JPH0216993A - ２’’’―ｏ―デメチルタイロシンの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は２°”°−０−デメチルタイロシンを生産する
ための新規な方法に関するものである。この化合物は、
タイロシン（ｔｙｌｏｓｉｎ）分子のミンノース部分に
おける２°°′−Ｏ−メチル基を欠いている点を除いて
はタイロシンと同一である。

本方法は、組換えＤＮＡ技術を利用することによって得
られる化合物を開示するものである。突然変異ｔｙ＋　
Ｅ遺伝子（デメチルマクロノン−２０−メチルトランス
フユラーゼ遺伝子（１）　Ｍ　ＯＭＴ））を含有する微
生物を、クローンされたｔｙｌＦ遺伝子（マクロノン３
″″−Ｏ−メチルトランスフエラーゼ遺伝子（ＭＯＭＴ
））を含有するプラスミドで形質転換することにより、
２”°−Ｏデメチルタイロシンを生産することかできる
。ＤＭＯＭＴ遺伝子（ｔｙｌＥ）の突然変異は通常、ｔ
ｙｌＦ産物、ＭＯＭＴに由来する３′°　−ヒドロキシ
位の意義のあるメチル化を前もって妨げるものであるが
、しかし、ＭＯＭＴ遺伝子（ｔｙｌ　Ｆ　）を高用量で
投与することを組合わせることにより、２位がメチル化
されていない６−デオキツアロースの３位におけるメチ
ル化が高度の割合て行われる。

２°゛−０−デメチルタイロシンは生物学的に活成経路
内が阻害されている突然変異体の効率的な利用法に関す
るものであり、別の抗生物質を産生ずるストレプトマイ
セス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種間で、生合成遺伝
子を転移させることに関するものでない。抗生物質産生
微生物で使用できるよう改良されたベクターは、さらに
マルパーチダ（Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ）およびホップウ
ッド（Ｄ、　Ａ、　Ｉｌｏｐｗｏｏｄ）のネイチャー　
３０９：４６２（１９８４）に開示されている。しかし
、本発明は、主としてタイロシン生合成経路の突然変異
、およびタイロシン生合成経路の遺伝子をクローニング
することに関連するものである。

最近、抗生物質生合成経路に組換えＤＮＡ技術を適用す
ることが、欧州特許公開、ＥＰＡ　　０２３８３２３　
（１９８７年９月２３日公開、出願番号８７３０２３１
８．８）に記載された。この出願には、抗生物質産生微
生物の抗生物質産生能を高めるためのベクターおよびそ
の方法が開示されている。この方法は、抗生物質生合成
経路内で速度制限する酵素まｔコは他の遺伝子産物を、
非形質転換微生物と比較して高いレベルで提供すること
何であり、抗菌性のタイロシンと同様の抗菌スペクトル
を有している。

近年、抗生物質産生微生物の組換えＤＮＡ技術における
開発および活用は、主として究極的には新規な抗生物質
を生産するためのクローニングベクターの開発に向けら
れていた。新規な抗生物質を得るための従来の方法は、
ムタ合成（ｍｕｔａｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）であり、抗生
物質生合成が遺伝子学的に阻害されている自体栄養体（
ｉｄｉｏｔｒｏｐｈ）に非天然の側鎖前駆体を与えるこ
とである。もう１つ別の方法は、ハイブリッド生合成で
あって、野生型菌株の生合成経路を表現型において阻害
する酵素インヒビターの存在下に、その受容菌株に非天
然の前駆体を与える生合成である。プロトプラストも使
用されており、これは遺伝子背景物（ｇｅｎｅｔｉｃｂ
ａｃｋｇｒｏｕｎｄｓ）の相互種間転移（ｉｎＬｅｒｓ
ｐｅｃｉｆｉｃ　ｔｒａｎｓｒｅｒ）を行うのに良好な
方法である。

特定のハイブリッド抗生物質がホップウッドら［Ｈｏｐ
ｗｏｏｄ、ネイチ＋　−　（Ｎａｔｕｒｅ）、　３］４
　６４２（１９８５）］に議論されているが、本発明は
、タイロシン土台に関連するものである。

本発明は、微生物からは相当量で入手できないと従来で
は考えられていた化合物である２０−デメチルタイロシ
ンの生産方法に，関するものである。ここに、このよう
な生産法は、タイロシン生合成経路内の特定の突然変異
遺伝子の存在下に２”’−ｏ−デメチルタイロシンを産
生ずる微生物を導く特定の遺伝子のコピーを含有してい
る組換えＤＮＡベクターで突然変異微生物を形質転換す
ることによって、得ることができるものである。

これまで知られていなかった化合物である２°″０−デ
メチルタイロシンは現在、突然変異したストレプトマイ
セス ｓ　ｆｒａｄｉａｃ）Ｇ　Ｓ　１　６菌株から微量なが
ら発見されている。しかし、本発明は、組換えＤＮＡ技
術を利用することによって、２°゛−０−デメチルタイ
ロシンを相当量で生産することができる。本発明は、組
換えＤＮＡ技術をさらにストレプトマイセスに適用でき
る点で特に意義がある。既知の天然の抗生物質の２／３
以」二はストレプトマイセスから産生されるので、この
工業的に重要な属に適用できる方法を開発することは特
に要望されているものである。

本発明の目的に照らし、以下のように用語を定義する。

抗生物質−耐性一付与遺伝子：ある抗生物質に対する耐
性を付与する活性をコードしているＤＮＡセグメント。

組ｍ　より　Ｎ　Ａクローニングベクター：付加的なり
ＮＡを追加できる、または既に追加されているＤＮＡ分
子を含有する、選択でき、かつ自律的に複製できるかま
たは染色体に組み込まれている物質であって、これには
プラスミドおよびファージがあるが、これらに限定され
ない。

兜ニブラスミドの複製起点（図中で使用）。

制限フラグメント：１つまたはそれ以上の制限酵素の作
用によって生成される線状ＤＮＡ。

形質転換体・形質転換された、生存可能な受容プロトプ
ラストなどの受容宿主細胞。

！に２［ｆｆｌ　：　２”’−０−デメチルタイロシン
およびタイロシンの構造。

纂旦回ニブラスミドｐＨＪＬ２８４の制限部位および機
能地図。

１４１Ｄニブラスミドｐｘｙｚ１０００の制限部位およ
び機能地図。

本発明は、ストレプトマイセスのタイロシン産生菌株を
培養して２°゛°−Ｏ−デメチルタイロシンを生産する
ための方法であって、該産生菌株が、（ａ）タイロシン
生合成遺伝子ｔｙＩＥの発現を妨げる１つまたはそれ以
上の突然変異（群）を含有し、（ｂ）タイロシン生合成
遺伝子ｔｙｔＦの発現をコードしているＤＮＡを含む組
換えＤＮＡクローニングベクターで形質転換されており
、 培養条件が細胞の増殖、ｔｙｌＦ遺伝子の発現、および
２゛”−Ｏ−デメチルタイロシンの産生に好適な条件で
あること、を特徴とする生産方法を提供するものである
。

さらに、本発明は、組換えＤＮＡクローニングベクター
、および上記の遺伝子とベクターで形質ＬＴ１　’ｊｚ
；　逸：生存可能な受容プロトプラストなどの受容宿主
細胞にＤＮＡを導入して受容細胞の遺伝子型を変化させ
ること。

タイロシン生合成遺伝子：１次代謝産物を、これも抗菌
活性を有することができる抗生物質中間体に変換し、次
いで最終産物タイロシンとする工程における酵素反応に
必須の酵素活性をコードしているか、または酵素活性の
発現を調節する産物をコードしているＤＮＡセグメント
。

阻害性突然変異体：例えば、１つまたはそれ以」二のタ
イロシン生合成遺伝子が欠失するなどの突然変異的な障
害のために、タイロシンを殆ど産生ヒないか、または全
く産生じない微生物。

タイロシン生合成経路叫次代謝産物を抗生物質中間体に
、そしてタイロシンに変換する工程に必須のタイロシン
生合成遺伝子および生化学的反応全体の組。

以下に、添付した図面の説明をする。

ｆｆ１ｌＦＩ：タイラクトン（ｔｙｌａｃｔｏｎｅ）か
らタイロシンへのタイロシン生合成経路。

転換されている２”’−ｏ−デメチルタイロシン産生微
生物、ならびに抗生物質２”゛−０−デメチルタイロシ
ンをも提供するものである。２”０−デメチルタイロシ
ンは、タイロシンと同様の微生物阻害活性スペクトルを
有する抗生物質として有用である。

本発明は、ストレプトマイセス・フラジアエ（ＳＬｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｄｉａｅ）Ｇ　Ｓ　ｌ　６を
プラスミドｐＨＪＬ２８４で形質転換することによって
調製するのが最適である。ストレプトマイセス・フラジ
アエＧＳＩ、６は、ｔｙｌＥ遺伝子の突然変異のため、
タイロシンを産生ずることのできない阻害性突然変異体
である。ｔｙ＋Ｅ突然変異は、ラクトン環に結合したミ
シノース（ｍｙｃｉｎｏｓｅ）前駆体（６−ゾオキシー
Ｄ−アロース（ａｌｌｏｓｅ））の２°゛°位における
０−メチル化を妨げるものである。従って、ｔｙＩＥ遺
伝子が無いことにより、２°゛°位はヒドロキシ基を有
している。ｔｙｌＥ遺伝子は、酵素、デメチルマクロシ
ン２”’−ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＤＭＯＭＴ
）をコードしているので、このｔｙ＋　Ｅ遺伝子は２゛
”−〇−メチル化に関与している。ｔＹＩ　Ｆ産物、マ
クロシン３”パ−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＯ
ＭＴ）による３”“−ヒドロキシ位の有効なメチル化は
、事前の２′ヒドロキシ位のメチル化を必要とするので
、ストレプトマイセス・フラジアエＧＳ　１６＋ｉ、２
”“０−デメチルタイロシンを微量でしか産生じない。

ストレプトマイセス・フラジアエＧＳ］６は現在一般に
入手可能であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）　（ＡＴＣＣ，ｏ　ツク
ビレ、メリーランド２０８５２）に寄託されており、受
託番号ＡＴＣＣ３１６６４の下に入手可能である。

本発明の新規な抗生物質を生産するのに有用なベクター
であるプラスミドｐＨＪ＋、２８４は、タイロシン生合
成経路におけるｔｙｌＦ遺伝子を含有している。ｔｙ＋
Ｆ遺伝子は、マクロシン３”゛−Ｏメチルトランスフェ
ラーゼ（Ｍ　ＯＭ　Ｔ　）　Ｑ−ｑ素’：ｉ：コードし
ている。ＤＭＯＭＴ活性が存在せず（従って、２゛°−
〇−位がメチル基でない）　、ＭＯＭＴが比較的高いレ
ベルで存在する場合、６−ゾオキシアロースの３°”−
ｏ−位が高い割合でメチル化されていることが観察され
る。プラスミドｐ１、ｉ　Ｊ　Ｌ　２８４は、ブタペス
ト条約の下に寄託（１９８６年２月１８ｒＩ）されてお
り、これは、ノーザン・リージオナル・リサーチ・ラボ
ラトリ−（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ
５ｅｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（Ｎ　ＲＲＬ）、
ベリオ、イリノイス６１６０４）のパーマネント・ス！
・ツタ・カルチャー・コレクションとして寄託されてお
り、その一部を構成しているＥ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２　
　ＨＢＩＯＩ／ｐＨＪＬ２８４から入手可能である。こ
れは、受託番号ＮＲＲＬＢ１８０４４の下にプラスミド
の保存貯蔵物（ストックリサーバー）として入手できる
。

