JPH0216682A - 細胞増殖状態のモニタ方法及びそのモニタ装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、正確且つ短時間で細胞状態を計測することが
出来る細胞増殖状態のモニタ方法及びそのモニタ装置に
関するものである。

［従来の技術］ マイクロプレートなどの細胞培養容器内で細胞を培養す
る場合、生細胞の濃度が濃くなり過ぎると、フルグロー
スと呼ばれる状態になって、死滅する細胞が出てくる。

　このため、フルグロース状態になる前に、継代培養を
する必要がある。

また、細胞融合を行った場合には、目的とする抗体を産
生じているかどうかを、細胞が増殖してきた適当な時期
にチエツクする必要がある。　これらの継代培養の時期
、抗体産生の時期は、これまで、作業者が顕微鏡を用い
て培養容器内の細胞増殖状態を観察し、経験に頼ってい
た。

［発明が解決しようとする課題］ 経験に頼る従来の方法では、培養細胞の増殖状態および
生細胞濃度の把握は、非常に曖昧なものとなり定量性が
なかった。　また、もし、顕微鏡下で、生細胞の数を数
えようとすれば、非常に時間がかかってしまい、多量の
培養細胞の増殖状態をすべて把握することは困難であっ
た。

顕微鏡の観察に代わり、画像処理による細胞認識方法、
例えば、単に二値化だけで行う方法も提唱されているが
、認識率が悪いものであった。

これは、寒天培地上に形成された細胞コロニーの場合の
ようなバックグランドが単純な場合には、認識が容易で
あるが、培養液中の培養では、死細胞、ゴミ、その他の
異物が含まれているため、バタンおよびバックグランド
が共に複雑であるためである。これを改良する方法とし
て、空間フィルタ処理を用いた方法も提唱されている（
特開昭６２−２０１３３２号公報）。

しかし、この方法は空間フィルタを用いるため、精度は
良いが、時間がかかるという問題点がある。

［課題を解決するための手段］ 本発明は、複雑なバタン、バックグランドを有する場合
にも、正確に且つ短時間で細胞の増殖状態を計測するた
めになされたもので、その第１の発明は、麗微鏡に接続
された撮像装置を介して、画像処理装置に取り込まれ、
デジタル化された細胞画像を、適切な画素数（水平ｎ画
素×垂直ｎ画素：ｎ≧２）のブロックに分割し、ブロッ
ク毎に２次元離散的コサイン変換（ＤｉｓｃｒｅｔｅＣ
ｏｓｉｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ：ＤＣＴ）を施した後
のＤＣＴ係数を用いて、各ブロック内の生細胞の有無を
判別することによって、細胞増殖状態をモニタする方法
を提供するものであり、その第２の発明は、顕微鏡と、
該顕微鏡に接続された撮像装置と、該撮像装置からの信
号をデジタル信号化するＡ／Ｄ変換器と、デジタル化さ
れた画像データを記憶する記憶手段と、画像データを指
定された数に分割する画像分割手段と、分割によって得
られる各ブロックの画像データを２次元ＤＣＴする変換
手段と、２次元ＤＣＴ後のＤＣＴ係数データを記憶する
手段と、記憶されたＤＣＴ係数のパワを計算する手段と
、記憶されたＤＣＴ係数データまたはパワデータのうち
から指定された一部又は全部を用いて判別関数の計算を
行い、得られた数値を基準値と比較する判別分析手段と
、各ブロックの判別結果を記憶する手段と、同一の判別
結果を有するブロックの全画像に対する集合の割合を計
算する演算手段と、計算された割合を出力する出力手段
からなる細胞増殖状態のモニタ装置を提供するものであ
る。

