JPH0216978A - 白血球の活性化を監視するためのモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、白血球の活性化の監視に有益なモノクロナー
ル抗体（ＭＡｂ）に関し、更に詳細には、インターロイ
キン−２（ＩＬ−２）により活性化された直後のナチュ
ラルキラー（ＮＫ）細胞上、低浮遊密度（ＬＢＤ）７９
７８球のサブセット上及びＴ細胞抗原レセプター複合体
の刺激後ある種のＴリンパ球上に出現する抗原、即ちＬ
ｅｕ２３と結合するモノクロナール抗体に関する。

（従来の技術） ＩＬ−２は、７９７８球及びＮＫ細胞の両方の増殖を可
能にし且つ細胞障害機能を発揮させる。

ＩＬ−２（もしくは組み換えＩＬ−２）にさらすと、抹
消血から単離された休止状態のＮＫ細胞は活性化後４時
間以内に強化された細胞障害活性を示す。この細胞障害
活性は１８時間後に最大になる。

これとは対照的に、殆どの抹消血の白血球は単独のＩＬ
−２に対しては応答しない。増殖を誘導するためには更
にＩＬ−１又はプロタインキナーゼＣのようなシグナル
が要求される。しかしながら、ＬＢＤ　Ｔ細胞のサブセ
ントは単独のＩＬ２にたいして応答し、そしてそれによ
りパ感作された″状態のように見える 一旦活性化されると、白血球は種々の新しい表面抗原を
発現する。例えば、ＩＬ−２による活性化後のＮＫ細胞
は、トランスフェリンレセプタＨＬ　Ａ　−Ｄ　Ｒ及び
ＣＤ２５　　ＩＬ−２レセプターを発現する。しかし、
これらの抗原は、ＮＫ細胞が最も細胞障害性である４〜
１８時間目時間間経過後しばらくまで大多数の細胞上に
は発現されない。従って、ＮＫ活性化及び細胞障害性機
能とこれらの抗原の発現との間には直接的な相関関係は
ない。結論としては、活性化の効果を測定する手段は最
大細胞障害性が終わるまでないことになる。

ＮＫＪａｌ胞の活性化の効果を測定すること及びその後
の細胞障害剤としてのそれらの効果は、例えば、ある種
の病気の治療において重要である。最近、ローセンベル
ブ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）らは、エヌ・エング・ジェイ
・メト（Ｎ、　Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、）＋６４＋８
１４（１９８５）及びローセンベルブの米国特許第４，
６９０，９１５号において、インビボ（ｉｎｖｉｒｏ）
でのＩＬ−２の使用とインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）
でＩＬ−２で活性化された患者の自己由来りンバ球の投
与との組み合わせを含む癌治療の方法を提案している。

投与の前に最大の治療効果を保証するためにリンパ球の
活性化を測定することは有益である。

！Ｌ−２による白血球の活性化に加えて、Ｔ＃Ｉ胞を、
例えばそのＴ細胞抗原レセプター複合体との相互作用に
より刺激することが可能であり、その複合体は抗原レセ
プター中のアルファー及びベーター鎖からなっており、
そして出現しＣＤ３”複合体と命名されている数種の他
の蛋白質と複合体を形成する。そのＴ細胞抗原レセプタ
ーは外来抗Ｗ（例えば、アロ抗原及びウィルス）の認識
を行っており、更に活性化Ｔ細胞に免疫応答を生じさせ
ることができるある種のトランス７オーメシヨンを行わ
せる。また、Ｔ細胞抗原レセプター複合体を介して刺激
された細胞を同定するためのマーカーがあれば更に有益
である。

ハラ（Ｈａｒａ）ら（ヒトＴ細胞活性化：■、１２０−
テトラデカノイル　ホルボール−１３−アセテート、マ
イトジェンおよび抗原によるリン酸化２８ｋＤ／３２ｋ
Ｄジスルフイド結合初期活性化抗ｇ（ＥＡ−ｔ）の迅速
誘導、ジェイ・エクスプ・メト（Ｊ、　　Ｅｘｐ、　Ｍ
ｅｄ、）１６４　：　　１９８８　　（１９８６））及
びコスリチ（Ｃｏｓｕｌｉｃｈ）ら（Ｔ細胞活性化の初
期段階において含まれる抗ｗ、（ＭＬＲ３）の機能的特
徴、ブナス（ＰＮＡＳ）、８４　：　４２０５　（１９
８７））は、最近活性化後短時間の内にＴ細胞上に発現
される表面抗原について述べている。これらの抗原、Ｅ
Ａ−１及びＭＬＲ３は夫々２８ｋＤ及び３２ｋＤの主成
分を有する糖タンパク質である。

ＥＡ−１及びＭＬＲ３はＨＬＡクラス■抗原ではなく、
そしてＭＬＲ３ＭＡｂはＩＬ−１結合をブロックする。

これらの抗原は活性化後１８時間以内にＴ細胞上に出現
し、そして４８時間目でも存在している。

これらの抗原は活性化を検出において有益であるが、本
発明は白血球、及び特にＮＫＩｍ胞及びＴ細胞のサブセ
ットの活性化を検出する別の手段を提供する。

（課題を解決するための手段） Ｌ７８は、ＣＤ８＋アロ抗原−誘導化細胞障害性Ｔ　Ｉ
Ｊンパ球（ＣＴＬ）細胞株によって免疫されたＢａ１ｂ
／ｃマウスの膝窩リンパ節由来の細胞とげっ歯頚の骨髄
腫細胞株５Ｐ２１０　　Ａｇ　　１４とで形成されるマ
ウスのハイブリドーマである。