本発明をより理解するには、タイロシンがタイロシン産
生微生物内でいかにして生合成されるかを理解しなけれ
ばならない。タイロシンは、３つの糖（ミカロース（ｍ
ｙｃａｒｏｓｅ）、ミカミノース（ｍｙｃａｍｉｎｏｓ
ｅ）およびミシノース（ｍｙｃｉｎｏｓｅ））と結合し
た１６員分枝鎖状ラクトン（タイロノライド）から構成
される。そのラクトンは、脂肪酸生合成に関連している
反応経路に類似していると考えられる経路により、プロ
ピオニル−８−補酵素Ａ分子と２つのマロニル−８−補
酵素Ａ分子、４つのメチルマロニル−８−補酵素Ａ分子
およびエチルマロニル−８−補酵素Ａ分子との縮合によ
り、２つのアセテート、５つのプロピオネート、および
ブチレートから誘導される。この反応には、ｔｙ＋ｃ遺
伝子の産物が必要である。ラクトンの形成、糖の生合成
／結合、および得られた中間化合物のタイロシンへの変
換は遺伝子にコードされた一連の酵素群によって触媒さ
れる。このような酵素群をコードしている遺伝子をクロ
ーニングおよび／または突然変異誘発すれば、この生合
成経路を増幅することができる。

分析によると、タイロシンが一連の生合成工程によって
組み立てられていることが分かる。種々の研究によって
、ストレプトマイセス・フラジアエから排出される検出
できる最初の中間体であるタイラクトンは、以下の工程
を包含する好ましい反応順序によってタイロシンに変換
されることが証明されている： （１）ラクトンのＣ−５ヒドロキシ位へのミカミノース
の付加、（２）Ｃ−２０メチル基におけるヒドロキシメ
チル基への酸化、（３）Ｃ−２０ヒドロキ７メチル基に
おけるホルミル基への脱水素、（４＞　（、−２３メチ
ル基におけるヒドロキシメチルＭへの酸化、（５）（、
−２３ヒドロキシメチル基への６−ゾオキシーＤ−アロ
ースの付加、（６）ミカミノースのイ°−ヒドロキシ基
へのミカロースの付加、（７）デメチルマクロシン（Ｄ
ＯＭＭ）の２′′−ヒドロキシ位へのメチル基の付加、
および（８）マクロシンの３”’−ヒドロキシ位へのメ
チル基の付加により、タイロシンが産生される。タイラ
クトンがタイロシンに変換される好ましい順序の反応に
必要とされる遺伝子には、ｔｙｌＡ、ｔｙｌＦ３、ｔｙ
ｌＬ、　ｔｙｌＭＸｔｙｌ　Ｔ、ｔｙｌＨ，ｔｙｌＤ。

ｔｙｌＪ、　ｔｙｌＫＸｔｙｌｃ、　ｔｙｌＥ、および
ｔｙｌＦがあるが、これらに限定されない。タイロシン
生合成経路の反応式図を添（＝ｆの第１図に示す。第１
図中の各矢印は、その−ヒに位置する遺伝子名（群）で
指示される生合成遺伝子産物を必要とする変換工程を表
す。

既述のように、本発明の新規な化合物は、ＬｙｌＥ遺伝
子に突然変異を含有するタイロシン産生のストレプトマ
イセスを、タイロシン生合成遺伝子ｔｙｌＦを含有する
組換えＤＮＡクローニングベクターで形質転換すること
によって得られる。現在では、例えばｔｙ＋　Ｆなどの
抗生物質生合成遺伝子を単離するための方法は種々のも
のが当業界周知である。例えば、以下の実施例１は、す
べての抗生物質産生微生物に一般に適用できる、ストレ
プトマイセス染色体またはプラスミドＤＮＡを単離する
ための好ましい方法である。染色体またはプラスミドＤ
ＮＡを特定の抗生物質産生微生物から単離した後、調製
したＤＮＡのゲノムライブラリーを、これも当業界周知
である方法によって構築する。例示を目的として、実施
例２では、抗生物質生合成経路の全体をクローニングで
きる可能性を高めるゲノムライブラリーを調製するため
の好えば、ストレプトマイセス・リモサス（ｒｉｍｏｓ
ｕｓ）およびストレプトマイセス・ハイグロスコピカス
（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）は、タイロシン生合成
経路によって天然でタイロシンを産生ずるその他２つの
微生物である。従って、これら２つの微生物も、本発明
の化合物を得るのに使用することができる。ｔｙＩＥ遺
伝子に突然変異を誘発させれば、これらの微生物は本発
明の目的にとっての宿主として使用することができる。

このように、少なくとも１つのＬｙｌＥ突然変異を含有
するタイロシン産生菌株はいずれも、発現可能なｔｙｌ
　Ｆ遺伝子を含有するクローニングビヒクル（クローニ
ング運搬体）で形質転換することによって２′１−○−
デメチルタイロシンの産生菌に変換することができる。

バルブ（Ｂａｌｔｚ）およびセノ（Ｓｅｎｏ）（１９８
１）の突然変異誘発操作法［抗菌剤および化学療法（＾
ｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＡｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈ
ｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）、　２０：２１４−２２５］に
実質的に従えば、ストレプトマイセスをＮ−メチルＮ’
−ニトローＮ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）で処理
することができる。この突然変異誘発ましい方法を開示
している。ゲノムライブラリーを構築すれば、抗生物質
生合成遺伝子を含有するＤＮＡフラグメントは、多くの
方法によって同定することができる。例えば、ある抗生
物質生合成酵素のアミノ酸配列の少なくとも一部分の知
見に基づいてＤＮＡプローブを構築すればよい。次いで
、このプローブを標準的な方法によってライブラリーと
ハイブリクイズさせれば、その酵素をコードしている遺
伝子を含有するＤＮＡフラグメントを検出することがで
きる。もう１つの方法は、抗生物質の生合成が阻害され
ている突然変異体にクローンしたＤＮＡフラグメントを
導入し、抗生物質産生の回復に関してスクリーニングす
ることである。ライブラリーを調製したベクターによっ
ては、そのＤＮＡで直接、突然変異体を形質転換しても
よく、または標準的な方法によって最初に適当なベクタ
ーにサブクローンしてもよい。

当業者であれば、本発明の新規な化合物がストレプトマ
イセス・フラジアエでの産生のみに限定されるものでな
いことは理解するものである。例によって、所望のスト
レプトマイセスのｔｙｌＥ阻害性突然変異閑株が菌株さ
れる。

本発明の目的のために微生物を形質転換するための他の
方法には、例えばプロトプラスト融合、接合およびトラ
ンスダクションなどの遺伝子組換えの伝統的な方法があ
る。これらの方法はいずれも、ＬｙＩＦ遺伝子を突然変
異背景物（ｍｕｔａｎｔ　ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）に導
入するのに使用することができるであろう。

さらに、当業者であれば、本発明がプラスミドｐＨＪ　
Ｌ２８４または他の特定のベクターの使用に限定されな
いことを理解するものである。ストレプトマイセス・フ
ラジアエ、ストレプトマイセス・リモサス、ストレプト
マイセス・ハイグロスコピカスまたは他のタイロシン産
生微生物内で、複製でき、かつ維持または組込みできる
ベクターは、適当なタイロシン生合成遺伝子を有するよ
う改変することができ、従ってこれは、２”’−０デメ
チルタイロシンを生産するのに使用することができる。

タイロシン生合成遺伝子をライゲートすることのできる
このようなベクターには、プラスミドｐｒＪ７０２、ｐ
ｒＪ９０３、ｐｆＪ９２２およびｐｌＪ９４１などがあ
るが、これらに限定されない。プラスミドｐｌＪ７０２
は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシコンか
ら、受託番号ＡＴＣＣ３９１５５の下に入手することが
できる。プラスミドｐｌＪ９０３、ｐｌＪ９２２、およ
びｐｌＪ９４１は、ジョーン・インイ、ス・ストレプト
マイセス・カルチャー・コレクション（Ｊｏｈｎ　Ｉｎ
ｎｅｓ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　
Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ。

ジョーン・インネス・インスティチュート、コルネイ・
レーン、ノルウィッチ、英国、ＮＲ４７ＵＨ）から、そ
れぞれ受託番号３４１７．３４１９、および３３３８の
下に、入手することができる。プラスミドｐ　ＨＪ　Ｌ
　２８０　Ｓｐ　＋−Ｉ　Ｊ　Ｌ　２８４、ｐ）ｆＪ　
Ｌ３１１およびｐ　Ｉ−Ｉ　Ｊ　Ｌ　３　］　５は例え
ば、ｔｙｌ　Ｆなどの各種のタイロシン生合成遺伝子を
含有しており、ノーザン・リージオナル・リサーチ・ラ
ボラトリ−（ＮＲＲＬ）［アグリ力ルチュアル・リサー
チ・サービス（＾ｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　Ｓｅｒ既述のように、ストレプトマイセス・フ
ラジアエＧ５１６を、野生型ｔｙｌ　Ｆ遺伝子を含有す
るプラスミドｐＨＪＬ２８４で形質転換することにより
、２°”−ｏ−デメチルタイロシンが、微量しか産生じ
ない非形質転換Ｇ５１６と比較して際立って多い量で産
生される。ＤＭＯＭＴ活性を欠いた比較的高いレベルの
Ｍ　ＯＭ　Ｔ　ｉＱ伝壬子産物、２位にメチル基が存在
しない６−ゾオキシアロースの３位におけるメチル化の
割合を高めることができる。従って、Ｓ、フラジアエＧ
Ｓ’１６／Ｔ）ＨＪＬ２８４は、本発明の目的にとって
特に好ましい菌株である。

プラスミドｐ　ＨＪ　Ｌ　２８　／ｌは、プロトプラス
ト形質転換によってストレプトマイセス・フラジアエＧ
５１６に導入される。プラスミドｐ　Ｉ−Ｉ　Ｊ　Ｌ　
２８４は抗生物質耐性付与遺伝子（Ｓ、フラジアエＧＳ
］５が感受性を示すチオストレプトンに対する耐性）を
有しているので、チオストレプトンの存在下にプロトプ
ラストを再生することによって形質転換体を選択するこ
とができる。適当な形質ｖｉｃｅ）、米国農務省、ペオ
リア、イリノイス、６１６０　／ｌ　ニ、それぞれ受託
番号Ｂ−１８０４３、Ｂ−１８１４、Ｂ−１８０４６、
およびＢ−１８０／Ｉ　７の下に寄託されている。これ
らのベクターは、Ｓ、フラシアエ中で複製するので、２
０−デメチルタイロシンを生産する本発明の方法にとっ
ては有用なものである。以下の第１表に、本発明の方法
に使用される幾つかのプラスミドを簡単に記載し、例示
する。

第１表 タイロシン生合成遺伝子を含有するプラスミドＥ、　ｃ
ｏｌ　ｉ　ＫＩ２　　　　Ｃ，Ｆ　、　Ｊ　、　　　　
　　Ｂ−１８０４４１１１３１０１／ｐＨＪ！、２８４ Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ　ＫＩ２　　　　Ｌ、　Ｍ　　　　　
　　　Ｂ−１８０４５１１１３１，０１／ｐＨＪＬ３＋
　１ Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２　　　　Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ，Ｊ　　　
　Ｂ−１８０４３１１Ｂ＋０１．／１）ｌｌＪＬ２８０ Ｅ、ｃｏｌｉ　ＫＩ２　　　　　Ｄ、　Ｅ、　Ｆ、　Ｈ
，Ｊ　　　　　Ｂ−１８０４７ＪＭＩ０９／ｐＨＪＬ３
１５ １９８６年２月１８日 １９８６年２月１８日 １９８６年２月１８日 １９８６年２月工８日 転換体を同定した後、チオストレプトンを存在させて繁
殖しざえすればプラスミドが維持される。

２°”−ｏ〜デメチルタイロンンを産生させるため、米
国特許第４．４＋９，４４７号に既に記載されているデ
ミジノシルタイロシンの発酵条件下で、得られた形質転
換体を増殖させる。デミジノシルタイロシンに関して米
国特許第４，４１９，４４７号が記載しているように、
得られた発酵ブロスを濾過し、抽出する。さらに、実施
例１１に記載のように、２′″−０−デメチルタイロシ
ンと前駆体２”’−０−デメチルマクロシン（ｍａｃｒ
ｏｃｉｎ）との混合物である抽出した物質を精製し、純
粋な２′°°〜Ｏ−デメチルタイロシンを得る。形質転
換、培養および発酵操作の詳細は、さらに以下の実施例
に記載する。

