JPH02167231A - ＴＧＦ―βによる乾癬の治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、表皮細胞、特にケラチノサイトの増殖阻害剤
、及び増殖性皮膚疾患治療剤に関する。

乾磨どは表皮の増殖速度が高することにより特徴づけら
れる慢性皮膚病のことであるっ過剰に増殖する表皮にお
ける主要細胞はケラチノサイトである。ケラチノサイト
ハトランスフオーミング成長因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍ
ｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ　）　　ＴＧＦ−α
によって刺激を受は成長する。培養ケラチノサイトを外
因性のＴＧＦ−αにさらすと、内因性ＴＧＦ−αのため
のメツセンジャーＲＮＡレベルの増加ｆｐたす、このよ
うにケラチノサイトの成長因子サイクルは自己増殖型の
ものである。

乾解症の皮膚標本の基底真皮には、免疫系の細胞、顕著
にはリンパ球及びマイクロファージの浸潤がある。これ
ら免疫細胞により分泌された因子類も表皮の増殖を刺激
する。

免疫細胞によって産生された刺激因子類としてはインタ
ーロイキン−１ルびインターロイキン−２のようなサイ
ト力イン類があげられる。

トランスホーミング成長因子β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉ
ｎｇｇｒｏｗｔｈ　　ｆａｃｔｏｒ　　ｔｙｐａ　　β
）（ＴＧＦ−β）として知られる一群のペプチドが細胞
の成長及び分化を制御している。これら成長制御ポリペ
プチドは、大いに細胞のタイプに依存した、細胞の増殖
を刺激したり及び抑制したりすることを行なうことがで
きる。ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２は共に正常の上皮
細胞に働いてがなりの抗増殖作用を示す。さらに、ＴＧ
Ｆ’−βＶｉ、またクラス■抗原の発沖を制御し、炎症
反応を抑制する。加えて、ＴＧＦ−βは免疫機能の制御
剤として有用で、リン、を球の芽球化、β細胞及びイン
ターリューロイキン（１ｎｔａｒｌ＠ｕｌｅｕｋｉｎ　
）による抗体の分泌及びサイト力イン誘起の他の関連し
た現象を阻害しつる。

ケラチノサイｌ上皮由来のものであるうそれゆえ、表皮
肥厚症（ａｃａｎｔｈｏｓｉｓ　）に分類される皮膚病
のうちに見出される増動症がこれら抗増殖作用因子によ
って阻止しつるかどうかを決定することには関心があっ
た。さらにはＴＧＦ−βは免疫反応を抑制して乾鮎症を
緩和するかどうかを決定することにも関心があったっ 関連文献 ＴＧＦ−βという名の一群の化合物のレビューは５ｐｏ
ｒｎｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　　（１９８６）２
３３：５３２　５３４によって示されている。ＣＩＦ−
β（軟骨誘導因子　Ｂ（ｃａｒＮｌａｇｅ−ｉｎｄｕｃ
ｉｎｇ　　ｆａｃｔｏｒ　１１　）　）とＴＧＦの構造
及び機能関係は、５ｅｙｅｄｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、
　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、（１９８７）２６２：１９４６−１９４９に
ょって示されている。また、５ｅｙｅｄｌｎ　ａｔ　ａ
ｌ、、Ｐｒｏｃ。

２２６７−２２７１参胛。

〔課題の解決〕

本発明は高い表皮増殖性で特徴づけられる皮膚病を治療
するための新規な組成物及び方法に関し、その組成物は
少なくとも一つのトランスホーミング成長因子β（ｔｒ
ａｎａ−ｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ
β）またはその同族体（ｃｏｎｇｅｎｅｒａ　）を含有
するものである。該組成物は、サイトキニンを含むマイ
トジェンにより起された表皮の刺激増殖という増殖性の
症状を阻止するのに用いられる。該組成物は局所的に問
題のＦｊ！膚に適用しうる。好１しくは角質層を通して
吸収されるようにしｆＣ調剤のかたちで適用しうる。

図面の説明 第１図はサル（５１ｍ１ａｎ）ＴＧＦ−β　ｃＤＮＡの
ヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示している。

ｐＴＧＦ−βの１６００ｂｐインサ一ト部をＭ１３ｍｐ
１８及びＭｌ　３ｍｐ１９クローニング・ベクター中に
サブクローン化しくＹａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　ａ
ｔ、　　ａｌ、、　１９８５）、ジデオキシチエインタ
ーミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ、ａｌ、。

１９７７）’ｚ用いて両方のストランドの配列を決めた
。ヒトのＤ　Ｎ　Ａ　Ｎ、列とサルのそれとは示した場
所以外は、同一である（点線）；ヒトのタンノ（り質と
サルのそれとの間のアミノ酸の差異は、上側に示されて
いる。成熟ＴＧＦ−βの＾配列は四角でかこったところ
で、シグナルＲゾチドは上側の棒線を引いたところであ
る。５′端の非翻訳領域のパリンドローム（ｐｍ口ｎｄ
ｒｏｍａ　）も上側に棒線を引いて示しである。

