JPH02163087A - α↓２−プラスミンインヒビター発現用プラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、大腸菌内でαｎ−プラスミンインヒビターを
大量に生産するように塩基配列が改良されたαｎ−プラ
スミンインヒビターをコードするＤＮＡを用いた該イン
ヒビターの遺伝子工学的製造方法に関する。

本発明により生産されたα２＝プラスミンインヒビタ−
は抗止血薬や抗癌転移薬、あるいは種々のプラスミン様
プロテアーゼの関与する炎症に対する治療薬として、ま
たは繊維素溶解亢進症（ｈｙｐｅｒ　ｆｉｂｒｉｎｏｌ
ｙｓｌｓ）の治療薬としてもその効果が期待されている
。

［従来の技術及び発明が解決しようとする問題点］αｎ
−プラスミンインヒビターは、４５２個のアミノ酸より
なる蛋白質であってそのアミノ酸配列およびそれをコー
ドする天然型ＤＮＡは、ヨーロッパ特許公開０２５７６
３０に記載されている。

しかしながら、このαｎ−プラスミンインヒビターをコ
ードする天然型ｃＤＮＡをそのまま、大腸菌を宿主とす
る外来遺伝子の発現に汎用される、トリプトファンプロ
モーターやタックプロモーターで発現させようとしても
生産性は極めて低い。

［問題点を解決するための手段］ 従来の天然型の塩基配列を有するαｎ−プラスミンイン
ヒビターｃＤＮＡとトリプトファンプロモーター又はタ
ックプロモーター若しくはタックプロモーターの変異体
であるトリックプロモーターを組み合わせた発現プラス
ミドを大腸菌て発現させた場合、αｎ−プラスミンイン
ヒビターの生産量が少なかったことの理由は次のように
考えられる。

即ち、上記のプロモーターの転写開始点から転写合成さ
れるメツセンジャーＲＮＡ　（以下ｒｍ　ＲＮ　ＡＪと
略）の５′側末端から、αｎ−プラスミンインヒビター
の蛋白合成開始コードであるＡＵＧ以下約５０個に至る
塩基配列（以下「翻訳開始点周辺塩基配列」と略）自体
に原因があるというものである。−本鎖であるｍＲＮＡ
はＡ−Ｕ及びＧ−Ｃの相補性により部分的な二本鎖構造
（ステム構造）をとることが知られている。そこで、従
来の発現プラスミドの上記の翻訳開始点周辺塩基配列中
に形成されうる高次構造を算出してみると、約２０組の
相補的な塩基対が形成され、最小自由エネルギー（＋１
ｎ１ｍｕｉ　ｒｒｅｅ　ｅｎｅｒｇｙ）の低い安定した
高次構造をとることがわかる。特に翻訳を開始するシグ
ナルであるＡＵＧの周辺には非常に安定したステム構造
が形成され、この翻訳開始シグナルからの蛋白合成がさ
れにくくなっていると考えられる。

最小自由エネルギーの算出には市販のｌく−ソナルコン
ピューター用のプログラムソフトが使用できる。例えば
、ソフトウェア開発株式会社の遺伝情報処理ソフトウェ
アであるｒ　ＧＥＮＥＴＹＸｖｃｒ、　８．０：　ＲＮ
Ａ　５ｅｃｏｎｄａｒｙ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ａｎｄ
　ＴｈｅｉｒＦｒｅｅ　Ｅｎｃｒｇｙ、　ｖｅｒ、　５
．０１Ｊ　　（１９８８年１２月１日発売）が使用でき
る。

これらの理由から、その翻訳開始点周辺塩基配列がエネ
ルギー的により不安定な高次構造をとるようにさせ、さ
らに翻訳開始シグナルのＡＵＧがステム構造の中に組み
込まれなくなれば、選ばれたプロモーターからのαｎ−
プラスミンインヒビターの大腸菌での生産効率が上がる
ことが考えられる。

この為本発明者らは、αｎ−プラスミンインヒビターの
アミノ末端側をコードする塩基配列の置換を考えた。こ
の時、αｎ−プラスミンインヒビターのアミノ酸残基は
換えずに、かつ天然型のｃＤＮＡの塩基配列と異なって
、ｍＲＮＡの５′末端付近の配列との間に安定な高次構
造を取れないような塩基を選び、置換を行なった。即ち
、大腸菌を宿主とする組換え蛋白質の生産において最も
よく用いられる代表的なプロモーターである、トリプト
ファンプロモーターおよびタックプロモーターあるいは
タックプロモーターの同族体であるトリックプロモータ
ーに適合するαｎ−プラスミンインヒビターをコードす
る新規な塩基配列を持つｃＤＮＡを提供することである
。

［本発明の構成］ 本発明は、αｎ−プラスミンインヒビターをコードする
ＤＮＡ０ （Ｘ　、１６）　、ＧＡＧ、ＣＣＴ、ＧＧＴ、ＧＧＣ，
ＣＡＧ、　ＡＣＴ、ＧＣ（１：、ＣＴＧ、　ＡＡＧ。

