取した。抗−ＰＴ
、抗−８ｌおよび抗−ｒｓＩｄ抗体の存在についてエラ
ピラ法によって、ＰＴ中和抗体の存在についてチャイニ
ーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞アッセイ（ヒユーレ
ットら（Ｈｅｗｌｅｔｔｅｔａｌ、ＨＩＶ−（１９８３
）、インフェクション・アンド・イミューニティ（Ｉｎ
ｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、ＨＩＶ−、５５．２４−３８
）によって血清を分析した。Ｓｌ−ＧＡ（ｐＲＩＴ１３
０７３）融合蛋白を注射したすべてのマウスは、抗−Ｐ
Ｔ、抗Ｓ−１および抗−ｒＳｌｄ抗体力価を増加させた
。これらの抗原に対する抗体力価は、ＧＡで免疫化した
マウスでは大きくは増加しなかった。また、Ｓ　１−Ｇ
Ａ　（ｐＲＩＴ１３０７３）を注射したすべてのマウス
はＣＨＯ細胞中和力価を増加させた。相加平均値はＳ］
−ＧＡ　（ｐＲＩＴ１３０７３）について９２０であっ
た。これらの結果は、Ｓｌ−ＧＡ蛋白が中和および保護
応答を誘導するのに十分であり、かかる蛋白はペルトウ
シスに対するワクチンで有用であることを示す。

実施例１３、パートＡおよびＢで概略を記載した方法と
同様の方法で、Ｓｔ蛋白の１８６個のアミノ酸（成熟蛋
白のアミノ酸２ないし１８７）をコード付けする５ａｕ
３ａ　　ＤＮＡ制限フラグメントは、カンジダ・アルビ
カンスナグルコアミラーゼ遺伝子のシグナルペプチドコ
ーディング配列に相同に融合することができ、得られた
発現カセ。

トは適当にベクターに移入でき、得られたベクターは適
当な宿主ニス・セレビンエ株に移入でき、得られた蛋白
はペルトウシスに対するワクチンで用いることができた
。

実施例１４−非経口ワクチン調製物 実施例１３の方法に従って調製したＳｌ−ＧＡ（ｐＲＩ
Ｔ１３０７３）５〜２５μｇを水酸化アルミニウムのご
ときアルミニウムアジュバントと混合して非経口投与形
態に一体化するのに適した形態のワクチンを得る。

前記の記載および実施例は本発明およびその好ましい具
体例を詳細に２載するが、本発明は個々の開示された具
体例に限定されるものと解釈されるへきでない。

本発明は前記実施例で与えられるカンジダの遺伝子およ
びプロモータに限定されない。むしろ、本発明はカンジ
ダ遺伝子発現ユニット、プロモータ、調節領域および構
造遺伝子を位置決めする一般的方法、ならびにかかる機
能性ＤＮＡ配列をサツカロミセスで発現する一般的方法
を提供する。

さらに、シイ会アルビカス・グルコアミラーゼ・シグナ
ル配列および酵母プロモータの制御下で発現された異種
遺伝子は本明細書中に記載した蛋白例に限定されない。

当業者ならば種々の注目する異種遺伝子を発現および分
泌するための記載した発現系の使用を認識するであろう
。

かくして、本発明は特許請求の範囲の範囲内に含まれる
すべての具体例を包含する。

【図面の簡単な説明】

第１図はシイ・アルビカンス・グルコアミラーゼ遺伝子
のプロモータおよびシグナル配列のヌクレオチド配列図
である。 第２図は実施例１０で使用した発現ベクターを表わす制
限地図である。 第３図はシイ・アルビカンス・グルコアミラーゼ遺伝子
のシグナル配列のヌクレオチドおよびアミノ酸配列図で
ある。 第４図は実施例１１で使用した合成リンカ−のヌクレオ
チドおよびアミノ酸配列図である。 第５図はＴＧＦ−αのＤＮＡおよびアミノ酸配列図であ
る。 特許出願人　　スミスクライン・ベックマン・コーポレ
イション 代理人弁理士青　山　葆　はか１名 ＦＩＧ、　２