２°゛′−Ｏ−デメチルタイロシンは実質的にタイロシ
ンと同等の活性スペクトラムを示す。従って、２”’−
ｏ−デメチルタイロシンは、グラム陽性およびグラム−
陰性菌、ならびに特定の植物病原体微生物などの各種の
微生物の増殖に対する阻害作用を有している。タイロシ
ンに関する詳細な抗菌活性は、米国特許第３，１７８，
３４１号に開示されている。２”’−０−デメチルタイ
ロシンが阻害作用を示す主要な微生物は、グラム−陽性
菌である。タイロシン同様、２°′°−０−デメチルタ
イロシンは動物に対しては十分許容されるものであり、
経口および非経口的投与の両縁路で有効である。

本発明をさらに説明するため、以下に実施例を挙げるが
、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

衷旌甜よ トリブチカーゼ大豆ブロス（ＴＳＢ”）１０肩Ｃニ単一
コロニーを接種し、この溶液を３回ホモジナイズ（ｈｏ
ｍｏｇｅｎｉｚｉｎｇ）　してコロニーを崩壊させて、
ブロス１０ＲＱ中にてストレプトマイセス・フラジアエ
を３０°Ｃで増殖させた。培養物１０３１ρを４８時間
増殖させ、次いでホモジナイズし、これｙ、Ｎｅｗ　Ｙ
ｏｒｋ　１１５１４）］の２２０％ｖ／ｖ）溶液約５０
１Ｑを加え、穏やかに混合した後、得られた細胞溶解し
た細胞を５５℃で３０分間インキュベートした。５Ｍ　
ＮａＣｌ２２５０ｘＱを溶解した細胞溶液中に穏やかに
混合した後、懸濁液を５ｏｒｖａｌｌ遠心管（〜４０顧
／管）に移し、水上に２時間放置した。得られた溶液を
Ｓ　ｏｒｖａｌｌ　Ｓ　Ｓ　３４０−ターおよび遠心機
によって１５．００　Ｏｒｐｍで２０分間遠心分離した
。得られた上清をまとめ（〜７００１の、イソプロピル
アルコール０．６４容量を加え、穏やかに混合した。こ
の溶液をＳ　ｏｒｖａｌｌ遠心ボトルに移し、Ｓ　ｏｒ
ｖａｌｌ　Ｇ　Ｓ　Ａ　ｏ−夕−および遠心機によって
ｌ０１ＯＯＯｒｐＩ＋＋で遠心分離し、沈澱物を採取し
た。得られた沈澱物を風乾し、次いでＴＥに穏やかに再
懸濁して最終容量１００１１０゜とした。

ＲＮＡａ８ｅＡ　（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ＳＬ、　Ｌ
ｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓ。

ｕｒｉ）約５．ＯｘｇをＴＥ（１０ｍＭ　　トリス−Ｈ
ＣＱ　ｐＨ８，Ｏ／１．０ｍＭ　ＥＤＴＡ）ｌｘｆｉ中
に懸濁し、２分間沸騰させ、ブロテイナーゼに５．Ｏｘ
を使用し、最終濃度０４％までグリシンを加えたＴＳＢ
５０ＯＮ＆を含有するフラスコに接種した。この培養物
を３０’Ｃで４８時間増殖させ、ＲＣ−５ツルパル（Ｓ
ｏｒｖａｌｌ）およびＧＳＡローターを使用して５ｏｒ
ｖａｌｌ遠心ボトル中で、１０，０００　ｒｐｍ、１５
分間遠心分離に付し、菌糸体を採取した。湿潤した菌糸
が約５０ｇ調製された。

細胞ペレットをトリス−ショ糖（１０ｍｌＶＩトリスー
１−ＩＣｆ！　ｐＨ８，０／］、ＯｍＭ　ＥＤＴＡ／２
５％シヨ糖）５００ｘＣに再懸濁した。次ぎに、得られ
た懸濁液に０．２５Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）およ
びリゾチーム溶液［トリス−ショ糖溶液中、］Ｏｘｇ／
ｉ（！　リゾチーム（カルビオケム（（：ａｌｂｉｏｃ
ｈｅｍ））］　２５０　＊σを加えた。この混合物を室
温で１５分間インキュベートし、次いでプロテイナーゼ
Ｋ（ベックマン）５０ｉｇを加え、得られた懸濁液をさ
らに３０分間インキュベートした。ドデシル硫酸ナトリ
ウム［特級品、ガラード・ンユレジンガー・ケミカル（
Ｇａｌｌａｒｄ−Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ　Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ　Ｍｆｇ、Ｃｏｒｐ、、　５８４　Ｍｉｎｅｏｌ
ａ　Ｐｌａｃｅ、Ｉｌｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ｃｉｔｇと共に
上記のＤ　Ｎ　Ａ　ｊｆｆ、Ａ濁液に加え、次いでこの
混合物を４°Ｃで１５時間インキュベートした。次ぎに
、等Ｂ１の緩衝液飽和フェノールをこの混合物に加え、
遠心分離（５，ＯＯＯｒｐｍ、ＧＳＡｏ−夕、１０分間
）によって層を分離した。水層を２５０ｍり容量のメス
シリンダー中にデカントし、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
８，０）を添加して０゜３Ｍ酢酸ナトリウムに調節した
。この溶液を水」二に置き、これら２つの液体が混合し
ないように冷エタノール２容量を穏やかに加えた。マー
ミュー　（Ｍａｒｍａｒ）ら［＋９６１．　Ｊ、　Ｍｏ
１．　Ｂｉｏｌ、　３：２０８−２１８］によって開発
された操作法を使用し、ＤＮＡとエタノールとの界面に
ガラスロッドを穏やかに渦巻かせて高分子ｍのＤＮＡ種
を採取した。このようにして採取したＤＮＡを７０％エ
タノールで１回洗浄し、風乾した後、最終濃度１．４ｒ
ｉｇ／ｘ（ｌで（Ｏ］ＭＮａ（４を加えた）ＴＥ５１ｆ
ｆに再懸濁した。

ａ）　　トリブチカーゼ大豆ブロスは、ボルチモア・バ
イオロジカル・ラボラトリーズ［Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ　
Ｂｉ。

ｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐ、Ｏ，
Ｂｏｘ　２４３．コノキーズビレ、メリーランド２１０
３］］、またはデイフコ・ラボラトリーズ［Ｄｉｆｃｏ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、デトロイトミシガン］か
ら入手される。

実施例２ 大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｋ　Ｉ　２　Ｃ６０Ｃ６００
ＲＫ　（ＡＴＣＣ３３５２５）の−晩培養物を、マルト
ース（２０％マルトースから０．２％マルト−ス）およ
びＭｇＳＯ４（１Ｍ　ＭｇＳＯ４から１０ｍＭ）を加え
たＴブロス（バタトートリブトン１０ｇ、酵母エキス５
ｇ、ＮａＣ４５ｇに蒸留水を加えて１リツトルとする（
ｐＨ７，０））ＩＯＪＩρ中で３７°Ｃにて増殖させた
。このような添加ブロスをＴＭＭと命名スる。シャロン
４のファージストック、（ＡＴＣＣ４０４３２）、標準
的なＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　］　２　　ラムダ（λ）クロー
ニングベクターを連続して希釈し、個々のファージ希釈
物０．１ｘｆ！を、ＴＭＭ中で増殖させたＥ、ｃｏｌｉ
培養物のｌ／１０希釈物０，１ｍρに加えた。次いで、
これらの培養物を３７°Ｃで２０分間インキユヘートし
た。ＴＭトップ寒天（ＴＭ　ｔｏｐ　ａｇａｒ）　（］
　ＯｍＭ　ＭｇＳ　Ｏ，および０．７％寒天を加えた′
Ｆブロス）３ｚｆ！を加えた後、培養物を、Ｉ　ＯｍＭ
　ＭｇＳＯ４を加えたＴ寒天（Ｔブロス＋１．５％寒天
）上にプレートシ、３７°Ｃで１６−２４時間インキュ
ベートした。〜２０，０００ｐｆｕ（プラーク形成ユニ
ット）を含有する平板を選携し、ラムダ緩衝液（トリス
−ＨＣσ６３５ｇ１　トリス−塩基１．Ｉ　８ｇ、Ｍｇ
５Ｏ，・７Ｈ。

０　２．４６ｇ、ＮａＣ＆　５．８４ｇに蒸留水を１リ
ツトルになるまで加える・＞５Ｍ（ｌを注いだ。得られ
た平板を５０＋０．容ｆｆ１ｓｏｒｖａｌｌ管に削り入
れ、ＣＪ−ＴＣＩ！３０．１！ρを添加した後、その管
を４，０００　ｒｐｍで１０分間遠心した。得られた上
清を新鮮な管中に採り、ＣＨＣａ２Ｏ５πａを加えた。

適当な力価を得るには、３−５細胞溶解物を調製すれば
よいことに注意すべきである。

Ｂ、ファージ細胞溶Ｉの調製 １’：、ｃｏｌｉ　Ｋ　Ｉ　２　Ｃ６００Ｒｘ　ＭＫ（
ＡＴＣＣ３３５２５）の培養物２０ｘＱを７ＭＭブロス
中、３２７〜 ７°Ｃで一晩増殖させた。この培養物をｌＱ″ｐｒｕの
シャロン４　（実施例２Ａの平板細胞溶解物から入手し
、常法によって力価測定した）と混合し、振盪させずに
３０℃で１０分間インキュベートシた。

インキュベートした混合物を半分に分け、その各々を、
最終濃度１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，でＭｇ５Ｏ，を加えたＴ
ブロス５００ＲＱを入れた１リツトル容量フラスコに加
え、３７℃で振盪させて細胞溶解した（約３−８時間）
。

細胞溶解した後、ＤＮＡａｓｅｌ　　（５０ｍＭ　　ト
リス−）（ＣρｐＨ８，０中、１０ｇｇ／ｘρ）［ウォ
ーンングトン・ダイアグノスティックＱｏｒｔｈｉｎｇ
ｔｏｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ）、フリーボールド、ニュ
ーシャーシー０７７２８から入手］を各フラスコ毎に終
濃度１μｇ／ｘ（ｌで加え、それらのフラスコを１５分
間振盪させた。次イテ、ＮａＣＱ　７．９　ｇ’／　１
００１ｇを各フラスコに加え、振盪して溶液とした。

クロロホルム０．２３！ρを各フラスコに加えた後、そ
の内容物をＳｏｒ’ｖａｌｌ遠心ボトルに移し、ＧＳＡ
ローター、４　、　ＯＯＯｒｐｍで１０分間回転させた
。

＝２８ 」１清をまとめた後、ポリエチレングリコール６０００
［シグマから入手］を終濃度１００ｇ／リツ！・ルで加
え、振盪させて溶液とし、氷上に１時間放置した。

この溶液の部分量を５ｏｒｖａｌｌボトルに移し、ＧＳ
Ｓクローター６，０ＯＯｒｐＬ１１で１０分間遠心して
沈澱物を採取した。すべてのベレットを全１１１５雇の
ラムダ緩衝液に再懸濁し、クロロホルム１５峠を加えた
５０１容量Ｓ　ｏｒｖａｌ　ｌ管に移し、旋回した後、
４　、００　Ｏｒｐｍで１０分間遠心した。

