JPH02174697A - 発光測定方式のバイオアッセイ法 - Google Patents
発光測定方式のバイオアッセイ法Info
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- JPH02174697A JPH02174697A JP568689A JP568689A JPH02174697A JP H02174697 A JPH02174697 A JP H02174697A JP 568689 A JP568689 A JP 568689A JP 568689 A JP568689 A JP 568689A JP H02174697 A JPH02174697 A JP H02174697A
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- JP
- Japan
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- dna
- bacterium
- luciferase
- plasmid
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、栄養要求性のルシフェラーゼ生産性形質転換
微生物を用いた発光測定方式のバイオアッセイ法に関す
る。
微生物を用いた発光測定方式のバイオアッセイ法に関す
る。
（従来の技術）
検体中の所望の被測定物質を測定するために。
微生物の代謝を利用した微生物センサーが用いられてい
る。例えば、細菌や酵母を寒天やカラギーナンの膜中に
固定化し、これにトランスデユーサ−（変換素子）を組
み合わせた酵素電極が使用されている。例えば、検体中
の被測定物質を利用した微生物の代謝により生産される
物質をトランスデユーサ−を介して電気信号に変換する
ことにより、該被測定物質の定量が行なわれ得る。この
ように、微生物センサーを用いることにより特定の化学
物質が定量され得、さらに、環境物質の評価（例えば、
有害性の度合を測定すること）が可能である。
る。例えば、細菌や酵母を寒天やカラギーナンの膜中に
固定化し、これにトランスデユーサ−（変換素子）を組
み合わせた酵素電極が使用されている。例えば、検体中
の被測定物質を利用した微生物の代謝により生産される
物質をトランスデユーサ−を介して電気信号に変換する
ことにより、該被測定物質の定量が行なわれ得る。この
ように、微生物センサーを用いることにより特定の化学
物質が定量され得、さらに、環境物質の評価（例えば、
有害性の度合を測定すること）が可能である。
しかし、上記微生物センサーを用いた場合に。
トランスデユーサ−を介して検知し得る量の物質が生成
するまでには比較的長時間を要し、かつ感度が充分であ
るとはいえない。
するまでには比較的長時間を要し、かつ感度が充分であ
るとはいえない。
（発明が解決しようとする課題）
本発明は、上記従来の問題を解決するものであり、その
目的とするところは、感度のよい微生物センサーを用い
たバイオアッセイ法を提供することにある。本発明の他
の目的は、形質転換微生物のルシフェラーゼ活性による
発光を利用した効果的なバイオアッセイ法を提供するこ
とにある。
目的とするところは、感度のよい微生物センサーを用い
たバイオアッセイ法を提供することにある。本発明の他
の目的は、形質転換微生物のルシフェラーゼ活性による
発光を利用した効果的なバイオアッセイ法を提供するこ
とにある。
（課題を解決するための手段）
本発明の発光測定方式のバイオアッセイ法は。
被測定物質を必須栄養源とし、かつルシフェラーゼ活性
を有する栄養要求性形質転換微生物を検体中に保持し、
該検体のルシフェラーゼ活性を測定することにより該被
測定物質を定量する発光方式のバイオアッセイ法であっ
て、該微生物が、ルシフェラーゼ活性を有するポリペプ
チドをコードする遺伝子を含む組換えプラスミドを、該
被測定物質を必須栄養源とする栄養要求性微生物宿主に
導入して得られ、そのことにより上記目的が達成される
。
を有する栄養要求性形質転換微生物を検体中に保持し、
該検体のルシフェラーゼ活性を測定することにより該被
測定物質を定量する発光方式のバイオアッセイ法であっ
て、該微生物が、ルシフェラーゼ活性を有するポリペプ
チドをコードする遺伝子を含む組換えプラスミドを、該
被測定物質を必須栄養源とする栄養要求性微生物宿主に
導入して得られ、そのことにより上記目的が達成される
。
本発明方法に用いられる形質転換微生物の宿主としでは
、その生育のためにはある特定の物質を必要とする微生
物、つまり栄養要求性の微生物が使用される。このよう
な性質を備えていれば、微生物の種類は特に限定されな
いが１例えば、大腸菌、枯草菌などが入手容易であるた
め汎用される。
、その生育のためにはある特定の物質を必要とする微生
物、つまり栄養要求性の微生物が使用される。このよう
な性質を備えていれば、微生物の種類は特に限定されな
いが１例えば、大腸菌、枯草菌などが入手容易であるた
め汎用される。
本発明により測定しうる物質は、上記使用される微生物
が必要とする物質であり、ビタミン１ アミノ酸、アル
コールなどがある。ビタミンとしては。
が必要とする物質であり、ビタミン１ アミノ酸、アル
コールなどがある。ビタミンとしては。
ビタミンＡ、ビタミンＢｔ（チアミン）、Ｂ、、Ｂ、。
Ｂ１□、ビタミンＣ，ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミ
ンになどがある。アミノ酸としてアラニン。
ンになどがある。アミノ酸としてアラニン。
アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システィ
ン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン。
ン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン。
ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン。
メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、ス
レオニン、トリプトファン、チロシン、バリンなどがあ
る。アルコールとしては、メタノール、エタノールなど
がある。
レオニン、トリプトファン、チロシン、バリンなどがあ
る。アルコールとしては、メタノール、エタノールなど
がある。
宿主を形質転換させるために用いられる組換え体プラス
ミドには、ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドを
コードする遺伝子が含まれる。このような遺伝子は、ル
シフェラーゼを生産する発光生物由来であり１発光生物
としては１例えば。
ミドには、ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドを
コードする遺伝子が含まれる。このような遺伝子は、ル
シフェラーゼを生産する発光生物由来であり１発光生物
としては１例えば。
発光細菌が好適に用いられる。特に発光細菌の一種であ
るビブリオ ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ 匝代ｕＬ）が
、上記組換え体プラスミドの調製に好適である。
るビブリオ ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ 匝代ｕＬ）が
、上記組換え体プラスミドの調製に好適である。
ビブリオ ハーベイは１例えばアメリカンタイプカルチ
ャーコレクシボン（Ａｌ！１ｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｒＢ ＡＴＣＣ）よ
り、寄託番号ＡＴＣＣ１４１２６の菌株として入手可能
である。
ャーコレクシボン（Ａｌ！１ｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｒＢ ＡＴＣＣ）よ
り、寄託番号ＡＴＣＣ１４１２６の菌株として入手可能
である。
上記ルシフェラーゼを生産する菌からルシフェラーゼを
コードするＤＮＡを存する組換え体プラスミドを得るに
は１通常のＤＮＡ単離方法１例えば。
コードするＤＮＡを存する組換え体プラスミドを得るに
は１通常のＤＮＡ単離方法１例えば。
次に示すフェノール法が採用され得る。まず、上記菌株
を培養し、集菌して菌体を生理食塩水または適当な緩衝
液に懸濁させる。これにリゾチーム。
を培養し、集菌して菌体を生理食塩水または適当な緩衝
液に懸濁させる。これにリゾチーム。
およびＳＤＳ （ドデシル硫酸ナトリウム）などの界面
活性剤を加えて溶菌させた後、フェノールにより不純物
を抽出・除去し、 ＤＮＡを水層に回収する。
活性剤を加えて溶菌させた後、フェノールにより不純物
を抽出・除去し、 ＤＮＡを水層に回収する。
この水層にエタノールを加えてＤＮＡ精製物を得る。
二のようにして得られたルシフェラーゼをコードするＤ
ＮＡを含むＤＮＡは１次に、遺伝子ライブラリーを作成
するために既知のプラスミドベクターに組み込まれる。
ＮＡを含むＤＮＡは１次に、遺伝子ライブラリーを作成
するために既知のプラスミドベクターに組み込まれる。
上記プラスミドベクターとしては、大腸菌の多コピープ
ラスミドであるｐｕｏｌｓ。
ラスミドであるｐｕｏｌｓ。
ｐＨｃ１２ 、およびｐＵｃ８などが挙げられる。これ
らのプラスミドはラクトースオペロン（Ｐｌａｃ）のプ
ロモーターを有するので、イソプロピル−β−Ｄ−チオ
ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によりオペロン
が誘導され得る。これらのプラスミドベクターは適当な
制限酵素により切断される。上記精製されたルシフェラ
ーゼをコードするＤＮＡも適当な制限酵素により切断さ
れ、上記制限酵素により切断されたプラスミドベクター
に連結される。
らのプラスミドはラクトースオペロン（Ｐｌａｃ）のプ
ロモーターを有するので、イソプロピル−β−Ｄ−チオ
ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によりオペロン
が誘導され得る。これらのプラスミドベクターは適当な
制限酵素により切断される。上記精製されたルシフェラ
ーゼをコードするＤＮＡも適当な制限酵素により切断さ
れ、上記制限酵素により切断されたプラスミドベクター
に連結される。
例えば、第１図に示すように、ビブリオ ハーベイから
単離した染色体ＤＮＡを５ａｕ３Ａで部分消化する一方
、 ｐＵｃ１８をＢａｍ旧で消化し、これらをＤＮＡ
リガーゼを用いて連結させる。ＤＮＡリガーゼとしては
１例えば、 Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼが用い
られ得る。
単離した染色体ＤＮＡを５ａｕ３Ａで部分消化する一方
、 ｐＵｃ１８をＢａｍ旧で消化し、これらをＤＮＡ
リガーゼを用いて連結させる。ＤＮＡリガーゼとしては
１例えば、 Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼが用い
られ得る。
このようにして得られる組換え体プラスミドは適当な宿
主微生物に導入される。ここで使用される微生物は、栄
養要求性であってもなくてもよい。
主微生物に導入される。ここで使用される微生物は、栄
養要求性であってもなくてもよい。
宿主微生物としては、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｔ）などが挙
げられる。大腸菌が容易に人手し得るため好適であり１
例えば、 Ｅ、 ｃｏｌｔ ＪＭ１０９株が有利に使
用され得る。上記組換え体ＤＮＡは、常法により宿主微
生物に導入される。例えば、塩化カルシウム法が用いら
れる。この方法によれば、まず大腸菌を液体培養し、集
菌して適当な緩衝液に懸濁させ。
げられる。大腸菌が容易に人手し得るため好適であり１
例えば、 Ｅ、 ｃｏｌｔ ＪＭ１０９株が有利に使
用され得る。上記組換え体ＤＮＡは、常法により宿主微
生物に導入される。例えば、塩化カルシウム法が用いら
れる。この方法によれば、まず大腸菌を液体培養し、集
菌して適当な緩衝液に懸濁させ。