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. （１）カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂ
   ｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼ遺伝子のシグナル配列と
   同一または実質的に同一のコーディング配列に由来する
   機能性ＤＮＡ配列よりなることを特徴とするサッカロミ
   セス属の形質転換体宿主微生物。
2. （２）該機能性ＤＮＡ配列が第３図のものと同一または
   実質的に同一のＤＮＡ配列よりなる請求項第（１）記載
   の微生物。
3. （３）該機能性ＤＮＡ配列が酵母プロモータに先行され
   た該シグナル配列よりなる請求項第（１）記載の微生物
   。
4. （４）シイ・アルビカンス・グルコアミラーゼ遺伝子の
   プロモータ配列と同一または実質的に同一の機能性ＤＮ
   Ａ配列よりなる請求項第（１）記載の微生物。
5. （５）該機能性ＤＮＡ配列が第１図のものと同一または
   実質的に同一のＤＮＡ配列よりなる請求項第（４）記載
   の微生物。
6. （６）該シグナル配列が選択された異種遺伝子と適当な
   向きで融合した請求項第（１）記載の微生物。
7. （７）該異種遺伝子がＴＧＦ−α、インターリューキン
   −１β、インターリューキン−１α、Ｓｌ−ＧＡ蛋白、
   ＨＩＶ− I 蛋白またはそのフラグメントよりなる群か
   ら選択される請求項第（６）記載の微生物。
8. （８）サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏ
   −ｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）種に属する請求
   項第（１）記載の微生物。
9. （９）組換体プラスミドよりなり、該プラスミドがシイ
   ・アルビカンス・グルコアミラーゼ遺伝子のシグナル配
   列と同一または実質的に同一の配列に由来するレプリケ
   ータ領域および機能性ＤＮＡ配列よりなる請求項第（１
   ）記載の微生物。
10. （１０）シイ・アルビカンス・グルコアミラーゼ遺伝子
    のシグナル配列と同一または実質的に同一のコーディン
    グ配列を含有する機能性ＤＮＡ配列よりなることを特徴
    とする組換体ＤＮＡプラスミド。
11. （１１）該機能性ＤＮＡ配列が第３図のものと同一また
    は実質的に同一のＤＮＡ配列よりなる請求項第（１０）
    記載のプラスミド。
12. （１２）該機能性ＤＮＡ配列が酵母プロモータに先行さ
    れる該シグナル配列よりなる請求項第（１０）記載のプ
    ラスミド。
13. （１３）シイ・アルビカンス・グルコアミラーゼ遺伝子
    のプロモータ配列と同一または実質的に同一の機能性Ｄ
    ＮＡ配列よりなる請求項第（１０）記載のプラスミド。
14. （１４）該機能性ＤＮＡ配列が第１図のものと同一また
    は実質的に同一のＤＮＡ配列よりなる請求項第（１３）
    記載のプラスミド。
15. （１５）該シグナル配列が選択された異種遺伝子と適当
    な向きで融合した請求項第（１０）記載のプラスミド。
16. （１６）該異種遺伝子がＴＧＦ−α、インターリューキ
    ン−１β、インターリューキン−１α、Ｓｌ−ＧＡ蛋白
    、ＨＩＶ− I 蛋白またはそのフラグメントよりなる群
    から選択される請求項第（１５）記載のプラスミド。
17. （１７）サッカロミセス属の宿主微生物を機能性ＤＮＡ
    配列で形質転換し、次いで該形質転換した宿主を該機能
    性ＤＮＡ配列が発現される適当な条件下で培養すること
    を特徴とするシイ・アルビカンス・グルコアミラーゼ遺
    伝子のシグナルもしくはプロモータ配列と同一または実
    質的に同一の配列よりなる機能性ＤＮＡ配列を発現させ
    る方法。
18. （１８）該シグナル配列が、選択された異種遺伝子と、
    同相に、かつ適当な向きにて融合された請求項第（１７
    ）記載の方法。
19. （１９）該異種遺伝子がＴＧＦ−α、インターリューキ
    ン−１β、インターリューキン−１α、Ｓｌ−ＧＡ蛋白
    、ＨＩＶ− I 蛋白またはそのフラグメントよりなる群