融合細胞を培養し、そしてアザセリン−ヒポキサンチン
培地で選択した。クローンＬＲ３−８Ｈ３が選択され、
そしてそれをＬ７８と再命名した。

Ｌ７８はブタペスト条約の規定に従ってＡＴＣＣに寄託
番号ＨＢ−９６２７として寄託されている。

Ｌ１８４は、ｒＩＬ−２活性化ＮＫ細胞で免疫されたＢ
ａ１ｂ／ｃマウスからの牌細胞と不ズミの骨髄腫細胞株
５Ｐ２１０　　Ａｇ　　１４とで形成されるマウスのハ
イブリドーマである。クローンＥ１４／Δ９７が単離さ
れ、そしてそれをＬ１８４と再命名した。Ｌ１８４はジ
ョー・フィリップス（Ｊｏｅ　Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ）博士
の研究室（ベクトン・デイキンソン・イムノサイトメト
リー・システムズ（ＢｅｃｋｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ
　Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｏｒｙ　Ｓｙｓｙｔｅｍ
ｓ））に保管されている。Ｌ７８及びＬ１８４によって
生産されるモノクロナール抗体はＡｎｔｉ−Ｌｅｕ２３
として命名され、それらはＩ　ｇＧ、イソタイプを有し
ている。

Ａｎｔｉ−Ｌｅｕ２３は、活性化及び抗原刺激された白
血球上の細胞表面抗原を認識する。ｒＩＬ−２活性化Ｎ
Ｋ細胞上に、活性化後４時間以内にその抗原、Ｌｅｕ２
３が発現し、活性化後７２時間は発現され続ける。Ｌｅ
ｕ２３は、少なくとも２個のＮ−結合炭水化物を伴う２
４ｋＤのサブユニットからなるジスルフィド−結合ホモ
ダイマーである。Ｌｅｕ２３はＩＬ−２に依存する過程
によって誘導され且つリン酸化される。

ＮＫ細胞上のＬｅｕ２３の出現は細胞障害性の発達と関
連していること及びある種のＴ細胞上のＬｅｕ２３の出
現はそのＴ細胞抗原レセプター複合体の刺激に関連して
いることから、Ａｎｔｉ−Ｌｅｕ２３は白血球の活性化
又は刺激を監視することにおいて有益である。

第１図Ａは、５％　２−メルカプトエタノール（２−Ｍ
Ｅ）を含む若しくは含まない２．３％ドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）中でのｌｘｓ　１標識されたｒｌＬ−
２活性化ＮＫ細胞、胸腺細胞及び抹消血Ｔリンパ球のＡ
ｎｔｉ−Ｌｅｕ２３と免疫沈澱物を、１０％ポリアクリ
ルアミドを用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｐ
ＡＧＥ）で分離したオートラジオグラフである。

第１ＵｇＪＢは、第１次元においては非還元状態で７．
５％ポリアクリルアミドで電気泳動し、第２次元におい
ては還元状態で１０％ポリアクリルアミドで電気泳動す
る５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって２次元に分離された第
１図Ａで得られた１２５Ｉ標識されたＩＬ−２活性化胸
腺細胞とＡｎｔｉ−Ｌｅｇ２３との免疫沈澱物のオート
ラジオグラフである。

第２図は、免疫沈澱物をエンド−Ｂ−Ｎ−アセチルグル
コサミニダーゼＦ（エンドＦ）を用いて脱糖鎖し、１０
％ポリアクリルアミドで５ＤＳＰＡＧＥ分析により分離
された第１図Ａで得られたＩｌｌ　１−標識されたＩＬ
−２活性化胸腺細胞とＡｎ　ｔ　１−Ｌｅｕ２３との免
疫沈澱物のオートラジオグラフである。

第３図は、５００Ｕ／ｍｌのｒＩＬ−２で活性化された
ＬＢＤ、ＨＢＤ及びＮＫ細胞について活性化後０，２．
６及び１８時間後にフローサイトメトリーにより測定さ
れた蛍光のヒストグラムであって、活性化細胞は、対照
としてフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）
結合ＩｇＧ及びフィコエリトリン（Ｐ　Ｒ）結合抗−Ｉ
ｇＧ；ＮＫ細胞（ＣＤ１６つについてのＡｎｔｉ　−Ｌ
ｅｕｌｌ（ＦＩＴＣ）及びＡｎｔ　１−Ｌｅｕ２３　（
ＰＥ）；及びＬＢＤ及びＨＢＤ（ＣＤ３”）についての
Ａｎｔ　１−Ｌｅｕ４　（ＦＩＴＣ）及びＡｎｔｉ−Ｌ
ｅｕ２３　（ＰＥ）；で標識されている。

第４図は、５００Ｕ／ｍｌのｒＩＬ−２中で培養された
ＬＢＤ細胞についてのヒストグラムであって、１８時間
後に、対照は第３図と同じ、ＣＤ１６抗原についてのＡ
ｎｔ　１−Ｌｅｕ２３　（ＦＩＴＣ）及びＡｎｔ　１−
Ｌｅｕｌｌ　（ＰＥ）；ＨＬＡＤＲ抗原についてのＡｎ
ｔｉ−Ｌｅｕｌｌ　（ＦＩＴＣ）及び抗−ＨＬＡ−ＤＲ
（ＰＥ）；及びＩＬ−２レセプター抗原についてのＡｎ
ｔｉ−Ｌｅｕｌｌ（ＦＩＴＣ）及び抗−ＩＬ−２Ｒ（Ｐ
Ｅ）で標識されている。

第５図は、種々の濃度のＩＬ−２中で培養されたＬＢＤ
細胞についてのヒストグラムであって、１８時間後に第
３図の対照及びＡｎｔｉ−Ｌｅｕｌｌ（ＦｒＴＣ）及び
Ａｎｔ　１−Ｌｅｕ２３　（ＰＥ）で標識されている。

第６図Ａは、６Ｕ／ｍｌ又は１２Ｕ／ｍｌのｒＩＬ−２
中で培養されたＬＢＤ細胞についてヒストグラムであっ
て、１８時間後にＡｎｔｉ−Ｌｅｕ２３（ＦＩＴＣ）及
びＡｎｔ　１−Ｌｅｕｌｌ　（ＰＥ）で標識されている
。