塩化カルシウムと接触させる。処理後の大腸菌と上記組
換え体プラスミドとを塩化カルシウム存在下にて接触さ
せた後、熱処理（約３７’Ｃ）を行うと形質転換微生物
が得られる。
換え体プラスミドとを塩化カルシウム存在下にて接触さ
せた後、熱処理（約３７’Ｃ）を行うと形質転換微生物
が得られる。
このようにして得られた組換え体プラスミドを含む微生
物群からルシフェラーゼを生産する菌株がスクリーニン
グされる。このスクリーニングは。
物群からルシフェラーゼを生産する菌株がスクリーニン
グされる。このスクリーニングは。
使用したベクタープラスミドに由来する薬剤耐性の発現
、菌株が生産するルシフェラーゼによる発光反応などを
利用して行われ得る。例えば、ベクタープラスミドとし
て、上記ｐＵｃ１８を使用する例においては、 該ｐＵ
ｃ１８がアンピシリン耐性遺伝子を持つことを利用して
、得られた大腸菌群をアンピシリン含有培地で培養し、
該培地で生育する菌を選択する。さらに、これらの菌体
に対して、長鎖アルデヒド（例えば、ｎ−デカナール）
を作用させて発光を示す菌体を選択する。このようにし
て得られた形質転換微生物は、ビブリオ ハーベイ由来
のルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれた組換え体プラス
ミドを有する。発明者らは、上記形質転換大腸菌群の中
から最もルシフェラーゼ活性の高い大腸菌を選び出し、
これをＪＭ１０９ （ρＬＩＩＸ１８０１） 。
、菌株が生産するルシフェラーゼによる発光反応などを
利用して行われ得る。例えば、ベクタープラスミドとし
て、上記ｐＵｃ１８を使用する例においては、 該ｐＵ
ｃ１８がアンピシリン耐性遺伝子を持つことを利用して
、得られた大腸菌群をアンピシリン含有培地で培養し、
該培地で生育する菌を選択する。さらに、これらの菌体
に対して、長鎖アルデヒド（例えば、ｎ−デカナール）
を作用させて発光を示す菌体を選択する。このようにし
て得られた形質転換微生物は、ビブリオ ハーベイ由来
のルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれた組換え体プラス
ミドを有する。発明者らは、上記形質転換大腸菌群の中
から最もルシフェラーゼ活性の高い大腸菌を選び出し、
これをＪＭ１０９ （ρＬＩＩＸ１８０１） 。
そして該大腸菌が有するルシフェラーゼ活性を発現し得
るプラスミドをｐＬＵＸ１８０１と命名した。
るプラスミドをｐＬＵＸ１８０１と命名した。
形質転換微生物から再びプラスミドを単離し。
該プラスミドに挿入されているルシフェラーゼ遺伝子を
含むＤＮＡ断片をサブクローン化することにより、さら
に高いルシフェラーゼ活性を発現しうるプラスミドが得
られる。例えば、上記月１０９（ｐＬＵＸ１８０１ ）
を大量培養し、菌体をアルカリ処理してプラスミドを単
離し１種々の制限酵素を単独で。
含むＤＮＡ断片をサブクローン化することにより、さら
に高いルシフェラーゼ活性を発現しうるプラスミドが得
られる。例えば、上記月１０９（ｐＬＵＸ１８０１ ）
を大量培養し、菌体をアルカリ処理してプラスミドを単
離し１種々の制限酵素を単独で。
もしくはこれらを組みあわせて上記プラスミドを切断す
ることにより９次のＤＮＡ断片が得られた：（１）４．
０ｋｂｐの垣ｎｄ ■ＤＮＡＤＮＡ断片内２） ３．７
ｋｂｐのシ畦ｌ−Ｈ４ｎｄＩ［ｌＤＮＡ断片、 （３）
３．０ｋｂｐのＨｉｎｄ ｍ Ｐｓｉ Ｉ ＤＮＡ断
片、および（４）１．５ｋｂｐの則ユｄＩ［［−Ｅ（辺
ｌ１ｌＤＮＡ断片。
ることにより９次のＤＮＡ断片が得られた：（１）４．
０ｋｂｐの垣ｎｄ ■ＤＮＡＤＮＡ断片内２） ３．７
ｋｂｐのシ畦ｌ−Ｈ４ｎｄＩ［ｌＤＮＡ断片、 （３）
３．０ｋｂｐのＨｉｎｄ ｍ Ｐｓｉ Ｉ ＤＮＡ断
片、および（４）１．５ｋｂｐの則ユｄＩ［［−Ｅ（辺
ｌ１ｌＤＮＡ断片。
これらのＤＮＡ断片を再び上記方法に準じてｐＵｃ１８
プラスミドベクターに組み込み、それぞれのＤＮＡ断片
に対応する組換え体プラスミドｐＬ［ｌＸ１８０２゜ｐ
ＬＵＸ１８０３． ｐＬ１１Ｘ１８０４．およびｐＬＵ
Ｘ１８０５を得た。これらをそれぞれ新たな大腸菌ＪＭ
１０９株に導入し。
プラスミドベクターに組み込み、それぞれのＤＮＡ断片
に対応する組換え体プラスミドｐＬ［ｌＸ１８０２゜ｐ
ＬＵＸ１８０３． ｐＬ１１Ｘ１８０４．およびｐＬＵ
Ｘ１８０５を得た。これらをそれぞれ新たな大腸菌ＪＭ
１０９株に導入し。
そのルシフェラーゼ活性を調べたところ、 ｐＬｔｌＸ
１８０２を有する形質転換大腸菌（、ｆＭ１０９ （ｐ
ＬｔｌＸ１１３０２ ）と命名）、およびｐＬＵＸ１８
０３を有する形質転換大腸菌（ＪＭ１０９ （ｐＬＵＸ
１８０３ ）と命名）にルシフェラーゼ活性が認められ
た。
１８０２を有する形質転換大腸菌（、ｆＭ１０９ （ｐ
ＬｔｌＸ１１３０２ ）と命名）、およびｐＬＵＸ１８
０３を有する形質転換大腸菌（ＪＭ１０９ （ｐＬＵＸ
１８０３ ）と命名）にルシフェラーゼ活性が認められ
た。
第２図に組換え体プラスミドｐＬＵＸ１８０１． ｐＬ
ＵＸ１８０２゜ｐＬＵＸ１８０３． ｐＬＵＸ１８０４
およびｐＬＵＸ１８０５（７）制限酵素切断地図を、そ
して、第３図にｐＬＵＸ１８０２およびｐＬＩＩＸ１８
０３の模式図を示す。第２図からルシフェラーゼ遺伝子
は４．０ｋｂρの形ｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡ断片および３
．７ｋｂｐのＳａｌ ｌ−Ｈｌｒｉｄ［［ＤＮＡ断片内
に存在することが確認される。
ＵＸ１８０２゜ｐＬＵＸ１８０３． ｐＬＵＸ１８０４
およびｐＬＵＸ１８０５（７）制限酵素切断地図を、そ
して、第３図にｐＬＵＸ１８０２およびｐＬＩＩＸ１８
０３の模式図を示す。第２図からルシフェラーゼ遺伝子
は４．０ｋｂρの形ｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡ断片および３
．７ｋｂｐのＳａｌ ｌ−Ｈｌｒｉｄ［［ＤＮＡ断片内
に存在することが確認される。
このようにして得られた組換え体プラスミド（例えばｐ
ＬＵＸ１８０１． ｐＬＵＸ１８０２またはｐＬＵＸ１