［作用］ 図面を参照にして、本発明を説明する。

第１図は、本発明の細胞増殖状態のモニタ方法の手順を
示すフロー図である。

観察手段である顕微鏡に接続されたテレビカメラ等の撮
像装置を用いて、培養容器中の細胞の画像を画像処理装
置に入力する。

培養細胞画像の取り込みは、１個の培養生細胞の直径が
、指定したサイズのブロックの一辺の大きさの１／２〜
１倍になる倍率、すなわち、分割ブロックのサイズをｎ
Ｘｎ画素（ｎ≧２）とした場合、培養生細胞の大きさは
、一般に１０〜２０μｍφであるので、１画素の大きさ
が、最小１０／ｎ［μｍ］、最大４０／ｎ［μｍ］とな
る倍率で行う、　これは、生細胞が指定されたサイズの
ブロックより大き過ぎても、反対に小さ過ぎても識別効
率が低下するからである。

画像処理装置に取り込んだ画像をデジタル化した後、ブ
ロック分割する。　分割するブロックのサイズは、ｎｘ
ｎ画素（ｎ≧２）のものを用いる２次元ＤＣＴを高速で
行うためには、ｎは２のべき乗であることが望ましい。

次に各ブロックに対して、それぞれ、２次元離散的コサ
イン変換を施し、ブロックのサイズと同じ次数のＤＣＴ
行列を用いて行う、　−例に、ブロックサイズを８画素
×８画素に設定した場合に用いる８次のＤＣＴ行列は、
第３図に示す式（１）％式％ ２次元ＤＣＴ係数の行列Ｙｆｉ８゜（ｎ行ｎ列）は、分
割したブロック内の輝度値の行列をＸ−０（ｎ行ｎ列）
とすると、式（２）で与えられる。

Ｙａ、、＝　　Ｄ、Ｘ、、、Ｄ、　　　　　　（２）こ
こで、ＹＩＩＸＩＩ　：　ｎＸｎ　　ＤＣＴ係数の行列
Ｘ　ａｘａ　：　ｎ　Ｘ　１１画素サイズのブロックの
輝度値の行列 ：ｎＸｎ　　ＤＣＴ行列 ：Ｄｆｉの転置行列 ｎ　：ｎ≧１の整数 である。

Ｄいは、 ＝　１　　　：　　　ｔａ：１．２，３．　・−−、ｎ
−１で与えられる。

このＤＣＴ後の係数行列Ｙ、。の各値は、ＤＣＴ行列で
表される各シーゲンシ成分の振幅を表している。　特に
、ｎの値が２のべき乗の場合、式（２）に示す行列計算
には、高速アルゴリズムが存在し、高速で計算すること
ができる。（Ｗ、Ｈ，Ｃｈｅｎ等　ＩＥＥＥ　　Ｔｒａ
ｎｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、Ｖ。

１、Ｃ０Ｍ−２５Ｎｏ、９　　ｐ、１００４〜１Ｏ０９
Ｓｅｐ、１９７７） このＹ　ＩＩＸＩＩの全部の値または一部の値を用いて
分割したブロック内に生細胞が存在するか否かを判別す
る。

ブロック内の生細胞の有無の判別には、マハラノビス汎
距離を用いることができる。

ＤＣＴ後の係数行列Ｙ　ｌｌＸ１１の全部またはその一
部を特徴とする特徴パラメータベクトルをｍ、に＝０．
１，２．−　　・・、　　ｎ−１その要素の数をｐ個と
する。

この際、ＤＣＴ後の係数の絶対値を特徴パラメータとし
て採用してもよい。　また、ＤＣＴ後の係数のパワ（２
乗）を特徴パラメータとして採用してもよい、　これは
、細胞像の画素データには、低シーケンシ成分のパワが
大きく寄与しており、判別分析の際にも細胞の有無の相
違は、主として低シーケンシ成分のパワに現れるからで
ある。

また、群数を２とすると、ブロック内の生細胞の有無は
線形判別関数２ ２＝χｔ　Ｒ−１（ア、−足２）− Ｃｚｔ＋７２　）ｔＲ−’（ｘ、　ｔ−Σａ）／’２０
）の符号によって決定することができる。