第２図Ｆｉ、ｐｒａｎｚ拡散室（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ　
ｃｈａｍｂｅｒ）を示す。

＠３図は局所用ＴＧＦ−βを受は入れた拡散室全体のプ
ールされたレセプター溶液から回収された［！５ｓ］の
ＨＰＬＣクロマトグラフィーを示している。溶媒として
ＰＢＳを用いてゲル−濾過をして分離した。前もって注
入されたマーカー標準をもとにピークの釦カよその分子
量をしるした。

第４図は４種の皮膚クリーム基材かものＴＧＦ−βの回
収予を示している。

以下本発明を更に具体的に説明する。

本発明に従えば、乾鮮（ｐａｏｒｉａｓｉｇ　）及び関
連した皮膚疾患を治療するため、表皮のケラチノサイト
のマイトジェン刺激による成長を阻止するための方法及
び組成物が提供される。咳組成物はＴＧＦ−βの一連の
アミノ酸配列の少なくとも一部と実質的に同一のアミノ
酸配列を有するポリペプチドを含有する。反対に作用し
うるケラチノサイト変異閃子としてｔｌＥＧＦ及びＴＧ
Ｆ−αがあげられる。

サルＴＧＦ−βＤＮＡのヌクレオチド配列及びヒト及び
サルのＴＧＦ’−βのアミノ酸配列は第１図で与えられ
る。

成熟ＴＧＦ’−β１は次の配列を持つ：Ａ−Ｌ−Ｄ−Ｔ
−Ｎ−Ｙ−Ｃ−Ｆ−８−８−Ｔ−Ｅ−に−Ｎ−Ｃ−Ｃ−
Ｖ−Ｒ−Ｑ−Ｌ−Ｙ−Ｉ−Ｄ−Ｆ−Ｒ−に−Ｄ−Ｌ−Ｇ
−Ｗ−に−Ｗ−Ｉ−Ｈ−１−Ｐ−に−Ｇ−Ｙ−Ｈ−Ａ−
Ｎ−Ｆ−Ｃ−Ｌ−Ｇ−Ｐ−Ｃ−Ｐ−Ｙ−Ｉ−Ｗ−８−Ｌ
−Ｄ−Ｔ−Ｑ−Ｙ−８−に−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｌ−Ｙ−Ｎ−
Ｑ−Ｈ−Ｎ−Ｐ−Ｇ−Ａ−８−Ａ−Ａ−Ｐ−Ｃ−Ｃ−Ｖ
−Ｐ−Ｑ−Ａ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｌ−Ｐ−Ｉ−Ｖ−Ｙ−Ｙ−
Ｖ−Ｇ−Ｒ−に−Ｐ−に−Ｖ−Ｅ−Ｑ−Ｌ−８−Ｎ−Ｍ
−１−Ｖ−Ｒ−８−Ｃ−に−Ｃ−８成熟ＴＧＦ−β２は
次の配列を持つ： Ａ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ａ−Ｙ−Ｃ−Ｆ−Ｒ−Ｎ−Ｖ−Ｑ−Ｄ
−Ｎ−Ｃ−Ｃ−Ｌ−Ｒ−Ｐ−Ｌ−Ｙ−Ｉ−Ｄ−Ｆ−に−
Ｒ−Ｄ−Ｌ−Ｇ−Ｗ−に−Ｗ−Ｉ−Ｈ−Ｅ−Ｐ−に−Ｇ
−Ｙ−Ｎ−Ａ−Ｎ−Ｆ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｐ−Ｙ−
Ｌ−Ｗ−８−８−Ｄ−Ｔ−Ｑ−Ｈ−８−Ｒ−Ｖ−Ｌ−８
−Ｌ−Ｙ−Ｎ−Ｔ−Ｉ−Ｎ−Ｐ−Ｅ−Ａ−８−Ａ−８−
Ｐ−Ｃ−Ｃ−Ｖ−８−Ｑ−Ｄ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｌ−Ｔ−Ｉ
　−Ｌ−Ｙ−Ｙ−Ｉ　−Ｇ−に−Ｔ−Ｐ−に−Ｉ　−Ｅ
−Ｑ−Ｌ−８−Ｎ−Ｍ−Ｉ−Ｖ−に−８−Ｃ−に−Ｃ−
８各アミノ酸を示す一文字の表示は次のと釦りである：
Ａ＝アラニン；Ｒ＝アルギニン；Ｎ＝アスパラギン；Ｄ
＝アスパラギン酸；Ｃ＝システィン；Ｑ＝グルタミン；
Ｅ＝グルタミン酸；Ｇ＝ニブリシンＨ＝ヒスチジン；Ｉ
＝イソロイシン；Ｌ＝ロイシン；に＝リジン；Ｍ−＃オ
ニン；Ｆ＝フェニルアラニン；ｐ＝ニブロリンＳ＝セリ
ン：Ｔ＝スレオニン；Ｗ−ドリフトファン；Ｙ＝チロシ
ン；■＝バリン。