」二部の水層を採取した後、塩化セシウム（０゜８　］
　４　ｇ／好）を加え、屈折率１．３８０９に調節した
。この溶液をベックマン超遠心管に移し、平衡化するま
で回転させた（５０．ＯＯＯｒｐｍ、１８時間）。ファ
ージバンドを注射器（針とシリンジ）で抜き取り、ラム
ダ緩衝液２リツトルに対して４−８時間透析した。だい
たいのＤＮＡ濃度を測定した後、等容量の緩衝液飽和（
５０ｍＭｌ！スー１−ＩＣρｐＨ８，０）フェノール［
特級、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−（Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　
　Ｂ　ＲＬ）、ガイザースブルク、メリーランド２０８
７７から入手］を加え、穏やかに混合してラムダＤＮＡ
を抽出した。５ｏｒｖａｌｌ遠心機で遠心して層を分離
し、水層を取り出し、等量のエーテルと混合した。遠心
によって層を再び分離し、エーテル層を取り出して廃棄
した。エーテル抽出工程を繰り返し、３Ｍ酢酸ナトリウ
ム（ｐＨ８，０）を添加して０．３Ｍ酢酸ナトリウムと
し、λＤＮＡ溶液を調製した。冷エタノール２容量を加
えてＤＮＡを沈澱させ、〜２０℃で一晩保存した。遠心
分離（１５，００Ｏｒｐｍ、１５分間、５ｏｒｖａｌｌ
管）してＤＮＡを採取し、７０％エタノールで１回洗浄
し、風乾した。このＤＮＡベレットを終濃度〜４００μ
ｇ／肩θでＴＥ５００μＱに再懸濁した。

Ｃ，シャロン４ＥｃｏＲＩアームの調製シャロン４の左
および右の両アームを得るために、シャロン４ＤＮＡ　
（１００μｇ）２５０ｔｔ（！、１０ＸＥｃｏＲＩ緩衝
液（］００００ｍＭリスＨＣＱ　ｐＨ７，５，５００ｍ
Ｍ　ＮａＣＱおよび５０００　ｒｐｍ、５°Ｃ１１５時
間）に付し、ＵＶ光でバンドを視覚化し、４つの観察で
きるバンドを注射器で抜き取った。臭化エチジウムをｎ
−ブタノールで抽出し、得られたＤＮＡをアガロースゲ
ル電気泳動（ＡＧＥ）によって調査した。シャロン４の
左および右のアームである２つのバンドを等モルで混合
し、半分で希釈し、エタノール２容量を加えて沈澱させ
、−２０°Ｃで一晩保存した。沈澱したＤＮＡをＨＢ４
０−ターで遠心（Ｓｏｒｖａｌｌ管、１２、００　Ｏｒ
ｐｍ、３０分）して採取し、次いでシャロン４アームＤ
ＮＡをＴＥに再懸濁して終濃度０゜１７４μｇ／μりと
した。

実施例３ 実施例１と実質的に同様に、ストレプトマイセス・フラ
ジアエの培養物をその条件下で増殖させ、ＤＮＡを調製
した。

ｍＭ　ＭｇＣＱ、’）　３０１１　Ｑｌｌ　Ｊｉｇ　／
　杼ウシ血清アルブミン（ＵＳＡ）３０μσ、および蒸
留水１０μＱをＥｃｏＲＩ酵素［Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎ
ｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｉｎｃ、、　３２Ｔｏｚｅｒ　
Ｒｏａｄ、　１ｌｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ　０１９１５］
　　］　Ｑ　μＱ（ｌ　Ｑ　Ｏ単位）によって３７℃で
２時間消化した。さらにＥｃｏＲＩ酵素１０μρを追加
し、もう１時間イン牛ユベー１−した。温度を７０°Ｃ
に１０分間上昇させて反応を停止させた。等量の緩衝液
飽和フェノールを混合し、微小管内の遠心によって層を
分離した。前述の実施例に記載のように、水層を取り出
し、エーテルで２回抽出した。

得られたＤＮＡ懸濁液を半分に分け、マニアチス（Ｍａ
ｎｉａＬｉｓ）らのモレキュラー・クローニング（Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ、ニュ
ーヨーク、　＋９８２）の記載に実質的に従い、２μｇ
／μＱ臭化エチジウムを入れた＋　０−４０％（ｗ／い
ショ糖勾配（１ＭＮａＣＱ、２０ｍＭ　　）リス−ＨＣ
ＣｐＨ８，Ｏ１および５ｍＭＥＤＴＡ中）を加えた２つ
の５Ｗ４０管に加えた。ベックマンＳＷ４０ローター（
２５，０臭化エチジウムを除き、かつ１０％Ｗ／Ｖおよ
び／ＩＯ％ｗ／ｖショ糖溶液の代わりにそれぞれ５％Ｗ
／Ｖおよび２０％ｗ／ｖショ糖溶液を使用する以外は、
実施例２Ｃに実質的に従って調製した５−２０％Ｗ／Ｖ
ショ糖勾配を入れた４つの５Ｗ４０ベックマンポリアロ
マ−管の上部に、上記Ａで得られたＤＮＡＱ濁液約］、
、５ｘｆ２を重層した。これらの勾配は、ベックマン超
遠心機中のベックマン５Ｗ４０を使用した３０．ＯＯＯ
ｒｐｍ、１７時間に付した。

６管の底に穴をあけ、滴を捕集し、各々の管からフラク
シヨン１．５Ｊｌρを採取した。これらのフラクション
をＡＧＥ　（アガロースゲル電気泳動）によって調査し
、高分子慣フラクンヨン（＞　５０　ｋｂ）を集め、常
法によって沈澱させた。得られたＤＮＡ沈澱物をＴＥ５
００μｇに再懸濁し、終濃度１４μｇ　／　ｔｔ　ｆ！
とした。

Ｃ，ストレプトマイセス・フラジアエ挿入体り凡人の調
製 前の実施例で得られたＤＮＡ約０．５ｊｌ１２に３Ｍ酢
酸すトリウムを加え、Ｏ、、３Ｍ酢酸ナトリウムに調節
し、冷エタノール２容■によって沈澱させ、−２０°Ｃ
で一晩保存した。得られた沈澱物を遠心によって採取し
、エタノールで洗浄し、終濃度０．４６μｇ／μσでＴ
ＥＩ、（３ｍｇに再懸濁し、４°Ｃで１６時間保存した
。Ｈａｅｌｌｌ制限酵素てＤＮＡを消化するため、３つ
の反応物を用意し、そしてＡｌｕｌ制限酵素でＤＮＡを
消化するため、３つの反応物を用意した。

上、　ＨａｅＩ［Ｉ制限酵素消化 １ＸＨａｅｎｌ緩衝液中に、懸濁したＤＮＡ約５４０１
１（１，Ｉ　ＯＸ　Ｈａｅｌｌｌ緩衝液（５００ｍＭＮ
ａＣＱ、６０ｍＭ　ＭｇＣ（！ｔ、６０ｍＭ　β−メル
カプトエタノール）２５０μＱ、水１７００μＱ、およ
びＨａｅｍ酵素（７単位／μσ、ＢＲＬ）１／１０希釈
液８．９μρを含有させ、Ｈａｅｌｌ１反応混合物を用
意した。この単一のＨａｅｌｌ１反応混合物から、各々
〜８００μＱを含有する３つの反応物を調製し、３７℃
で２０分間、４０分間、および６０分間インキュベート
し、次いで水上に放置した。ＡＧＥによって消化の程度
をモニターした。反応物の各３つの反応を行った。次い
で、これらの反応物を採取し、沈澱させた。

２つのＤＮＡ消化物をＨＢ４０−ターの遠心（１２、Ｏ
ＯＯｒｐｍ、１２分間）によって別々ニ捕集した。得ら
れた沈澱物を７０％エタノールで１回洗浄した。最後に
、この沈澱物をＴＥ２００μａに別々に再懸濁した。懸
濁液を採取し、ＴＥを加えて最終審１１６００μρとし
た。この採取したＤＮＡ約２００　ｔｔ（ｌをそれぞれ
、３つの５−２０％Ｗ／Ｖショ糖勾配置３１１に加えた
。これら３つの勾配液を５Ｍ４０ベツクマンローター中
、３０，００Ｑ　ｒｐｍ、５℃に１７時間かけた。勾配
管の底に穴をあけ、滴を捕集して各管毎に各々〜０．４
畦含有する約３０個のフラクションを捕集した。各フラ
クションをＡＧＥで分析し、１Ｏ−２５ｋｂの大きさの
ＤＮＡに対応するフラクションを採取し、常法によって
沈澱させた。得られた沈澱物をＴＥ８００μＱに再懸濁
して濃度０．０６５μｇ／μａとした。

３、ストレプトマイセス・フラジアよりＮＡの々に、Ｉ
−１ｌ−１ａ制限酵素の１／１０希釈液２μρを加え、
３７°Ｃのインキュベートを３０分間続けた。

得られた反応物を再び氷上に置き、八〇Ｅによって消化
程度をモニターした。この酵素２μａの添加を繰り返し
、最終的な消化の程度をＡＧＥで確認した。３つの反応
物を一緒にし、３Ｍ酢酸すトリウムを添加して０．３Ｍ
酢酸ナトリウムとし、エタノール２容量で洗浄し、−２
０°Ｃで一晩放置することで沈澱させた。

２、Ａｌｕｌ制限酵素消化 Ｈａｅｌｆｆ反応酵素および緩衝液の代わりに、Ａｌｕ
ｌ（６１’位／μρＢＲＬ）の１／１０希釈液１０μρ
、蒸留水〜１７００μρ、および］ＱＸＡ］ｕｌ緩衝液
（５００ｍＭ　　トリス−ＨＣＱ　ｐＨ８，０，５０ｍ
Ｍ　ＭｇＣ（ｌｘ、５００ｍＭ　ＮａＣＱ、および１０
ｍＭ　ジチオ１・レイト−ル）を使用する以外は、Ｈａ
ｅｌＩｌ消化の操作法と同一の操作法を使用してＡＩｕ
ｌ消化を行った。ＡｌｕＪ酵素とのインキュベート期間
を１回だけ付加的に設けることが必要である以外は、Ｈ
ａｅｌ消化の反応操作に実質的に従い、メチル化 ５ＸＥｃｏＲＩメチラーゼ緩衝液（５００ｍＭトリス−
ＨＣｏ、ｐＨ８，０，１２，５ｍＭ　ジチオトレイト−
ル、２５ｍＭ　ＥＤＴＡ、２ｙｇ／ｘＱ　Ｂ５Ａ１およ
び５．５μＭＳ−アデノシルーメチオニン）約２００μ
ｅ１およびＥｃｏＲＩメチラーゼ（１０単位／μｇ、Ｂ
ＲＬ）１０μｅを、上記のようにして調製したＤＮＡ−
８００μＱに加え、次いで３７°Ｃで２時間インキュベ
ートした。このＤＮＡを緩衝液飽和フェノールで２回抽
出し、得られたフェノール層をＴＥで再度抽出した。得
られた水層を採取し、エーテルで２回抽出し、次いで酢
酸すトリウム、次ぎに２容量のエタノールを用いて沈澱
させ、−２０’Ｃで２時間インキュベートした。沈澱物
を遠心（１２，ＯＯＯｒｐｍ、１５分間）によって集め
、得られたＤＮＡを７０％エタノールで１回洗浄し、風
乾した後、ＴＥ７５μσに再懸濁した。これは、メチル
化されたＡｌｕｌ　−Ｈａｅ■部分消化Ｓ、フラジアよ
りＮＡ約４４μｇを含有していた。

４６　リンカ−付加 ＴＥ中、１００μｇ／屑ｑのＥｃｏＲＩリンカ−（ｐＧ
　Ｇ　ＡΔＴＴＣＣ，コラボレイティブ・リサーチ　　
Ｉ　　ｎｃ、（Ｃｏｌ　１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ、、　　１２８スプリング・スト
リート、レキシングトン、ＭＡ０２１７３）から入手）
約４０μＱを６５°Ｃで３分間インキュベートした後、
氷」二で冷却した。

メチル化したストレプトマイセス・フラジアよりＮＡ約
２μｇ、　　リンカ−ＤＮＡ４０μｔ！　、５Ｘリガー
ゼ／キナーゼ緩衝液（２５０ｍＭ　　トリスＨＣＱ　ｐ
Ｈ７，８，２５％グリセロール、２５ｍＭジチオトレイ
トール、および５０ｍＭ　ＭｇＣρ、）４０μρ、０．
６６Ｍ　ＡＴ　Ｐ４０ｉｔＱ　、およびＴ４　　ＤＮＡ
リガーゼ（１単位／μρ、ベーリンガー・マンハイム・
バイオケミカルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｃｒ−Ｍａｎ口ｈ
ｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））　　１２　ｔｔ
Ｑを含有するライゲート反応物を室温で１２時間インキ
ュベー１・した。