ＡＧＴ、　ＣＣＣ，ＣＣＡ、　ＧＧＡ　、　ＧＴＣ，Ｔ
ＧＣ，ＡＧＣ，ＡＧＡ、　ＧＡＣ，ＣＣＣ，ＡＣＣ。

ＣＣＡ、　ＧＡＧ、　ＣＡＧ、　ＡＣＣ，ＣＡＣ，ＡＧ
Ｇ、ＣＴＧ、ＧＣＣ，ＣＧＧ　、　ＧＣＣ、ＡＴＧ　。

ＡＴＧ　、　ＧＣＣ、ＴＴＣ、ＡＣＴ　、　ＧＣＣ、Ｇ
ＡＣ、ＣＴＧ　、　ＴＴＣ、ＴＣＣ、ＣＴＧ　、　ＧＴ
Ｇ。

ＧＣＴ、　ＣＡＡ　、　ＡＣＧ　、ＴＣＣ，ＡＣＣ，Ｔ
ＧＣ，ＣＣＣ，ＡＡＣ，ＣＴＣ，ＡＴＣ、ＣＴＧ　。

ＴＣＡ　、　ＣＣＣ、ＣＴＧ　、　ＡＧＴ　、　ＧＴＧ
　、　ＧＣＣ、ＣＴＧ　、　ＧＣＧ　、　ＣＴＧ　、　
ＴＣＴ　、　ＧＡＧ。

ＣＴＧ、　ＧＣＡ　、ＣＴＡ、　ＧＧＴ、ＧＣＴ、　Ｃ
ＡＧ、　ＡＡＣ，ＣＡＣ，ＡＣＧ　、ＴＴＧ　、　ＧＡ
Ｇ。

ＡＧＧ　、　ＣＴＧ　、　ＣＡＡ　、　ＣＡＧ、ＧＴＧ
、　ＣＴＧ、ＣＡＣ，ＧＣＡ、　ＧＧＣ，ＴＣＡ　、　
ＧＧＧ。

ＣＣＣ，ＴＧＣ、ＣＴＣ、ＣＣＣ，ＣＡＴ、　ＣＴＧ　
、ＣＴＧ　、　ＡＧＣ、ＣＧＣ，ＣＴＣ、ＴＧＣ。

ＧＡＧ　、ＧＡＣ，ＣＴＧ　、ＧＧＣ，ＣＣＣ，ＧＧＣ
，ＧＣＧ、ＴＴＣ，ＣＧＡ　、　ＣＴＣ，ＧＣＴ。

ＧＣＣ，ＡＧＧ、　ＡＴＧ、　ＴＡＣ，ＣＴＧ、　ＣＡ
Ｇ、　ＡＡＡ　、ＧＧＡ、ＴＴＴ、ＣＣＣ，ＡＴＣ。

ＡＡＡ、ＧＡＡ、ＧＡＴ、ＴＴＣ，ＣＴＧ、ＧＡＡ、Ｃ
ＡＡ、ＴＣＣ，ＧＡＡ、ＣＡＣ，ＣＴＡ。

ＴＴＴ、ＧＧＧ、ＧＣＡ、ＡＡＧ、ＣＣＣ，ＧＴＧ、Ａ
ＧＣ，ＣＴＧ、＾ＣＧ、ＧＧＡ、＾＾Ｃ３ＣＡＧ、ＧＡ
Ａ、ＧＡＴ、ＧＡＣ，ＣＴＧ、ＧＣＡ、＾ＡＣ，ＡＴＣ
，ＡＡＣ，ＣＡＡ、ＴＧＧ。

ＧＴＧ、ＡＡＧ、ＧＡＧ、ＧＣＣ，ＡＣＧ、ＧＡＧ、Ｇ
ＧＧ、ＡＡＧ、ＡＴＴ、ＣＡＧ、ＧＡＡ。

ＴＴＣ，ＣＴＣ，ＴＣＴ、ＧＧＧ、ＣＴＧ、ＣＣＧ、Ｇ
ＡＡ、ＧＡＣ，ＡＣＣ、ＧＴＧ　、　ＴＴＧ。

ＣＴＴ　、ＣＴＣ，ＣＴＣ，ＡＡＣ，ＧＣＣ，ＡＴＣ，
ＣＡＣ，ＴＴＣ，ＣＡＧ、ＧＧＴ、ＴＴＣ。

ＴＧＧ、　ＡＧＧ　、　ＡＡＣ，ＡＡＧ、ＴＴＴ、　Ｇ
ＡＣ，ＣＣＧ、　ＡＧＣ，ＣＴＴ、　ＡＣＣ，ＣＡＧ。

ＡＧＡ　、　ＧＡＣ，ＴＣＣ，ＴＴＣ，ＣＡＣ、ＣＴＧ
、ＧＡＣ，ＧＡＧ　、　ＣＡＧ　、　ＴＴＣ、ＡＣＧ。

ＧＴＧ、ＣＣＣ，ＧＴＧ、　ＧＡＡ、ＡＴＧ、　ＡＴＧ
、ＣＡＧ　、ＧＣＣ，ＣＧＣ、ＡＣＧ　、ＴＡＣ。

ＣＣＧ、　ＣＴＧ、ＣＧＣ、ＴＧＧ　、ＴＴＣ、ＴＴＧ
　、ＣＴＧ　、　ＧＡＧ、　ＣＡＧ、　ＣＣＴ　、　Ｇ
ＡＧ、ＡＴＣ，ＣＡＧ、ＧＴＧ、　ＧＣＴ、ＣＡＴ、Ｔ
ＴＣ，ＣＣＣ，ＴＴＴ、　ＡＡＧ、　ＡＡＣ，ＡＡＣ。

ＡＴＧ　、　ＡＧＯ、ＴＴＴ　、　ＧＴＧ　、　ＧＴＣ