当該組成物のうちの配列は、ＴＧＦ−β前駆ポリペプチ
ドを含めて、ＴＧＦ−β分子の断片の配列に和尚するも
のでよいっ該組成物は、表皮の細胞、特にケラチノサイ
トの増印金阻害するというＴＧＦ−βの餌察された生物
活性のもととなっている分子の部分に実質的に相当する
配列を含んでいてよい。

本発明の、組成物は、活性部分として、少なくとも約８
個のアミノ酸、通常中々くとも約２５個のアミノ酸、よ
り一般的には少なくとも約３５個のアミノ酸の少なくと
も１個のＴＧＦ−β、全長１でのＴＧＦ’−βまたはＴ
ＧＦ’−βの前駆ポリペプチドを有していてよいう好１
１〜く目、該組成物はＴＧＦ−βのホモダイマーを含ん
でいる。ホモダイマーとは少なくともそれぞれ８個のア
ミノ酸の同一のアミノ酸鎖二本からなるポリペプチドで
ある。その二本の鎖を結合させる好１し７い方法け、分
子間ジスルフィド結合によるもので、そこでけ各釦は少
なくとも−イ１θのシスティンを含むが、他の結合によ
ることもできる。

該アミノ酸配列は上記の配列に完全に一致している必要
はなく、顕著に目的物の活性に影響を与えることなく、
通常約１個以下のアミノ酸に関しての除去及び付加を含
む、そしてその修飾１１Ｄ−アミノ酸を包含していてよ
いような１個から４個１での保存性又は非保存性の置換
により修飾されていてよいことがわかる。それゆえ、該
ポリペプチドは、挿入、削除、及び置準のような、そし
て保存性あるいは非保存性のいずれかのようないろいろ
な改変にかけられてよく、そのような改変はある場合に
はその使用にあたり利点があろう保存性の９＝とＦ′ｉ
、Ｇ、Ａ：Ｖ、Ｉ、Ｌ：Ｄ。

Ｅ；Ｎ、Ｑ：Ｆ、Ｔ：に、Ｒ：Ｓ、Ｙ、Ｗのよう４組合
せである。

ＴＧＦ−β乃びその同１４一体ｄいろいろな方法で得ら
れる。

そハらはウシの骨及びヒト血小板のような天然にある原
料から得られる。その製造法としては次のものがあげら
れる：Ｒブチドは既知のプロトコールに従った市販の各
種自動合Ｗ装置を用いて同相で合成し、つる。参照、例
えば、Ｓｔｅｗａｒｔａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ、　　５ｏｌ
ｉｄ　Ｐｈａａｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅａｉ
ｓ。

Ｚｎｄｅｄ、、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｔｃａｌ　Ｃｏ
ｍｐａｎｙ　（１９８４）；Ｔａｍ　　ｅｔ　ａｌ、、
Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、（１９８３）、１０５：
６４４２゜さらに、それらは絹換えＤＮＡ技術を用いて
製造しうるっＴＧＦ−βのサルの遺伝子を持つチャイニ
ーズハムスター卯単細胞（ＣＨＯ）をその生育培地中で
ジヒドロ葉酸還元酵素ｆｄｈｆｒ）遺伝子により増幅を
かけて高レベルでその遺伝子を発現させ、そしてその培
地から得られる。形質転推され７’ｖＣ１１０＃ｌ胞か
らのＴＧＦ−β前駆体ポリペプチド及びホモダイマーを
得る方法は、Ｇｅｎｔｒｙ　　ｅｔ、ａｔ、Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ　　ａｎｄ　　ＣｅｌｌｕｌａｒＢｔｏｌｏｇ
ｙ（ｊ９８７）７：３４１７−３４２７及び１９８８年
１月２５日米国出願の米国特許出願第１４７゜８４２号
に：＆’、？されてかり、それらはここトて参考資料と
してあげられる。ＴＧＦ−βｔｉｈその断片ｆ１１９８
８年１月２５日米国出願の米国特許出願第１４８，２６
７号に記載されているように組換え技術を用いて製造し
つる。その資料もここに参考としてあげられる。

ＴＧＦ−βにいろいろな精製法を用いて実質的に細胞成
分のないように精製しうる。これらの技術としては、溶
媒抽出、ゲル１過クロマトグラフイー、逆相ＨＰＬｅ、
［気泳動、イオン交揶りロマトグラフィー、アフイニテ
イクロマトグラフイー等があげられる。