ここで、χ：特徴パラメータベクトル、χｊ　（ｊ＝１
．２）：各群内の平均値ベクトル、Ｒ：分散・共分散行
列を表し、右肩のｔ、　−１は、それぞれ転置、逆行列
であることを示す。

予め、サンプル画像を用いて２１　＋　２２およびＲ−
１（ｚｔ　　ｘ２”）を求めておけば、各ブロックのＤ
ＣＴ係数またはそのパワをこの式に代入することによっ
て、生細胞の有無を判定できる。

また、培養細胞の増殖度は、生細胞が存在すると判定さ
れたブロック数の全ブロック数に対する割合で表すこと
ができる。

第２図は、第２の発明の細胞増殖状態のモニタ装置のブ
ロック図である。　　（１）は顕微装置、（２）は顕微
装置（１）と接続したテレビカメラ等の撮像装置である
。　撮像装置（２）からの画像信号は、Ａ／Ｄ変換器（
３）によってデジタル化されてフレームメモリ（４）に
記憶される。

一方、（５）はブロック分割器で、フレームメモリ内に
記憶された画像データを、ブロック数入力手段（６）か
ら入力されたブロック数に分割する。　−ブロックにお
ける画像データを２次元ＯＣＴ変換器（７）によって２
次元ＤＣＴを施し、ＤＣＴ係数を算出する。　算出され
たＤＣＴ係数は、ＤＣＴ係数メモリー（８）に記憶され
る。

他の各ブロックにおける画像データについても同様に、
２次元ＤＣＴ係数が算出され記憶される。

（９）は、判別分析に使用するＤＣＴ係数またはそのパ
ワのデータを選択する係数データ選択手段で、選択デー
タ入力手段（１０）から入力された選択されるべき変換
係数に基づいて選択する。

また、係数データのパワを計算する手段を介してもよい
。

選択された係数のデータは、判別分析手段（１１）によ
って、予め結合係数入力手段（１２）から入力され結合
係数記憶設定装置（１３）に設定されている結合係数と
乗算され、各ブロックにおける細胞増殖の有無が判別さ
れる。

各ブロックにおける細胞増殖の有無は、判別分析結果メ
モリ（１４）に記憶され、増殖率計算手段（１５）によ
って、記憶された各ブロックにおける細胞増殖の有無か
ら増殖率が計算される。

（１６）は、増殖率を表示するための出力装置で、例え
ば、プリンタ、デイスプレィ装置等が使用される。

［実施例］ 死細胞、異物等の中に培養生細胞のコロニーが存在する
ような顕微鏡像をテレビカメラ、８ピツ）Ａ／Ｄ変換器
を介して、画像処理装置に入力した。　一つの画像は、
５１２Ｘ４８０画素で構成されており、細胞の直径が４
画素程度になるように入力系の倍率を調整した。

画像のブロック分割は、１ブロツクが８画素×８画素と
なるように行い、式（１）に示した８×８ＤＣＴ行列を
用いて、各ブロック毎に２次元ＤＣＴを施した。

得られた交流ＤＣＴ係数を、ジャミングのバンドの定義
に従って、１４グループに分類し、低シーケンシ成分の
グループから順に１４個のＤＣＴ係数を選択し、それら
のパワを判別分析のパラメータとして用いた。　画像■
から培養細胞の存在するブロックと存在しないブロック
を１００ブロツクづつ抽出し、これらより、式（３）の
Ｒ，；ｔ＋およびマ２を算出した。　ここで、 （ａｔ、ａａ−ａｔＪ＝！Ｒ−’（ｚｔ　　ｚ２）１で
表される結合係数ａ１を求めた。