５分間温度を６５°Ｃに上昇させ、この反応を停止させ
、次いで４°Ｃで一晩保存した。保存したライゲート反
応物約＋９０μＱを１０ＸＥｃｏＲＩ緩酵素（１Ｏ単位
／μσ、ＢＲＬ）２０μ夕と混合し、３７°Ｃで５時間
インキュベートした。０．２５ＭＥＤＴ八（ｐｔ＋８．
０）２０μＱを添加した後、温度を６５°Ｃに５分間上
昇させて反応を停止させ、次いで水」二で冷却した。こ
の反応物を５−３０％ｗ／ｖショ糖勾配に重層し、ＳＷ
４０ローターに付した（１８時間、３０．ＯＯＯｒｐｍ
、５°Ｃ）。管の底に穴をあけ、５滴のフラクションを
３６個採取した。これらフラクションをＡＧＥによって
調査し、１Ｏ−１９ｋｂの大きさのフラクションを集め
、酢酸ナトリウムおよびエタノールで沈澱させ、２０’
Ｃで一晩保存した。５ｏｒｖａｌｌ　ＨＢ４　ローター
（１２，ＯＯＯｒｐｍ、１５分間）で遠心して沈澱した
ＤＮＡを採取し、７０％エタノールで１回洗浄して風乾
し、Ｔ　Ｅ　４．００μＱに再懸濁した。この懸濁液は
、濃度０．０２２μｇ／μσで、Ｅｃ。

ＲＩ結合Ｓ、フラジアよりＮＡを含有していた。

３９〜 火旌圓Ａ ファージライブラリーの生産 実施例３（Ｃ）で調製したストレプトマイセス・フラジ
アよりＮＡ約２μｇを、実施１’Ａｌ２ＣでＪ＋ｕ２し
たシャロン４アーム１７．２μ（ｌｃ〜３μｇ）と混合
し、次いで３Ｍ酢酸ナトリウム（終濃度０３Ｍ酢酸ナト
リウム）および２容量のエタノールを加えてＤＮＡを沈
澱させた。この混合物を７０℃で１５分間インキュベー
トした。ブリンクマン（Ｂ　ｒｉｎｋｍａｎ）微小管中
で１０分間遠心してＤＮＡベレットを捕集し、７０％エ
タノールで洗浄して風乾した。次いで、得られたペレッ
トを以下のライゲート反応混合物１６μｅに再懸濁した
；ライゲート反応混合物−５ｘキナ一ゼ／リガーゼ緩衝
液４μｇ、０．６６Ｍ　ＡＴＰ　（ｐＨ７，４）４μＱ
１蒸留水１１μｇ、およびＴ４　　ＤＮＡリガーゼ１μ
Ｃ０このライゲート反応物を９°Ｃで７２時間インキュ
ベートした。

ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−・パッケージング抄
本（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｅｘｔｒａｃｔ）を
使用し、その手引書に実質的に従い、」１記のライゲー
ト物を常法によりパッケージングした。バイオチック・
パッケージングキットなどの他の同様のインビトロパッ
ケージングミックスも本発明に使用するために入手可能
である。

このパッケージング混合物をＣｓＣＩ２ブロック勾配」
二に重層し、５Ｗ５０ベツクマンローターにかけた（２
時間、３０．　ＯＯＯｒｐｍ、　５°Ｃ）。塩化セシウ
ム勾配は、ＣｓＣσ０．５ｘρ当たりの密度を１．７．
１．５および１．３にする以外は、マニアチス（１９８
２）らの教示に従って調製した。管の底に穴をあけ、１
０滴のフラクションを捕集し、それぞれ１３ＲＬ　ミニ
透析ユニットでラムダ緩衝液に対して透析した。Ｅ、ｃ
ｏｌｉ　Ｋ１２　　Ｃ６Ｃ６００Ｒｘの代わりに、Ｅ、
ｃｏｌｉ　Ｋ１２　２９４　　（ＡＴＣＣ３１４／１６
）のＴＭＭ中、３７℃、１６２４時間培養物１０酎を使
用し、実施例２Ａに記載のようにフラクションの力価を
測定し、組換え体に関して調査した。１０ｍＭ　Ｍｇ５
Ｏ，および４０μｇ／ｉσ５−ブロモー４−クロロ−３
−インドリル−β−Ｄ−ガラクトンダーゼを加えたＴ′
ｆｉ！天平板（Ｘ−ガル、ＢＲＬから入手）上に現れる
非−青色プラークの発現性によって、組換え体の同定を
行った。種々のフラクンヨンを採取し、組換えファージ
のライブラリーを得た。各平板上に少なくとも４，００
０個の組換えプラークがあるＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　２
９４のライブラリーの平板溶解物を調製することで、第
１次細胞溶解物の増幅を行った。これらの平板溶解物か
ら、実施例２の教示に従い、大規模に、ファージ溶解お
よびＤＮＡ調製を行った。得られたＤＮＡを濃度０．２
３μｇ　／　ｔｔ　（ｌでＴＥＩ肩Ｑに再懸濁した。

実施例５ 増幅したファージ細胞溶解物を、実施例２Ａに記載のよ
うにＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　２９／Ｉににプレートし、
平板毎に約５，０００プラークとした総量約２０，００
０プラークを得た。ベントンら［Ｂｅｎ＝４３ 用し、ホスホトリエステル法によってオリゴヌクレオチ
ドを調製する。このシステムは自動であるので、ユーザ
ーは所望のＤＮＡ配列を決定するだけでよく、次いでそ
の装置の取り扱い説明書に従う。得られたオリゴヌクレ
オチドは、１５％アクリルアミドおよび７．０Ｍ尿素の
ゲル電気泳動法によって精製する。合成されるオリゴヌ
クレオチドは末端が［γ−３２Ｐ］ΔＴＰで標識されて
おり、ポリヌクレオチドキナーゼで処理されている［こ
れは、マニアチス、フリチノシュ、およびサンプルツク
のモレキュラー・クローニンク：研究マニュアル（コー
ルド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド
・スプリング・ハーバ−１Ｎ。

Ｙ、、１９ｇ２）に記載されている］。モレキュラー・
クローニング・マニュアル（３２４−３２１）に詳細に
記載されているように、得られた放射活性プローブを」
１記のフィルターとハイブリダイズした。

実施例２Δに記載のように、このプローブとハイブリダ
イズするプラーク内のファージを高い力ｔｏｎ　ａｎｄ
　Ｄａｖｉｓ、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、　１９
６：１８０（１９７７）］に記載の方法（これは、モレ
キュラー・クローニング（マニアチス、フリチノシュ、
サンプルツク）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラ
ボラトリ−１３２Ｃ１−３２］頁の研究マニュアルに詳
細に記載されている）によって、これらのプラークを二
ｌ・ロセルロースフィルターに移シた。

ライブラリー内のｔｙｌＦ遺伝子を検出するため、ｔｙ
ｌＦ遺伝子産物、ＭＯＭＴの最初の３６個のアミノ酸を
コードしている遺伝子の既知のＤＮＡ配列部分［フィソ
ンユマン（Ｆｉｓｈｍａｎ）らのプロシーディング・オ
ブ・す／ヨナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵ　Ｓ
　Ａ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ
、　ＵＳＡ）、　８４　：８２４８、１９８７］に基づ
いて放射活性オリゴヌクレオチドプローブを構築した。

このＤＮＡプローブ（最善の結果を得るためには、長さ
が少なくとも４４個ヌクレオチド長あるべきである）を
作成する方法は、当業界周知である。簡単に言えば、Ｓ
ＡＭＩ自動１）　Ｎ　Ａ　音成機［バイオサーチ（Ｂｉ
ｏｓｅａｒｃｈ）、サン・ラフアール、ＣＡ］または同
様の装置を使価にまで増殖させ、実施例２Ｂに記載のよ
うにファージＤＮＡを調製した。

実施例６ 鼾巨 通常の微生物学的手法に従って、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１
２　Ｃ６００ＲＫ　Ｍ　Ｋ−／　ｐ　ＨＪ　Ｌ　２１０
　（Ｎ　ＲＲＬＢ−１５８２４）の単一の細菌コロニー
を、水溶１１１２１リットル当たり２５μｇ／＋ｌＩｆ
！のアンピシリンを含有するバクト（Ｂａｃｔｏ）　ｌ
−リプトン１０ｇ、バクト酵母エキス５ｇ、およびＮａ
Ｃｆ！１０ｇ（ｐ＋−１７，５）を含有するＬＢ培地に
接種した。

この培養物を３７℃で］　６−２　／１時ｆｆ、’５イ
ンキュベートシた。翌朝、ｌ　ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４
，０，２％グルコース、０．３−０．４％ＣＡΔ（カザ
ミノ酸、デイ７　’：ｊ　（１）ｉｆｃｏ乃、２　ｔｔ
　ｇ／＊Ｑ　Ｂ　１　（チア　ミラ−ＨＣＱ、シグマ）
、および添加物を加えたＭ９培地（ミラーら、１９７９
、分子遺伝学の実験（Ｉｉｘｐｅｒ　ｉｍｅｎｉｓ　ｉ
ｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、コール
ド・スブリング・バーバー・ラボラトリ−、コールド・
スプリング・ハーバ−ニューヨーク）５００１１ρに」
１記培養物５ＲＱを接種した。（ｇられた培養物を激し
く振盪させなから３７°Ｃて１６〜２／１時間インキュ
ベートシ、その培養物の試料を希釈度１／１０から１１
５０で」１記の添加Ｍ９培地に接種し、激しく振盪させ
ながら３７℃で２時間半から３時間インキュベートした
。その培養物の濁度をブルーフイルターで測定すると、
約３０Ｃ）−４００ＫｌｅｔｔＵｉ位であった。クロラ
ムフェニコール（１５０−１７５μｇ／ｘのを培養物に
加え、激しく撹拌しながら１６−２４時間インキュベー
トを続けた。

遠心（７５００ｒｐｍ、５分間、４°Ｃ）によって細菌
細胞を収穫し、次いでＳ　Ｖ（０，１５Ｍ　ＮａＣＱ、
Ｏ，ＩＭ　ＮａＥＤＴＡ、ｐ　Ｈ８，０）２００ｘＱで
２回洗浄した。得られたペレットを１０ｄ／ｇ湿潤重量
のＴＳ溶液（２５％ショ糖、５０ｍＭ　トリス、ｐ　Ｈ
８）に再懸濁し、氷上に置いた。この懸濁物に、リゾチ
ーム溶液（５０ｍＭ）リス−Ｉ］Ｃ０，ｐＨ７，８中、
５ｔｔｇ／ＲＱ　）　２ｙＱ／ｇ湿潤重量を加え、氷」
１に５分間放置して冷却した。次いで、０．２５　Ｍ　
Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（＋）　Ｈ８、Ｏ）　４好／ｇ湿潤重
ｈ１を加え、さらに５分間冷却した。細胞溶解溶液（０
，４％デオキンコール酸塩、１％Ｂ　ｒｉｊ５８．５０
ｍＭ１・リスおよび０．０６２５Ｍ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８
）］６好／ｇ湿潤重量を添加し、混合物を３７°Ｃで１
５−３０分間インキュベートした。Ｓ　ｏｒｖａｌｌｓ
　Ｓ　３４０−ターの遠心（２１゜０００　ｒｐｍ、＋
５−３０分間、４°Ｃ）によって細胞残骸（ｄｃｂｒｉ
ｓ）を除去した。」１清を採取し、３Ｍ酢酸すトリウム
（ｐＨ８）０．１容量およびイソプロピルアルコール０
．６４容量をその上清に加えた。得られた溶液を遠心（
１０，ＯＯＯｒｐｍ、１０分間、４°Ｃ）　Ｌ、得られ
たペレットをＴＥ　（］ＱｍＭＭトリス、］ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ　　ｐＨ８）１１１２に再懸濁した。常法に従い、
塩化セシウム（ＣｓＣのを使用した、プロピジウム・ニ
ョウ化物（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｄｉｉｏｄｉｄｅ）を
含有する平衡密度勾配遠心法によって、プラスミドＤＮ
Ａを精製した。

