JPH02163099A - 酵素触媒反応達成法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素−触媒反応の達成法、該方法に使用する
ための新規な化合物及び該新規化合物の製造法に関する
。

非水性溶媒の使用を含む多くの酵素−触媒反応が知られ
ている。かかる反応はしばしば少量の水の存在を当てに
しており、酵素保持物質の付近に水性相の形成をもたら
す。次いで、酵素−触媒反応は水性相中で起こることが
できる。

非水性溶媒の使用を含む酵素−触媒反応は、はぼ１９０
０年以来知られているが、しかし、産業的に殆ど使用さ
れておらず、主に好奇心でもって注目されている。しか
し、これらの反応に関連する文献報告の数の増加が、最
近、それら及びそれらに関連するに問題に産業的興味を
もたらしている。これらの反応に関連する一問題はｐＨ
の測定である。

非水性溶媒の使用を含む酵素触媒反応は、しばしば、水
と混和しない溶媒を使用し、このように水と混和しない
溶媒を使用する系は、次の３種に分類できる：即ち、 Ａ）直接的に接近容易な水性相があり、ｐＨ探針を使用
できる系； Ｂ）透明なミクロエマルジョン（Ｉ０−１００００個の
分子からなる水滴）を含み、且水性相に溶解可能な指示
薬を使用できる系；及び Ｃ）水性相がｒ熱力学的に存在」するが、しかし接近容
易でない系である。

本発明に関連して関係のある系は、分類Ｃ）のようなも
のである。かかる系についての文献には：（Ｉ）キャン
ポウ（Ｃｘｍｂｏｕ）氏及びクレバノフ（Ｋｌｅｂ−ｘ
＋＋ｅｖ）代著、Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌ、＆　Ｂｉｏｓ
ｎｇ、、第２６巻、第１４４９頁（Ｉ９８４年）（水溶
性染料の添加を検討）：及び（ｉｉ）カセルス（Ｃａｓ
ｓｅｌｌｓ）氏及びバーリング（■ａｌｌ−ｉｏｇ）代
著、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、＆　Ｂｉｏｅｎｇ、、印刷
中、！９８９年発行予定（より多くの水による水層の希
釈及びｐＨメーターの使用を検討）−等がある。

本発明者等は、現在、水性相から非水性相を分離するこ
となく非水性相に添加することにより、非水性溶媒の使
用を包含する酵素−触媒反応中にｐＨの決定に使用でき
る多くのフルオレセイン誘導新規化合物を調製した。修
正したフルオレセイン系化合物を生成させる今までの試
みは、通常水溶性染料を生成することを意図し、従って
、今までの化合物は、本発明者等が調製しｔ；化合物と
異なる構造を有する。

本発明では、接近容易でない酵素を含有する第一の水性
相及び水と混和しない溶媒を含有する第二の実質的に非
水性相である二相からなる反応混合物中で酵素−触媒反
応を達成するための方法を提供するものであり、非水性
相中には構造式（Ｉ）：に！ 又は構造式（■）： は異なる）であり；そしてＲ２は水素原子又はその他の
任意の基（個々のＲ２は互いに同一か若しくは異なる）
である。）を有する化合物が存在し、該化合物は、分光
特性を観察し、それから水性相のｐＨを計算することに
より水性相のｐＨを測定する目的のために存在する。

更に、本発明では、本発明者等は、構造式（■）：ｔ （式中、α位及びβ位は水素原子によって置換されてい
てもよいか又は１若しくは２個の原子からなる橋架けを
介して共に結合されていてもよく、それらの原子は置換
基を有してもよく；Ｒは置換若しくは未置換の炭化水素
基又は置換若しくは未置換のアミド基であり；Ｒ，は水
素原子又はその他の任意の基（個々のＲ１は互いに同一
か若しく又は構造式（■）： （式中、α位及びβ位は水素原子によって置換されてい
てもよいか又は酸素原子を介して共に結合されていても
よく：Ｒｏは置換若しくは未置換の炭化水素基（しかし
、Ｒ４及びＲ３の総てが水素原子の場合、メチル基又は
エチル基であることができない）又は置換若しくは未置
換アミド基であり；Ｒ４は水素原子、ハロゲン原子又は
ＮＯ７基（個々のＲ，は互いに同一か若しくは異なる）
であり；Ｒ３は水素原子又はアルキル基（個々のＲ２は
互いに同一か若しくは異なる）：そしてＲ６は水素原子
、メチル基、エチル基又はＲである。）を有する化合物
を提供する。