８０３ ）が上記栄養要求性微生物に導入される。例え
ば、チアミン要求性の大腸菌ＪＭ１０９株に該組換え体
プラスミドを導入することにより、チアミン要求性でか
つルシフェラーゼを生産する形質転換体が得られる。
ＬＵＸ１８０１． ｐＬＵＸ１８０２またはｐＬＵＸ１
８０３ ）が上記栄養要求性微生物に導入される。例え
ば、チアミン要求性の大腸菌ＪＭ１０９株に該組換え体
プラスミドを導入することにより、チアミン要求性でか
つルシフェラーゼを生産する形質転換体が得られる。
このようにして得られた形質転換微生物を、適当な培地
で培養することにより、対数増殖期の菌体を得る。例え
ば、上記チアミン要求性の大腸菌株であれば、チアミン
を含む培地で培養される。
で培養することにより、対数増殖期の菌体を得る。例え
ば、上記チアミン要求性の大腸菌株であれば、チアミン
を含む培地で培養される。
遠心分離により集められた菌体を次に、チアミンを含ま
ない培地に移した後、これを本発明のバイオアッセイに
供する。例えば、検体溶液に上記菌体を加え、所定時間
、適当な温度で放置する。必要とされる時間および温度
は、形質転換微生物に用いられる宿主などにより異なる
。これに長鎖アルデヒド（例えば、デカナール）を加え
ると発光が起こる。この発光反応は１次の式により説明
される： ルシフェラーゼ ＰＭＮＨ２＋ ０□＋ Ｒ−ＣＨＯ−〉Ｆ門Ｎ ＋
Ｒ−ＣＯＯＨ＋ ■２０ ＋ ｈν ここでＲは、長鎖アルデヒドのアルキル基を示す。
ない培地に移した後、これを本発明のバイオアッセイに
供する。例えば、検体溶液に上記菌体を加え、所定時間
、適当な温度で放置する。必要とされる時間および温度
は、形質転換微生物に用いられる宿主などにより異なる
。これに長鎖アルデヒド（例えば、デカナール）を加え
ると発光が起こる。この発光反応は１次の式により説明
される： ルシフェラーゼ ＰＭＮＨ２＋ ０□＋ Ｒ−ＣＨＯ−〉Ｆ門Ｎ ＋
Ｒ−ＣＯＯＨ＋ ■２０ ＋ ｈν ここでＲは、長鎖アルデヒドのアルキル基を示す。
上記検体溶液にチアミンが含有されると、形質転換微生
物はこれを利用し、該微生物は、ルシフェラーゼを生産
する。同時に微生物の代謝により還元型フラビンアデニ
ンモノヌクレオチド（ＰＭＮＨ，）が生成する。ルシフ
ェラーゼの働きにより酸素（０□）の存在下でＦＭＮＨ
ｚおよびアルデヒド（Ｒ−ＣＨＯ）から。
物はこれを利用し、該微生物は、ルシフェラーゼを生産
する。同時に微生物の代謝により還元型フラビンアデニ
ンモノヌクレオチド（ＰＭＮＨ，）が生成する。ルシフ
ェラーゼの働きにより酸素（０□）の存在下でＦＭＮＨ
ｚおよびアルデヒド（Ｒ−ＣＨＯ）から。
フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、 該アルデヒド
に対応するカルボン酸（Ｉ？−ＣＯＯＨ） 、水（Ｕｔ
Ｏ）、および光（ｈν）が生成する。
に対応するカルボン酸（Ｉ？−ＣＯＯＨ） 、水（Ｕｔ
Ｏ）、および光（ｈν）が生成する。
このように、栄養要求性でルシフェラーゼ活性を有する
形質転換微生物を用い、その生育の程度に応じた発光量
の相違を測定することにより、被測定物質が精度よく定
量される。このような光デバイスを用いるバイオセンサ
ーは、従来の酵素電極などに比較すると高感度であり５
短時間のうちに測定がなされる。所望の栄養要求性微生
物を選択することにより、ビタミン、アミノ酸、アルコ
ールをはじめ、各種の物質の測定が可能となる。
形質転換微生物を用い、その生育の程度に応じた発光量
の相違を測定することにより、被測定物質が精度よく定
量される。このような光デバイスを用いるバイオセンサ
ーは、従来の酵素電極などに比較すると高感度であり５
短時間のうちに測定がなされる。所望の栄養要求性微生
物を選択することにより、ビタミン、アミノ酸、アルコ
ールをはじめ、各種の物質の測定が可能となる。
（実施例）
本発明を実施例によりさらに説明する。本実施例で使用
した発光細菌ビブリオ ハーベイは、アメリカンタイプ
カルチャーコレクションから購入したＡＴＣＣ１４１２
６株である。大腸菌ＪＭ１０９株およびプラスミドｐｌ
Ｊｃ１Ｂ （宝酒造社製品Ｎα３２１８）は宝酒造社
から購入した。
した発光細菌ビブリオ ハーベイは、アメリカンタイプ
カルチャーコレクションから購入したＡＴＣＣ１４１２
６株である。大腸菌ＪＭ１０９株およびプラスミドｐｌ
Ｊｃ１Ｂ （宝酒造社製品Ｎα３２１８）は宝酒造社
から購入した。
ビブリオ ハーベイＡＴＣＣ１４１２６株を、２％Ｎａ
Ｃ１を含有するＬＢ培地（バクトドリブトン１ｇ。酵母
エキスＱ、５ｇ、 ＮａＣ１２ｇ／１００ｍ）１００ｍ
で２８°Ｃにて８時間培養した後、 ８．００Ｏｒｐｍ
で１０分間遠心分離を行った。得られた菌体沈澱物をＥ
ＤＴＡを含有する生理食塩水（ＮａＣＩ ０．８８ｇ、
ＥＤＴＡ−Ｎａｚ １．８６ｇ／１００戚、 ｐＨ８
，０）１０ｍｌに懸濁して洗浄し、 ８，０ＯＯｒｐｒ
ｒｌで１０分間遠心分離を行った。次いで、沈澱物を上
記のＥＤＴＡを含有する生理食塩水５ｄに懸濁し、リゾ
チームを最終濃度が２■／ｄとなるように添加し、３７
°Ｃで２０分間振盪しながらインキュベーションを行っ
た。さらに、この溶液に１０％ＳＤＳを０ 、６ ｍｌ
添加し、６０°Ｃで１０分間インキュベートした。その
後９等量のフェノール溶液（フェノール：クロロホルム
：イソアミルアルコール：！（ｚｏ＝２５：２４；１：
５０）を添加して穏やかに撹拌し１次いで遠心分離を行
ってその上清（ＤＮＡを含有する水層）を得た。この上
清について、上記のフェノール溶液による抽出操作をさ
らに２回繰り返した。
Ｃ１を含有するＬＢ培地（バクトドリブトン１ｇ。酵母
エキスＱ、５ｇ、 ＮａＣ１２ｇ／１００ｍ）１００ｍ
で２８°Ｃにて８時間培養した後、 ８．００Ｏｒｐｍ
で１０分間遠心分離を行った。得られた菌体沈澱物をＥ
ＤＴＡを含有する生理食塩水（ＮａＣＩ ０．８８ｇ、
ＥＤＴＡ−Ｎａｚ １．８６ｇ／１００戚、 ｐＨ８
，０）１０ｍｌに懸濁して洗浄し、 ８，０ＯＯｒｐｒ
ｒｌで１０分間遠心分離を行った。次いで、沈澱物を上
記のＥＤＴＡを含有する生理食塩水５ｄに懸濁し、リゾ
チームを最終濃度が２■／ｄとなるように添加し、３７