第６図Ｂは、５１Ｃｒ−標識Ｃｏ１ｏ−２０５癌標的細
胞に対する試験における、未分類のＬＢＤ。

ＦＡＣ３４４０”フローサイトメトリー装置により第６
図Ａから分類され単離されたＣＤ１６”／Ｌｅｕ２３−
及びＣＤ１６”／Ｌｅｕ２３＋細胞についてのエフェク
ターと標的細胞の比率に対する細胞障害性のパーセント
比率のプロットである。

第７図は、第１図Ｂで述べられた１０％ポリアクリルア
ミドによる２次元５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分析された［
”ＰＩ　−オルトリン酸で標識されたＩＬ−２活性化Ｌ
ＢＤ細胞のＬｅｕ２３及び対照免疫沈澱物のオートラジ
オグラフでる。

第８図は、（ａ）無関係な対照ＭＡｂ又は（ｂ）抗−Ｃ
Ｄ３抗体（Ａｎｔｉ−Ｌｅｕ４）によって−晩刺激され
、Ａｎｔ　１−Ｌｅｕ２３　（ＦＩＴＣ）又は無関係な
対照ＭＡｂで標識された白血病細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）
についての蛍光のヒストグラムである。

Ｌ７８ハイブリドーマ及びそれにより生産されるＡｎ　
ｔ　１−Ｌｅ　ｕ　２３ＭＡｂは次のようにして調製さ
れた。５Ｘ１０５個のＣＤ８＋アロ抗原−誘導化細胞障
害性リンパ球細胞株（Ｅ　１　ｘＰＧＦ／ＪＹ、ベクト
ン・ディキンソン・イムノサイトメトリー・システムズ
のベテイ・エバンス（Ｒｅｔ【ｙ　Ｅｖｉｎｓ）博士か
ら入手）をＢ　ａ　Ｉ　ｂ　／　ｃマウスの足踏に０゜
４．７．１１．１４及び１８日目間注射した。

１９日ｌ１マウスを殺しその膝窩リンパ節を切り取った
。そして、細胞を不滅形質細胞腫融合パートナ−５Ｐ２
／Ｑ　　Ａｇ　　１４　（シュルマン（Ｓｈ。

１ｍ１ｎ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２７６　
：　２６９（１９７８））と３５％ポリエチレングリフ
ール中で融合させた。同様の方法及び牌細胞の調製及び
融合が米国特許第４，１７２，１２４号及び第４゜１９
６．２６５号に開示されており、ここに参照により本明
細書に含められる。

融合によって得られる生細胞を、２０％牛脂児血清（Ｋ
Ｃバイオロジカルス（ＫＣＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ））
を含むヅルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の修飾イーグル
培地（ＤＭＥＭ、ギブコ（ＧＩＢＣＯ））の入った９６
穴マイクロカルチヤープレートに撒いた。１５ｍＭのＨ
ＥＰＥＳ　（ギブコ）溶液及びアザセリン−ヒポキサン
チン（それぞれ２μｇ／ｍ＋及び１０−’Ｍの最終濃度
となるように）をブック（Ｂｕｃｋ）らの方法（ブレヌ
ム・パブリジング・コープ（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｉＢ　Ｃｏｒｐ、）のケラネット（Ｋｅｎｎｅｔｔ
）ら編集の１゛モノクロナ一ル抗体及び機能的細胞株”
（１９８４）の中の、ヒトモノクロナール抗体の生産）
に従って選択培地として各式（ウェル）に添加した。こ
の培地の中で増殖したハイブリドーマは、融合後直ぐに
死滅する融合していない骨髄腫細胞及び牌細胞から分離
された。インキュベーションは目視できるコロニーが出
現するまで７〜１０口間続けられた。

細胞が増殖した各式から得られた上清液は、最初に陽性
選択としてＣＴＬを用いたパンデックス免疫アッセイ（
パンデックス・ラボラトリーズ・インク（Ｐａｎｄｅｘ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、））によってス
クリーニングした。５Ｘ１０’個のＣＴＬを９６穴バン
デツクスプレートの各式に添加した。各式には２５〜５
０μ此の上滑液を添加した。３０分後、細胞をＯ，１５
Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。そして
、フルオレセインイソチオシアネートと結合したヤギ抗
−マウスＩｇ抗体を各式に添加した。免疫アッセイで得
られた結果はバンデックス装置を用いて読み取った。

陽性を示した上溝液の入った各式からの細胞を２４大マ
イクロカルチヤープレートに再び撒き、選択培地を含ま
ないＤＭＥＭ中で増殖させた。それらの穴の各々から得
られた上清液は、その上清液をｒＩＬ−２（シータス・
コープ（Ｃｅｔｕｓ　Ｃａｒｐ、））活性化１９２３球
又は休止状態の抹消血白血球のどちらかが入った穴に添
加することによって再びスクリーニングされた。ヤギ抗
−マウスＩｇ（ＦＩＴＣ）を各式に添加した。これらの
穴から得られた染色された細胞はフローサイトメトリー
装置（ＦＡＣＳ　４４０”）による分析に供される。

染色された細胞は前方及び直角方向の散乱及び蛍光につ
いて調べられた。そして、ゲートがリンパ球集団につい
て設定された。この分析から、クローンＬＲ３−８Ｈ３
が選択された。それはブタベスト条約の規定に基づいて
寄託番号ＨＢ−９６２７としてＡＴＣＣに寄託された。

そのノ１イブリドーマはＬ７８と命名された。

しかし、Ｌ７ＢはＬｅｕ２３と結合できるＭＡｂを生産
する唯一のハイブリドーマではない。ジョー・フィリッ
プス（Ｊｏｅ　Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ）博士の研究室（ベク
トン・ディキンソン・イムノサイトメトリー・システム
ズ）に保管されているＬ１８４は、Ａｎｔｉ　−Ｌｅ　
ｕ　２３ＭＡｂを生産するハイブリドーマである。

