JPH02174792A - ５’―付加オリゴヌクレオチドの製造のための試剤 - Google Patents

５’―付加オリゴヌクレオチドの製造のための試剤

Info

Publication number
JPH02174792A
JPH02174792A JP1238413A JP23841389A JPH02174792A JP H02174792 A JPH02174792 A JP H02174792A JP 1238413 A JP1238413 A JP 1238413A JP 23841389 A JP23841389 A JP 23841389A JP H02174792 A JPH02174792 A JP H02174792A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
group
reporter
dna
oligonucleotides
oligonucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP1238413A
Other languages
English (en)
Inventor
Jr Frank W Hobbs
フランク・ワーデン・ホブズ・ジユニア
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
EIDP Inc
Original Assignee
EI Du Pont de Nemours and Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by EI Du Pont de Nemours and Co filed Critical EI Du Pont de Nemours and Co
Publication of JPH02174792A publication Critical patent/JPH02174792A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6558—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system
    • C07F9/65586—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system at least one of the hetero rings does not contain nitrogen as ring hetero atom
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、５′−付加（ｔａｇ）のオリゴヌクレオチド
の製造に有用である非ヌクレオシド含有の、フルオレッ
センスの付加された燐試剤に関する。
ある種の５′−フルオレッセンス付加のオリゴヌクレオ
チドも本発明の一部として開示される。
要するに本発明によれば、５′−フルオレラセン付加の
オリゴヌクレオチドの製造に有用な試剤が開示される。
ある種のオリゴヌクレオチドも開示される。
デオキシリポ核酸（ＤＮＡ）は生体系のすべての過程を
指示するために必要とされる情報を貯わえる分子である
。それはホスホジエステル結合によって連結した４つの
非ヌクレオチド・サブユニットからなるポリマーである
。天然に産するＤＮＡは普通水素結合によって一緒に保
持された２つの相補的二重鎖形で見出される。二重鎖形
のＤＮＡは一重鎖のＤＮＡの解離することができ、逆に
相補的な一重１ＪＪＤＮＡは会合して二重鎖ＤＮＡを形
成しよう。
「ＤＮＡ」及び「オリゴヌクレオチド」という術語はし
ばしば互換的に使用されるが、本明細書においてｒＤＮ
ＡＪは大きい（ヌクレオチド長＞１００）又は天然に産
する分子、特に種々の分析に供されるものに関して使用
される。「オリゴヌクレオチド」は、ここでは現在の実
用的化学合成によって作るのに十分少さい（ヌクレオチ
ド長＜１００）−重鎖ＤＮＡの断片に関して使用される
。しかしながらこのｒＤＮＡＪ　と「オリゴヌクレオチ
ド」との間の区別はいくらか人為的と思われる。ＤＮＡ
はオリゴヌクレオチドとして考えるのに十分少さい良く
定義される断片に分解することができ、また化学的に合