実施例７ プラスミドｐｌ−ＩＪＬ２１０（実施例６で調製）約１
０μＱ（〜１１μｇ）を、１０ＸＥｃｏＲ［緩衝液５μ
Ｃ，Ｂ５Ａ３μＱ１蒸留水２５μｇ、およびＥｃｏＲＩ
制限酵素（１０単位／μρ、ＮＥＢ）５μＱに加え、３
７°Ｃで２時間イン牛ユベートシた。温度を７０℃に１
０分間上昇させて反応を停止させた。３Ｍ酢酸ナトリウ
ム（ｐＨ８，０）６μｇおよび冷エタノール１２０μＱ
を加えてＤＮＡを沈澱させた。−７０’Ｃで１５分間イ
ンキュベートした後、ブリンクマン（Ｂｒｉｎｋｍａｎ
）微小管中で１０分間遠心してＤＮＡを採取した。得ら
れたＤＮＡペレットを７０％エタノールで１回洗浄し、
風乾した後、蒸留水８０μａに再懸濁した。この懸濁液
に５ＸＣＩＡＰ緩衝液（５００ｍＭ）リスＨＣＱ　ｐＨ
７，５，２５０ｍＭ　ＮａＣＱおよび５ＱｍＭＭ）（Ｃ
ρ、）を加えた。ＤＮＡを脱リン酸化するため、製造ス
ペックに従い、ウシ腸内アルカリホスファターゼ（■級
）［４単位／μｇ、ベーリンガー・マンハイム］の１／
１０希釈液３μＱを加え、得られた反応物をまず３７°
Ｃで３０分間、次いで７０°Ｃでさらに３０分間インキ
ュベートした。

Ｂ、ストレプトマイセス・フラジアよりＮＡ挿入体の副
刃 各バタテリオファージ（実施例２で調製）から得たＤＮ
Ａ　Ｉ　０ｔｔ（！　（〜２μｇ）を、ｌ０ＸＥｃ。

Ｒ１緩衝液２μＱ、Ｂ５Ａ２μρ、水５μＣおよびＥｃ
ｏＲ１酵素（１０単位／μＱ、ＮＥＢ）と共に３７°Ｃ
で３時間インキュベートした。温度を７０°Ｃに１０分
間」１昇させて反応を停止させた。

Ｃ，ライゲーション 脱リン酸化し、ＥｃｏＲＩ消化したｐＨＪＬ２１０　Ｄ
　ＮΔ約１０μρをＥｃｏＲＩ消化バタ消化バクテリオ
ファージＤＮＡ２０μＣ得られた混合物に、３Ｍ酢酸ナ
トリウム３μｇおよび冷１００％工タノール８２μＱを
加えて沈澱させた。ドライアイス上で一７０℃に冷却し
て１０分間インキュベートした後、遠心して沈澱物を捕
集し、７０％エタノールで１回洗浄し、風乾した。得ら
れたベレットを蒸留水２３μσに再％濁し、この溶液に
、０６６Ｍ　ＡＴＰ８μσ、５Ｘキナ一ゼ／ワガーゼ緩
衝液８μｇおよびリガーゼ（ベーリンガー・マンハイム
）Ｉμｅを加え、得られたライゲーンヨン液を１５℃で
２０時間インキュベートした。蒸留水〜４８μＣ１５Ｘ
キナーゼ／リガーゼ緩衝液１６μＱ、０．６６Ｍ　ＡＴ
Ｐ　１６μりおよびリガーゼ１μＣを添加することによ
って、このライゲーンヨン液を希釈し、環状化を促進さ
せた。得られた溶液を１５°Ｃで７２時間イン牛ユベー
トシ、次いで温度を１０分間７０℃に上昇させて反応を
停止させた。容管に３Ｍ酢酸すトリウム１２μＱおよび
冷エタノール３００μσを加えてＤＮＡを沈澱させた。

これらの管をドライアイス上で１０分間インキュベート
した後、ブリンクマン微小管中にＤＮＡを採取し、７０
％エタノールで１回洗浄し、風乾し、最後にＴＥ３０μ
ρに再懸濁した。

実施例８ プラスミドｐ　ＨＪ　Ｌ　２８４の単離（実施例７の変
法） Δ、　　Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ　１２　　ＨＢ　１０１／
ｐＨＪ　Ｌ２り聯甥芥 Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２　　ＨＢＩＯＩ／ｐＨＪＬ２８
４の凍結乾燥品は、受託番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１８０４４
の下にＮ　ＲＲＬから入手可能である。この凍結乾燥さ
れた細胞を、５０μｇ／ｘＱ、アンピシリンを含有する
し一寒天平板（１リツトル当たりバタトトリプトン］Ｏ
ｇ、バクト酵母エキス５ｇ、ＮａＣ０１０ｇ１グルフー
ス２ｇ、および寒天１５ｇを含有するし寒天）」二に画
線培養し、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　ｔＴＢ　１０１／
ｐｌ（Ｊ　Ｌ２８４の単一のコロニー単１２％　体を得
た。このようなコロニーの１つをＬ　Ｂ培地（ＬＢ培地
は寒天を除いたし寒天である）］０Ｏｘｆ！に接種し、
実施例６に記載のようにプラスミドＤＮＡを調製した。

実施例９ プラスミドｐＨＪＬ４０１　　［ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８
２１７から、実施例６に記載のように単離し、調製する
］約２μｇを、ニュー・イングランド・バイオラドから
入手した１６μ／μ（！ＥｃｏＲＩ制限酵素１μＱを加
えた総容量２５μｇのＥｃｏＲＩ緩衝液［５０ｍＭ　Ｎ
ａＣ（！、１００ｍＭ　　トリス−ＨＣＱ　ｐＨ７，５
，５０ｍＭ　ＭｇＣＱ、、１００μｇ／酎ウシ血清アル
ブミン］に懸濁した。この反応物を３７°Ｃで４時間イ
ンキュベートし、次いで７０°Ｃに１０分間加熱して反
応を停止させた。無水エタノール２．５容量および３Ｍ
酢酸ナトリウム０．１容量を加えて制限分断されたＤＮ
Ａを沈澱させ、−７０’Ｃで１５分間維持した。遠心に
より沈澱物を採取し、二ニー・イングランド・バイオラ
ドから入手した８単位／μＱのＢａｍＨＩ酵素２μＱを
加えたＢａｍＨＩ制限酵素緩衝液（１５０ｍＭ　ＮａＣ
ｌ２，６ｍＭ　　）リス−ＨＣＱｐＨ７，９，６＝５２ ｍＭ　Ｍ　ｇ　ＣＱ　ｔ、１００μｇ／ｚＱウシ血清ア
ルブミン）２５μρ中に懸濁した。この反応物を３７°
Ｃで４時間インキュベートし、次いで７０°Ｃに１０分
間加熱して反応を停止させた。制限分断されたＤＮＡを
使用前Ｏ℃に維持した。

Ｂ、ｐＨＪＬ２８４のＥ　ｃｏＲＩ　／Ｂ　ａｍＨＩ消
化実施例８の教示に実質的に従って調製したｐＨＪＬ２
８４ＤＮＡ約５μｇを、容量２５μρでなく５０μＱで
反応を行うこと以外は実施例９Ａに従い、制限酵素Ｅｃ
ｏＲｒおよびＢａｍＨＴで消化した。得られたフラグメ
ントを、アガロースゲル電気泳動によって分離し、ｔｙ
ｌ　Ｆおよびｔｙｌ　Ｊ遺伝子を含有する〜２．３ｋｂ
フラグメントを常法により単離した。単離したフラグメ
ントを０°Ｃで保存した。

ＥｃｏＲ１／　Ｂ　ａｍＨＩ消化ｐ　ＨＪ　Ｌ　４０１
、および〜２．３ｋｂ　ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＴフラグ
メントを一緒に混合し、０１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム
および２．５容量の無水エタノールを加えて沈澱させた
。得られた沈澱物をリガーゼ−キナーゼ緩衝液（０２５
Ｍ　トリス−Ｔ−ＴＣＱＩ）ｒ−Ｉ７．８．５０　ｍＭ
　Ｍ　ｇ　ＣＱ　ｔ、２５ｍＭ　ジチオトレイトールお
よび２５％グリセロール）５０μＱに溶解した。

０．６６Ｍ　ＡＴＰ１２μρ、およびＴ／ＩＤＮΔリガ
ーゼ２μＱを加え、得られた溶液を１５°Ｃで１８時間
インキュベートした。

Ｄ、Ｇ５１６の形質転換 ７００Ｃで１０分間インキュベートしてライゲーション
反応を停止させ、０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムおよ
び２．５容量の無水エタノールを加えてＤＮＡを沈澱さ
せ、−７０°Ｃに１５分間維持した。所望のプラスミド
ｐＸＹＺ１０００を含む沈澱物をＴＥ２０μＱに溶解し
、その１０１１ｇを使用し、実施例１０に記載の操作法
に従ってＧ５１６を形質転換した。２”’−ｏ−デメチ
ルタイロシンの産生に関してチオストレプトン耐性の形
出されたＤＮＡ挿入体を有するプラスミド）を精製した
後、それぞれ約５μｇをＧＳ］６に形質転換する。

ストレプトマイセス・フラジアエＧ５ｌ６（ＡＴＣＣ３
］６６４）の培養物を、トリブチカーゼ大豆ブロス（Ｔ
ＳＢ）２０１１０．に接種し、水浴インキュベーター中
、２９℃、２６　Ｏｒｐｍで１６２４時間インキュベー
トした。ホモジナイズ管［トーツス・サイエンティフィ
ック（Ｔｈｏｍａｓ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、スエデ
スボロ、ＮＪ］およびＴ−ライン研究スターラー（Ｔ　
−Ｌ　ｉｎｅ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　５ｔｉｒｒｅｒ
）を使用し、この培養物をホモジナイズした後、音波処
理細胞粉砕機（Ｓｏｎｉｒｉｅｒ　Ｃｅ１ｌ　Ｄｉｓｒ
ｕｐＬ。

ｒ）　［ヘッド・システムズ・ウルトラソニックス、１
ｎｃ（Ｈｅａｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｕｌｔｒａｓｏｎｉ
ｃＳ、　Ｉｎｃ、　）］を使用して７６ワツトで７秒間
分断した。ホモジナイズし、分断した培養物４ｘ１！を
、０．３％ｗ／ｖグリシンを含有するＴＳＢ　（ＢＢＬ
）２０ＭＱに接種し、２９°Ｃで１６−２４時間再びイ
ンキュベートした。

次いで、得られた培養物をホモジナイズし、」二記質転
換体をスクリーニングし、これらのコロニから得られた
プラスミドＤＮＡを分析して正しいプラスミド構造物を
確認した。プラスミドｐＸＹ２１０００のマツプを添付
の第４図に示す。

実施例１０ 実施例７で構築したプラスミドＤＮＡは、Ｇ５１６を直
接、形質転換することができるが、さらに効率の良い方
法として、まずプラスミドＤＮＡを増幅し、Ｅ、ｃｏｌ
ｉ内にその構造物を確認する方法がある。次いで、大量
の所望のプラスミドをＥｃｏｌｉから精製すればよく、
これを使用してストレプトマイセス・フラジアエ菌株を
形質転換することができる。形質転換によってプラスミ
ドＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉに導入し、制限酵素分析によっ
てそのプラスミドを同定し、Ｅ、ｃｏｌｉから大量のプ
ラスミドを精製する方法は、当業界周知である。適切な
プラスミド（すなわち、オリゴヌクレオチドプローブと
のハイブリダイゼーションによって検のように０１度培
養した。この３度目の培養が終了した後、培養物をホモ
ジナイズして採取し、次いでＰ培地で２回洗浄した。Ｐ
培地基体は、Ｋ、３０４０　、２５　ｇおよびＭ　ｇ　
ＣＱ　ｔ・６Ｈ，０２，０３ｇにショ糖１０３ｇを加え
、次いで脱イオン水を最終審ｆｆｔ７００ｍｇになるま
で加えて調製した。