Ｌ１８４は、前もってｒＩＬ−２中で１週間活性化され
、Ｌｅｕｌｌ＋で分類されたＮＫ細胞でＢａ１ｂ／ｃマ
ウスを免疫することによって開発された。ここで免疫原
として使用されるＣＴＬ細胞株及びＮＫ細胞は活性化リ
ンパ球からなる。マウスは以下のスケ−ジュールに従っ
て活性化ＮＫ細胞で免疫された：２ＸＩＯ’個のＮＫ細
胞を腹腔内（Ｉ　／Ｐ）に０．２８．３５．４２及び４
９日日；及び２Ｘ１０’個のＮＫ細胞を静脈内（Ｉ／Ｖ
）に５０．５１．５２及び５３日目に免疫した。

５４日目に、肺臓を切り取り、上記と同様に牌細胞をＳ
Ｐ２／θ　Ａｇ１４細胞株と融合した。

選択方法は同様に行い、最終的にＥ１４／Ａ９７が選択
された。クローンＥ１４／Ａ９７はＬ１８４と再命名さ
れた。

Ｌ７８及びＬ１８４によって生産されるモノクロナール
抗体はＡｎｔｉ−Ｌｅｕ２３と命名された。それらはＩ
　ｇＧＩイソタイプを有している。

それらは、それらと反応する抗原によって更に特徴ずけ
られている。

Ａｎｔ　１−Ｌｅｕ２３は本質的には全てのＩＬ−２活
性化ＣＤ１６”ＮＫ細胞と反応する。同様に、Ａｎ　ｔ
　１−Ｌｅｕ２３は、ＩＬ−２依存性ＣＤ８”ＣＴＬ細
胞株、ＣＤ４＋破傷風特異性ヘルパーＴ細胞クローン、
ＩＬ−２依存胸腺細胞及びマイトジェン活性化Ｔリンパ
球と反応する。これら夫々の細胞種とＡｎｔ　１−Ｌｅ
ｕ２３の結合は、ＦＩＴＣ又はＰＥ標識Ａｎｔｉ−Ｌｅ
ｕ２３及び夫々他の細胞種についての相補的ＭＡｂを使
用する直接又は間接免疫蛍光によって評価された。これ
らのＭＡｂ（例えば、Ａｎｔ　１−Ｌｅｕｌｌ　（ＣＤ
Ｉ６）、Ａｎｔ　１−Ｌｅｕ４　（ＣＤ３）及びＡｎｔ
　１−Ｌｅｕ１２　（ＣＤ１９））及びその他ここで記
載されているものは特に断らない限りベクトン・ディキ
ンソン・イムノサイトメトリー・システムズより市販さ
れている。標識された細胞はフローサイトメトリー、コ
ンソート４０データ分析システムが組み込まれた装置Ｆ
ＡＣ３４４０”（両方ともベクトン・ディキンソン・イ
ムノサイトメトリー・システムズより市販されている）
によって分析された。これらの分析から得られた結果を
表１に示した。

表１ Ｕ胸壁　　　　　　　　　　　　　区皮塩正常抹消血 Ｔリンパ球（ＣＤ３つ　　　　　　　　Ｏ〜５％陽性Ｉ
ｌＢリンパ球（ＣＤ１９つ　　　　　　　θ〜５％陽性
１〕ＮＫリンパ球（ＣＤ１６つ　　　　　　０〜１５％
陽性１）単球　　　　　　　　　　　　　　　　　弱陽
性顆粒球　　　　　　　　　　　　　　　　５％陽性正
常胸腺細胞　　　　　　　　　　　　　　３０％陽性正
常牌細胞　　　　　　　　　　　　　　　１０％陽性Ｉ
Ｌ−２依存性細胞株 ＣＤ８＋アロ抗原−誘導化ＣＴＬ細胞株　４／４陽性１
ＣＤ４＋破傷風毒素ヘルパーＴクローン　５１５陽性”
胸腺細胞株　　　　　　　　　　　　　４／４陽性２）
ＮＫ細胞株　　　　　　　　　　　　　５／′５陽性２
′Ｐ　ＨＡ−活性化Ｔリンパ芽球（３日）　　　５０％
陽性１）１０人の正常成人血液提供者の分析に基づいて
いる。

２ゝ細胞株の内少なくとも細胞の５０％が検出可能な量
のＬｅｕ２３抗原を発現した数字である。

Ｌｅｕ２３は活性化白血球においては優勢であるが、増
殖している細胞においては優先的に発現されない。複数
の培養されたＴ白血病細胞株（例えば、ＨＰＢ−ＡＬＬ
、ＰＥＥＲ及びＣＥＭ）はＬｅｕ２３を発現しない。同
様に、ＥＢＶでトランスフオームされたＢリンパ芽球様
細胞株、ＣＣＲＦ−５ＲはＬｅｕ２３を発現しない。従
って、Ｌｅｕ２３は本質的には増殖についてのマーカー
とはならないが、活性化白血球には分布している。

Ｌｅｕ２３抗原の生化学的分析を、異なった細胞種が同
一の抗原を発現することを示すために行った。単核細胞
がフィコール／ヒパクエ（Ｆｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑａ
ｅ）　（７フルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉｘ））を用い
て正常抹消血から単離された。プラスチックのベトリ皿
（Ｂ−Ｄファルコン（Ｆａｌｃｏｎ））に固着させた後
、単球及び８９７３球を夫々除去するためにナイロン綿
を通過させ、残った細胞をリン酸緩衝生理食塩水（Ｐ　
Ｂ　Ｓ）中で不連続パーコール（Ｐｅｒｅｏｌｌ）（フ
ァルマシア）勾配上での遠心分離により分画した。その
ＬＢＤ画分はＮＫ細胞（ＣＤ１６”）及び１９２３球（
ＣＤ３つを含んでいる。その高浮遊密度（ＨＢ　Ｄ）画
分には休止状態のＴ　ＩＪンパ球を含んでいた。胸腺細
胞は心臓外科手術を受けている子供から得た。