培養に用いる場合、トランスホーミング成長因子はいか
なるを椎動物由来Ｃ’）ものでよく、必ずしもその細胞
と同じ由来である必要はない。しかしながら、前孔動物
の治療のためには、免疫反応の可能性を少なくするため
天然由来の成分と実質的に均一である成分を伸出するこ
とが好豊しい。

通常核成分け、宿主から得た天然起源のもののアミノ酸
配列と、５モル嘩より少なく、エリ一般的にｉｉ２モル
予より少なく異なっている。

ＴＧＦ−β又はその同族体は一般に問題の皮膚に適用す
するためのクリーム又は、軟膏基材に入れて製剤化され
る。

ＴＧＦ−β又はその同族体は一つの化合物として用いて
よい。該化合物は、普通約５０優の純度で及び完全に純
粋なもの１でであってよいつ該ポリペプチドは処置用組
成物中に上皮細胞の増殖を阻止するｔを入かられる；一
般的には培養ケラチノサイトの５０優以上の阻害が約２
０〜約４゜ｎｆ／ｌｎｌの成熟ＴＧＦ−βで達成しうる
。ケラチノサイトの増殖を阻止するのに最も有効なＴＧ
Ｆ−βの濃Ｉｇ′け培養ケラナノサイト中に−ｇｔざ筐
な濃度のＴＧＦ−βを加λ、細胞増殖の阻害ｔをモニタ
ーすることＫより６１１１定される。

阻止のために求められる情は使用されるＴＧＦ−βの相
対力価に佑存して変わる。例えば成熟ＴＧＦ−βより比
較的低い生物活性を持つＴＧＦ−β同族体の場合より高
濃；「が用いられる。成熟ＴＧＦ−βの場合、使用ａ顧
は普通約２０ｎ９／ｌｎｔ　　より大きい。

所望により、ＴＩＣＦ−β含有組成物は問題の部付に該
はプチドを継続的に与える包帯及び仙の包帯剤に入れら
れる。

担体類の特性は広範囲に変えられ、意図した場所及び適
用法によって変えられる。他の鏑用法の例としては注射
及びエアロゾルによる適用法及びデルマジェット（ｄｅ
ｒｍａｊｅｔｌによるような加圧投与法があげられる。

ＴＧＦ−βの生物活性を保存するためには、非イオン性
乳化剤、例λば、ステアリン酸グリセロール、ステアリ
ンＷＩ／ＰＥＧ−４０、ステアリン酸ソルビタンを約０
．５−１５優の製産で；緩和剤９例えば脂肪酸エステル
類を約１−２０優の濃度で；保湿剤、例えばソルビトー
ルを約１−１５％の！！度で；保存剤、例えばベンジル
アルコール又はＫａｔｈｏｎ　Ｃ，Ｇ、を約００１−２
優の濃度で含んでいる。水中油（０／Ｗ）型クリーム状
、白色乳剤性基剤のようなりリーム賦形剤に該ＴＧＦ−
βを製剤化できる。好ましい製剤はまたヒト血漿アルブ
ミン、コラーゲン及びその誘導体のようなタンパク質担
体をクリーム基材の約０．０１−０．１ｆ／ｆ、ＴＧＦ
’−βの安定化を助けるため含んでいる。そのような製
剤からの生物活性ＴＧＦ−βの回収率ｔ′ｌｔ緩和剤と
してジメチコン、　ワセリン（ｐｅｔｒｏｌａｔｕｍ　
）　等’に含むか、あるいはグリセリンのような保湿剤
を含む製剤からのものよりも高い。

当該ペプチドは単独でも少なくとも一つの他の抗増殖性
化合物、例えば、トウモアヌクレオシス　ファクター−
β（ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ−β
）、トウモアヌクレオシス　ファクター−α（ｔｕｍｏ
ｒ　　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　　ｆａｃｔｏｒ−α）、ＴＧ
１ｉ’−β、又は血小板因子４　（ｐｌａｔｅｌｅｔｆ
ａｃｔｏｒ　４　）等と一緒に用いてもよい。

ＴＧＦ’−β乃びその同族体の使用 当該組成物は表皮肥厚症に分類される皮膚病と関連した
増殖庁の治療に及びサイトカイン誘起現象と関連した乾
鮮症状の緩和に使用しうろことがわかった。その生長阻
害作用に加えて、ＴＧＦ−β及びその断片は診断に用い
ることができる。ＴＧＦ−β又はその断片はラジオアイ
ソトープ、酵素、螢光剤、化学ルミネッセンス剤、酵素
フラグメント、粒子等のようなラベル（標識）を結合さ
せることができる。