、ＣＴＴ　、　ＧＴＡ　、　ＣＣＣ，＾ＣＣ，ＣＡＣ，
ＴＴＴ、ＧＡＡ、ＴＧＧ　、ＡＡＣ，ＧＴＧ、ＴＣＣ，
ＣＡＧ、ＧＴＡ、ＣＴＧ、ＧＣＣ，ＡＡＣ、ＣＴＧ。

ＡＧＴ、ＴＧＧ、　ＧＡＣ，ＡＣＣ，ＣＴＧ、ＣＡＣ，
ＣＣＡ　、　ＣＣＴ、ＣＴＧ、　ＧＴＧ、　ＴＧＧ。

ＧＡＧ、ＡＧＧ、ＣＣＣ，＾ＣＣ，ＡＡＧ、ＧＴＣ，Ｃ
ＧＧ、ＣＴＧ、ＣＣＴ、ＡＡＧ、ＣＴＧ。

ＴＡＴ、ＣＴＧ、ＡＡＡ、ＣＡＣ，ＣＡＡ、ＡＴＣ，Ｃ
ＡＣ，ＣＴＧ、ＧＴＧ、ＧＣＣ，ＡＣＣ。

ＣＴＣ，ＡＧＣ，ＣＡＧ、ＣＴＧ、ＧＧＣ，ＣＴＧ、Ｃ
ＡＧ、ＧＡＧ、ＴＴＧ、ＴＴＣ，ＣＡＧ。

ＧＣＣ，ＣＣＡ、ＧＡＣ，ＣＴＧ、ＣＧＴ、ＧＧＧ、Ａ
ＴＣ，ＴＣＣ，ＧＡＧ、ＣＡＧ、ＡＧＣ。

ＣＴＧ、ＧＴＧ、ＧＴＧ、ＴＣＣ，ＧＧＣ，ＧＴＧ、Ｃ
ＡＧ、ＣＡＴ、ＣＡＧ、ＴＣＣ，ＡＣＣ。

ＣＴＧ、ＧＡＧ、ＣＴＣ，ＡＧＣ，ＧＡＧ、ＧＴＣ，Ｇ
ＧＣ，ＧＴＧ、ＧＡＧ、ＧＣＧ、ＧＣＧ。

ＧＣＧ　、　ＧＣＣ、ＡＣＣ、ＡＧＣ、ＡＴＴ　、　Ｇ
ＣＣ、ＡＴＧ　、　ＴＣＣ、ＣＧＣ、ＡＴＧ　、　ＴＣ
Ｃ。

ＣＴＧ、ＴＣＣ，ＴＣＣ，ＴＴＣ，＾ＧＣ，ＧＴＧ、Ａ
ＡＣ，ＣＧＣ，ＣＣＣ，ＴＴＣ，ＣＴＣ。

ＴＴＣ，ＴＴＣ，ＡＴＣ，ＴＴＣ，ＧＡＧ、　ＧＡＣ，
ＡＣＣ，ＡＣＡ　、ＧＧＣ，ＣＴＴ、　ＣＣＣ。

ＣＴＣ，ＴＴＣ，ＧＴＧ、ＧＧＣ，ＡＧＣ，ＧＴＧ、Ａ
ＧＧ、ＡＡＣ，ＣＣＣ，ＡＡＣ，ＣＣＣ’。

ＡＧＴ、ＧＣＡ、ＣＣＧ　、ＣＧＧ、ＧＡＧ、ＣＴＣ，
ＡＡＧ、ＧＡＡ、ＣＡＧ、ＣＡＧ、ＧＡＴ。

ＴＣＣ，ＣＣＧ、ＧＧＣ，ＡＡＣ，ＡＡＧ、ＧＡＣ，Ｔ
ＴＣ，ＣＴＣ，ＣＡＧ、ＡＧＣ，ＣＴＧ。

ＡＡＡ、ＧＧＣ，ＴＴＣ，ＣＣＣ，ＣＧＣ，ＧＧＡ、Ｇ
ＡＣ，ＡＡＧ、ＣＴＴ、ＴＴＣ，ＧＧＣ。

ＣＣＴ、ＧＡＣ，ＴＴＡ、ＡＡＡ、ＣＴＴ、ＧＴＧ、Ｃ
ＣＣ，ＣＣＣ，ＡＴＧ、ＧＡＧ、ＧＡＧ。

ＧＡＴ、ＴＡＣ，ＣＣＣ，ＣＡＧ、ＴＴＴ、ＧＧＣ，Ａ
ＣＣ，ＣＣＣ，ＡＡＧ。

において、プロモーターがトリプトファンプローｌ１−
−９−＋７）場合は、（Ｘｌ−１６）は、ＡＡＣ，ＣＡ
Ｇ、ＧＡＧ。

ＣＡＧ、ＧＴＡ　、　ＴＣＣ，ＣＣＣ，ＣＴＣ，ＡＣＡ
、ＣＴＡ　、ＣＴＧ　、　ＡＡＧ　、ＴＴＣ，ＧＧＣ。

ＡＡＴ、ＣＡＡ、であり、 また、プロモーターがタック（ｔａｃ）又はトリック（
ｔｒｃ）プロモーターの場合は、（ｘｌ−１８）は、Ａ
ＡＣ，ＣＡＡ、ＧＡＧ、ＣＡＧ、ＧＴＧ、ＴＣＣ，ＣＣ
Ａ、ＣＴＴ、ＡＣＣ，ＣＴＣ。

ＣＴＴ、ＡＡＧ、ＴＴＣ，ＧＧＣ，ＡＡＴ、ＣＡＡ、で
あるようなαｎ−プラスミンインヒビターをコードする
ＤＮＡである。