更に本発明では、発明者等は、フルオレセイン又は置換
フルオレセインを硫酸の存在下でアルコールと反応させ
る工程を含む、構造式（ＩＩＩ）’：ていでもよいか又
は酸素原子を介して共に結合されていてもよく；Ｒは置
換若しくは未置換の炭化水素基又は置換若しくは未置換
のアミド基；Ｒ４は水素原子、ハロゲン原子又は−ＮＯ
７基（個々のＲ４は同−若しくは異なる）；そしてＲ６
は水素原子又はアルキル基（個々のＲ２は同−若しくは
異なる）である。）の化合物の製造法を提供する。

構造式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の好適な化合物は、α位
及びβ位が酸素原子を介して共に結合されており、Ｒ１
及びＲ，の総てが水素原子であるものであり、各々、下
記の構造式（Ｖ）及び（■）：（式中、α位及びβ位は
水素原子によって置換されを与える。

構造式（Ｉ［Ｉ）及び（ＩＶ）のうち特に好適な化合物
は、Ｒｏが下記の基：即ち、イソプロピル基、オクチル
基、シクロヘキシル基、フェニルエチル基、ネオペンチ
ル基（即ち、（ＣＨｚ）ｘ−Ｃ−ＣＨｚ−１，３、７ジ
メチルオクチル基又は３，７．１１−トリメチルドデシ
ル基のうちの−である。

一般に、構造式（Ｉ硫酸）及び（ＩＶ）の化合物では、
ＲＯが炭化水素基である場合、直鎖状及び分校鎖状双方
のアルキル基、シクロアルキル基並びに芳香族アルキル
基を包含するいずれの炭化水素基でもよく、未置換炭化
水素基が好ましい。Ｒｏが炭化水素基である場合、３〜
２０個の炭素原子を有するアルキル基が好ましく、特に
、８〜１５個の炭素原子を有するアルキル基が好ましい
。Ｒ２がノ＼ロゲン原子の場合、臭素が好ましく、Ｒ，
とじて−ＮＯ□基を使用する場合、構造式（ｎＩ）及び
（ＴＶ）中のいくつかのＲ４が−Ｎ０２基であるがその
他はハロゲン原子であること（即ち、構造式中のＲ４は
混合である）ことが好ましい。Ｒ３がアルキル基である
場合、１〜５個の炭素原子を有する基が好ましく、特に
、１〜３個の炭素原子を有する基が好ましい。

本発明の方法において、構造式（Ｉ）及び（ｎ）の化合
物のうちで好ましいものは、構造式（Ｉ［Ｉ）及び（Ｉ
Ｖ）の化合物である。本方法では、これらの化合物は、
普通、異なる状況で使用される。従って、方法が非極性
酸性分子の使用を包含するとき、構造式（ｒ）の化合物
を使用できるが、方法が非極性塩基分子の使用を包含す
るとき、構造式（ＩＩ）の化合物を使用する。どちらの
構造式の化合物でも、中性試薬と共に使用できる。塩基
（プロトン受容体）の存在下では、構造式（Ｉ）の化合
物を、中性体からアニオン体に変換する。酸（プロトン
供与体）の存在下では、構造式（Ｉ［）の化合物を、中
性体からカチオン体に変換する。これらの変化は、可視
範囲のスペクトルの該化合物による光の吸収の変化を伴
い、分光光度計を使用して観察できる。