次いで、この混合物を滅菌し、溶液７　、ＯＨＱの各々
＋、＝に＋＋ｔｐｏ、０．０５ｇ／脱イオン水１００祿
、ＣａＣＱｖ　２．７８　ｇ／脱イオン水１００ｊｌｆ
ｆ、および０．２５Ｍ　ＴＥＳ（２−（［）リス−（ヒ
ドロキンメチル）メチルコアミノ）エタンスルホン酸）
（ｐ　Ｈ７、２）約１０酎をそれぞれ加え、所望のＰ培
地を調製した。

得られた細胞ペレットを、ｌｘｇ／ｘＱ　リゾチーム（
カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、う・ジヨウ
、ＣΔ９２０３７）を含有するＰ培地１５１Ｑに再懸濁
し、次いで室温で約１時間および１．５時間インキュベ
ートし、プロトプラストを形成させた。

このプロトプラストを遠心して穏やかに採取し、Ｐ培地
で２回洗浄し、Ｐ培地２蛙に再懸濁し、使用するまで水
上でインキュベートした。プラスミドｐＨＪＬ２８４Ｄ
ＮＡ約５μｇを、Ｐ培地中、１ｇｇ／ｍ（ｌの硫酸ヘパ
リン（シグマ）約５０μＱに加え、水上で約１０分間イ
ンキュベートした。

非常に少ない量（約５−１００ナノグラム（ｎｇ））の
プラスミドＤＮＡは、Ｅ　、　ｃｏｌ　ｉから直接使用
せずに、最初にＳ、フラジアユ中で複製させれば、スト
レプトマイセス・フラジアエ菌株を形質転ｍするのに使
用することがてきる。ストレプトマイセスプラスミド 当業界周知であり、ホップウ・ノド（ｌｌｏｐｗｏｏｄ
）ら［ストレプトマイセスの遺伝子増幅（Ｇｅｎｅｔｉ
ｃ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳｔｒｅｐＬｏ
ｍｙｅｅｓ）、　Ｉ　９　８　５、研究’？−ｔアル（
Ｊｏｈｎ　Ｉｎｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，　Ｎｏ
ｒｗｉｃｈ，　Ｅｎｇｌａｎｄ）］にも記載されている
。ＤＮＡ／ヘパリン溶液ヲまず、プロトプラスト約２０
０μ夕に加え、次いでＰ培地中、５５％ＰＥＧ１００Ｏ
　（シグマ）から構成される溶液約０．９ｊｌ（をＤＮ
Ａ／プロトプラス１−混合物に加え、得られた混合物を
室温で穏やかに混合した。

この混合物を軟質Ｒ２寒天重層部（ｓｏｆｔ　Ｒ２　ａ
ｇａｒ　ｏｖｅｒｌａｙｓ）４　ａρを使用し、Ｒ２平
板の各種の標本に上記の混合物をプレートした。Ｒ２平
板は、Ｒ２培地３０ｆｆρを含有しており、３７℃で約
４日間乾燥されたものであった。Ｒ２培地は、水７００
ＲＱに、シヨ糖１０３ｇ，に２Ｓｏ４０．２５ｇ１微量
元素溶液２ｔｉＱ　、　ＭｇＣＬ・６Ｈ．０１０１２ｇ
１グルコース１０．０ｇ．、Ｉ−−アスパラギン２．Ｏ
ｇ，カザミノ酸０．１ｇ、および寒天２２ｇを加え、次
いで得られた溶液を滅菌し、最後に、以下の溶１１ｋを
各々加えて調製する：　ＫＨ，Ｐｏ．００５ｇ／脱イオ
ン水１　０　０ｙｉＱ，　ＣａＣ１！＝２．　２　２　
ｇ／脱イオン水１００ｆＩＱ、および０．２５Ｍ　ＴＥ
Ｓ（ｐＨ７．２）、この最終溶液のｐＨをＮａＯＴ−１
で７　２に調節する。微量元素溶液は、１リツトル当た
りＺｎＣＱｘ４　０ｆｆｇ，ＦｅＣＱｓ’　６Ｈｔｏ　
　２０Ｑｘｇ，ＣｕＣＱｔ・２Ｈ，Ｏ　　Ｉ　Ｏｘｇ，
ＭｎＣｅ２・４ＨｚＯ　　］　ＯＲｇ，ＮａａＢ＋Ｃ）
＋”　１　０Ｈ２０　　］　０３１１ｇおよび（　Ｎ　
ｕ　４）ＩＩＭＯ？０　２４・４Ｈ！０１０肩ｇを含有
している。軟質Ｒ２寒天重層部は、ショ糖５１５　ｇ，
ＭｇＣＱｔ”　６ＨｔＯ　　５．０　６　ｇＳ　ＣａＣ
Ｑｔ　　］　。

１１１ｇ０．２５Ｍ　ＴＥＳ　　（ｐＨ７．２）５０ｘ
Ｑ、および寒天２．０５ｇを十分ｍの脱イオン水に加え
、終審ｆｆｔ５００ｘ（！とすることによって調製する
。この混合物を蒸し、寒天を溶融し、管（各々４＋のに
分配し、使用するまでオートクレーブ処理した。形質転
換されたプロトプラストをプレートした後、得られた平
板を２９℃で２４時間インキュベートし、次いでジメチ
ルスルホキシド中、５０ｇｇ／ｘＯ．チオストレプトン
（Ｅ．Ｒ．スクイブ（Ｓｑｕｉｂｂ）、プリンストン、
ＮＪＯ８５４０）２５μＱを含有する軟質Ｒ２寒天４Ｒ
（ｌをそのプロトプラスト上に散布した。２９°Ｃにお
ける平板のインキュベートを、再生が完了するまで、通
常は約７−１４日間続け、所望のストレプトマイセス・
フラジアエＧＳ　１　５／ｐＨＪＬ２８４形質転換体を
選択した。培地に２０ｇｇ／ｘＱチオストレプトンを加
えてプラスミドを維持する以外は、米国特許第４，４１
９，４４７号に記載の発酵条件にて、そのＳ．フラジア
エＧＳ　１６／ｐｌ（ＪＬ２８４閑株を培養した。バル
ゾ（Ｂａｌｔｚ）およびセノ（Ｓｅｎｏ）［Ａｎｔｉｍ
ｉｃｒｏｂｉａｌ＾ｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔ
ｈｅｒａｐｙ，２０：２１４−２２５，１９８１］、な
らびにケネディ−　（Ｋｅｎｎｅｄｙ，　Ｊ。

Ｉｔ）　［　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅ
ｒａｐｙ，　２８１　：２８８−２９２．　１９８３］
の教示に実質的に従い、２”’ー０ーデメチルタイロシ
ン産生を常法により検定し、測定した。

実施例１１ Δ．２　　−０−デメチルタイロシンの構造確認２゛“
−〇ーデメチルタイロシンは、９５％酢酸エチルと５％
ジエチルアミンとの溶液で展開させるシリカゲルプレー
トの薄層クロマトグラフィーではＲｆ値約０．４２−０
．５２である。このＲｆ値は、ｔｙｌＦ遺伝子がクロー
ンされていないストレプトマイセス・フラジアエＧＳ］
６から産生される２”’−０−デメチルマクロシンのＲ
ｆ値（０．０６）よりも非常に高い値である。また、２
°′°−０−デメチルタイロシンは、高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）［ゾルボックス（Ｚｏｒｂｏｘ
）Ｃ８／ｌ）Ｎ（５２３）カラム、移動層：２３％アセ
トニトリル、１９％テトラヒドロフラン、および５８％
イオン対溶液（ベン−タン−スルホン酸１．４５ｇ、氷
酢酸５８１１１２、水５８００Ｒの］のシステムにおけ
る保持時間（約６９０秒）によっても同定することがで
きる。このシステムは非勾配溶離（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ
）であり、３０℃で行う。２０−デメチルタイロシンは
吸収２８０ｎｍで検出される。この／ステムにおける２
”’−ｏ−デメチルマクロシンの保持時間は約４８０秒
である。

生成物は融点１２４−１２８°Ｃである。その他の物理
的性質は、キヨ／マ（Ｋｉｙｏｓｈｉｍａ）ら［ジャー
ナル・オブ・アンチバイオチフス（Ｊ、　Ａｎｔｉｂｉ
ｏｔｉｃｓ）ＸＬ　１＋２３（１９８７）］に記載され
ている。

Ｂ９発酵ブロスからの２°゛°−Ｏ−デメチルタイロシ
ンの調製 ストレプトマイセス・フラジアエＧ５１６（１）ＨＪＬ
２８４）の７日間発酵培養物を濾過して菌糸体および培
地固形物を除去した。Ｍｉ＆のｐＨを９．０−９．５に
調節し、マクロライド成分を酢酸エチル中に抽出させ、
次いでｐ　Ｈ４、０の水でさらに抽出した。このｐＨを
９．０にし、マクロラストレブトマイセス・フラジアエ
のＬｙＩＥ突然ストレプトマイセス・フラジアエ（例え
ば八ＴＣＣ１９６０９）のタイロンン産生菌株の保存標
本をＴＳＢ２０ｊＩ０．に接種し、３０’Ｃで２４４８
時間好気的に増殖させ、十分に繁殖させた。

得られた培養物をホモジナイズし、音波処理（実施例１
９参照）し、その５籾をＴＳＢ４５ｊｌＣに接種した。

培養物を１６−２４時間好気的に増殖させ、再度分断し
、５ＷＱ部分量を、幾つかの複製のフラスコ中でＴＳＢ
４５ｆｆ（に接種した。この培養物を２．５−３時間好
気的に３７℃で増殖させ、水酸化ナトリウムでそのｐＨ
を８．５に調節シ、次イで２５μｇ／＋ρクロラムフェ
ニコールおよび異なる量のＮ−メチル−Ｎ−ニトロＮ−
ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）を加え、ＭＮＮＧの終
濃度を１００．２００または３００μｇ／ｘρとした。

得られた培養物を２０分間増殖させ、試料を取り出し、
生存性について試験し、残った細胞を遠心によってペレ
ット化し、新鮮なイド成分を塩化メチレン中に抽出させ
た。溶媒を留去し、得られた固形残渣をアミルアセテー
トに溶解し、濃度約５０ｇ／９とした。この溶液を等量
の飽和ホウ酸ナトリウム（９，０）と共に撹拌した。ア
ミルアセテート分画を回収し、マクロライド成分をｐ　
Ｈ４、Ｑ−４、５の水に抽出させた。

このｐＨを９．０に調節し、活性物質を塩化メチレン中
に再抽出さた。この塩化メチレンを留去し、得られた残
渣を酢酸エチルに溶解した。シリカゲルの調製用薄層ク
ロマトグラフィー（展開溶媒：９５％酢酸エチルおよび
５％ジエチルアミン）によって、２”’−ｏ−デメチル
タイロシンを他のマクロライド成分から分離した。２゛
゛−Ｏ−デメチルタイロシンは、混合物中に存在するマ
クロライド成分の中では最も高いＲｆ値（〜０．４２０
５２）を示した。得られた純粋な２°′°−０デメチル
タイロシンを、標準品として使用するため、酢酸エチル
に溶解し、１ａｇ／ｍＱの濃度とした。

実施例１２ ’Ｆｓｎに再懸濁した。これらの培養物を３７°Ｃで１
６＝２／１時間増殖させた。インキュベートの後に適度
に十分な増殖を示す培養物をホモジナイズし、音波処理
し、ＴＳＢに希釈し、プレートしてＡＳＩＪ７９地」二
に孤立し、突然変異誘発されたコロニーを得た＋ＡＳｌ
培地−酵母エキスＩｇ／ｆｆ。

