JPH02167066A - 細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、細胞を細胞固定化用ゲル内で増殖させる際に
、その増殖に必要なゲル内の空隙量を可及的に多くし、
細胞を短時間にしかも高い細胞密度に到達させる培養方
法に関するものである。

［従来の技術］ 近年のバイオテクノロジーの進歩により、医薬品などの
高付加価値物質の生産が培養細胞で行われている。そし
て生産物質の需要が増大するにつれ大量に細胞を培養す
ることが必要になってきている。細胞を大量に工業的規
模で培養する装置としては、微生物の培養に用いられる
ものと同様のジャーファーメンタ−やエアーリフト型フ
ァーメンタ−が用いられている。

大型ファーメンタ−による大量培養では、大型化による
設備投資費の増大、機械的シェアの増大、培地と細胞と
の分離の困難性、さらには担体からの細胞の剥離、脱落
などの種々の問題点がある。

ところが、上記の問題点は細胞培養の高密度化および固
定化培養という方向で解決されつつある。

そのひとつの方法としてアルギン酸のような細胞固定化
用ゲルの使用がある。即ち、細胞をゲル内に固定化する
ことにより、従来の大量培養で問題とされていた機械的
シェア、培地と細胞の分離の困難さが解決され、培地の
交換率が上昇し、細胞の生育環境が向上し高密度培養が
可能となっている。

〔発明が解決しようとする課題〕

ところで、固定化細胞では細胞と培養液との分離が容易
になるため、培地の交換率を上げることができる。そし
て交換率に比例して細胞密度は上昇する。しかしながら
細胞固定化用ゲル内で細胞を培養するためには、ゲル内
に空隙がなければならず、ゲル当たりの空隙量が到達細
胞密度を左右している。この空隙の形成は、細胞や気泡
を起点としたカチオン濃度勾配の不均一性に起因してい
ると考えられている。この空隙量は、固定化剤のロント
により差があり、またゲル化させる時の条件にも太き（
左右される。この様に現在行われている培養方法では空
隙量をコントロールないしは増加させることができない
という問題点があるＪ特に、多くの有用物質が細胞で生
産されるところから、細胞の固定化による高密度培養法
が待望されている。

本発明は、細胞固定化用ゲル内の空隙で細胞を培養する
ことによる培養法における上記の問題点を解決すべく鋭
意努力の結果なされたものであって、その目的とすると
ころは装着性細胞を固定化用ゲル内で増殖させる時に、
その増殖に必要なゲル内の空隙量を増大させ、細胞を短
時間にしかも高い細胞密度に到達させる培養方法を提供
するものである。

〔課題を解決するための手段） 本発明者らは、上記問題点を解決するために種々研究を
重ねたところ、固形物と細胞とを細胞固定化用ゲルに固
定化することによって、当該ゲル内に空隙が有為に発生
することを見出し、さらに研究を重ねて本発明を完成し
たものである。

即ち、本発明は固形物と細胞とを細胞固定化用ゲルに固
定化することによって生じるゲル内の空隙にて当該細胞
を培養することによる細胞の培養方法である。

本発明において使用される固形物は、滅菌ができる粒子
であれば特に制限はない、その粒径は通常２５ｎｍ〜５
００ｎｍ、好ましくは１００　ｎｍ〜３００ｎｍである
。かかる固形物としては、たとえばコラーゲンビーズ、
ゼラチンビーズ、アガロースビーズ、デキストロースビ
ーズなどの高分子化合物よりなるビーズなどが例示され
る。

本発明で使用される細胞は、増殖を意図する細胞であれ
ば、特に制限はなく動物由来細胞、植物由来細胞、微生
物由来細胞のいずれでもよく、それらは遺伝子組換え細
胞、形質転換細胞などの如何を問わない０本発明によっ
て増殖される細胞の好ましい具体例としては、たとえば
チャイニーズ・ハムスター・オバリー細胞、マウス細胞
などの付着依存性動物細胞、ハイブリドーマ、血球系細
胞などの付着非依存性動物細胞、植物カルス、昆虫細胞
などが例示される。

当該細胞によって生産される物質としては、たとえばエ
リスロボエチン、組織プラスミノーゲンアクチヘータ、
インターフェロン、インターロイキン１１インターロイ
キン２、インターロイキン３、モノクローナル抗体、イ
ンシュリン、成長ホルモンなどが例示される。

本発明において使用される細胞固定化用ゲルは細胞を固
定化しうるちのであり、かつ固形物と細胞との存在によ
って空隙が発生するものであり、しかもゲル化反応を行
わせる際に細胞に与える障害が少なく、また形成された
ゲルを通して、細胞により生成されたベプタイドや蛋白
質などの産生物が流出してくるものであれば特に制限さ
れるものではない。かかる細胞固定化用ゲルとしては、
具体的にはアガロース、Ｋ−カラギナン、アルギン酸、
アルギン酸塩（ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカ
リ金属塩など）などの天然高分子、ポリビニルアルコー
ル、光架橋性のポリエチレングリコール、ポリプロピレ
ングリコールなどの合成高分子などが挙げられる。