成されたオリゴヌクレオチドは酵素的に結合させること
によりＤＮＡと呼ばれ且つ生命過程を指示するのに十分
大きい二重鎖ポリマーとすることができる。
オリゴヌクレオチド及びＤＮＡにリポータ−を導入する
ことの可能性は、一部分子生物学の分野における最近の
爆発的な進歩によっている。リポータ−は適当な物理的
又は化学的検知系及び検知法によって容易に測定又は検
知しうる物理的又は化学的特性を有する化学基として定
義することができる。容易な検知性は、色の変化、リン
光、蛍光、及び放射線のような特性によって付与するこ
とができ、或いはそれはリポータ−がリガンド認識部位
として働いて、第２のリガンドが通常（例えば比色、分
光学、蛍光又は放射線）の検知法で検知しうる基を含ん
でいる特異的なりガント−リガンド錯体を形成する能力
によって付与することができる。リガンド−リガンド錯
体は蛋白質−リガント、酵素−基質、抗体−抗原、炭水
化物−レクチン、蛋白質−補因子、蛋白質−エフエクタ
ー核酸−核酸、又は核酸−リガント複合体の形であって
よい。ビオチン及びアビジン間に生成する錯体はそのよ
うなりガント−リガンド複合体の例である。
高特異的活性３２Ｐは一般に種々の用途のためにオリゴ
ヌクレオシド並びにＤＮＡに付加するために使用されて
きたけれど、この放射性同位体の使用は理論的及び健康
的観点から問題がある。３２ｐの短い半減期は試薬の必
要性を数日前に予測し且つそのような試薬を急いで使う
ことを必要とする。
−度３２ｐの付加したＤＮＡ配列の７ラグメントを生成
させると、それは自己分解する傾向があり、直ぐに電気
泳動分析に供さねばならない。続く標識したＤＮＡフラ
グメントの電気泳動ゲルにおける可視化のために必要と
される自動カーデイオグラフィーは遅い方法である（夜
通しの露呈が通常である）。最後に可能な健康の危険性
はそのような有用な放射性同位体の使用及び廃棄と関連
したものである。
これらの問題を処理するために　３！ｐ／オートカーデ
イオグラフイーを、別の非放射性同位体のリポータ−（
ｒｅｐｏｒｔｅｒ）　／検知系で代替することが考えら
れてきた。新規なリポータ−／検知系は３２Ｐを代替す
べく非常に感度が良（なければならない。ある意味にお
いて、ＤＮＡは紫外線（ＵＶ）吸収光で検知できるから
、それ自体「リポータ−」であることができる。しかし
ながら多くの重要な分析は、ＤＮＡがＵＶ吸収で検知で
きる濃度より数けた低い濃度でＤＮＡを検出することを
必要とする。例えばＤＮＡの配列決定はＤＮＡｌ０−”
モル（又は約１０’個の分子）を検知できる゛リポータ
ー／検知系を必要とする。それ故に、実用的な非同位体
リポータ−／検知系は少くとも３１ｐに匹敵する感度を
有していなければならない。以下、「リポータ−」は高
特異的活性の１！Ｐを代替しうる化学基にだけ関係する
であろう。
プローバー（Ｐｒｏｂｅｒ）ら、サイエンス（Ｓｃ　１
ｅｎｃｅ）２３８．３３６〜４１（１９８７）及びスミ
ス（Ｓｍｉｔｈ）ら、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　３
２１　ｓ　６７４〜７９　（１９８６）は、アルゴンレ
ーザー及びフィルター付き光増巾管検知系と組合せると
、ある蛍光染料はＤＮＡの配列決定に対するリポータ−
として３２ｐを代替しうるということを示した。
必要とされる感度を達成するために、これらの染料はア
ルゴンレーザーの波長における強い吸収、蛍光放射の高
い量子効率、及び蛍光放射のバックラウンド信号からの
区別の可能性に関して注意深く選択された。
ＤＮＡの特異的部位において容易に検出されるリポータ
−が導入できることは、ＤＮＡを分析する多くの方法に
とって絶対的に必須である。例えばＤＮＡの配列を決定
するために現在知られているすべての方法は、数百の異
なるオリゴヌクレオチドをゲル電気泳動によって分離す
ることを必要とする。（各オリゴヌクレオチドの約ｔｏ
−”〜１０−”モルが一般に存在する。）それ故に、リ
ポータ−がゲル電気泳動による分離を複雑にしないとい
うことが重要である。■Ｐは非放射性Ａｌｐに代替して
もゲル電気泳動に何の影響も及ぼさないから理想的なリ
ポータ−である″。蛍光染料のような非放射性リポータ
−をオリゴヌクレオチドに付加する場合、そのオリゴヌ