更に本発明は、このＤＮＡとプロモーターを含む組換え
ＤＮＡ断片、それを含む発現プラスミド、そのプラスミ
ドにより形質転換された大腸菌、その大腸菌を用いたα
　−プラスミンインヒビターの製造方法に関する。

本発明のＤＮＡは全合成によって作成することもできる
が、α　−プラスミンインヒビターの天然型ＤＮＡの一
部を合成ペプチドで置換して作成することが簡便である
。

α　−プラスミンインヒビターの天然型ＤＮＡであるＡ
ＰＨＬは、ヨーロッパ特許公開０２５７６３０に記載さ
れているように、ＨｃｐＧ２由来のλＡＰＨ３４と、ヒ
ト肝ｃＤＮＡライブラリーより得られたλＡＰＬＩから
のＥｃｏＲＩ断片を連結させて作成された。このＡＰＨ
Ｌ断片は、トランスポゾンＴｎ９０８（文献：　Ｏｋａ
、　Ａ、ら；　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｌｏｌ。

（１９８１）　１４８．２１７〜２２６）由来のカナマ
イシン耐性と、ｐＵｃ１９（宝酒造より入手）由来のポ
リリンカーを有する、プラスミドベクターｐｕｓ　Ｇ　
２９９〔竹下ら、　Ｇｅｎｅ、　６１．　ｐ　−６３−
７４（１９８７））のＥｃｏＲＩサイトに組み込み、ｐ
ａＡＰ３と名づけＩ：。このｐａＡＰ３にて宿主のＥ、
　ｃｏｌｔ　Ｋ１２１０ａ＋２１４を形質転換させた。

このＡＰ、ＨＬを含むｐαＡＰ３による、形質転換体の
大腸菌は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄
第１３５０号（ＦＥＲＮ　ＢＰ−１３５０）として寄託
されている。

このｃＤＮＡ鎖ＡＰＨＬの塩基配列は第１表にその制限
酵素マツプは第１図に示すとおりである。

（以下余白） この塩基配列において１〜６の塩基配列はクローニング
に使用したＥｅｏＲＩリンカ−に由来するＥｃｏＲＩサ
イトであり、７〜２４は５′側−ノンコーディング領域
である。２５〜１４１はαｎ−プラスミンインヒビター
の前駆体にのみ結合しているペプチド部分（いわゆるア
ンカ一部分）である。

１４２〜１４９７カく目的とするαｎ−プラスミンイン
ヒビターをコードする部分である。１４９８〜１５００
のＴＧＡはストップコドンである。１５０１以下は３′
側−ノンコーディング領域であり、２２１２〜２２１７
のＡＡＴＡＡＡはポリＡ配列付加シグナル、２２３０以
下のポリＡは、ポリＡメツセンジャーのポリＡ末端に由
来している領域である。２２５１〜２２５６はクローニ
ングに使用したＥｃｏＲＩリンカ−由来のＥｅｏＲ１サ
イトである。