異なる形体のものは、可視スペクトルの異なる領域に最
も強い吸光度を有する。例えば、Ｒ，が才クチルの場合
の中性体の構造式（ＩＩ［）の化合物は、４ｍ５ｘ＝　
　４５１．９ｎｍ　（ξ１５９８９）であるが、アニオ
ン体は、λｍａｘ＝　５２１ｏＩｃ（ξ４２６８３）で
ある、２，４，５゜７−テトラブロモフルオレセインｎ
−オクチルエステルの中性体では、４ｍ５ｘ＝　　５４
７ｎｍ　（ξ１８４３２）であるが、アニオン体では、
λｍ！ｘ＝　　Ｓ４７ｎｍ　（６９３ｇ９＋）である。

２，４，５．７−チトラブロモフルオレセインー３．７
．１１−１−リメチルドデンルエステルの中性体では、
λＩＩ＋ａｘ−４７５，５ｎｍ　（ξ１５６４６）であ
るが、アニオン体λｒｍａｘ−５４５，９（ξ７９５９
２）である。従って、もし、構造式（Ｉ）又は構造式（
ｎ）の異なる二形体の最大吸収極大を示す波長における
吸光度が、適切な吸光係数を使用して分光光度計測定か
らの計算により得られるならば、この二形体の相対割合
を計算できる。この情報は、続いてｐ）ｌを決定できる
。

本発明の方法は、実質的に非水性溶媒を包含する酵素−
触媒反応中のｐＨの変化を検出するのに使用できる。反
応媒体の試料を採取し、ｐＨ決定に使用でき、反応の監
視ができる。次いで、いずれかの必要なｐＨに変化をさ
せることができる。

即ち、ｐＨが予め決められた範囲外になった場合、緩衝
液を反応媒体に加え、ｐｉ（を範囲内に回復させること
ができる。

本発明の方法で、構造式（ＩＩＩ）及び（ｒＶ）以外で
、構造式（Ｉ）及び（ｎ）の化合物として使用できる化
合物には、α位とβ位が酸素以外の原子を含有する橋架
けにより結合されている化合物が包含され、例えば、 ＣＨ，Ｎ　　　　　　Ｎ　　　　　　ＣＣ／　　　＼、
／　＼、／　＼、／　＼又は／　＼のような基である。

本発明の方法は、実質的に非水性溶媒の使用を包含する
あらゆる酵素−触媒反応を実施するのに使用できる。酸
性試薬を使用し、且構造式（Ｉ）の化合物の使用が適切
であるような反応の例には、リパーゼ酵素を使用するエ
ステルの合成がある。

本発明の方法は、トリクロロエタン又はジエチルケトン
のような溶媒を使用して反応を実施するのに非常に有用
である。本発明の方法の経過中に存在する水性相の割合
は、酵素に依存して変動する。

例えば、その割合は凍結乾燥後に残留する水の量である
可能性がある。それは、酵素１分子当たり２００分子で
ある可能性がある。キモトリプシン酵素の場合、Ｉｇの
酵素当たり１ｇまでの水である可能性がある。

非水性溶媒を使用する酵素−触媒反応中のｐＨの決定に
における使用の外に、本発明の化合物はその他の用途を
有する。これらの用途には、溶媒抽出において重要な特
性若しくは特質である、二相系の混合中の界面の面積の
決定がある。混合している間の、系のイオン化の程度は
、混合の程度に依存し、混合度の尺度を与える。

本発明の化合物を調製するのに、いずれがの好適な方法
を使用できる。構造式（Ｉ）の化合物の調製のｔ；めの
適切な方法には、硫酸の存在下でフルオレセイン若しく
は置換フルオレセインとアルコールとを反応させる工程
がある。この工程は、窒素若しくはアルゴン等の不活性
ガスのもとで、１００〜＋　３０　’Ｏの範囲の温度で
実施するのが好ましい。