胸腺細胞、１９２３球及びＮＫ細胞をｒｒＬ２を含んで
いる培地中で２週間培養した。培養されたＮＫ細胞、Ｔ
細胞及び胸腺細胞はケスキーオジャ（Ｋｅｓｋｉ−Ｏｊ
ａ）らのグルコースオキシダーゼ／ラクトパーオキシダ
ーゼ法（バイオケム・バイオフィシ・レス・コム（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｂｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ
、）７４　：　６９９　（１９７７））によって１２Ｊ
　（アマ−ジャム・コープ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃａｒ
ｐ、））で標識された。細胞を５ｍＭの３　［３−コル
アミドプロピルジメチルアンモニオ］−１−プロパンス
ルフェート（ＣＩＡＰＳ）界面活性剤、２０ＫＴユニツ
ト／　ｍ　Ｑのアプロチニン（ａｐｒｏｔｉＩｌｉｎ）
　（シグマ（Ｓｉｇｕｍａ））　及び１ｍＭフェニルメ
タンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）（シグマ）を含
む溶解緩衝液（Ｓ　Ｏｍ　Ｍ　）リス塩酸、１５０ｍＭ
　ＮａＣ１，０，０２％ナトリウムアザイド、ｐＨ８，
０）に溶かした。取り込まれなかった１ｔ６Ｉをダウエ
クス（Ｄｏｖｅｘ）１ｘ８−４００イオン交換樹脂（シ
グマ）を用いて除去し、溶解物はウサギ抗−マウスＩｇ
血清（ペルーフレッツ・バイオロジカルス（Ｐｅｔ−Ｆ
ｒｅｚ　ＢｉｏｌＢｉｃｘｌｓ））又はＡｎｔｉ−Ｌｅ
ｕ２３で被覆されたプロタインＡを持っているホルマリ
ンで固定されたスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔ
ａｐｂｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）によって予
備精製した０免疫複合体は、５％２−ＭＥを含むか又は
含まない２．３％ＳＤＳを含んでいるサンプル緩衝液中
で溶出された。そして、■又は２次元電気泳動を行っＩ
こ。

第１図Ａに示されるように、木質的に同一の構造物がＮ
Ｋ細胞、１９２３球及び胸腺細胞のＩＬ２依存性細胞株
から免疫沈澱した。ＡｎｔｉＬｅｕ２３はジスルフィド
結合した５０〜６０ｋＤの糖タンパク質を免疫沈澱し、
その糖タンパク質は還元により３２ｋＤ及び２８ｋＤの
サブユニットに解離した。第１図Ｂにおいては、二次元
１″対角”５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析によりサブユニットの
ジスルフィド結合を確認し、その対角分析でのサブユニ
ットの相対移動度はこれらのタンパク質が３２ｋＤ＋３
２ｋＤ、３２ｋＤ＋２８ｋＤ及び２８ｋＤ＋２８ｋＤタ
ンパク質の二量体を形成できることを示している。

より詳しい分析は糖鎖の状態を示している。Ｌｅｕ２３
は５０ｍＭ　　ＥＤＴＡ、１％２−ＭＥ及び１％ＳＤＳ
を含む２０μ此のリン酸緩衝液（０゜１ＭＳ　ｐＨ６，
１）を添加することによって前述のスタフィロコッカス
・アウレウス／免疫複合体から溶出した。２０分間のイ
ンキュベーションの後、複合体を遠心分離し、溶出物を
除去し、そしてベレットを５０ｍＭ　　ＥＤＴＡ及び１
％ＮＰ４０を含むリン酸緩衝液中で１０倍に希釈した。

その２５ｉをミクロフーゲ（ｍｉｃｒｏｌｕ（ｅ）管に
入れた。エンド−Ｆにュー・イングランド・ヌークレア
−（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ））を最
終濃度が２３０／ｍｌとなるように加えて、サンプルを
３７００で１６時間インキュベーションした。そして１
０％２−ＭＥを含む等しい体積の２Ｘサンプル緩衝液を
分解を止めるために添加して洟騰した湯浴中に５分間浸
けた。そして、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。

予め決められた最適濃度のエンドＦ酵素による抗原の脱
糖鎖は２４ｋＤの単一のタンパクを示した。第２図を参
照されたい。部分的に脱糖鎖されたものは２８ｋＤの相
対移動度で観察された。エンドＦはペプチドにアスパラ
ギンを介して結合している炭水化物の高マンノース型及
び複合型の両方を切断するので、Ｌｅｕ２３抗原は少な
くとも２部位のＮ−結合糖鎖を伴う２４ｋＤのタンパク
であることが明らかである。変化していない及び脱糖鎖
した。Ｌ　ｅ　ｕ　２３抗原の二次元ＮＥＰＨＧＥ分析
は、３２ｋＤ及び２８ｋＤのサブユニットは単一のＮ−
結合炭水化物の付加によって区別される同一のポリペプ
チドに相当しているようであることを示している。糖鎖
が取り除かれた２４ｋＤタンパク質は、エンドＦ処理に
対して抵抗性のあるアスパラギン結合オリゴ糖を加水分
解できる酵素であるＮ−グリカナーゼによる更なる分解
に対して抵抗性であだ。糖鎖を除去された２４ｋＤタン
パク質中に観察される僅かな差異はＮＥＰＨＧＥ分析中
の尿素によるタンパク質のカルバミル化によって生じた
のか、又は酵素抵抗性炭水化物若しくは〇−結結合オリ
精糖存在によるものであろう。

Ｌｅｕ２３の構造的特徴に加えて、その抗原は単一に制
御されているようであり、そして活性化又は刺激を監視
／検出するための方法を提供している。Ｌｅｕ２３の発
現に必要な条件が決定され！：、、。