クレオチドの電気泳動における易動性が変化する。唯１
つのリポータ−を正確に定義された領域においてオリゴ
ヌクレオチドに付加するならば、そのような変化は均一
であって許容しうる。しかしながら変化させうる数のリ
ポータ−が付加する場合或いは唯１つのリポータ−が種
々の位置に付加する場合、電気泳動による分析は不可能
にある。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡの拡大は
、ゲル電気泳動による分離を必要とするＤＮＡを分析す
るための他の技術である。好ましくは、この方法で用い
るオリゴヌクレオチドは唯１つの位置において非同位体
リポータ−を有するであろう。
ＤＮＡの非部位特異的酵素的付加はいくつかの方法が公
知であるけれど、非同位体リポータ−を部位特異的に付
加する種類の方法は１つだけが公知である。酵素即ち末
端トランスフェラーゼは種々の改変された及び／又は付
加されたヌクレオチドをオリゴスクレオチドの３′−末
端に付加しうる。この酵素は改変された及び／又は付加
されたヌクレオチドの３′−ヒドロキシル基が除去され
又は変化せしめられた時だけ単一の部位付加を行なう。
悪いことにこの方法で付加されたＤＮＡは多くの酵素の
分析において使用することができない。ＤＮＡの配列決
定及び拡大は、これらの分析に用いる付加したオリゴヌ
クレオチドが３′−位に普通のヒドロキシル基を有する
ということを必要とする。
ＤＮＡを付加する多くの化学的方法が開発されたが、こ
れらの殆んどは非部位特異的反応を含み、この結果ゲル
電気泳動分析に適当でない付加されたＤＮＡを生成する
。部位特異的な付加されたオリゴヌクレオチドは全合成
、即ち化学合成で製造されてきた。１つを除いて、これ
は常に異常な反応性の付加された基例えば脂肪族アミノ
基又はチオールを有するオリゴヌクレオチドを合成する
ことによってなされてきた。この研究法において、付加
されたアミノ又はチオール基は、５′−ヒドロキシル基
を代替し、或いはある連結基によって５′−ヒドロキシ
ル基に添加され、或いはある連結基によって塩基に添加
される。この部位特異的付加法は、（ｉ）異常に反応性
の基を保護された形で含有する単量体ヌクレオチドの製
造；　（ｉ）異常に反応性の基を有する所望のオリゴヌ
クレオチドの、普通異常に反応性の基の同時の脱保護基
を伴なう化学的合成及び精製、並びに（ｉｎ）蛍光染料
（又は他のリポータ−）の、異常に反応性の基への選択
的結合、を含んでなる。
この及び関連した研究の例は、ドレイパ（Ｄｒａｐｅｒ
）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
）１９．１７７４〜１８　（１９８０）；スミス（Ｓｍ
ｉｔｈ）　、独国特許第３，４４６，６３５号（１９８
５）；スミスら、ヌクレイツク・アシツズ・レス（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　ｌ　３．２３９
９〜２４１２　（１９８５）；クール（Ｃｏａｌｌ）ら
、テトラヘドロン曇しト（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌ
ｅｔｔ、）　２７．３９９１−９４（１９８６）；スプ
ロート（Ｓｐｒｏａｔ）ら、ヌクレイツク・アシツズ・
レス、１５．４８３７〜４８　（１９８７）；スプロー
トら、ヌクレイツク・アシツズ・レス、１５．６１８１
〜９６（１９８７）；タナ力ら、テトラヘドロン・レト
、２８．２６１１−１４　（１９８７）；タナ力ら、ヌ
クレイツク・アシツズ・レス、１５．６２０９−２４　
（１９８７）；アゲロウアル（Ａｇｒａｗａｌ）ら、ヌ
クレイツク・アシツズ・レス、１４．６２２７−４５　
（１９８６）；コノリー（Ｃｏｎｎｏ　ｌ　Ｉｙ）ら、
ヌクレイツク・アシツズ・レス、１５．３１３１〜３９
　（１９８７）；コノリーら、ヌクレイツク・アシツズ
・レス、１３．４４８５〜４５０２　（１９８５）；及
びシン”　（Ｓｉｎｈａ）ら、ヌクレイツク・アシツズ
・レス、１６．２６５９〜６９（１９８８）に開示され
ている。
全合成の部位特異的付加の研究は付加したオリゴヌクレ
オチドの合成にいくつかの問題を提起する。
第一に、それは改変されたオリゴヌクレオチドの合成及