Ｉ７−アラニン０．２ｇ／（！、Ｌ−アルギニン０．２
ｇ／ρ、Ｉ、−アスパラギン０．５　ｇ／（１、可溶性
澱粉５　ｇ／Ｑ、塩化ナトリウム２．５　ｇ／（！、　
Ｎａ、ＳＯ，ＩＯｇ／ρ、肉汁寒天（ｍｅｅｒ　ａｇａ
ｒ）　２０　ｇ　／　１２、ｐ＋−１７，５、前滅菌。

得られた平板を２９−３００Ｃで７−１４日間インキュ
ベートシ、コロニーを増殖させた。個々のコロニーを小
フラスコまたはボトル中の既知のタイロシン発酵培地［
ボルフおよびセノ（Ｂａｌｔｚ　、ａｎｄ　５ｅｎｏ）
、ＡｎＬｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ
　Ｃｈｒｍｏｔｈａｒａｐｙ、　２０：２１４−２２５
．１９８１］　７−１０ｘＱに接種した。もう１つのＡ
ＳＩ平板上に各コロニーを同時に複製バッチした。発酵
培養物を好気的に２９°Ｃで７日間増殖させ、従来知ら
れているように（ｌｌａｌｔｚ　ａｎｄ　５ｅｎｏ、　
１１８１）　、薄層り０７トゲラフイーによってマクロ
ライド成分の存在に関し、個々の発酵ブロスを分析した
。２“゛−Ｏデメチルタイロシンは、既知の２“°°−
〇−デメチルタイロシン試料（実施例１１）との同時ク
ロマトグラフィーによってまず同定することができる。

次いで、この化合物を産生ずる突然変異体（ｔｙｌ　Ｅ
　）を保存し、２′°“−〇−デメチルタイロシンの生
産に使用する。

実施例１３ ストレプトマイセス・フラジアよりＡ２の突然変異体の
構築 実質的に実施例１２の教示に従い、ストレプトマイセス
・フラジアエを突然変異させて、バルブおよび七ノ（Ａ
ｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃ
ｈｅｍｏｔｈｃｒａｐｙ、　２０：２１４−２２５（１
９８１））の方法に実質的に従い、得られたｔｙ＋Ｅ突
然変異を含有する微生物を常法により選択した。得られ
た菌株をＳ　リモサス　ＢＡ２と命名するが、これは本
発明の目的に叶う宿主として有用である。

実施例１４ 絶倒１２に記載のように、ストレプトマイセス・ハイグ
ロスコピカスのタイロシン生合成経路における突然変異
体を入手する操作を行った。ｔｙｌ　Ｅ生合成遺伝子に
関連した突然変異は常法により確認でき、バルブおよび
セス（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａ
ｎｄ　Ｃｈｅ＋ｎｏｔｈｅｒａｐｙ、　２０：２１４−
２２５（１９８１））の方法に従い、選択することがで
きる。得られた菌株をＳ。

リモサスＢＡ３と命名する。

実施例１６ ストレプトマイセス・フラジアエＧＳ］６およびプラス
ミドｐ　ＨＪ　Ｌ　２８４の代わりにストレプトマイセ
ス・リモサス　ＢＡ３およびプラスミドｐＸＹＺ１００
０の培養物を使用する以外は、実施例１０に記載の方法
に実質的に従い、ストレブ）マイ１−　ＩＪモサス　Ｂ
Ａ３／ｐＸＹＺ　１０００を構築した。２”’−０−デ
メチルタイロシンの産生は、常法により検定でき、また
ボルフおよびセス、＾ｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇ
ｅｎｔｓ　ａｎｄ　ＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙスＩ・レ
ブトマイセス・リモサスＢ　Ａ　３　突然変異体省構藩 ストレプトマイセス・フラジアエの代わりにストレプト
マイセス・リモサス（ＡＴＣＣ］０９７０）を使用する
以外は、実質的に実施例１２に記載のように、ストレプ
トマイセス・リモサスのタイロシン生合成経路における
突然変異体を入手する操作を行った。ｔｙｌＥ生合成遺
伝子に関連した突然変異は常法により確認でき、バルブ
および七ノ（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔ
ｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、　２０：２１
４−２２５（１９８０）の方法に従い、選択することが
できる。得られた菌株をＳ　リモサスＢＡ３と命名する
が、これは本発明の目的に叶う宿主として有用である。

実施例１５ ストレプトマイセス・フラジアエの代わりにストレプト
マイセス・ハイグロスコピカス（ＡＴＣ（，１０９７６
）を使用する以外は、実質的に実２０：２１４−２２５
、およびケネディ−（Ｋｅｎｎｅｄｙ）、　Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　２８１：２８
８−２９２（１９８３）に記載の教示に実質的に従い、
測定できる。この化合物ハ、既知の２”’−０−デメヱ
ルタイロシン試料（実施例１１）との同時クロマトグラ
フィーによってまず同定される。

実施例１７ ストレプトマイセス・フラジアエＧ５ｌ６およびプラス
ミドｐ）（ＪＬ２８４の代わりにストレプトマイセス・
ハイグロスコピカス　ＢＡ４およびプラスミドｐｘＹｚ
１０００の培養物を使用する以外は、実施例１０に記載
の方法に実質的に従い、ストレプトマイセス・ハイグロ
スコピカス　ＢＡ４／ｐＸＹＺ　１０００を構築した。

ボルフおよびセス、＾ｎＬｉｍ１ｃｒｏｂｉａｌ＾ｇｅ
ｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　２０：２
＋４−２２５、およびケネデ４　＋、　Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　Ｃｈｅｍ。

ｔｈｅｒａｐｙ　２Ｂ１：２８８−２９２　（１９８：
（）に記載の教示に実質的に従い、２””Ｏ−デメチル
タイロシンの産生は、常法により検定、測定できる。こ
の化合物は、既知の２”’−０−デメチルタイロシン試
料（実施例１１）との同時クロマトグラフィーによって
まず同定される。

実施例１８ ストレプトマイセス・フラジアエＧ５１５およびプラス
ミドｐＨＪ　Ｌ２８／ｌの代わりにストレプトマイセス
・フラジアエ　ＢＡ２およびプラスミドｐｘｙｚ　］　
０００の培養物を使用する以外は、実施例１０に記載の
方法に実質的に従い、ストレプトマイセス・フラジアエ
　ＢＡ２／ｐＸＹＺ］ＯＯＯを構築した。ボルフおよび
七ノ、ＡｎＬｉｍｉｃｒ。

ｂｉａ１人ｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａ
ｐｙ　２０：２＋４−２２５、およびケネディー、　Ｊ
ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　２８
１：２８８−２９２（１９８３）に記載の教示に実質的
に従い、２“−〇−デメチルタイロシンの産生は、常法
により検定、測定できる。この化合物は、既知の２０−
デメチルタイロシン試料（実施例１１）理して分断した
。次いで、この培養物の接種物をチオストレプトン不含
のＴＳＢに３回連続して継代した。各継代の後に、培養
物を分断し、体積１０％のレベルで接種した。最後の継
代の後、培養物を分断し、チオストレプトンを２５μｇ
／ｘＱで含有するＡＳＩ寒天培地（組成に関しては実施
例１２を参照）上にプレートした。チオストレプトン耐
性コロニーを取り出し、ＴＳＢ上で増殖させた。完全に
増殖した時に、培養物を分断し、チオストレプトン含有
培地上における平板効率（ｐｌａｔｉｎｇ　ｅｆｆｉｃ
ｉｅｎｃｙ）を測定した。この効率が１．００の値であ
るか、またはこの付近である場合には、ｐＨＪＬ２８４
プラスミドはゲノムに組み込まれている。その理由はこ
の自立的なプラスミドは抗生物質選択の無い増殖期では
不安定であり、消失するからである。平板効率が１．０
０よりも小さい場合は、別のチオストレプトン耐性コロ
ニーを取り出し、選択無しの増殖を繰り返し、再度、チ
オストレプトンに対する平板効率を評価する。平板効率
が１．００、またはその付近に達するまでとの同時クロ
マトグラフィーによってまず同定される。

実施例１９ み 実施例１０に記載のように、Ｇ５１６をｐＨＪＬ２８４
で形質転換し、チオストレプトン耐性形質転換体を選択
した。ｐＨＪＬ２８４の存在が確認された形質転換体を
選択し、チオストレプトン（２０１１ｇ／ｕｉ２）を加
えたＴＳＢに接種した。得られた培養物を３０’Ｃで振
盪し、完全に増殖させた（約４８時間）。この培養物を
ガラスホモジナイザー［トーツス・サイエンティフィツ
ク（Ｔｈｏｍａｓ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、スウェデ
スボラ、ニューシャーシー］でホモジナイズし、超音波
振動機（ｕｌｔｒａｓ。

ｎｉｃ　ｖｉｂｒａｔｉｏｎ）　［ヒート・ンステムズ
・ウルトラソニノクス、　Ｉ　ｎｃ、　（Ｈｅａｔ　Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ　Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ、　Ｉｎｃ、　
）、ＩＣＣ肩口ローブ７６ワツト、７秒］で処（このこ
とは、ｐＨＪＬ２８４を含有する培養物がゲノムに組み
込まれていることを示す）、この操作を繰り返す。次い
で、得られた培養物を使用し、実施例１０に記載の方法
で２゛°”−Ｏ−デメチルタイロシンを生産する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、タイラクトンからタイロシンまでのタイロシ
ン生合成経路を示す経路図であり、第２図は、タイロシ
ンおよび２°゛−〇−デメチルタし／ イロシンの構造式を示す図であり、第２図は、プラスミ
ドｐＨＪＬ２８４（２６，９４ｋｂ）の制限部位および
機能地図の模式図であり、第４図は、プラスミドｐＸＹ
Ｚｌｏ００（８，１ｋｂ）の制限部位および機能地図の
模式図である。 特許出願人　イーライ・リリー・アンド・カンパニー化
　理　人　弁理士　前出　葆　（外１名）ＦＩＧ、３ ＥｃｏＲＩ ＦＩＧ、４ ｃｏＲＩ ７ト危にン市」巨＝：＝Ｌ’＋’ （ブｊＪ：′ＳＯ：、） 補正の内容 平成 １年 ７月１０１１ ７４頁１０行、 「第２図」を「第３図」 に訂正する。 １、事件の表示 平成 １年 特許願 第０７６３８３号 以 上 ２、発明の名称 一〇 デメチルタイロシンの生産力 ３、補正をする者 事件との関係

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ストレプトマイセスのタイロジン産生菌株を培養し
   て２’’’−Ｏ−デメチルタイロシンを生産するための
   方法であって、該産生菌株が、（ａ）タイロジン生合成
   遺伝子ｔｙｌＥの発現を妨げる１つまたはそれ以上の突
   然変異（群）を含有し、（ｂ）タイロジン生合成遺伝子
   ｔｙｌＦの発現をコードしているＤＮＡを含む組換えＤ
   ＮＡクローニングベクターで形質転換されており、 培養条件が細胞の増殖、ｔｙｌＦ遺伝子の発現、および
   ２’’’−Ｏ−デメチルタイロシンの産生に好適な条件
   であることを特徴とする生産方法。 ２、組換えＤＮＡクローニングベクターが培養中自律的
   に複製するベクターとして維持される請求項１に記載の
   方法。 ３、組換えＤＮＡクローニングベクターがプラスミドで
   ある請求項２に記載の方法。 ４、プラスミドがプラスミドｐＨＪＬ２８４、またはｐ
   ＸＹＺ１０００である請求項３に記載の方法。 ５、組換えＤＮＡクローニングベクターが培養中微生物
   のゲノムＤＮＡに組み込まれた配列として維持される請
   求項１に記載の方法。 ６、形質転換用ベクターのｔｙｌＦ　ＤＮＡが培養中微
   生物のゲノムＤＮＡに組み込まれることによって維持さ
   れる請求項１に記載の方法。 ７、培養する菌株がストレプトマイセス・フラジアエ、
   ストレプトマイセス・リモサス、またはストレプトマイ
   セス・ハイグロスコピカスである請求項１から６までの
   いずれかに記載の方法。 ８、培養する菌株がストレプトマイセス・フラジアエＧ
   ５１６である請求項７に記載の方法。 ９、ＤＮＡクローニングベクターがｐＨＪＬ２８４であ
   る請求項８に記載の方法。