ＬＢＤ及びＨＢＤは前述のようにジェイ・エッチ・フィ
リップス（Ｊ、　Ｈ，Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ）、エヌ・エル
・ワーナー（Ｎ、　１．　Ｗａｒｎｅｒ）及びエル・エ
ル・ラニエル（Ｌ、　Ｌ、　Ｌａｎ１ｅｒ）　（ナツト
・イミュン・セル・グロース・レグル（Ｎａｔ、　１ｍ
ｍｕｎ、　Ｃｅ１ｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｒｅｇｕｌ）３　
ニア３　（１９８４））らの方法により単離した。リン
パ球を５００Ｕ／ｍｌのｒｌＬ−２中で培養し、その一
部を２．６、及び１８時間培養後に取り出した。細胞は
ＰＥ−結合Ａｎ　ｔ　１−Ｌｅｕ２３及び、ＮＫ細胞を
同定するためのＦＩＴＣ−結合Ａｎｔ　１−Ｌｅｕｌｌ
　（ＣＤ１６）又は１９７７球を同定するためのＦＩＴ
Ｃ結合Ａｎｔｉ−Ｌｅｕ４　（ＣＤ３）の２色免疫蛍光
によって染色した。

ｒＩＬ−２による刺激の前には、Ｌｅｕ２３はＬＢＤ　
（大きい）Ｔ細胞又はＨＢＤ　（小さい）Ｔ細胞上には
検出されず、ＮＫ細胞のうち少数のものに少量が存在し
た。第３図を参照されたい。しかし、Ｌｅｕ２３はｒＩ
Ｌ−２刺激後６時間までにＮＫ細胞の大多数及びＬＢＤ
画分中のＴリンノく球のあるサブセット上に検出された
。１８時間以内には、ｒＩＬ−２で刺激された実質的に
全てのＮＫ細胞がＬｅｕ２３を発現した。これに反して
、ｒＩＬ−２で刺激されたＮＫ細胞のうちほんの僅かの
ものだけがトランスフェリンレセプターＨＬＡ−ＤＲ又
はＣＤ２５を発現した。第４図を参照されたい。全ての
ＮＫ細胞がｒｌＬ−２にさらしてから１８時間以内にＬ
ｅｕ２３を発現したので、これは全てのＮＫ細胞がＩＬ
−２応答性であることを示している。ｒＩＬ−２と共に
培養液中に７２時間維持されたＮＫ細胞は変わり無＜Ｌ
ｅｕ２３陽性であり続けた。全てのＮＫ細胞がＬｅｕ２
３を得たにもかかわらず、ｒＩＬ−２と共に７２時間の
培養後でさえＬＢＤ画分においてはＴ細胞のあるサブセ
ットのみがこの抗原を発現した。ＬＢＤ画分の中の１９
７７球に対して、ｒＩＬ−２は、７２時間の培養後でさ
えＨＢＤ　（第３図）中の小さな休止状態の１９７７球
の検出可能な程度の比率の細胞上にはＬｅｕ２３の発現
を誘導しなかった。

Ｉ　Ｌ−２によるＬｅｕ２３抗原の誘導は濃度に依存し
ている。第５図を参照すると、１８時間の培養後、低い
レベルのＬｅｕ２３抗原が３　Ｕ　／　ｍｌのｒｌＬ−
２でＮＫ細胞上に誘導され、そして１００Ｕ／ｍｌのｒ
ＩＬ−２では殆どのＮＫ細胞上に抗原を誘導するのに十
分であった。ＴＬ−２はＮＫ細胞上にＬｅｕ２３の発現
を誘導するために必要にして十分だあった。ＦＡＣ３４
４０ＴＭ細胞分類装置を用いてＬＢＤ画分からＣＤ１６
＋リンパ球を単離することによって精製されたＮＫ細胞
は、ｒＩＬ−２と共に１８時間培養した後Ｌｅｕ２３の
発現を獲得した。Ｔりンパ球、単球、又はその他の補助
細胞はＩＬ−２がＮＫ細胞上のＬｅｕ２３の発現を誘導
するためには必要ではなかった。

ＩＬ−２強化細胞障害性とＬｅｕ２３の発現の関連を測
定するために更に研究を行った。ＬＢＤ細胞を血清を含
まない培地中で１００Ｕ／ｍ１ｒＩＬ−２と共に１８時
間、ウサギもしくはヤギの中和用抗−ＩＬ−２血清の存
在下又は不存在下で培養した。

ヤギ抗−ＩＬ−２は１００Ｕ／ｍｌのｒＩＬ２を完全に
中和できる濃度で使用した。ウサギ抗−ｒｒ−−２（ゲ
ンチーム（Ｇｅｎｚｙｍｅ））は１００Ｕ／　ｍ　＋の
ｒｒＬ−２の５０％を中和できる濃度で使用した。１８
時間後、細胞を採取し、エフェクターと標的細胞の比率
が１２：ｌの条件で６１（ｒ標識（アマ−ジャム）され
た標的細胞（即ち、ｃｏ　１ｏ−２０５，ＡＴＣＣＮｏ
、ＣＣＬ２２２）に対する細胞障害性について４時間細
胞を分析した。これらの細胞はＦＩＴＣ−結合対照１ｇ
Ｇ又はＡｎｔ　１−Ｌｅｕ２３（ＦＩＴＣ）で染色して
後フローサイトメトリーによって更に分析された。

表２に示されるように、結腸癌細胞株に対するＩＬ−２
強化細胞障害性及びＮＫ細胞上のＬｅｕ２３の誘導の両
方とも中和抗血清により同程度に阻害された。細胞障害
性の阻害とＬｅｕ２３抗原誘導の阻害の間には定量的な
関係が存在する。これらの結果は両方の現象がＩＬ−２
依存性であり、そして同時に制御されている事象である
可能性を示している。

表２ 無添加 無添加　　　　士 正常血清　　　十 ウサギ抗−ＩＬ−２＋ ヤギ抗−ＩＬ−２十 ４３　　　　　Ｄ Ｉｏｎ　　　　６５　　　　　　　　０第６図Ａを参照
すると、Ｌｅｕ２３抗原発現のレベルが溶解活性と関連
しているかどうかを調べるために実験が行われた。ＬＢ
Ｄ細胞は６　Ｕ　／　ｍ１及び１２Ｕ／ｍｌのｒＩＬ−
２と共に１８時間培養し、モしてＦＩＴＣ結合Ａｎｔｉ
−Ｌｅｕｌｌ及びＰＥ結合Ａｎｔ　１−Ｌｅｕ２３で染
色した。