び精製、この改変されたオリゴヌクレオチドの反応性基
へのリポータ−の付加、及び最終的精製を含めて多段工
程である。
第二に、ＤＮＡの配列決定及びＤＮＡの拡大（ａｍｐｌ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、付加したオリゴヌクレオチド
がＤＮＡポリメラーゼに対する基質であるということを
必要とする。これらのポリメラーゼはオリゴヌクレオチ
ドの３′−末端での反応を接触するから、オリゴヌクレ
オチドの５′−末端は非同位体リポータ−を付加させる
のに好適な部位である。普通反応性基がヌクレオチドに
付加され或いはヌクレオチド内に導入されている場合、
この手法は融通性を欠く。５′−ヌクレオチドはｄＡ。
ｄＴ、ｄＣ又はｄＧであってよい。それ故に異常に反応
性の基を導入するために、４種の適当な試剤が所望の５
′−ヌクレオチドと共に必要とされる。これらの試剤は
典型的には空気及び水分に敏感であり且つ限られｔ；貯
蔵寿命しか有さないから、少くとも４種の試剤セットを
準備しておくことが必要であり、これは厄介である。
第三に、異常に反応性の官能基を５′−位に導入するた
めに連続基を用いるならば、更なる問題が起こる。異常
に反応性の基が合成オリゴヌクレオチドに成功裏に連続
するかどうかを決定することはしばしば困難である。異
常に反応性の基をオリゴヌクレオチドに付加させるため
に用いる試剤は限られた貯蔵寿命しかをさないから、所
望のリポータ−の導入に失敗することが普通である。
第四に、問題に遭遇したとき、失敗した段階を決定する
ことが普通困難である。
第五に、異常に反応性の基を成功裏に結合させるために
は、一般に大過剰のリポータ−が使用される。これはリ
ポータ−の無駄であるし、オリゴヌクレオチドの精製を
複雑にする。
上述した全合成の部位特異的付加の研究法の１つを除い
て、プローバー（Ｐｒｏｂｅｒ）ら、ヨーロッパ特許第
２５２．６８３号は、ＤＮＡの配列決定のためにフルオ
レッセンス付加のオリゴヌクレオチドを合成するより直
接的で信頼性のある方法を既述している。この手法では
異常に反応性の官能基は使用されなかった。その代りに
ヌクレオチドを所望のオリゴヌクレオチドに導入する前
に、蛍光リポータ−をヌクレオチドに直接付加した。
この方法の主な欠点は、それがリポータ−の特異的ヌク
レオチドへの付加に依存し、従って融通性に欠けること
である。得られるフルオレッセンス付加のオリゴヌクレ
オチドは４つの区別しうる蛍光染料を必要とするＤＮＡ
配列決定系で用いられた。完全な融通性はオリゴヌクレ
オチドの合成に適当な１６の異なるフルオレッセンス付
加のヌクレオチド試剤セットを必要とするであろう。こ
の試剤も空気と水分に敏感であり、限られた貯蔵寿命し
か有さない。
本発明の目的は、５′−付加のオリゴヌクレオシドを製
造するために、非ヌクレオシドを含有するフルオレッセ
ンス付加の燐試剤を提供することによって、過去の技術
で遭遇する問題を克服しようとするものである。本発明
に開示される試剤は製造が容易であり、プローバーらの
ヨーロッパ特許第２５２，６８３号に見出される化合物
よりも融通性がある。本発明のリポータ−の、得られる
オリゴヌクレオチドにおける存在はゲル電気泳動による
分析或いはＤＮＡの配列決定又はＤＮＡの拡大における
使用を妨害しない。これらのリポータ−を用いる場合に
は、より少ない工程ですみ、誤差や誤認の機会が減少す
る。
本発明の５′−付加のオリゴヌクレオチドは、自動化さ
れたＤＮＡの配列決定及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）によるＤＮＡの拡大に対する標識されたブライマー
（ｐｒｉｍｅｒ）として使用することができる。
本発明は式 ％式％ ［式中、リポータ−は保護された蛍光リポータ−及び保
護されてない蛍光リポータ−からなイる群から選択され
； からなる群から選択され、但しＲ及びＲ１は独立にＨ％
Ｃ３〜Ｃ３゜分岐鎖アルキル、Ｃ１〜ＣＩＯ直鎖アルキ
ル、Ｃ６〜Ｃ３゜アリール、Ｃ２〜Ｃ１，アルカリール
、及びＣ７〜Ｃａｔアラルキルからなる群から選択され
；そして Ｑは 及びこれらの塩からなる群から選択され、但しＲ２及び
Ｒ３は独立にＣ３〜Ｃ１６分岐鎖アルキル及びＣ３〜Ｃ
ＩＯ直鎖アルキルからなる群から選択され；Ｒ６は−（