この天然型ＤＮＡを改変するには、改変部分を含むＤＮ
Ａ断片を合成し、適当な制限酵素サイトを利用して置換
する。

本発明のＤＮＡを発現させるプラスミドはαｎ−プラス
ミンインヒビターをコードする遺伝子の他に、転写開始
を指示する原核生物のプロモーター、転写の終結を指示
する原核生物のターミネータ−および適当な選択マーカ
ーをコードする遺伝子を含む。原核生物宿主細胞の例と
しては大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｌｃｉａ　ｃｏｌｔ　　：
　　Ｅ、　ｃｏｌｔと略す）があげられる。またプロモ
ーターの例としてはＩＥ、ｅｏｌｌの中で転写効率のい
い、ｔｒｐプロモーターやｔａｅプロモーターや類似の
プロモーターであるｔｒｃプロモーターがあげられ、タ
ーミネータ−の例としては、強い終結シグナルであるｒ
ｒｎ　ＢリボゾームＲＮＡターミネータ−があげられ、
さらに選択マーカーとしては前出のＡｐＲ，ＣｍＲＫ　
ｍ　Ｉ？等があげられる。

この組み換え体プラスミドを大腸菌の宿主に導入する方
法は、ＭａｉｌａｔｊＳ等によるｒ　Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＣｌｏｎｉｎｇ　　Ｊ　　　（１９８２年　Ｃｏ１ｄ
　　Ｓｐｒｌｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒｌ、ａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ出版）等の成書に詳説されている、カルシウムイオ
ン存在下での形質転換法（Ｌｒａｎｓｌ’ｏｒａ＋ａＬ
Ｉｏｎ）を用いた。こうして得られた形質転換細胞を培
養することによって、αｎ−プラスミンインヒビターを
生産させる。

次に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明する。

実施例　１ トリプトファンプロモーターを有する大腸菌での発現プ
ラスミドの作成 Ｅ、　ｃｏｌｔ　Ｋ１２１０＋ａ２１４（ＦＥＲＮ　Ｂ
Ｐ−１３５０）を培養して得られるプラスミドｐαＡＰ
３をＥｃｏＲＩ切断しＴ４ＤＮＡポリメレースで平滑化
後、第２表中の１４２７の塩基の位置でＢｉｎｄｕ切断
したフラグメントをｐＵｃ１８（アンピシリン耐性、国
立予防衛生研究所遺伝子バンクより人手可能、寄託番号
Ｖ　Ｅ　００７）のＨ１ｎｄｍサイトとＴ４ＤＮＡポリ
メレースによって平滑化したＰｓｔｌサイトとの間に挿
入し、ｐαＡＰ５とする。一方、１５０７の塩基の位置
でＦ　ｏｋ　Ｉ切断後Ｔ４ＤＮＡボリメレースにより平
滑化してのちに、１４２７でＨ１ｎｄｍ切断して得られ
たαｎ−プラスミンインヒビターのカルボキシ末端をコ
ードする領域を含むフラグメントをｐＨ５Ｇ３９９　　
（クロラムフェニコール耐性、同上遺伝子バンクより入
手可能、寄託番号Ｖ　Ｅ　０２４）のＨｉｎｃＩＩサイ
トとＨｌｎｄＩ［Ｉサイトとの間に挿入し、ｐαＡＰ６
とする。次に、ｐαＡＰ５とｐαＡＰ６をＨｌｎｄｕで
切断後ライゲートしアンピシリンとクロラムフェニコー
ルの二重耐性のプラスミドを選択しｐαＡＰ７とする。

ｐαＡＰ７は、αｎ−プラスミンインヒビターのコーデ
ィング領域全体（２５〜１５００の１４７６　ｂｐ）を
含み、その領域を含むＤＮＡ断片はＡｃｃＩサイトとＸ
ｂａｌサイトで切り出すことができる。

他方、ｐ　ＨＳ　０２９８　　（カナマイシン耐性、同
上バンクより入手可能、寄託番号Ｖ　Ｅ　０１８）のＳ
　ａｅ　Ｉサイトと５ＩＩｌａＩサイトの間をそれぞれ
の酵素による切断とＴ４ＤＮＡポリメレースによる平滑
化をしたのち連結させることによって欠失させたクロー
ニングベクターｐＨ３Ｇ２９７のＡｃｃｌとＸｂａｌの
間に、ｐαＡＰ７のαｎ−プラスミンインヒビターのＡ
ｃｃｌとＸｂａＩで挾まれたｃＤＮＡを挿入し、ｐαＡ
Ｐ８（第２図）とする。

一方、発現ベクターである、ｐＨ３Ｇ７４１　　（第３
図、アンピシリン耐性、同上バンクより入手可能、寄託
番号Ｖ　Ｅ　０４０）は、トリプトファンプロモーター
とりボゾームＲＮＡ遺伝子ｒｒｎ　Ｂのターミネータ−
をもちその間に、Ｎｅｏｎ、　　ＰｓＬｒ。