このような条件の下では低いレベルのＬｅｕ２３がＣＤ
１６”ＮＫ細胞集団上に誘導された。明確な陰性又は陽
性のＬｅｕ２３のサブセットは明らかではないが、陰性
または低いレベル（又は″暗い″）のＬｅｕ２３抗原を
発現するＣＤ１６”ＮＫ細胞及び比較的高いレベル（又
は“明るい”）のＬｅｕ２３抗原を発現するＣＤ１６”
ＮＫ細胞を同定することが可能であった。

第６図Ｂを参照すると、誘導に６Ｕ／ｍｌのｒＩＬ−２
を使用すると、たとえ低いレベルのＬｅｕ２３抗原がＮ
Ｋ細胞集団で検出されたとしても、ＮＫ−非感受性の結
腸癌細胞株（Ｃｏｌｏ−２０５）に対する細胞障害性の
増大は観察されなかった。これらの結果はＬｅｕ２３抗
原が細胞障害活性の検出より前に発現され得ることを示
している。

誘導のために１２Ｕ／ｍｌのｒＩＬ−２を用いると、細
胞障害性はＬｅｕ２３抗原の゛暗い″及び“明るい′の
両方のレベルを発現したＮＫ細胞により媒介された。エ
フェクターと標的の種々の比率において媒介される細胞
障害性の比較は、高レベルのＬｅｕ２３抗原を発現して
いるＮＫ細胞はＬｅｕ２３を欠落しているか又はこの抗
原を低いレベルで発現しているＮＫ細胞よりもより溶菌
性であることが示された。

ＩＬ−２による細胞活性化後備時間か以内に起こるＬｅ
ｕ２３の発現と細胞障害性若しくは溶菌活性の相関性は
、トランスフェリンもしくはＩＬ２レセプターの発現を
待つことなく細胞障害性機能を監視するための手段を提
供する。これは投与の前に細胞の活性化を確認する手段
を臨床医に提供し、その手段は改善された治療法を生む
かもしれない。

例工ば、ローセンベルブ（Ｉｌｏｓｅｎｂｅｒに）によ
り提案されているＬＡＫ治療のための方法（米国特許第
４，６９０，９１５号を参照されたい、ここに参照によ
り本明細書に取り込まれる）において、自己のＬＡＫ細
胞を単離し静脈（Ｉ　／Ｖ）投与の前に３〜４日間ｒｌ
Ｌ−２と混合した。細胞障害性活性はＮＫ−非感受性腫
瘍細胞株を溶かすＬＡＫ細胞の活性によって測定された
。

この長い方法の別法として、ｒＩＬ−２活性化細胞のサ
ンプルがＡｎｔｉ−Ｌｅｕ２３と混合された。ｒＩＬ−
２活性化細胞の染色は直接的蛍光（例えば、Ａｎｔ　Ｉ
−Ｌｅｕ２３をＦＩＴＣ又はＰＥのような蛍光色素やフ
ィコビリンタンパクと結合させる）又は間接的な蛍光（
例えば、ＦＩＴＣ結合ヤ結合ヤギ中スＩｇを用いる）に
よって検出できる。いずれにしても、活性化細胞の染色
の程度は細胞障害性と相関している。従って、サンプル
が採取されている細胞は、その細胞が効果的に活性化さ
れていることを知ってから治療のために投与することが
できる。

同様に、Ｔ細胞抗原レセプターのマイトジェン刺激とＬ
ｅｕ２３の発現の相関は白血球の活性化を監視する別の
手段を提供する。第８図を参照すると、Ｔ白血病細胞株
、ジュルカット（Ｊｕｒｋａｔ）はＡｎｔｉ−Ｌｅｕ４
による一晩の刺激の後Ｌｅｕ２３を発現する。従って、
Ｔ細胞抗原レセプターを介した正常Ｔ細胞の特異的な抗
原（例えば、アロ抗原、ウィルス又は自己抗原）による
生理学的刺激はＬｅｕ２３の発現を招くことができる。

それゆえ、Ａｎｔｉ−Ｌｅｕ２３は、例えばウィルス感
染の兆候を示していると考えられるヒト又は患者からの
白血球と結合させることができる。Ａｎｔｉ−Ｌｅｕ２
３による直接もしくは間接的免疫蛍光を用いることによ
って、Ｌｅｕ２３は検出できる。治療を適切に処方する
ことができる。

結果的には、Ｌｅｕ２３はＩＬ−２刺激の結果として誘
導され且つリン酸化されることが分かった。ＬＢＤ細胞
を洗浄し、１ｍＭグルタミン（ギブコ（ＧＩＢｃｏ））
非−必須アミノ酸、ｌｏｏμｇ／ｍ　１ゲンタマイシン
（ギブコ）及び２％熱熱油活性化馬血清ＫＣバイオロジ
カルス（ＫＣＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ））を補われた２
５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（イルビン・サイエンチフィツク
（Ｉｒｖｉｎ　５ｃｉｅ＋＋ｔｉｆｉｃ））と共にリン
酸を含まない緩衝液（ＭＥＭ無リンすエアーレの塩を修
飾した）中で３７℃で１時間インキュベージョンした。

細胞は、１．２５ｍＣｉ／ｍ　Ｉ　　［”ＰＩ　−オル
トリン酸（キャリアーを含まない、アマ−ジャム−＝＋
−プ）及び８００Ｕ／ｍｌのｒＩＬ−２を含む無−リン
酸緩衝液中に再懸濁した。