ＣＲＲ’）１．１（Ａ）ｎ（ＣＲＲ’）Ｉｌｌ−１から
なる群から選択され、なおＲ，Ｒ’、及びＡは上述の通
りであり、ｍ＝１〜６、ｎ”０〜ｌ、ｐ−ｔ−ｔｏ、及
びｑ−０〜ｌＯであり、なお但し２ｍ＋ｎ＜１２及び更
に２≦１＋ｐ＋ｑ≦１３であり；ＸはＦ、Ｃ１゜Ｂｒ、
！、イミダゾルーｌ−イル、ｌ　、２．４−トリアゾル
−１−イル、テトラゾルー１−イル、及びｌ−ヒドロキ
シベンゾトリアゾル−〇−イルからなる群から選択され
：そしてＹはいずれかのホスフェートｅｔ護基である］
の化学試剤を提供する。
更に本発明はある種の５′−フルオレッセンス付加のオ
リゴヌクレオチドを含む。これらのオリゴヌクレオチド
は本発明の試剤を用いて簡便に製造される。この種のオ
リゴヌクレオチドの一般的な構造は、 〔式中、Ｒ５及びＲ・は独立にＨＳＣ，〜Ｃ４アルキル
、Ｆ、Ｃ１、Ｂｒ１１、ＣＩ’−Ｃ＊アルコキシ及び−
ＣＮからなる群から選択され；Ｂはｌ−チミニル、■−
シトシニル、■−ウラシニル、９−アデニニル及び９−
グアニニルからなる群から選択され、Ｒ１はＨ及びＯＨ
かもなる群から選択され；そしてｎ＝ｏ〜約１００であ
る〕 である。
第１図は、実施例７で製造しｔ；４つの試料に対し、電
気泳動中に観察されｔ；蛍光放射と時間のプロットを示
す。この図は５′−フルオレッセンス付加のオリゴヌク
レオチドに由来するプライマー延長生成物かその蛍光放
射によって検知できることを示す。またこの図はＤＮＡ
テンプレートにおける塩基の配列がこのプロットから引
き出せることを示す。
第２図は実施例８で製造したＤＮＡの拡大試料の電気泳
動中に観察された蛍光放射と時間のプロット及びサイズ
・マーカー（ｓｉｚｅ　ｍａｒｋｅｒ）の同様のプロッ
トを示す。この図は５′−フルオレッセンス付加のオリ
ゴヌクレオチド・プライマーに由来する拡大生成物がそ
の蛍光放射によって検知できることを示す。またこの図
は拡大法の主な生成物が予想されるように、サイズで約
３３７の塩基対のフルオレッセンス付加オリゴヌクレオ
チドであることも示す。
本発明の非ヌクレオチドを含有するフルオレッセンス付
加の燐試剤は５′−付加のオリゴヌクレオチドの製造に
有用である。これらの試剤は式９式％ ［式中、リポータ−は保護された蛍光リポータ−及び保
護されてない蛍光リポータ−からなる群から選択され： からなる群から選択され、但しＲ及びＲ１は独立にＨ，
Ｃ，〜Ｃ１゜分岐鎖アルキル、Ｃ，〜Ｃ１゜直鎖アルキ
ル、Ｃ，〜Ｃ１゜アリール、Ｃ７〜ＣＩ２アルカリール
、及び０７〜Ｃ１□アラルキルからなる群から選択され
；そして Ｑは 及びこれらの塩からなる群から選択され、但しＲ２及び
Ｒ３は独立にＣ３〜ｃ１゜分岐鎖アルキル及びＣ３〜ｃ
１゜直鎖アルキルからなる群から選択され：Ｒ１は−（
ＣＲＲ’）ｍ（Ａ）ｎ（ＣＲＲ’）Ｉｎ−１からなる群
から選択され、なおＲ，Ｒ１、及びＡは上述の通りであ
り、ｍ−１〜６、ｎ　−０〜ｌ、ｐ＝ｌ−１ｏ１及びｑ
＝０−１ｏｆあり、なお但し２ｍ＋ｎ≦１２及び更に２
くｎ＋ｐ＋ｑ≦１３であり；ＸはＦ、ＣＩ、Ｂｒ、Ｉ、
イミダゾルーｌ−イル、ｌ　、２．４トリアゾル−１−
イノ呟テトラゾルーＩ−イル、及びｌ−ヒドロキシベン
ゾトリアゾル−〇−イルからなる群から選択され；そし
てＹはいずれかのホスフェート保護基テある１のもので
ある。このリポータ−は活性化しうる燐基Ｑに共有的に
連結されている。
好ましくはＡは一〇−である。この場合これらの試剤は
（活性化しうる燐基Ｑを参照して）ホスホラミダイト（
ｌ及び２）、亜燐酸（３）、Ｈ−ホスホネート（４）、
及び活性化されたホスホジエステル（５）として通常公
知である。構造（３）及び（４）は適度な強酸を表わし
、且つこれらの構造で表わされる試剤は一般にその有機
的に可溶性の塩として単離させ、使用される。
これらの試剤のＨ−ホスホネート形（４）は−般に亜燐
酸形（３）と平衡にあり、Ｈ−ホスホネートは非常に好
ましい。同様の平衡はＡが−５−燐基Ｑはいずれかのホ
スフェート保護基のいずれかであってよいＹを含む、好
ましくはＹは４−ＣＩ−ＣａＪ−０−１２−ＣＩ−ＣＪ
ａ〜０−１４−ＮＯＩ−ＣｓＨａ−０−１４〜Ｎ０ｘ−
ＣＪ４ＣＨｔＣＨｚ−０−１２，４−Ｎ０ｘ−ＣａＨｓ
ＣＨｘＣＨｚ−０−１２＋４−Ｃ１ｘ−Ｃ４Ｈ６−０−