ＥｃｏＲＩ　、　Ｈｌｎｄ　ｍサイト等のクローニング
サイトをこの順に持っている。まずこのプラスミドのＮ
ｃｏｌサイトとＰｓｔＩサイトの間に化学合成した次の
ようなフラグメントを挿入した。

５’　ＣＡＴＧＡＡＣＣＡＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＴＣＣ
ＣＣＡＣＴＴＡＣＣＣＴＣＣＴＣＡＡＧＴＴＧＧＧＣＡ
ＡＣＣ３’　ＴＴＧＧＴＣＣＴＣＧＴＣＣＡＣＡＧＧＧ
ＧＴＧＡＡＴＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＣＡＡＣＣＣＧｎＧ
ＧＡＧＧＡＧＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＡＧＡＣＴＧＣＣＣ
ＴＧＡＡＧＡＧＴＣＣＣＣＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＣＡ　
３’ＴＣＣＴＣＧＧＡＣＣＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＣＧＧ
ＧＡＣＴＴＣＴＣＡＧＧＧＧＧＴＣＣＴＣＡＧ　５’こ
のフラグメントの最初にある粘着末端ＣＡＴＧは、ｐＨ
３Ｇ７４１のトリプトファンプロモーターとＳＤシーク
エンスのすぐ後ろにあるＮｃｏｌサイトの粘着末端に相
補的になっており、かつこのうちＡＴＧは、αｎ−プラ
スミンインヒビターの翻訳開始コドンになっている。二
番目のコドン以下は同蛋白質のリーダーシーフェンスを
コードする部分を除＜１４２以下の塩基に相当し第一番
目のアミノ酸以下のＡｓｎ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｇ　ｌ　ｕ−
Ｇ　Ｉ　ｎ等をコードしている。後ろの粘着末端は２３
６のＰｓｔｌサイトの粘着末端に相補的になっている。

次に、このプラスミドのＰ　ｓｔ　ＩサイトとＥｃｏＲ
１サイトの間にｐａＡＰ８のαｎ−プラスミンインヒビ
ターのｃＤＮＡ部分の残り、２３ＧのＰｓｔｌサイトと
６７６のＥｃｏＲＩサイトの間のフラグメントを挿入す
る。次にこのプラスミドのＥｃｏＲＩサイトと平滑化し
たＨ１ｎｄｍサイトの間に６７６の位置のＥｃｏＲＩサ
イトから３′下流域にあるＸｂａＩサイトを平滑化した
所までを挿入する。

この結果、ＸｂａＩサイトは再生し、ｐａＡ　Ｐ　２１
３（第４図）を完成した。

このようにして得られたｐａＡＰ２１３の、トリプトフ
ァンプロモーター中のＨｐａ　Ｉサイトと、αｎ−プラ
スミンインヒビターコーディング領域中のＢ　５ｔＸＩ
サイトではさまれる、αｎ−プラスミンインヒビターの
Ｎ末端をコードする部分を含むＤＮＡ断片を化学合成し
た次のようなフラグメントと置換した。

５’　ＡＡＣＴＡＧＴＡＣＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＡ
ＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＡＣＣＡＧＧＡ
ＧＣＡＧＧＴＡＴＣＣＣＣ：Ｃ３’　ＴＴＧＡＴＣＡＴ
ＧＣＧＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＴＴＴＴＴＣＣＣＡＴＡＣ
ＴＧＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＣＴＣＧＴＣＣＡＴＡＧＧＧ
ＧＧＣＴＣＡＣＡＣＴＡＣＴＧＡＡＧＴＴＣＧＧＣＡＡ
ＴＣＡＡＧＡＧＣ３’ＧＡＧＴＧＴＧＡＴＧＡＣＴＴＣ
ＡＡＧＣＣＧＴＴＡＧＴＴ　５’このフラグメントの最
初にある平滑末端は、ｐａＡＰ２１３中のＨｐａＩサイ
トの平滑末端と連結することにより再びＨｐａＩサイト
を形成し、左端より３７番目から３９番目の塩基にあた
るＡＴＧは翻訳開始コドンになっている。それにつづく
塩基配列はαｎ−プラスミンインヒビターのシグナルペ
プチドを除いたＮ末端から１７番目までのアミノ酸配列
（Ａｓｎ−Ｇｌ　ｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−３ｅｒ
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−
Ｌｅｕ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａｓ　ｎ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｇ　！　
ｕ）をコードしており、後ろの粘着末端はαｎ−プラス
ミンインヒビターコーディング領域中のＢ　５ｔＸＩサ
イトの粘着末端と相補的になっている。このように構築
されたプラスミドをｐａＡＰ２１８　　（第４図）と名
付けた。

実施例　２ ｔｒｃプロモーターを有する大腸菌での発現ベクターの
作成 ｔｒｃプロモーターを用いたαｎ−プラスミンインヒビ
ターの発現は、ｐＴｒｃ９９Ａ　（Ａｍａｎｎら。