好ましくは、酸は濃硫酸である。本発明の化合物の基本
構造を有する生成物を生じる、フルオレセインとアルコ
ールとの反応が起こる工程の後、基本構造に置換基を導
入する追加の１工程若しくは数工程があってもよい。例
えば、基本工程の生成物を臭素と反応させて、Ｒ，とし
て臭素原子を導入できる。

次の実施例により、本発明を例証する。

実施例１ ３°、７．１１トリメチルドデカン−１−オール（５ｇ
）に固体状フルオレセイン（６，５ｇ）を加えた。混合
物を、濃硫酸（０，５ｍ１）の存在下で、Ｎ０°Ｃ１不
活性雰囲気下で９時間攪拌した。冷却後、反応混合物を
希水酸化ナトリウム溶液中に溶解させた。このアルカリ
溶液を十分に酢酸エチルで抽出した。

次いで、酢酸エチル抽出物を希水酸化ナトリウムで洗浄
し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させて、赤色の
油状物（５，３ｇ）を得た。

薄層クロマトグラフィーを使用するこの油状物の分析は
、Ｒｆ値０．４（溶離溶媒：酢酸エチル）の生成物を示
した（未反応材料を伴っていた）。

ヘキサンの２０％酢酸エチル溶液から１００％酢酸エチ
ルまで、徐々に溶媒の極性を増加させる、油状物のシリ
カゲルカラムクロマトグラフィーにより、未反応のアル
コール、未反応のフルオレセイン及び最終の粗エステル
生成物（＋、ｉｇ）を得た。

酢酸エチルを用いて溶出する予備的薄層クロマトグラフ
ィー（シリカゲルＧＦ２６４）を使用して、粗生成物を
精製した。

メタノールを使用して、シリカゲルから精製エステル生
成物（ＲＩＭ　０．４）を抽出し、メタノールを蒸発さ
せて橙赤色の粉末を得た（０．３３ｇ　４１％）。

’　ｎ−ＮＭＲスペクトルは次の結果を与えた：’　Ｈ
−ＮＭＲ ８，０７δ　Ｉｌｌ二重二重線Ｊ・７［１，、ｌｉｔ、
■Ａ７．６４δ　２■多重線■Ｂ ７．３９δ　１■二重二重線Ｊ−７１！、Ｉ■２Ｈｃ６
．５６δ　２■二重二重線Ｊ−７Ｈ２，ｒＢｚ　ｌＩＤ
６．２４δ　２■二重二重線ＪＩＩ７Ｌｌｌ［ｌｙ　Ｈ
Ｆ２．２０δ　２■二重線Ｊ−１■７．［ｌｙ３．９０
δ　Ｚ■エステルのα−Ｃ１１２−１，５５δ　１ＩＩ
Ｉエステルのβ−ＣＨ，−１，１０８１５１１エステル
鎖■ ０．８１δ　６Ｆ［二重線Ｊ＝７■ア「イングロ０．７
９δ　３■二重線−Ｃ１ｌ！Ｊ・７１１゜０．７１δ　
３■二重線Ｊ・７Ｈ，−ＣＨ。

’！１−１−１ｌにより与えられる構造は：＋１Ｄ であった。

ピル」 実施例２ ２．４，５．７−チトラブロモフルオレセインー３．７
．１１−トリメチルドデシルエステルの製造 乾燥メタノール中にフルオレセイン３，７．ＩＩ−トリ
メチルドデシルエステル（ｏ、ｏｓＯを溶解させ、得ら
れた溶液を室温で攪拌した。

攪拌した溶液に臭素（５当量）を加え、得られた混合物
を室温で攪拌した。１時間後、赤色の固体沈澱を形成し
た。更に１時間攪拌を続けＩ；。反応媒体を蒸発乾燥さ
せ、生成物をクロロホルムに溶解させ、濾過し、濾液を
薄層クロマトグラフィー（溶離剤として、７５％酢酸エ
チル−ヘキサン溶液＋１滴の氷酢酸）により分析した。