ＴＦＧ−βを用いた診断の例としては細胞上のＴＦＧ−
βレセプターのｔを滴定することがあげられる。ＴＧＦ
−βレセプターを同定することＦｉＴＧＦ−βの成長阻
害作用に対する細胞の反応性の指標となる。生検標本は
このようにしてＴＧＦ−βレセプターの存在を分析され
うる。そのようなレセプターを欠いている患者は、当該
組成物による治療に好甘しくない。さらＫ、レセプター
の景を測定し、次いで異なった治療法を用いることによ
シ、最適な治療ゾロトコールをとることができる。例え
ば、治療の間隔、又は順序及び／又は使用される治療用
組成物の削成などである。

例えば、ＴＧＦ−βレセプターの数を増やすような治療
法はＴＧＦ−βを含有する組成物に対する反応性を改善
することが期待しうるっ 次なる実施例は説明のためであって、限定するためのも
のではない。

実施例 ＴＧＦ−β：特に示さない限シ、すべての実施例で使用
されたＴＧＦ’−βは５ｅｙｅｄｉｎ　ａｔ、　ａｌ−
の記載のようにしてウシの骨から得られ、はぼ明白な分
子ｉ２４，０００を持つＴＧＦ−β１（ホモダイマー）
である。

実施例１ ヒト　ケラチノサイト　を新生児包皮からトリプシン処
理して取得した。該包皮をペニシリン及びストレプトマ
イシンを含有する０、９＋％食塩水中で洗滌し、室温て
１２時間０．２％トリプシン溶液中に置いた。表皮の上
層を取り除き、該包皮をＭｅＣｏｙ’ｓ　５　Ａ培地に
置いた。該包皮の表面を曲がった鉗子でブラッシングし
て基底ケラチノサイトを取得した。細胞を培地中で洗滌
し、数をかぞえ、４０，０００細胞Ａ−で平面培養した
。

細胞が接触するのを許容して、３７℃、５　％　ＣＯ，
／９５多空気のもと１２〜１８時間培養後、培地をＴＧ
Ｆ−β単独で含む培地で又は１ｏｎり／ｄＴＧＦ−α又
はＥＧＦ’をＴＧＦ−βと共に含む培地で置き換えた。

コントロール培養物は培地のみを与えられた。６日後に
、細胞金１μＣｉ／−トリチウム化チミジンで６時間ノ
モルスする。次に細胞を収穫し、全ＤＮＡはを測定し、
ＤＮＡ中にとシ込１れたトリチウム化チミジンＩＩ−を
決定したつ試験培養物中のＤＮＡの比活性をコントロー
ル培養物のものと比較した。表１に示したように、ＴＧ
Ｆ−β（０，４〜４０ｎｆ／ｄ）は単独の場合もＥ　Ｇ
　Ｆ　（１０ｎｆ／！／）あるいはＴＧＦ−α（１０ｎ
ｆ／−）のいずれと−緒の場合も培養中のヒトケラチノ
サイトの成長を阻害した。このように、ＴＧＦ−βは投
与量に応じてケラチノサイトの増殖を阻害した。ＥＧＦ
又はＴＧＦ−αのケラチノサイト増殖刺激作用をも阻害
した。

実施例２ マウスケラチノサイトをトリプシン浮遊法を用いて調製
した。細胞を１０％加熱不活性化ウシ血清を加えたダル
ベコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　）修飾イーグル培地（Ｄ
ＭＥＭ）中で生育させた。次の日培地を０．０６ｒｎＭ
　Ｃａ”“を含有する新鮮な血清フリー培地（ＤＭＥＭ
／修飾Ｆ−１２培地、３：２）に変え、Ｇ１（Ｇｏ）期
のケラチノサイトを採取し、分化ケ明止した。

試験用細胞を９６−組織培養プレートウェル（Ｆａｌｃ
ｏｎ３０２）中、１０傅ウシ胎児血清を含有するＤ　Ｍ
　Ｅ　Ｍ／修飾Ｆ−１２培地５０μｔあたり３ｘ１０ｍ
細胞数という一定の比率で培養した。試験すべき組成物
を０．２Ｍ酢酸に溶解し、無菌１２Ｘ７５１１Ｎ試験管
（Ｆａｌｃｏｎ　　２０６３）中で凍結戦慄した。相換
えＩＬ−１をＣｏ目ａｂｏｒａｔｉｖｅＢｌｏｃｈｅｍ
ｌｃａｌｓ、Ｌａｘｌｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓ＋　から購
入し、表２で規定した製産で使用した。ＴＧＦ−βはヒ
ト血小板から得られた。