細胞固定化用ゲルは固形物１部に対して、１〜３０部程
度の容量で使用される。

また、細胞固定化用ゲルは細胞１部に対して、１〜３０
部程度の容量で使用される。

〔作用〕

本発明においては、まず細胞および固形物を細胞固定化
用ゲルに固定化させる。ここに固定化とは細胞固定化用
ゲル内へ細胞および固形物を封じ込めることをいう。

一般に、当該固定化は目的とする細胞を細胞固定化用水
溶液と混合し、２価カチオンを添加したり、温度を上昇
させたり、または温度を下降させたりしてゲル化させ、
細胞を閉じ込めるなどの手段によって行われる。たとえ
ば、細胞固定化用ゲルとしてアルギン酸を使用する場合
には、アルギン酸溶液は、２価のカチオンが存在すると
、ゲルを形成して固化するので、この性質を利用して、
アルギン酸カルシウムゲルを形成させることが出来、こ
の際、細胞および固形物を存在させておくことによって
細胞および可溶性固形物の固定化が行われる。即ち、細
胞および固形物（たとえば、コラーゲンビーズ）の培地
浮遊液とアルギン酸塩水溶液とを混合し、これを塩化カ
ルシウム溶液中に滴下すると、アルギン酸カルシウムの
ゲルビーズが形成されて、それに伴って細胞および固形
物のアルギン酸カルシウムのゲル、即ち細胞固定化用ゲ
ルへの固形物および細胞の固定化が行われる。

その際、アルギン酸塩水溶液は通常０．５〜５％、好ま
しくは０．７５〜３％程度の濃度であることが好適であ
る。また、塩化カルシウム溶液は５〜２００ｍＭ、好ま
しくは１０−１００ｍＭであることが好適である。固形
物の培地浮遊液（固形物の含有量は、通常１〜１００程
度、好ましくは３〜５０程度である）とアルギン酸塩水
溶液との混合割合は、前者１重量部に対して後者０．５
〜２重量部程度である。

その後、固形物が可溶性のものであれば、所望によって
、可溶性固形物を溶解させることが好ましい、かくして
、当該固形物の溶解後に生じた空隙にも細胞の増殖が起
こる。当該溶解手段は可溶性固形物の種類などによって
異なるが、通常加熱処理、酵素による分解などが例示さ
れる。加熱処理は通常３５〜４２℃程度に加熱すること
によって行われる。特に、ゼラチンビーズは３７°Ｃ程
度に加熱することによって溶解させることができる。

また、酵素による分解において使用される酵素は、固形
物の種類によって変わりうるちのであり、たとえばコラ
ーゲンビーズに対してはコラゲナーゼが使用される。細
胞に対する障害が少ないことから、酵素による溶解が好
ましい、たとえば、可溶性固形物がコラーゲンビーズで
ある場合には、これをコラゲナーゼ溶液に浸漬してコラ
ーゲンビーズを溶解させる。かくして、コラーゲンビー
ズの溶解した後の空隙にも、細胞が増殖することになる
。

（実施例〕 次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、以
下に記載する例は本発明を限定するものではない。

実施例１ 培養装置として、１．５２スピンナーフラスコを使用し
た。また、細胞としてマウス細胞を使用し、培地として
は、ＤＭＥ培地＋１０％ＦＣ３を使用した。

コラーゲンビーズ、細胞および無菌の２％アルギン酸ナ
トリウム溶液を用意する。コラーゲンビーズ浮遊液と２
％アルギン酸ナトリウム溶液とのｌ：２（重量比）混合
液に抗ＴＰＡ抗体産生細胞浮遊液を等量混合した。これ
を５０ｍＭ塩化カルシウム生理食塩液の中に滴下し、ア
ルギン酸カルシウムのゲルビーズを調製する。この状態
で約２０分間放置後、コラゲナーゼ溶液に置換する。そ
のまま、３７°Ｃ数時間インキュベート後、培地で洗浄
し培養を開始する。培地交換を３日間に１回行って２１
日間培養を行った。

本発明による細胞培養法により、アルギン酸カルシウム
ゲル内に空隙が生じていることが第１図から明らかであ
る。

また、第２図は培！１２１日目を示したものであるが、
コラーゲンビーズを起点とした空隙とコラーゲンビーズ
を溶解した後に生じた空隙両方に細胞が高密度に増殖し
ていることがわかる。

（発明の効果〕 以上述べた如く、本発明により細胞固定化用ゲル内に細
胞増殖可能空隙を多量に調製することができ、これによ
って到達細胞密度を高めることができる。かくして細胞
の産生ずる、エリスロボエチンなどの医薬品などとして
有用な蛋白質の生成量の向上を図ることができるという
効果を有する。

【図面の簡単な説明】

第１および２図は、培養時の細胞を示すところの生物の
形態に関する写真である。 第１図は、本発明の培養法による培養前の写真である。 第２図は、 本発明の培養法による培養後の写真 である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 固形物と細胞とを細胞固定化用ゲルに固定化することに
   よって生じるゲル内の空隙にて当該細胞を培養すること
   を特徴とする細胞の培養方法。