°Ｃで２０分間振盪しながらインキュベーションを行っ
た。さらに、この溶液に１０％ＳＤＳを０ 、６ ｍｌ
添加し、６０°Ｃで１０分間インキュベートした。その
後９等量のフェノール溶液（フェノール：クロロホルム
：イソアミルアルコール：！（ｚｏ＝２５：２４；１：
５０）を添加して穏やかに撹拌し１次いで遠心分離を行
ってその上清（ＤＮＡを含有する水層）を得た。この上
清について、上記のフェノール溶液による抽出操作をさ
らに２回繰り返した。
得られた上清に２倍量のエタノールを添加し。
浮遊している染色体ＤＮＡをガラス棒を用いて巻きとり
１回収した。この染色体ＤＮＡが巻きついているガラス
棒を７０％エタノール、８０％エタノール９０％エタノ
ール、１００％エタノールに順次浸漬しＤＮＡの脱水を
行った。これをさらに室温で乾燥させた後、ｌ−のＴＥ
ＩＯ−１（１０ｍＭ Ｔｒｆｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）
。
１回収した。この染色体ＤＮＡが巻きついているガラス
棒を７０％エタノール、８０％エタノール９０％エタノ
ール、１００％エタノールに順次浸漬しＤＮＡの脱水を
行った。これをさらに室温で乾燥させた後、ｌ−のＴＥ
ＩＯ−１（１０ｍＭ Ｔｒｆｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）
。
１ｍＭ ＥＤＴＡ４ａｚ）に？容解させた。
このようにして得られたビブリオ ハーベイの染色体Ｄ
ＮＡを２ｕｇ含有する溶液（ＤＮＡ量は００２６０ｎｍ
における吸光度より求めた）に、 １／１０量の１０
Ｘ ５ａｕ３Ａ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐＨ７，５）、７０ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、ＩＭ ＮａＣ
Ｉ）および制限酵素５ａｕ３Ａを２単位添加し、３７°
Ｃで１５分間部分消化した。この溶液のうちＤＮＡ ２
００ｎｇに相当する量（上記ＤＮＡ消化物の１７１０量
に相当する量）と、制限酵素で完全消化した大腸菌プラ
スミドＤＮＡとを混合した。この「制限酵素で完全消化
した大腸菌プラスミドＤＮＡ Ｊとは、大腸菌の多コピ
ープラスミドｐＨｃ１ＢのＤＮＡ １１００ｎに、 １
／１０１の１１０ＸＢａ！＋１緩衝液（１００ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、 ７０ｍＭ ＭｇＣ１
ｚ、 ＬＭＮａＣｌ、 ２０ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノール、および０．１％ウシ血清アルブミン）、および
２単位の制限酵素Ｒａｍ旧を添加して、３７°Ｃで２時
間インキュベーションして完全に消化したものである。
ＮＡを２ｕｇ含有する溶液（ＤＮＡ量は００２６０ｎｍ
における吸光度より求めた）に、 １／１０量の１０
Ｘ ５ａｕ３Ａ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐＨ７，５）、７０ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、ＩＭ ＮａＣ
Ｉ）および制限酵素５ａｕ３Ａを２単位添加し、３７°
Ｃで１５分間部分消化した。この溶液のうちＤＮＡ ２
００ｎｇに相当する量（上記ＤＮＡ消化物の１７１０量
に相当する量）と、制限酵素で完全消化した大腸菌プラ
スミドＤＮＡとを混合した。この「制限酵素で完全消化
した大腸菌プラスミドＤＮＡ Ｊとは、大腸菌の多コピ
ープラスミドｐＨｃ１ＢのＤＮＡ １１００ｎに、 １
／１０１の１１０ＸＢａ！＋１緩衝液（１００ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、 ７０ｍＭ ＭｇＣ１
ｚ、 ＬＭＮａＣｌ、 ２０ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノール、および０．１％ウシ血清アルブミン）、および
２単位の制限酵素Ｒａｍ旧を添加して、３７°Ｃで２時
間インキュベーションして完全に消化したものである。
この混合液に、 ｌ／ＩＤｔのＩＱ Ｘ Ｔ４リガーゼ
緩衝液（６６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＩＣｉ （ｐｌ！７．
６） 、 ６６ｍＭ ＭｇＣ］ ２＋ １００ｍＭジチ
オスレイトール１および１ｍＭ ＡＴＰ） および１
０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加し、１０°Ｃで一
晩反応を行って連結させた（第１図参照）。大腸菌ＪＭ
１０９株のコンピテントセルを調製し、これに上記連結
混合物を接触させて、該大腸菌の形質転換を行った。こ
の菌体を。
緩衝液（６６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＩＣｉ （ｐｌ！７．
６） 、 ６６ｍＭ ＭｇＣ］ ２＋ １００ｍＭジチ
オスレイトール１および１ｍＭ ＡＴＰ） および１
０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加し、１０°Ｃで一
晩反応を行って連結させた（第１図参照）。大腸菌ＪＭ
１０９株のコンピテントセルを調製し、これに上記連結
混合物を接触させて、該大腸菌の形質転換を行った。こ
の菌体を。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンと１ｍＭのイソプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含有
するＬＢ寒天培地（１００ｍｌあたりバタトトリプトン
Ｉｇ。
−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含有
するＬＢ寒天培地（１００ｍｌあたりバタトトリプトン
Ｉｇ。
酵母エキス０．５ｇ、 ＮａＣ１Ｏ，５ｇ、および寒天
１．５％を含む） １０枚に塗り、３７°Ｃで一晩平板