表　２ ９７　　　　　　　２０　　　　　　　５　Ｂ凍結乾燥
された試料を１０肇ウシ胎児崩清を加えたＤＭＥＭに再
懸濁し、平面培養を５時間した後三つの試験ウェルに５
０　ｐｔづつ加えた。３７℃、湿度を加えた５％ＣＯ，
−９５％空気雰囲気中７２時間培養後、［！Ｉｓ■］Ｉ
ｄＵｄｒ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　　ＩＭ　　３５５）％
チミジン類縁体を、５０μｔの培地に（１μＣｉ　／＊
　）に加えた。細胞をさらに２４時間培養した後リン酸
緩衝塩液（ＰＢＳ）で−回洗滌し、次に１０分間２００
　ｐｔメタノールで固定した。

次に細胞を１５分間風乾し、６５℃で２０分間２００　
ｐｔＩＭＮａＯＨ中に溶かした。Ｔｉｔｅｒｔｅｃｈ　
５ｕｐｅｒｎａｔａｎｔＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓ
ｔｅｍ　（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

７８−２１０−０５）を用いて標識化物質を集めた。処
理細胞中への（”’　Ｉ　］　Ｉｄ　Ｕｄｒのとシ込み
を未処理細胞へのとシ込みと比較した減少多として成長
阻害を表わした。

表２に示したように、ＩＬ−１（３０〜１２０単位／己
、）はケラチノサイトに釦けるＤＮＡ合成を刺激した；
ＴＧＦ−β（５〜２０ｎ９／／Ｒｔ）は単にＩＬ−１誘
起のＤＮＡ合成刺激をかさえるのみでなく、ＤＮＡ合成
をさらにもつと阻害した。

実施例３ 表皮細胞増殖のＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２による阻
害の比較 新生児包皮から得たケラチノサイトを実施例１に記載の
ようにして培養した。細胞を平面培養した後、ＢＧＦ（
１０ｎ　ｔ　／＋＋＋ｊ　）あるいＶｉＴＧＦ−α（１
０４／ｍ）のいずれかとＴＧＦ−β２の三つの異なる濃
度の一つとを含む培地（参照表３）でもって、その培地
を置き拌えた。成長因子類と一緒に６日間培養した後、
該培養物を６時間３Ｈ−チミジンでパルスし、細胞のＤ
ＮＡの比活性を測定した。表３に示したように、ＥＧＦ
又はＴＧＦ−αの存在下ではそれは両方とも増殖を活性
化し、そしてＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２のいずれも
細胞の増殖に拮抗した。ＴＧＦ−β因子類はケラチノサ
イト増殆の阻害性（６”いて同じであった。

実施例４ ＴＧＦ−βの経皮吸収性 明らかに約２０００　ＫＤＡ工りも大きな分子景ケ持つ
化合物は皮膚内に良好に浄透しない。それで増強剤（Ａ
ｚｏｎｅ）の作用を評価した。死体よシ得たヒト皮膚を
通してのＴＧＦ−βの経皮吸収を定投与量Ｆｒａｎｚ拡
散モデルを用いたＦｒａｎｚ拡散室中で測定した。使用
に際して、皮膚はセルキャップ（供与体）とセルボディ
（受容体）の間に設置された。真皮はボート部から目的
に応じ注入される等侵食塩溶液によう下側からひたすよ
うにした。温度は、食塩溶液室を取シ囲むウォータージ
ャケットの底部より入り、その上部より循環排出するサ
ーモスタット制御のボーダーにより３７℃に保たれる。

水は定温の浴槽に接続された２個の（上部及び下部）の
ステンレススチール製のマニホールドにより供給され排
出される。塩浴溶液を均等な温度分布とするため、タイ
ミングモーターを備えた外部マグネットによう駆動する
テフロン被覆されたマグネテイツクスターラーを動かす
ことにニジなされた。セルキャップを空気に対して開き
、表皮を実験室環境条件にさらす。開口キャップを通し
て、ミクロピＲットまたは攪拌棒を使用し表皮に試験化
合物の定投与ｔを適用した。

ＴＧＦ−βの吸収を分析するため、次のような方法を行
なう。剖検で背部から得られ、−７０℃で保存されたヒ
ト採取皮膚を室温で急速融解した。付着した角質層を持
つ表皮を、２分間６０℃に加熱した２個のアルミニウム
製ブロックの間に皮膚をはさむことにより、真皮から取
り除いた。