Ｇｃｎｃ、　［ｔ９．　ｐ３０１〜３１５　（１９８８
））を用いて行われた。

まずｐＴ　ｒｃ９９ＡのＮｃｏｌサイトとＸｂａｌサイ
トの間に化学合成した次のようなフラグメントを挿入し
た。

このフラグメントの最初にある粘着末端ＣＡＴＧはｐＨ
８Ｇ７５１のｔｒｃプロモーターとＳＤシークエンスの
すぐ後ろにあるＮｃｏＩサイトの粘着末端と相補的にな
っており、このうちＡＴＧはαｎ−プラスミンインヒビ
ターの翻訳開始コドンになっている。ＡＴＧに続く塩基
配列は、α２プラスミンインヒビタ−のシグナルペプチ
ドを除いたＮ末端から数えて１呑目から１２番目までの
アミノ酸配列（＾５ｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｖａ
ｌ−８ｃｒ−Ｐｒｏ−Ｌｃｕ−Ｔｈｒ−Ｌｃｕ−Ｌｃｕ
−Ｌｙｓ）をコードしており１１番目と１２番目のアミ
ノ酸に対応するコドンはＡＩ’Ｉｎサイトとなっている
。さらにＸｈｏｌサイトがそれに続き、後ろの粘着末端
はＸｂａｌサイトの粘着末端と相補的になっている。こ
のように構築されたプラスミドをｐαＡ　Ｐ　２２２と
名付けた。

一方、ｐαＡＰ８のＳ　ｐｈ　Ｉサイトとαｎ−プラス
ミンインヒビターコーディング領域中のＢ　５ｔＸＩサ
イトの間に化学合成した次のようなフラグメントを挿入
した。

５°　ＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＡＧＴＴＧＧＧＣＡＡＣＣ
ＡＧＧＡＧＣ３３ＧＴＡＣＧＣＣＡＴＧＧＡＡＴＴＣＡ
ＡＣＣＣＧＴＴＧＧＴＣ５このフラグメントの最初にあ
る粘着末端ＧＴＡＣはｐαＡＰ８中にあるＳ　ｐｈ　Ｉ
サイトの粘着末端と相補的になっており、ＫｐｎＩサイ
トとＡｆｌＩＩサイトがそれに続いている。後ろの粘着
末端はｐαＡＰ８中にあるＢｓｔＸＩサイトの粘着末端
と）０補的になっており、ＡｆｌＩＩサイトから後ろの
粘着末端までの塩基配列は、αｎ−プラスミンインヒビ
ターのシグナルペプチドを除くＮ末端がら数えて１１番
目から１７７番目でのアミノ酸配列（１，ｅｕ−１、ｙ
ｓ−１，ｅｕ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａｓ　ｎ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｇ
　Ｉ　ｕ）をコードしている。このように構築されたプ
ラスミドをｐαＡ　Ｐ　２２３と名付けた。

次に、αｎ−プラスミンインヒビターのシグナルペプチ
ドを除いたＮ末端から数えて１１番目以降のアミノ酸配
列をコードする部分を含む、Ａｆ’ｌＩＩ　−Ｘｂａｌ
フラグメントをり（ＺＡＰ２２３より切り出して、ｐα
Ａ　Ｐ　２２２にクローニングされた合成りＮＡ中のＡ
ｆｌＩＩ　−Ｘｂａｌフラグメントと置換することによ
りｐαＡＰ２２１　　（第５図）を完成させた。

実施例　３ ｐαＡ　Ｐ　２１ｇを使ったヒトαｎ−プラスミンイン
ヒビターの大腸菌での発現 ｐαＡ　Ｐ　２＋８で形質転換された大腸菌Ｗ３１１０
をＭ９カザミノ酸＋Ｔｒｐ培地（Ｍ９カザミノ酸培地に
トリプトファンを最終濃度１００μＭになるように加え
た培地）で３７℃、１６時間振とう培養した。

この菌液１ｍｌを１００ｍ１のＭ９カザミノ酸培地に植
菌後約３．５時間培養した。０Ｄ５５ｏが０．９の時点
でＩＡＡ（インドールアクリル酸）を最終濃度ＩＩＩＭ
で加えｔｒｐプロモーターを活性化しさらに１０％カザ
ミノ酸１０ｍ１２０％グルコース５ｍｌを加え、３時間
後に同量のカザミノ酸とグルコースを加えた。さらに３
時間培養後、大腸菌を集め、大腸菌の生産する全タンパ
ク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べた
。発現ベクターのみのｐＨ３Ｇ７４１およびαｎ−プラ
スミンインヒビターを少量発現するｐαＡ　Ｐ　２１３
で形質転換した大腸菌を対照として用いたが図６に示す
ようｐαＡ　Ｐ　２＋８で形質転換した菌においてのみ
矢印で示す位置に強いバンドが検出された。このｐαＡ
Ｐ２１８を用いた時生産されるタンパク質を詳細にしら
べるために以下に示す実験を行なった。