１２，３−ＣＩ！−Ｃ４Ｈ６−０−１ＮＧＣＩ、ＣＨ！
０−１ＮＣＣＨＩＣ（ＣＨ３）　！−０−１ＣＨ，０−
１（Ｚ）３ＣＣＨ１−０−１（Ｚ）３ＣＣ（ＣＨ３）　
ｚ−０−１Ｒ’　５−１Ｒ’　５ＣＨ２ＣＨ＊−０−１
Ｒ’　ＳＯ，ＣＩ、ＣＨ２−０−１及びＲ’　ＮＨ−か
らなる群から選択され、但しＺはＣ１，Ｂｒ及び！から
なる群から選択され、そしてＲ′はＨ，Ｃ，〜Ｃ８゜分
岐鎖アルキル、ＣＩ””Ｃｌ１ｌ直鎖アルキル、Ｃ１〜
ＣＩ。
アリール、Ｃｔ〜Ｃ１！アルロリール、及びＣ２〜Ｃ１
２アラルキルからなる群から選択される。最も好適なＹ
基はＮＣＣＨｚＣＪＯ−５ＣＩ（，０−１及び２−Ｃ１
Ｃ，Ｈ，Ｏ−である。
適当な蛍光リポータ−は、その保護されていない形にお
いてｊ２Ｐで迅速に達成されうる検出濃度又はそれ以下
、即ち約ＩＯ−ロモルで検知できるものである。特別な
所望の性質は、励起領域における大きい吸光係数、高い
量子収率、最適な励起及び放射波長（好ましくは３５０
ｎｍ以上）、及び光安定性を含む。例えばアルゴンレー
ザーで効率良く励起される蛍光染料はこのレーザーが安
価な理由から望しい。
好ましくは、保護されていない形においてリポータ−は
、キサンチン（例えばフルオレスカン、エオシン、エリ
スロシン）、ローダミン（例、ｔＪｆテトラメチルロー
ダミン、テキサス・レッドリ、ペンザミジゾール、エチ
ジウム、プロピジウム、アンスラシフシン、ミスラマイ
シン、アクシジン、アクチノマイシン、メロシアニン、
クマリン（例えば４−メチル−７−メドキシクマリン）
、ピレン、クリセン、スチルベン、アンスラセン、ナフ
タレン（例えばダンシル、５−ジメチルアミノ−１−ナ
フタレンスルホニル）、サリチル酸、ベンズ−２−オキ
サ−１−ジアゾール（ベンゾフランとしても公知）、（
例えば４−アミノ−７−二トロベンズー２−オキサ−１
，３−ジアゾール）、及びフルオレスカミンからなる群
から選択される蛍光染料である。これらの染料の多くは
有用な形で市販されている。ＤＮＡに付加するために使
用される蛍光染料の総説については、Ａ、Ｓ、ワラゴナ
−（Ｗａｇｇｏｎｅｒ）ら、生物医学の科学における蛍
光染料の応用、Ｄ、Ｌ、ティラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら編
、アランＲ，リス社（Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、Ｎｅｗ
　Ｙｏｒｋ）　　（１９８６）を参照のこと。
最も好ましくは、リポータ−はキサンチン、特に構造式 ％式％ ［式中、Ｒ’及ヒＲ’ハ独立４：　−Ｈ、Ｃ、−Ｃ、フ
ルキル、−Ｆ、−Ｃ１、−Ｂ　ｒ　ｓ　−１％　Ｃｒ〜
Ｃ４アルコキシ、及び−〇Ｎからなる群から選択され；
Ｒ７はＣ１〜Ｃ，アルキルであり；そしてＲ８はアルキ
ル又はナリールからなる群から選択される］ １こよって表わされるキサンチンで、ある。
技術的に公知の方法を用いることにより、これらの染料
と活性化しうる燐基Ｑとの間に共有連結基を作ることが
できる。合成の容易さ及び安定性の理由から、Ｑは形式
的にはリポータ−のヒドロキシル基の一部であった酸素
に普通連結する。いくつかの場合、活性化しうる燐基Ｑ
は、リポータ−としての有用性を妨害しない部位におい
て蛍光染料に直接結合することができる。他の場合には
、これらの染料の１つを小さい２官能性分子の一端に結
合し且つ活性化しうる燐をこの分子の他端に選択的に結
合することによって共有結合を形成させることができる
。上述した蛍光リポータ−の多くは、小さい２官能性分
子に結合させるのに適当な形で市販されている。
いくつかの場合、活性化しうる燐基の結合、燐基の活性
化、或いは燐基の、オリゴヌクレオチドの５′−ヒドロ
キシル基への結合中に、リポータ−の敏感な官能基を保
護することが必要である。
存在するならは保護基の性質はリポータ−の敏感な官能
基に依存しよう。本発明の好適なキサンチン染料は保護
を必要とする求核的ヒドロキシル基を有する。種々の官
能基の保護及び脱保護の方法は技術的に公知であり、Ｊ
、Ｆ、Ｗ、マツクオーミ（ＩｉｌｃＯｍｉｅ）編、有機
化学における保護基、プレナム−プＬ／　ス（Ｐｌｅｎ
ｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　　（１９７３