細胞を３７℃で３時間インキュベーションし、そして０
．１ｍＭ　　Ｎａ、ＶＯ，，０，４ｍＭ　　ＥＤＴＡ。

１０ｍＭ　ＮａａＰ２０ｔ、１０ｍＭＮａＦ及び０゜１
％ＮａＮ３を含む冷やされたＰＢＳ中で３回洗浄した。

その後、細胞を溶解し、溶解物及び溶出物を前述のよう
に調製した。

第７図を参照すると、３２ｋＤ及び２８ｋＤサブユニツ
トからなるジスルフィド結合した［”ＰＩ−標識タンパ
ク質二量体が検出された。これらのサブユニットは第１
図Ｂに示されたものと同一である。それゆえ、Ｌｅｕ２
３の誘導及びリン酸化は、増殖因子レセプター、Ｔ細胞
抗原レセプター複合体の成分及び膜に存在する他の糖タ
ンパクをリン酸化する細胞内プロタインキナーゼの活性
化を招くリンパ球刺激において観察される結果と類似し
ている。

従って、Ａｎｔｉ−Ｌｅｕ２３は、外部からの共同因子
もしくは補助細胞が存在しない状態で■Ｌ−２にさらさ
れた抹消血ＮＫ細胞及びＴリンパ球のあるサブセット上
に速やかに誘導される抗原を同定する。ＮＫ細胞上にＩ
Ｌ−２で誘導されるＬｅｕ２’３の発現の反応機構は固
体腫瘍標的に対する細胞障害性機能の獲得と密接に関連
しており、それによってＮＫ細胞の活性化についての有
益なマーカーを提供できる。

ここで開示された本発明の変更及び修飾は当業者にとっ
ては容易であろう。従って、これらの記載及び例を制限
的に把握するべきではない。

【図面の簡単な説明】

第１図Ａは、ＮＫ細胞、胸腺細胞及び抹消面Ｔリンパ球
のＡｎｔｉ−Ｌｅｕ２３の免疫沈澱物のポリアクリルア
ミドゲル電気泳動のオートラジオグラフである。 第１図Ｂは、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって２次元に分
離された第１図Ａで得られた免疫沈澱物のオートラジオ
グラフである。 第２図は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分離された第１
国人で得られた免疫沈澱物のオートラジオグラフである
。 第３図は、ｒＴＬ−２で活性化されたＬＢＤ。 ＨＢＤ及びＮＫ細胞についてフローサイトメトリーによ
り測定された蛍光のヒストグラムである。 第４図は、ｒｌＬ−２中で培養されたＬＢＤ細胞につい
てのヒストグラムである。 第５図は、Ｉ　Ｌ−２中で培養されたＬＢＤ細胞につい
てのヒストグラムである。 第６図Ａは、ｒｌＬ−２中で培養されたＬＢＤ細胞につ
いてヒストグラムである。 第６図Ｂは、ＣＤ１６”／Ｌｅｕ２３−及びＣＤ１６”
／Ｌｅｕ２３”Ｊｉｌ胞についてのエフェクターと標的
細胞の比率に対する細胞障害性のパーセント比率のプロ
ットである。 第７図は、２次元５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分析された■
Ｌ−２活性化ＬＢＤ細胞のＬｅｕ２３及び対照との免疫
沈澱物のオートラジオグラフでる。 第８図は、（ａ）無関係な対照ＭΔｂ又は（ｂ）抗−Ｃ
Ｄ３抗体（Ａｎｔｉ−Ｌｅｕ４）によって−晩刺激され
、Ａｎｔｉ−Ｌｅｕ２３　（ＦＩＴＣ）又は無関係な対
照ＭＡｂで標識された白血病細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）に
ついての蛍光のヒストグラムである。 凄、２図 ／／ろ− ’７７− 、−一一 ＋ エツトゝ’　−Ｆ す 光 （Ａ　Ｌｏ３　） ＆３ 図 ＮＫ細肥 大さいＴ細胞 Ｊｌご％ｌ’Ｔ細吃 φ光 （　ＩＬ　Ｌｏ３　） 蛍 光 （４Ｌｏ３） 坑す 凹 蛍 光 （Ａ　Ｌｏｇ　） 蛍光 （ｄ　Ｌａｙ　） 孝２ Ａ） 乙Ｌｌ／ｒｎｌ　ＦＩＬ−２ １２Ｕ／ｒｎｌ　ＦＩＬ−２ 蛍光 （４１−Ｊ） 尾７ 凶 Ａ） ＮＲゆ 尾８ 凹 蛍光 管光 ｆ 続 補 止 書（方式） ％式％ ２、発明の名称 白血球の活性化を監視するためのモノクロナル抗体 ３、補正をする者 一１１件との関係

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ−９６２７の特徴を有するハイ
   ブリドーマ。 ２、ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ−９６２７の特徴を有するハイ
   ブリドーマによって生産されるモノクロナール抗体。 ３、Ｌｅｕ２３に対するモノクロナール抗体をサンプル
   と混合すること、直接的又は間接的蛍光手段によってそ
   の結合を検出すること及びフローサイトメトリーまたは
   蛍光顕微鏡検査手段により蛍光を検出することからなる
   生化学的サンプル中の白血球の活性化を監視するための
   方法。 ４、活性化白血球がＴリンパ球、Ｂリンパ球及びＮＫ細
   胞からなる群から選択される、請求項３記載の方法。 ５、活性化白血球がＮＫ細胞である、請求項４記載の方
   法。 ６、活性化白血球がＴリンパ球である、請求項４記載の
   方法。 ７、モノクロナール抗体がＡｎｔｉ−Ｌｅｕ２３である
   、請求項４記載の方法。 ８、活性化白血球とＡｎｔｉ−Ｌｅｕ２３の結合を検出
   するための手段がＡｎｔｉ−Ｌｅｕ２３を直接的に蛍光
   色素と結合させることによる、請求項７記載の方法。 ９、蛍光色素がフルオレセインイソチオシアネート及び
   フィコビリプロテインからなる群から選択される、請求
   項８記載の方法。 １０、サンプル中の白血球がＩＬ−２で活性化されるか
   、又は外来の抗原、自己抗原、抗−Ｔ細胞レセプター抗
   体もしくは抗−ＣＤ３抗体によってＴ細胞抗原レセプタ
   ーを介して活性化される、請求項３記載の方法。