該表皮断片を１ｄの利用表面ｆＪを持つＦｒａｎｚ拡散
室（第２図）に取り付けた。

３０那アセトニトリル、０．０５％ＴＦＡ中の（３５３
１−ＴＧＦ−β（３Ｘ　１０’　ｃｐｍ／　ｐｆ　）を
５０μ２のウシ血清アルブミンを添加したあと５ｐｅｅ
ｄ−ｖａｃ　ａｙｓｔｅｍ中で乾燥した。−旦乾燥後、
［”５）−ＴＧＦ−βを二つに分け、一方を賦形剤−Ｎ
（４％プロピレングリコール、４７．５多エタノール抄
び４多イソプロピルアルコールの水溶液）Ｋ溶解し、他
方を賦形剤−Ｎに５多のＡｚｏｎｅ　（ドデシルアザシ
クロヘプタン）、浸透増強剤の水溶液を含むものに溶解
した。Ａｚｏｎｅ　ＶｉＮｅｌｓｔｏｎ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓによって製造されている、各賦形剤混合物
の２０マイクロリツターを二つの別々の皮膚にビはット
で加えた。各賦形剤のｘｏｐｔを標準物として分析した
つ 該拡散室内の溶液をＴＧＦ−βを適用したあと４．８．
１２．２４．３６及び４８時間の時点で分析のため取り
出し、新鮮溶液で置き換えた。３−の該拡散室内溶液を
１０−のシンチュレーション液ト混合し、シンチュレー
ションカウンター中でカウントした。各試料から得られ
た該拡散室内内の溶液の残りは、他の拡散室内溶液試料
と一緒にされ、−３０℃で保存さ力た。

表 ０．００３８ ０．００３８ ０．００３７ ０．００２１ ０．００２４ ０．００１５ 全浄透景 皮膚十表面 全回収量 ０．１１８ β９．９３５ ９０．０５２ ０．０１９５ ０．０１３６ ０．０１２５ ０．００６０ ０．００６４ ０．００４８ ０．３９０ ８　Ｚ９３７ ４８時間後に該拡散室から表皮を除去し、１　ｖｌ　５
ｏｌｕｅｎｅ−３５０に溶解した。１０−のシンチュレ
ーション液を加え、試料をカウントした。外部標準Ｈカ
ウント法により二つのカウント値を平均し、クエンチン
グを補正（〜た。得られた結果を表４に示した；該結果
はＴＧＦ−βの浸透性がＡｚｏｎｅ　　（５％）によっ
て増進されていることを示している。

実施例５ ヒト皮膚を通しての浸透 乾鮮症の皮膚の角質層が傷害されていることは公知であ
る。ＴＧＦ−βの正常な皮膚と乾癖症の皮膚のうちへの
浸透性の比較を次のようにして行なった。乾蘇症の皮膚
を角膜切開用ナイフを用いてボランティアから０．４　
ｓｒｓだけ取得した。当該表皮試料をＦｒａｎｚセル（
参照、第２図）に置き、ゆっくりと下から塩水を満たし
たうヒト正常皮膚試料をコントロールとして用いた。（
”５）−ＴＧＦ’−β３　Ｘ　１０’　ｃｐｍ／ｐｔ　
ｆ、リン酸緩衝食塩液中の４ｐ９／ｌｎｌ冷ＴＧＦ−β
と混合した。０．７５Ｘ１０’ｅｐｍを含有する水溶ｆ
ｆ５０μｔを皮膚断片の上に置き、拡散室の下側への標
識物の拡散をモニターする。、！＆初の１２時間以内に
３４優の３ＳＳ−標識タンパク質が乾解症の障害のある
部分の下側へ拡散した。しかしながら、標識物のたった
０、４％が正常皮膚の下側に拡散したのみで、このこと
はＴＧＦ−βのより有効な浸透性が乾鮮庁の皮膚で得ら
れることを示している。

表　５ 実施例６ ＴＧＦ−βの活性を保つための各秤非イオン性乳化クリ
ーム基材の作用活性を評価するため、類似のＴＧＦ−β
１を四種のクリーム賦形剤、Ａ％Ｂ、Ｃ１及びＤのうち
の一つに入れて製剤化した。配合Ａ、Ｂ及びＤＦｉ、非
イオン性乳化クリーム基材中に、ワセリン、グリセリン
及びジメチコンを含有している。この三鍾の調剤中の各
成分のパーセンチエイ：）に表６に示した。

表　６ 配合ｃＶｉ、表７に示した成分を含有する水中？［ｔｌ
（０／Ｗ）型、クリーム状白色、乳剤性基材である。

表　７ 調剤Ｃの組成 水 ポリプロピレングリコール−１５ セチルエステル類 セチルステアリルアルコール グリセリルステアレート ソルビトールステアレート ソルビトール ポリソルベート６０ ばンジルアルコール ｌメチルクロロイソチアゾリノン ルび　イソチアゾリノン ０．０５ １Ｋａｔｈｏｎとして販売；　Ｒｏｈｍ　ａｎｄ　Ｂａ
ａｓ、Ｐａ、から入手可っ各クリーム０１２ｆと１又は
１０μりのＴＧＦ−βを含有する２０ｄＰＢＳとを混合
して調剤を製造した。使用する場合には、ヒト血清アル
ブミン（１０μり１０．２ｆ）をその調剤に加えた。ク
リームを室温で１晩インキユハートし、次に蒸溜水１＋
ｄ１０．２Ｆクリームで抽出した。該クリームを遠心分
離し、沿んだ上清′ｆ：Ｂｏｕｒｎｅ　ａｔ　ａｌ、　
５ｃｉｅｎｃｅ（１９８６）：５３１−５３４に記載の
ＴＧＦ−β活性用ラジオレセプター分析法を用いて分析
した。ジメチコン、ワセリン又はグリセリンを含有して
いない調剤ｃＨそれらの成分を含有している調剤よりも
ＴＧＦ−β活性を良好に保存した。しかしながら、ヒト
血清アルブミン（１０μ２１０．２ｆ）の存在下では、
ＴＧＦ−βの回復は調剤Ａ及びＣで似ていた。