）を参照しうる。
自動化されたＤＮＡ合成装置は一般にオリゴヌクレオチ
ド合成に対してホスホラミダイト法を用いるから、本発
明の好適な燐試剤はホスホラミダイトである。即ちＡが
一〇−であり且つＱが−Ｐ−ＮＲ”Ｒ３及び　−Ｐ−Ｎ
ζ〕Ｒ′Ｙ　　　　　　　　　　　Ｙ からなる群から選択される時、好ましくは上に特定した
キサンチン染料が用いられる。好適な具体例は活性化し
うる燐基ＱのＲ１及びＲ３がＣＨ（ＣＨ））　！である
ものである。
上述した試剤は５′−フルオレッセンス付加のオリゴヌ
クレオチドの製造に有用である。これらの試剤を用いて
活性化しうる燐基Ｑとオリゴヌクレオチドの５′−ヒド
ロキシル基との間に共有結合を形成させる適当な方法は
公知である。これらの方法は　５／　　−ｙルオレツセ
ス付加のオリゴヌクレオチドを製造するためにオリゴヌ
クレオチドを合成する他の公知の方法と組合せることが
できる。オリゴヌクレオチドの分野の一般的文献として
は、Ｍ、Ｊ、ゲイト（Ｇａｉむ）ｍ１オリゴヌクレオチ
ド合成、−膜内研究法、ＩＲＬプレス（ＩＲＬＰｒｅｓ
ｓ、０ｘｆｏｒｄ）　　（１９８４）を参照されたい。
蛍光リポータ−を保護された形で用いる場合には、脱保
護工程が必要であることがある。
開示した試剤のほかに、本発明はある種の５′−フルオ
レラセン付加のオリゴヌクレオチドを含む。これらのオ
リゴヌクレオチドは、本発明の試剤及びオリゴヌクレオ
チドの技術に公知の方法を用いることにより簡便に製造
される。この種のオリゴヌクレオチドの一般構造式は ［式中、Ｒ’及ＣＪ　Ｒ’ハａ立＋：　Ｈ、Ｃ、〜Ｃ，
７ルキシ、Ｆ％ＣＩ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ，〜Ｃ，アルコキシ
及び−ＣＮからなる群から選択され；Ｂは！−チミニル
、ｌ−シトシニル、ｌ−ウランニル、９−アデニニル及
び９−グアニニルからなる群から選択され；Ｒ”はＨ及
びＯＨからなる群から選択され：そしてｎ＝０〜約１０
０である］ である。
これらのオリゴヌクレオチドは、プローバー（Ｐｒｏｂ
ｅｒ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２３８．３
３６〜４１　（１９８７）及びアンソージ（Ａｎｓ。
ｒｇｅ）ら、Ｊ、バイオケム・バイオフイズ・メソッズ
（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ）
、１３．３１５〜２３　（１９８６）に記述された方法
に従い、自動化されたフルオレッセンスに基づ＜ＤＮＡ
配列決定に使用することができる。更にそれらは米国特
許環４．６８３．１９５号及び第４．６８３．２０２号
に記述されている方法に従い、ポリメラーゼｉＩ！、鎖
反応（ＰＣＲ）法によるＤＮＡ拡大に使用することがで
きる。
実施例 一般的な方法 次の実施例は本発明の化合物及び適用法を例示するが、
これを限定するものではない。実施例１〜４は特許請求
する試剤の製造を示し；実施例５及び６は５′−フルオ
レッセンス付加のオリゴヌクレオチドの特許請求する種
類のものを開示し且つそれを製造することのできる方法
を記述し、そして実施例７及び８はこれらの試剤及び５
′−フルオレッセンス付加のオリゴヌクレオチドの有用
性に関す。
次の系統図は実施例におけるものに関する。構造式７ａ
−ｄ、ｇａ−ｄ、及び９ａ−ｄは好適なキサンチン・リ
ポータ−の保護された形を示す。
図においてＰ（ＯＣＨ□ＣＨｇＣＮ）　（Ｎ　（１−Ｐ
ｒ）ｚ）である活性化しうる燐基Ｑを旦及び旦の間でリ
ポータ−に付加する。最後の構造式は本発明の蛍光付加
のオリゴヌクレオチドを要約する。
？　− すべての温度はセラ氏である（２５℃は大気又は室温に
相当する）。すべての部及びパーセントは断わらない限
り、容量で表わす液体混合物を除いて重量によるものと
する。実施例中法の略号が使用される：ＤＭＦ＝ジメチ
ルホルムアミド、ＤＭＳＯ−ジメチルスルホキシド、Ｓ
Ｆ−サクシニルフルオレラセン、ＮＭＲ−核磁気共鳴ス
ペクトル、ＩＲ−赤外スペクトル、ＵＶ＝紫外スペクト
ル又は検知、ＴＬＣ−シリカゲルでの薄層クロマトグラ
フィー、ＨＰＬＣ−高速液体クロマトグラフィー、ＧＣ
−ガスクロマトグラフィー、ｍｐ”融点、ｍｐｄ−分解