また、３種類の画像■〜■を対象として、この結合係数
ａ１を用いて実施した識別結果を表１に示す。

この結果、判別関数の結合係数ａ、を求めた画像はもと
より、他の細胞画像についても９０％程度の識別率が得
られた。

ここで、識別率は、 識別率［％］＝（生細胞の有無を正しく判定したブロッ
ク数）／（１画像中の全ブロック数）×１００で求めた
。

表１　識別結果（ブロック数の分布） ［発明の効果］ 生細胞を含む画像の適当なサイズのブロック分割と各ブ
ロックの輝度分布をシーケンシ成分に変換する２次元Ｄ
ＣＴの組み合わせにより、生細胞の特徴を表すシーケン
シ成分の大きさを容易に測定することができるので、複
雑なパターン、複雑なバックグランドを有する画像であ
っても、その中より生細胞を含むブロックを識別するこ
とができる。

また、（イ）ブロックサイズが２のべき乗の場合高速計
算アルゴリズムが存在し、高速に２次元ＤＣＴを行うこ
とができる。　　（ロ）２次元ＤＣＴは、分割したブロ
ックの数だけ行えば良く、フィルタリング等で必要な、
画素毎の処理が不要である。　　（ハ）ＤＣＴ係数の全
部を使わなくても、ブロック内の生細胞の有無を判別す
ることができる。　　（ニ）判別分析の結合係数は、−
度求めれば、各画像について求める必要がない。

以上の理由により、処理を高速で行え、短時間で大量の
培養細胞の増殖状態をモニターすることができる。

従って、継代培養の時期や抗体産生の有無のチエツク時
期を迅速かつ適切に決定でき、同時に行うことができる
。

【図面の簡単な説明】

第１図は２次元ＤＣＴと判別分析を用いた細胞増殖状態
のモニタ方法の処理フロー図、第２図は本発明の細胞増
殖状態のモニタ装置のブロック図、第３図は８次のＤＣ
Ｔ行列式を示す。 （１〉・・・顕微鏡、（２）・・・撮像装置、（３）・
・・Ａ／Ｄ変換器、（４）・・・フレームメモリ、（５
）・・・ブロック分割器、（７）・・・ＤＣＴ変換器、
（８）・・・ＤＣＴ変換係数メモリ、（９）・・・係数
データ選択手段、（１１）・−・判別分析手段、（１３
）・・・結合係数記憶設定装置、（１４）・・・判別分
析結果メモリ、（１５）・・・増殖率計算手段、（１６
）・・・出力装置 −一一一ヰロ 図

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）培養細胞の状態を顕微装置に接続された撮像装置
   で撮り、その画像をＡ／Ｄ変換器にてデジタル化し、次
   いで該画像を適当な画素数（水平ｎ×垂直ｎ：ｎ≧２整
   数）からなるブロックに分割し、各ブロック毎に２次元
   離散的コサイン変換を施した後の変換係数を用いて、各
   ブロック内の生細胞の有無を判別することを特徴とする
   細胞増殖状態のモニタ方法。
2. （２）顕微装置と、該顕微装置に接続された撮像装置と
   、該撮像装置からの信号をデジタル信号化するＡ／Ｄ変
   換器と、デジタル化された画像データを記憶する記憶手
   段と、画像データを指定された数に分割する画像分割手
   段と、分割によって得られる各ブロックの画像データを
   ２次元離散的コサイン変換（ＤＣＴ）する変換手段と、
   ２次元離散的コサイン変換後のＤＣＴ係数データを記憶
   する手段と、ＤＣＴ係数のパワを計算する手段と、記憶
   されたＤＣＴ係数データまたはパワデータのうちから指
   定された一部又は全部を用いて判別関数の計算を行い、
   得られた数値を基準値と比較する判別分析手段と、各ブ
   ロックの判別結果を記憶する手段と、同一の判別結果を
   有するブロックの集合の全画像に対する割合を計算する
   演算手段と、計算された割合を出力する出力手段からな
   る細胞増殖状態のモニタ装置。