培養し、てスクリーニングを行った。この培養で得られ
た１０．０００個のアンピシリン耐性の形質転換コロニ
ーに、 ｎ −デカナール（牛丼化学）を噴霧器を用
いて霧状に添加し３発光を示した（ルシフェラーゼ活性
を有する）コロニーを１株得た。このコロニーを形成す
る菌株に含有されるルシフェラーゼ活性を存する組換え
体プラスミドをｐＬＵＸ１８０１と命名し、該大腸菌コ
ロニーを大量培養した後にアルカリ処理を行うことによ
り、該プラスミドｐＬＵＸ１８０１を単離・精製した。
１．５％を含む） １０枚に塗り、３７°Ｃで一晩平板
培養し、てスクリーニングを行った。この培養で得られ
た１０．０００個のアンピシリン耐性の形質転換コロニ
ーに、 ｎ −デカナール（牛丼化学）を噴霧器を用
いて霧状に添加し３発光を示した（ルシフェラーゼ活性
を有する）コロニーを１株得た。このコロニーを形成す
る菌株に含有されるルシフェラーゼ活性を存する組換え
体プラスミドをｐＬＵＸ１８０１と命名し、該大腸菌コ
ロニーを大量培養した後にアルカリ処理を行うことによ
り、該プラスミドｐＬＵＸ１８０１を単離・精製した。
この精製されたプラスミドｐＬＵＸ１８０１に制限酵素
坦ユｄＩ［Ｉ、影佳ｉ、Ｐｓｔｌ、およびは遼Ｒ１を種
々の組み合わせで作用させて消化し、０．８χアガロー
スゲルで電気泳動することにより、以下のＤＮＡ断片を
得た： （１）４．０ｋｂｐの旧ｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡ
断片、 （２） ３．７ｋｂｐのＳａｌ Ｉ −Ｈｌｎ
ｄＩＩ［ＤＮＡ断片、 （３）３．０ｋｂｐの旧ｎｄｌ
ＩＩＰｓｔ Ｉ ＤＮＡ断片、および（４）Ｌ５ｋｂｐ
の旧ｎｄＩＩＩ −ＥｃｏＲＩＤＮＡ断片。（１） 〜
（４）それぞれのＩ）ＮＡ断片２０ｎｇと、 １０ｎＨ
のｐＵｃｌＢ ＤＮＡを（１）〜（４）と同じ制限酵素
の組み合わせで消化したＤＮＡとを１００単位のＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、プラスミドｐＬＵＸ
１８０１よりサブクローニングし、プラスミドｐ１、ｌ
Ｘ１８０２． ｐＬＩＪＸ１８０３ｐＬＵＸ１８０４．
およびｐＬＵＸ１８０５を調製した（第２図）。
坦ユｄＩ［Ｉ、影佳ｉ、Ｐｓｔｌ、およびは遼Ｒ１を種
々の組み合わせで作用させて消化し、０．８χアガロー
スゲルで電気泳動することにより、以下のＤＮＡ断片を
得た： （１）４．０ｋｂｐの旧ｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡ
断片、 （２） ３．７ｋｂｐのＳａｌ Ｉ −Ｈｌｎ
ｄＩＩ［ＤＮＡ断片、 （３）３．０ｋｂｐの旧ｎｄｌ
ＩＩＰｓｔ Ｉ ＤＮＡ断片、および（４）Ｌ５ｋｂｐ
の旧ｎｄＩＩＩ −ＥｃｏＲＩＤＮＡ断片。（１） 〜
（４）それぞれのＩ）ＮＡ断片２０ｎｇと、 １０ｎＨ
のｐＵｃｌＢ ＤＮＡを（１）〜（４）と同じ制限酵素
の組み合わせで消化したＤＮＡとを１００単位のＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、プラスミドｐＬＵＸ
１８０１よりサブクローニングし、プラスミドｐ１、ｌ
Ｘ１８０２． ｐＬＩＪＸ１８０３ｐＬＵＸ１８０４．
およびｐＬＵＸ１８０５を調製した（第２図）。
つまり、上記４種の組換え体プラスミドは、それぞれ、
以下のようなビブリオ ハーベイ由来のＤＮＡ断片を有
する： ｐＬＵＸ１８０２ ： ４．０ｋｂｐのＨｉｎ
ｄ ＩＩＩ ＤＮＡ断片、 ｐＬＵＸ１８０３ ： ３
．７ｋｂｐのＳａｌ Ｉ Ｈｉｎｄｌｌ［ＤＮＡ断片
。
以下のようなビブリオ ハーベイ由来のＤＮＡ断片を有
する： ｐＬＵＸ１８０２ ： ４．０ｋｂｐのＨｉｎ
ｄ ＩＩＩ ＤＮＡ断片、 ｐＬＵＸ１８０３ ： ３
．７ｋｂｐのＳａｌ Ｉ Ｈｉｎｄｌｌ［ＤＮＡ断片
。
ｐＬＵＸ１８０４：３．０ｋｂｐの旧ｎｄ［１−Ｐｓｔ
ｌ ＤＮＡ断片、およびｐＬＵＸ１８０５：１．５ｋ
ｂｐの旧ｎｄｌｌｌ −ＥｃｏＲ［ＤＮＡ断片。これら
それぞれの組換え体プラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株を
上記と同様の方法により形質転換した。この形質転換体
をＬＢ寒天培地で培養し、上記ｎ−デカナールを用いる
方法によりルシフェラーゼ活性を調べた。その結果２組
換え体プラスミドｐＬ［ｌＸ１８０２およびＩ）ＬＵＸ
１８０３を含有する菌体にルシフェラーゼ活性が検出さ
れた。
ｌ ＤＮＡ断片、およびｐＬＵＸ１８０５：１．５ｋ
ｂｐの旧ｎｄｌｌｌ −ＥｃｏＲ［ＤＮＡ断片。これら
それぞれの組換え体プラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株を
上記と同様の方法により形質転換した。この形質転換体
をＬＢ寒天培地で培養し、上記ｎ−デカナールを用いる
方法によりルシフェラーゼ活性を調べた。その結果２組
換え体プラスミドｐＬ［ｌＸ１８０２およびＩ）ＬＵＸ
１８０３を含有する菌体にルシフェラーゼ活性が検出さ
れた。
ルシフェラーゼ活性を発現し得る上記プラスミドｐＬＵ
Ｘ１８０２およびｐＬＵＸ１８０３（７） 、上記ｐＬ
［ｌＸ１８０１からの調製の詳細は次のとおりである。
Ｘ１８０２およびｐＬＵＸ１８０３（７） 、上記ｐＬ
［ｌＸ１８０１からの調製の詳細は次のとおりである。
まず、 ｐＬＵＸ１８０１のＤＮＡ １０ｕｇに、 １
／１０量の１０×旧ｎｄ［ｒ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、 ７０ｍＭ ＭｇＣ１ｇ
、６００ ｍＭ ＮａＣ１）および制限酵素旧ｎｄＩ［
を２０単位添加して３７°Ｃで２時間完全に消化し、
４．０ｋｂｐのｌ１ｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ断片を含む反
応混合溶液を得る。このＨｔｎｄｌｌｌ ＤＮＡ断片を
含む溶液に１７１０量の１１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび
制限酵素Ｓａｌ ｒを２０単位添加し、３７°Ｃで２時