クロマトグラムはＲｆ値０．６の１成分を示した。

溶離剤として酢酸エチル及び数滴の酢酸を使用して、予
備的薄層クロマトグラフィー（シリカゲルＧ　Ｆ　２５
１）により、生成物を精製しｊ；。

メタノールを使用してシリカから生成物を抽出し、溶媒
を蒸発し、暗赤色の粉末を得た。この粉末をクロロホル
ムに溶解し、溶液を濾過し、濾液を蒸発し乾燥させると
、赤色の粉末を得た。数ｍｌのヘキサンを粉末に加え、
結晶性固体を掻き取ることにより回収した（（Ｉ，６５
６ｇ、７１％）。’Ｈ−Ｎ［スペクトルは次の結果を示
した： ”ＩＩ−ＮＭＲ １、Ｂａ　　ＩＩＩ　二ｍ＝１１ｒ線Ｊ□７Ｂｙ、ｌｌ
１７１１゜７．７１δ　２■多重線■８ ７．４９δ　ｌｉｔ二重二重線Ｊ＝７■７．ｌ■、Ｈｃ
３．９７δ　２８　　ｎｍ　　ａ−Ｃ’Ｆ１ｚ−１，４
９δ　２■　ｎｍ　　β−ｃｎ、−１．１０δ　ＩＳＨ
ａｍ　エステル鎖■０．８４δ　６［１２−イングロビ
ルーＣ■。

０．７９δ　３Ｈ鎖Ｃ−３のメチル ０．５９δ　３ｔｌ　５Ｒｃ−ｙのメチル’　トＮＭＲ
により与えられる構造は：実施例３ フルオレセイン−３，７，１１−トリメチルドデシルエ
ステル（０，０５ｇ）を乾燥メタノール（５ｍ１）に溶
解し、得られた溶液を室温で攪拌した。この溶液に臭素
（Ｉ当量）を加え、反応混合物を室温で３０分間攪拌し
た。

反応混合物を蒸発させて乾燥し、クロロホルムに溶解し
、酢酸エチルを溶離剤として使用し、予備薄層クロマト
グラフィー（シリカゲルＧ　Ｆ　２５４）を使用して分
離した。

Ｒｆ値０．３の成分をメタノールを使用して抽出し、蒸
発させて乾燥し、熱酢酸エチルで再溶解させた。濾過後
、濾液を蒸発させ、赤色固体を得た。

得られた固体をヘキサン中でこすると、赤色結晶性固体
を得た（０．０２５（，３９％）。

ｌ■−ＮＭＲスペクトルより決定した４、５−ジブロモ
フルオレセイン−３，７，１１−１−リメチルドデシル
エステルの構造は以下の結果を与えた。

’Ｅ！−ＮＭＲ ８，０９δ　１■ブロ一ド二重線Ｊ・７＋１７　Ｈ人７
．７６δ　２Ｈ多重線ＨＢ ７．４１δ　ｌｆｔブロード二重線Ｊ＝７ｆｌ、　Ｈｃ
６６６１δ　１■ブロ一ド二重線Ｊ＝７Ｈ，，Ｉｌｌ、
　ＨＦ２．２５δ　２Ｈ二重線ｊ・７Ｈ，ＨＦ３．９４
δ　２Ｈ多重線エステルのσ−ＣＨ２１，５０δ　２Ｈ
多重線エステルのβ−ＣＨ２１，１０δ　１５＋１多重
線エステル鎖水素原子０．８５δ　６Ｈ二重線Ｊ・７［
１，ｒ末端メチル」”Ｉｔ−ＮＭＲにより与えられる構
造は：実施例４ 多くの溶媒中での相対的な溶解性を確認する、その他の
多くのフルオレセインのエステルを調製するために実施
例１の方法を使用した。表１に結果を示す。

表１ これらの結果は次のことを示す：即ち （Ｉ）エステルでは、エステル基が大きくなるほど、水
に対する溶解性が増す； （ｂ）有機溶媒の溶解性は、エステル基の大きさに伴っ
て増加する；及び （ｃ）総てのエステルは水酸化ナトリウムと反応してア
ニオン体のナトリウム塩の溶液を与える。