以上の結果より、ＩＬ−１、ＥＧＦ及びＴＧＦ−αで誘
起されるケラチノサイトの増殖に拮抗しうるＴＧＦ−β
含有組成物が提供されることが明らかである。このよう
に該組成物は乾鮮のような増殖性皮膚疾患の治療法を提
供しうる。

本明細書で述べた文献及び特許出Ｊ８ｉＦ′ｉすべて本
発明の属する技術分野の当業者の技術水準を示すための
ものである。

それぞれの文献及び特許出願を参考として含めることが
特別に及び個々に指摘されたのと同程度にすべての文献
及び特許出願をここに訃いて参考として含める。

本発明はここに大変詳細に記載されているが、当業者に
とっては本特許請求の精神及びその範囲から逸脱するこ
とがないかぎり、多くの改変及び修飾がなされうること
は明らかである。

【図面の簡単な説明】 第１図はサル（ａｉｍｉａｎ　）ＴＧＦ−β　ｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示している
。ｐＴＧＦ−βの１６００ｂｐインサ一ト部をＭ１３ｍ
ｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９クローニング・ベクター中に
サブクローン化しくＹａｎｉａｅｈ−Ｐａｒｒｏｎ　＠
ｔ、　ａｌ、、　１９８５）、ジデオキシチエインター
ミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ　ａｔ、　ａｌ、。 １９７？）を用いて両方のストランドの配列を決めた。 ヒトのＤＮＡ配列とサルのそれとは示した場所以外は、
同一である（点＃）；ヒトのタンパク質とサルのそれと
の間のアミノ酸の差異は、上側に示されている。成熟Ｔ
ＧＦ−βの配列は四角でかこったところで、シグナルペ
プチドは上側の棒線を引いたところである。５′端の非
翻訳領域のパリンドローム（ｐａｌ　ｉｎｄｒｏｍｅ　
）も上側に棒線を引いて示しである。 第２図はＦｒａｎｚ拡散室（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ　ｃｈ
ａｍｂｅｒ　）を示す。 第３図は局所用ＴＧＦ−ρを受は入れた拡散室全体のプ
−ルされたレセプター溶液から回収さヵた［３５ｓ］の
ＨＰＬＣクロマトグラフィーを示している。溶媒として
ＰＢＳ′５ｒ用いてケ゛ルー「過をして分離した。前も
って注入されたマーカー標準をもとにピークのおおよそ
の分子量をしるした。 第４図１１４ＦＪの皮膚クリーム基材がらのＴＧＦ−β
の回収％を示している。 出願人　オンコシエン　リミテッド パートナーシップ ／′；予２ Ｆｉｇｕｒｅ　４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、少なくとも一つのトランスフォーミング成長因子−
   β（ＴＧＦ−β）又はそのＴＧＦ−βの完全配列のうち
   の少なくとも８個の一連のアミノ酸を含有する断片を有
   効成分とする表皮細胞増殖阻止組成物。 ２、該表皮細胞がケラチノサイトである請求項１に記載
   の組成物。 ３、該トランスフォーミング成長因子−βがＴＧＦ−β
   １又はＴＧＦ−β２である請求項１に記載の組成物。 ４、トランスフォーミング成長因子−βの完全配列のう
   ちに含まれる少なくとも８個の一連のアミノ酸を含有す
   るペプチドを有効成分とするサイトカイン誘起ケラチノ
   サイト増殖阻止組成物。 ５、該サイトカインがＴＧＦ−α、インターロイキンＩ
   及びＥＧＦのうちの少なくとも一つである請求項４に記
   載の組成物。 ６、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、又はその同族体を含
   むポリペプチドを有効成分とする数多くの増殖性表皮細
   胞の増殖阻止組成物。 ７、少なくとも一つのトランスフォーミング成長因子−
   β又はその同族体と生理学的に許容しうる担体とからな
   るケラチノサイト細胞増殖阻止組成物。 ８、該生理学的に許容しうる担体としてさらに表皮浸透
   増強剤を含む請求項７に記載の組成物。 ９、該増強剤として約５〜約５０％の濃度のジメチルス
   ルホキシドを含有する請求項８に記載の組成物。 １０、該濃度が約２５％である請求項９に記載の組成物
   。