間完全に消化したものを、０．８％アガロースゲルで電
気泳動することによって３．７ｋｂρの坦ｎｄＩ［［Ｓ
；佳Ｉ ＤＮＡ断片３μｇを単離・精製する。この３．
７ｋｂｐの旧ｎｄ Ｉ［［−５ａｌ ｒ ＤＮＡ断片２
０ｎｇと、 ｐＵｃｌＢ ＤＮＡ １０ｎｇを制限酵素
５ａ１１２単位および旧ｎｄｌｌ！２単位で消化したＤ
ＮＡとをＴ４ ＤＮＡリガーゼエ０単位を用いて結合し
１組換え体プラスミＦｐＬＵＸＩ８０３を得る。
／１０量の１０×旧ｎｄ［ｒ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、 ７０ｍＭ ＭｇＣ１ｇ
、６００ ｍＭ ＮａＣ１）および制限酵素旧ｎｄＩ［
を２０単位添加して３７°Ｃで２時間完全に消化し、
４．０ｋｂｐのｌ１ｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ断片を含む反
応混合溶液を得る。このＨｔｎｄｌｌｌ ＤＮＡ断片を
含む溶液に１７１０量の１１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび
制限酵素Ｓａｌ ｒを２０単位添加し、３７°Ｃで２時
間完全に消化したものを、０．８％アガロースゲルで電
気泳動することによって３．７ｋｂρの坦ｎｄＩ［［Ｓ
；佳Ｉ ＤＮＡ断片３μｇを単離・精製する。この３．
７ｋｂｐの旧ｎｄ Ｉ［［−５ａｌ ｒ ＤＮＡ断片２
０ｎｇと、 ｐＵｃｌＢ ＤＮＡ １０ｎｇを制限酵素
５ａ１１２単位および旧ｎｄｌｌ！２単位で消化したＤ
ＮＡとをＴ４ ＤＮＡリガーゼエ０単位を用いて結合し
１組換え体プラスミＦｐＬＵＸＩ８０３を得る。
組換え体プラスミドρＬＵＸ１８０２は、同様にして７
ｐＬＵＸｉ８０１のＤＮＡを制限酵素堕ｎｄｌＩ［で消
化して得られた。 ４．０ｋｂｐの坦ｎｄＩ［［ＤＮＡ
断片と、ρＵＣｌ３ＤＮＡ （あらかじめＨｉｎｄＩ［
Ｉで消化）とを、 Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて結合
することにより調製される。
ｐＬＵＸｉ８０１のＤＮＡを制限酵素堕ｎｄｌＩ［で消
化して得られた。 ４．０ｋｂｐの坦ｎｄＩ［［ＤＮＡ
断片と、ρＵＣｌ３ＤＮＡ （あらかじめＨｉｎｄＩ［
Ｉで消化）とを、 Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて結合
することにより調製される。
（Ｂ）±ヱまノ少定量
（Ａ）項で得られた組換え体プラスミドｐＬＵＸ１８０
２を用い、チアミン要求性株である大腸菌ＪＭ１０９株
を上記と同様の方法により形質転換した。この形質転換
体を、 ５ｍｌのＬＢ培地で３７°Ｃで１夜培養した
。
２を用い、チアミン要求性株である大腸菌ＪＭ１０９株
を上記と同様の方法により形質転換した。この形質転換
体を、 ５ｍｌのＬＢ培地で３７°Ｃで１夜培養した
。
この培養液５０μｌを、チアミン塩酸塩が添加されたグ
ルコース含有最少培地５ｄに接種して３７°Ｃで培養し
た。このチアミン塩酸塩が添加されたグルコース含有最
少培地は、培地ＩＩ！、中にＩ Ｍ Ｍｇ５０４１ ｍ
ｌ、 ０．１Ｍ ＣａＣ１ｚ １ｍ、 １Ｍチアミン塩
酸塩１ｄ。
ルコース含有最少培地５ｄに接種して３７°Ｃで培養し
た。このチアミン塩酸塩が添加されたグルコース含有最
少培地は、培地ＩＩ！、中にＩ Ｍ Ｍｇ５０４１ ｍ
ｌ、 ０．１Ｍ ＣａＣ１ｚ １ｍ、 １Ｍチアミン塩
酸塩１ｄ。
２０％グルコース］Ｏｄ、１０ｘＭ９塩溶液（ｌＩ！、
中にＮａＪＰＯ４６０ｇ、 ＫｌｈＰＯ４３０ｇ、 Ｎ
Ｈ４Ｃｌ １．０ｇおよびＮａＣ１５ｇを含む）１００
ｄを含む。３７゛Ｃにて２時間培養を行ない、 ＩＰＴ
Ｇを最終濃度が１ｍＭになるように加えて。
中にＮａＪＰＯ４６０ｇ、 ＫｌｈＰＯ４３０ｇ、 Ｎ
Ｈ４Ｃｌ １．０ｇおよびＮａＣ１５ｇを含む）１００
ｄを含む。３７゛Ｃにて２時間培養を行ない、 ＩＰＴ
Ｇを最終濃度が１ｍＭになるように加えて。
さらに２時間培養を行なった。このようにして。
対数増殖期まで菌体を増殖させた後、 ８０００ｒｐｍ
で１０分間遠心分離を行なった。得られた菌体沈澱物を
、チアミン塩酸塩を含まないグルコース最少培地５緘に
懸濁し、４°Ｃで保存した。
で１０分間遠心分離を行なった。得られた菌体沈澱物を
、チアミン塩酸塩を含まないグルコース最少培地５緘に
懸濁し、４°Ｃで保存した。
次の濃度のチアミン塩酸塩水溶液の調製を行なった：
Ｏｎｍｏｌ／成、 ０．２ｎｍｏｌ ７ｍ１．０．４ｎ
ｍｏｌ ／ｍｌＯ，６ｎｍｏｌ ７ｍ１．０．８ｎｍｏ
ｌ ／ｒｒｄｌ、 １．０ｎｍｏｌ ７ｍ１０上記保存
した菌体懸濁液を１ｍＪｌずつ採取し、これらのチアミ
ン塩酸塩溶液とそれぞれ混合し、室温で１時間放置した
。これに、ｎ−デカナール５ｔｉｌを加え、液体シンチ
レーションカウンターＬＳ３８０１（ベックマン社製）
でフォトン数を測定した。その結果を次に示す。
Ｏｎｍｏｌ／成、 ０．２ｎｍｏｌ ７ｍ１．０．４ｎ
ｍｏｌ ／ｍｌＯ，６ｎｍｏｌ ７ｍ１．０．８ｎｍｏ
ｌ ／ｒｒｄｌ、 １．０ｎｍｏｌ ７ｍ１０上記保存
した菌体懸濁液を１ｍＪｌずつ採取し、これらのチアミ
ン塩酸塩溶液とそれぞれ混合し、室温で１時間放置した
。これに、ｎ−デカナール５ｔｉｌを加え、液体シンチ
レーションカウンターＬＳ３８０１（ベックマン社製）
でフォトン数を測定した。その結果を次に示す。
（以下余白）
チアミン塩酸塩 計数値（ｃｐｍ）上記結果を第４
図に示す。第４図から、チアミン塩酸塩の濃度とフォト
ン数とは比例関係にあることがわかる。この検量線を用
いてチアミンの定量が行なわれ得る。
図に示す。第４図から、チアミン塩酸塩の濃度とフォト
ン数とは比例関係にあることがわかる。この検量線を用
いてチアミンの定量が行なわれ得る。
（Ｃ）悲乏之勿足１
（Ａ）項で得られた組換え体プラスミドｐＬＵＸ１８０
３を用い、リジン要求性株である大腸菌（ＡＴＣＣ２３
８１２株）を上記と同様の方法により形質転換した。こ
れを（Ｂ）項と同様に対数増殖期まで増殖させ、遠心分
離により菌体を得た。この菌体をリジンを含まないグル
コース最少培地５戚に懸濁し ４ ’Ｃで保存した。