本発明の方法に使用する好適な化合物は、有機溶媒にす
でに溶解しているとき、水性相に入る傾向のないもので
あり、従って、６及び７のエステルが本発明の方法に最
も有用であることを上記の結果は示す。

実施例５ 水性相のｐＨ変化に応答する指示薬を示すモデルに艷 ペンタン−３−オン中に、指示薬分子２，４゜５．７テ
トラブロモフルオレセインー３．７．Ｉ＋−トリメチル
ドデシルエステルを溶解させ、橙赤色の溶液を生成した
。

この指示薬溶液（ＩＯｍｌ）を、密栓付きガラス製バイ
アルに入った既知のｐＨの、０．１モルのピロリン酸四
ナトリウム水溶液緩衝液（ｌｏｍｆ）に加えた。

手で激しく振った後、有機相を採取し、分光光度計を使
用して分析した。

この手順を、一定の範囲のｐＨ値について繰り返した。

表２に試料の結果を記録した。指示薬の各形体の濃度を
各吸光度の既知の吸光係数より求めた。

表　　２ 指示薬の濃度についてのグラフ）にも示す。

指示薬の濃度と水性相のｐ■］との代数関係は、系に実
験定数を与える。

この定数は、水性相が接近容易でない場合に、類似の二
相系中のｐＨを計算するのに使用される。

実施例６ 表２の項目の意味は次の通りである： ［１１Ａ］（μＭ）指示薬の中性体の濃度（マイクロモ
ル）［Ａ］（μＭ）指示薬のアニオン体の濃度（マイク
ロモル） Ａｓ２．、、　５４５．９ａｍにおける有機相の吸光度
Ａ４７６−５　４７５．５１１１１１における有機相ノ
吸光度これらの結果を、図面（水性相のｐＨに対する２
、４，５．７−チトラブロモフルオレセインー〇−オク
チルエステル（２，４ミリモル）の１．ｌ。

１−）リクロロエタン（ｌＨｌｍｌ）溶液に、固形状の
テトラメチルアンモニウムプロミド（＋、ｇｘ　１０−
４モル）を加えた。得られた懸濁物を、固形物が溶解す
るまで、室温で攪拌した。

上記のようにして調製した溶液を、等量の０．１モルピ
ロリン酸四ナトリウム緩衝水溶液（ｐＨは、酸を加える
ことによりｐＨ６に調整）に加えた。

相を混合すると、黄橙色から暗赤色に変化する二相系を
形成した。暗赤色の強度は、相の混合度に依存した。混
合の停止時に、二相系は回復し、有機相の色は、最初の
黄橙色に戻った。

例えば、可視反射率分光光度計（ｖｉｓｉｂｌｅ　ｒｅ
ｆｌｅ−Ｎａｎｅｅ　５ｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）を使
用することにより、系の測定可能な特性と系中の混合度
との間の相関関係を得、それ故その界面面積を得ること
が可能である。これは、界面面積が重要な変量である場
合、溶媒抽出装置の予備修正に使用できる。