前記した条件で集めた大腸菌をｌ０ＸＴＥ　（１００ｉ
ＭＴｒｌｓ−ＨＣ！ｌ　　（ｐＨ７，６）　　、　　　
１０１Ｍ　　ＥＤＴＡ）ｌこ０Ｄ５５０＝１０となるよ
うに懸濁しリゾチームを最終濃度５０μｇ／ｍｌになる
ように加え室温で３０分間反応させた。超音波により細
胞を破壊後１２０００　Ｋで１０分間遠心し沈殿と上滑
を分離しこの上清を可溶性画分とした。この沈殿をｌ０
ＸＴＥ−０，５％トライトンＸ１００溶液に懸濁し室温
で５分間放置した。

１２０００ｇ、　４℃で５分間遠心後沈殿を回収し不溶
性画分とした。大腸菌の生産するインクルージヨンボデ
ーは、この不溶性画分に含まれていた。可溶性画分、不
溶性画分、および大腸菌をＳＤＳ電気泳動用サンすルバ
ッフｙ　−＜８２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ＣＵ　。

２％ｇｌｙｃｃｒｏ１．２％ＳＤＳ、　５％βメルカプ
トエタノール、　０．００１％　ＢＰＢ）中テロ０℃５
分間処理し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行なった、同様な操作を発現プラスミドのみのｐＨ３Ｇ
７４１について行ない、ｐαＡＰ２１８の場合と比較し
た。

この時、ｐａＡＰ２１８で形質転換された菌においての
み不溶性画分に強いバンドが検出された。またこのバン
ドは、ウェスタンプロット法により抗αｎ−プラスミン
インヒビター抗体を用いて染色されることより、αｎ−
プラスミンインヒビターであることが明らかになった。

以上のことよりｐαＡ　Ｐ　２１８で形質転換された大
腸菌がαｎ−プラスミンインヒビターインクルージヨン
ボデーとして大量に発現していることが明らかとなった
。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のＡＰＨＬの制限酵素マツプを示す。 第２図はプラスミドｐαＡＰ８の制限酵素地図である。 図中（Ｆｏｋｌ）及び（ＥｃｏＲＩ）はライゲーション
によって消失したサイトである。 第３図はプラスミドｐＨ５Ｇ７４１の制限酵素地図であ
る。 第４図はｐαＡ　Ｐ　２１３およびｐαＡＰ２１８の制
限酵素地図である。図中（ＮｃｏＩ）はライゲーション
によって消失したサイトである。 第５図は、ｐαＡＰ２２１の制限酵素地図である。 第６図は、ｐＨ３Ｇ７４１　、　ｐａＡＰ２１３　。 ｐαＡ　Ｐ　２１８を用いて形質転換された大腸菌によ
り生産されるタンパク質のＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動パターンである。第６図において、コラムＭ
はサイズマーカーのパターンを示し、コラム１はｐＨ７
４１で、コラム２はｐαＡ　Ｐ　２１３で、コラム３は
ｐαＡ　Ｐ　２１８で形質転換された大腸菌により生産
されるタンパク質のパターンを示す。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の塩基配列を有するヒトα＿ｎ−プラスミン
   インヒビターをコードするＤＮＡ。 【遺伝子配列があります】 【塩基配列があります】 ただし、（Ｘ＿１＿−＿１＿６）はつぎの［Ｘ− I ］
   又は［Ｘ−II］のいずれから選ばれる。 ［Ｘ− I ］；【塩基配列があります】 ［Ｘ−II］；【塩基配列があります】
2. （２）（Ｘ＿１＿−＿１＿６）が［Ｘ− I ］である請
   求の範囲第１項のα＿２−プラスミンインヒビターをコ
   ードするＤＮＡをトリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ
   ーに連結した組換えＤＮＡ断片。
3. （３）（Ｘ＿１＿−＿１＿６）が［Ｘ−II］である請求
   の範囲第１項のα＿２−プラスミンインヒビターをコー
   ドするＤＮＡをタック（ｔａｃ）プロモーター、又は、
   トリック（ｔｒｃ）プロモーターに連結した組換えＤＮ
   Ａ断片。
4. （４）請求の範囲第２項の組換えＤＮＡ断片を含むα＿
   ２−プラスミンインヒビターの発現プラスミド。
5. （５）請求の範囲第３項の組換えＤＮＡ断片を含むα＿
   ２−プラスミンインヒビターの発現プラスミド。
6. （６）請求の範囲第４項のプラスミドにより形質転換さ
   れた大腸菌。
7. （７）請求の範囲第５項のプラスミドにより形質転換さ
   れた大腸菌。
8. （８）請求の範囲第６項の形質転換菌によるα＿２−プ
   ラスミンインヒビターの製造方法。
9. （９）請求の範囲第７項の形質転換菌によるα＿２−プ
   ラスミンインヒビターの製造方法。