３を用い、リジン要求性株である大腸菌（ＡＴＣＣ２３
８１２株）を上記と同様の方法により形質転換した。こ
れを（Ｂ）項と同様に対数増殖期まで増殖させ、遠心分
離により菌体を得た。この菌体をリジンを含まないグル
コース最少培地５戚に懸濁し ４ ’Ｃで保存した。
次に、（Ｂ）項と同様の濃度のし一リジン水溶液を調製
し、これを用いて（Ｂ）項と同様に試験を行ない、フォ
トン数を測定した。その結果を次に示す。
し、これを用いて（Ｂ）項と同様に試験を行ない、フォ
トン数を測定した。その結果を次に示す。
Ｌ−リジン濃度（ｎｍｏｌ／ｍｌ） 計数値（ｃｐ
ｍ）上記結果を第５図に示す。第５図から、Ｌ−リジン
濃度とフォトン数とは比例関係にあることがわかる。こ
の検量線を用いてＬ−リジンの定量が行なわれ得る。
ｍ）上記結果を第５図に示す。第５図から、Ｌ−リジン
濃度とフォトン数とは比例関係にあることがわかる。こ
の検量線を用いてＬ−リジンの定量が行なわれ得る。
（発明の効果）
本発明によれば、このように、栄養要求性のルシフェラ
ーゼ生産性形質転換微生物を用い、所望の被測定物質が
発光により効果的に測定される。
ーゼ生産性形質転換微生物を用い、所望の被測定物質が
発光により効果的に測定される。
このようなバイオアッセイ法は、酵素電極のような従来
の微生物センサーを用いた方法よりも感度が高く、かつ
短時間のうちに測定がなされるため。
の微生物センサーを用いた方法よりも感度が高く、かつ
短時間のうちに測定がなされるため。
各種生物学的試験などに好適に利用され得る。
土−Ｎ血■皿爪星説ユ
第１図は組換え体プラスミドｐＬＵＸ１８０１の調製工
程を示す説明図；第２図は組換え体プラスミドｐＬＵＸ
１８０１が有する細菌ルシフェラーゼをコードするＤＮ
Ａ断片を種々の制限酵素で切断した。欠失１）ＮＡが挿
入されている組換え体プラスミドｐＬＵＸ１８０２．
ｐＬＵＸ１８０３、 ｐＬＵＸ１８０４およびｐＬＩＪ
Ｘ１８０５の制限酵素切断地図；第３図は細菌ルシフェ
ラーゼをコードするＤＮＡ断片が挿入されている組換え
体プラスミドｐＬＵＸ１８０２およびｐＬＵＸ１８０３
を示す模式図、第４図は本発明方法を用いてチアミン塩
酸塩を測定したときの該チアミン塩酸塩とフォトン数と
の関係を示すグラフ。
程を示す説明図；第２図は組換え体プラスミドｐＬＵＸ
１８０１が有する細菌ルシフェラーゼをコードするＤＮ
Ａ断片を種々の制限酵素で切断した。欠失１）ＮＡが挿
入されている組換え体プラスミドｐＬＵＸ１８０２．
ｐＬＵＸ１８０３、 ｐＬＵＸ１８０４およびｐＬＩＪ
Ｘ１８０５の制限酵素切断地図；第３図は細菌ルシフェ
ラーゼをコードするＤＮＡ断片が挿入されている組換え
体プラスミドｐＬＵＸ１８０２およびｐＬＵＸ１８０３
を示す模式図、第４図は本発明方法を用いてチアミン塩
酸塩を測定したときの該チアミン塩酸塩とフォトン数と
の関係を示すグラフ。
そして第５図は本発明方法を用いてリジンを測定したと
きの該リジンとフォトン数との関係を示すグラフである
。
きの該リジンとフォトン数との関係を示すグラフである
。
以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、被測定物質を必須栄養源とし、かつルシフェラーゼ
活性を有する栄養要求性形質転換微生物を検体中に保持
し、該検体のルシフェラーゼ活性を測定することにより
該被測定物質を定量する、発光方式のバイオアッセイ法
であって、 該微生物が、ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチド
をコードする遺伝子を含む組換えプラスミドを、該被測
定物質を必須栄養源とする栄養要求性微生物宿主に導入
して得られる、 バイオアッセイ法。 ２、前記被測定物質が、ビタミンまたはアミノ酸である
特許請求の範囲第１項に記載の発光測定方式のバイオア
ッセイ法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP568689A JPH02174697A (ja) | 1988-09-30 | 1989-01-12 | 発光測定方式のバイオアッセイ法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24759688 | 1988-09-30 | ||
| JP63-247596 | 1988-09-30 | ||
| JP568689A JPH02174697A (ja) | 1988-09-30 | 1989-01-12 | 発光測定方式のバイオアッセイ法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02174697A true JPH02174697A (ja) | 1990-07-06 |
Family
ID=26339664
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP568689A Pending JPH02174697A (ja) | 1988-09-30 | 1989-01-12 | 発光測定方式のバイオアッセイ法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02174697A (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6143998A (ja) * | 1984-06-05 | 1986-03-03 | アマーシャム インターナショナル パブリック リミティド カンパニー | 環境中微生物の検出方法 |
-
1989
- 1989-01-12 JP JP568689A patent/JPH02174697A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6143998A (ja) * | 1984-06-05 | 1986-03-03 | アマーシャム インターナショナル パブリック リミティド カンパニー | 環境中微生物の検出方法 |
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