原則として、装置はテトラメチルアンモニウムカチオン
の塩と作用する（上記のプロミドではなくて）。

いずれの非混和性有機相も使用できた。

いずれのフルオレセインのエステルも又使用できる。

【図面の簡単な説明】

図面は、水性相のｐＨと指示薬の濃度との関係を示す図
表である。図表中、縦軸は、指示薬の濃度（マイクロモ
ル）を示し、横軸は水性相のｐＨを示す。 （外４名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、近接容易でない酵素を含有する第一の水性相及び水
   混和性でない溶媒を含有する第二の実質的に非水性相か
   らなる二相を含む反応混合物中における酵素触媒反応達
   成方法であって、前記非水性相中に、構造式（ I ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） 又は、構造式（II）： ▲数式、化学式、表等があります▼（II） ｛式中、α位及びβ位は水素原子によって置換されてい
   てもよいか又は１若しくは２個の原子からなる橋架けを
   介して共に結合されていてもよく、そしてそれらの原子
   は置換基を有してもよく；Ｒは置換若しくは未置換の炭
   化水素基又は置換若しくは未置換のアミド基であり；Ｒ
   ＿１は水素原子又はその他の任意の基（個々のＲ＿１は
   互いに同一か若しくは異なる）であり；そしてＲ＿２は
   水素原子又はその他の任意の基（個々のＲ＿２は互いに
   同一か若しくは異なる）である。｝を有する化合物が存
   在し、該化合物が、分光特性を観察し、それから水性相
   のｐＨを計算することにより水性相のｐＨを測定する目
   的のために存在する前記方法。 ２、実質的に非水性溶媒を使用する酵素触媒反応の間に
   、ｐＨ変化を観察する請求項１記載の方法。 ３、非極性酸性分子を使用し、且構造式（ I ）の化合
   物が存在する請求項１又は２記載の方法。 ４、リパーゼ酵素を使用してエステルを合成する請求項
   ３記載の方法。 ５、構造式（III）： ▲数式、化学式、表等があります▼（III） 又は構造式（IV）： ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） ｛式中、α位及びβ位は水素原子によって置換されてい
   てもよいか又は酸素原子を介して共に結合されていても
   よく；Ｒ＿０は置換若しくは未置換の炭化水素基（しか
   し、Ｒ＿４及びＲ＿５の総てが水素原子の場合、メチル
   基又はエチル基であることができない）又は置換若しく
   は未置換アミド基であり；Ｒ＿４は水素原子、ハロゲン
   原子又はＮＯ＿２基（個々のＲ＿４は互いに同一か若し
   くは異なる）であり；Ｒ＿５は水素原子又はアルキル基
   （個々のＲ＿５は互いに同一か若しくは異なる）；そし
   てＲ＿５は水素原子、メチル基、エチル基又はＲである
   。｝を有する化合物。 ６、式（III）及び（IV）から各々構造（Ｖ）（VI）：
   ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ） ▲数式、化学式、表等があります▼（VI） を与える、α位及びβ位が酸素を介して共に結合され、
   Ｒ＿４及びＲ＿５は水素原子である請求項５記載の化合
   物。 ７、Ｒ＿０がイソプロピル基、オクチル基、シクロヘキ
   シル基、フェニルエチル基、ネオペンチル基｛即ち、（
   ＣＨ＿３）＿３−Ｃ−ＣＨ＿２−｝、３，７−ジメチル
   オクチル基、又は３，７，１１−トリメチルドデシル基
   である請求項５記載の化合物。 ８、フルオレセイン又は置換フルオレセインを硫酸の存
   在下でアルコールと反応させる工程を含む、構造式（I
   II）′： ▲数式、化学式、表等があります▼（III）′ ｛式中、α位及びβ位は水素原子によって置換されてい
   てもよいか又は酸素原子を介して共に結合されていても
   よく；Ｒは置換若しくは未置換の炭化水素基又は置換若
   しくは未置換のアミド基；Ｒ＿４は水素原子、ハロゲン
   原子又は−ＮＯ＿２基（個々のＲ＿４基は互いに同一若
   しくは異なる）；そしてＲ＿５は水素原子又はアルキル
   基（個々のＲ＿５は互いに同一若しくは異なる）である
   。｝の化合物の製造法。 ９、フルオレセイン又は置換フルオレセインをアルコー
   ルと反応させ基本構造（III）′を有する化合物を生成
   させた後、置換基を基本構造上に導入する、少なくとも
   一種の別の工程が存在する請求項８記載の方法。 １０、フルオレセイン又は置換フルオレセインがアルコ
   ールと反応する工程は、不活性ガス下、１００〜１３０
   ℃の温度で実施する請求項８又は９に記載の方法。