    から選択される請求項第（１８）記載の方法。
20. （２０）該宿主微生物がサッカロミセス・セレビシエ種
    に属する請求項第（１７）記載の方法。
21. （２１）第１図のものと同一または実質的に同一の配列
    よりなることを特徴とする酵母発現ベクターで用いるプ
    ロモータ配列。
22. （２２）第３図のものと同一または実質的に同一の配列
    よりなることを特徴とするそれに融合する異種遺伝子の
    分泌を可能とする酵母発現ベクターで用いるシグナル配
    列。
23. （２３）形質転換したサッカロミセス宿主細胞を培養す
    ることによってプロセッシングされていない形態で産生
    され、該宿主細胞が酵母プロモータおよびカンジダ・ア
    ルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）グルコ
    アミラーゼ遺伝子のシグナル配列と同相かつそれに対し
    て適当な向きで融合したｇｐ１６０遺伝子配列よりなる
    ことを特徴とするＨＩＶ− I 糖蛋白ｇｐ１６０。
24. （２４）ミセル形態で産生された請求項第（２３）記載
    の糖蛋白。
25. （２５）形質転換したサッカロミセス宿主細胞を培養す
    ることによって産生され、該宿主細胞が酵母プロモータ
    およびカンジダ・アルビカンス・グルコアミラーゼ遺伝
    子のシグナル配列と同相かつそれに対して適当な向きに
    融合したＴＧＦ−α遺伝子配列よりなることを特徴とす
    るＴＧＦ−α。
26. （２６）形質転換したサッカロミセス宿主細胞を培養す
    ることによって産生され、該宿主細胞が（ａ）酵母プロ
    モータに対し、かつ（ｂ）カンジダ・アルビカンス・グ
    ルコアミラーゼ遺伝子内に、同相で、かつ適当な向きで
    融合したＳｌ−ＧＡ蛋白コーディング配列よりなり、た
    だし、かかる融合はカンジダ・アルビカンス・グルコア
    ミラーゼ遺伝子のシグナル配列を包含することを特徴と
    するＳｌ−ＧＡ蛋白。
27. （２７）Ｓｌ−ＧＡ（ｐＲＩＴ１３０７３）である請求
    項第（２６）記載の蛋白。
28. （２８）形質転換したサッカロミセス宿主細胞を培養す
    ることによって産生され、該宿主細胞が酵母プロモータ
    およびカンジダ・アルビカンス・グルコアミラーゼ遺伝
    子のシグナル配列と同相かつそれに対して適当な向きで
    融合したＳｌ−ＧＡ蛋白コーディング配列よりなること
    を特徴とするＳｌ−ＧＡ蛋白。
29. （２９）形質転換したサッカロミセス宿主細胞を培養す
    ることによって産生され、該宿主細胞が酵母プロモータ
    およびカンジダ・アルビカンス・グルコアミラーゼ遺伝
    子と同相かつそれに対して適当な向きで融合したＩＬ１
    −β遺伝子配列よりなることを特徴とするＩＬ１−β。
30. （３０）形質転換したサッカロミセス宿主細胞を培養す
    ることによって産生され、該宿主細胞が酵母プロモータ
    およびカンジダ・アルビカンス・グルコアミラーゼ遺伝
    子と同相かつそれに対して適当に向きで融合したＩＬ１
    −β遺伝子配列よりなることを特徴とするＩＬ１−α。
31. （３１）百日咳に対し保護を刺激するワクチンであって
    、免疫保護性かつ非毒性量のＳｌ−ＧＡ蛋白よりなるこ
    とを特徴とする該ワクチン。
32. （３２）Ｓｌ−ＧＡ（ｐＲＩＴ１３０７３）蛋白よりな
    る請求項第（３１）記載のワクチン。
33. （３３）請求項第（３１）記載のワクチンをヒトに投与
    することを特徴とする引き続いての百日咳に対しヒトを
    接種する方法。
34. （３４）Ｓｌ−ＧＡ蛋白。
35. （３５）Ｓｌ−ＧＡ蛋白コーディング配列。
36. （３６）請求項第（３５）記載のＳｌ−ＧＡコーディン
    グ配列よりなることを特徴とする組換体ＤＡＮＡ分子。
37. （３７）請求項第（３５）記載のＳｌ−ＧＡコーディン
    グ配列よりなることを特徴とする組換体ＤＮＡベクター
    。
38. （３８）請求項第（３５）記載のＳｌ−ＧＡコーディン
    グ配列よりなることを特徴とする合成ＤＮＡ分子。
39. （３９）請求項第（３７）記載のベクターを含有するＳ
    ｌ−ＧＡコーディング配列で形質転換したことを特徴と
    する宿主細胞。