を伴う融点、及びｂｐ−沸点、ＮＭＲのデータを報告す
る場合、化学シフトはｐｐｍで、まｔ；結合定数（Ｊ）
はヘルツで表示する。すべての融点は補正してない。イ
オン交換樹脂は使用前に適当な水性及び有機溶媒で洗浄
した。ここに記述するすべての化合物の同定は適当な分
光法及び分析技術によった。断らない限り、シリカゲル
でのクロマトグラフィーによる精製はスチル（Ｓｔｉ目
）ら、Ｊ、オルグ・ケム（Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、）４３．
２９２３〜２６　（１９７８）に記述されている如く行
なった。
実施例１ ホスホラミダイト９ａの合成 段階１　：　　Ｎ−（３−（３，６−ジアセドキシー９
−エトキシ−９Ｈ−キサンチン−９−イル）フロピオニ
ル）−４−ヒドロキシピペリジン８ａの製造 乾燥ジクロルメタン（２０ｍｊ２）中４−ヒドロキシピ
ペリジン（５０６ｍｇ、５．００ミリモル、２．５当量
、アルドリッチ）及び９−　（２−（Ｎ−サクシニミジ
ロキシー力ルポニル）エチル）−３，６−ジアセドキシ
ー９−エトキシ−９Ｈ−キサンチン７ａ　（１，０２３
ｇ、２．００ミリモル、プローバーらのヨーロッハ特許
１２５２．６８３号）の溶液を３０分間撹拌した。この
反応物を１Ｍ水性燐酸カリウム緩衝液（３０にｐＨ−７
）に添加し、ジクロルメタン（３Ｘ　３０−で抽出した
。
有機抽出物を硫酸カルシウムで乾燥し、濃縮し、夜通し
真空乾燥して粗アミド８ａ　（１，０３９ｇ。
１０４％）を灰色がかった泡状物として得た。この物質
はＮＭｋ及びＴＬＣにより純度＞９０％であり、次の段
階に更に精製しないで使用した。
’Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄｓ）　　：　７．５８　（
ｍ、　２Ｈ％ＡｒＨ）、７．０４（ｍ、４Ｈ，ＡｒＨ）
　、４．６６　（ｄ％Ｊ−４、ＩＨ，ＯＨ）、３．７２
　（ｂｒ　ｍ、　ＩＩ、　ＮＣＨ，つ、３．５７　（見
かけ上８重線、ＬＨ，ＣＨＯＨ）　、３−１７　（ｂｒ
　ｍ、　ＩＨ％ＮＣＨ！’）、２．８８　（ｑ、　Ｊ−
７，２Ｈ，０ＣＨｚＣＨ３）　、２−８３　（ＩＩ＋−
２Ｈ１ＮＣＨ！’及びＮＣＨｚ’）　、２．２９　（ｓ
、　６Ｈ，０Ａｃ）　、２．２２（見かけ上明白なｔ、
Ｊ−８，２Ｌ　ＧＨｚＣＯ）　、１．７３（見かけ上明
白なｄｄ、　２Ｈ−ＣＨｚＡｒ）　、１５８　Ｃｍ−２
Ｈ，ＣＨ，”ＣＨＯＨ）　、１．１１　（ｍ、　２Ｈ，
ＣＨ，’ＣＨＯＨ）、及び１．０３　（ｔ、　Ｊ−７，
３Ｈ１０ＣＨＩＣＨ３）　。Ｔ　Ｌ　Ｃ（９：ｌジクロ
ルメタン−メタノール；ＵＶ）：出発物′Ｉｉヱ、Ｒｆ
−０，８７；アミド生成物８ａ、Ｃ１−４９゜段階２：
　２−シアノエチル（Ｎ−（３−（３，６−ジアセドキ
シー９−エトキシ−９Ｈ−キサンチン−９−イル）フロ
ピオニル）−ピペリジン−４〜イル）オキシＮ、Ｎ−ジ
イソプロピルホスホラミダイト９ａ 粗アミド８ａ　（１，００ｇ、約１．９８モリモル）を
乾燥ピリジン（ｌｘｌｏｍり及び乾燥トルエン（２ＸＩ
Ｏｍｊりと共蒸発させ、次いで真空乾燥した。乾燥ジク
ロルメタン（１５ｍｊり、乾燥ジイソプロピルアミン（
０，１４ｍｊ２、■、００ミリモル、０．５当量）、テ
トラゾール（７０，０ｍｇ、１．００ミリモル、０．５
当量、アルドリッチ製ゴールド・ラベル）、及び２−シ
アノエチルＮ、Ｎ、Ｎ’Ｎ′−テトライソプロピルホス
ホロジアミダイト（０，７６ａ＋４２．２．４１モリモ
ル、１．２当量、アルドリッチ）を連続的に添加した。
得られた溶液を２時間撹拌した後、反応混合物を１Ｍ水
性燐酸カリウム緩衝剤（３０ｍ！、ｐＨ＝７）３０−に
添加し、エーテル（３Ｘ３０−）で抽出した。このエー
テル抽出物を硫酸力ルンウムで乾燥し、濃縮した。残渣
を、ジクロルメタン、酢酸エチル及びピリジンの７０：
２８：２混合物を用いるシルカゲル（ｌｏｏｇ）でのク
ロマトグラフィーに供した。
流出する最初のＵＶ吸収成分を濃縮し、乾燥トルエン（
２Ｘ３０ｍｊりと共蒸発させ、そして真空乾燥してホス
ホラミダイト９ａ　（８９３ｍｇ、６５％）を得た。残
存するトルエン（１６モル％）の存在を除いて、この物
質は１Ｈ及び”ＩＰ−ＮＭＲとＴＬＣによると純度〉９
５％であった。”Ｐ−ＮＭＲによると、この物質は普通
に封じたＮＭＲ管内の乾燥ＤＭＳＯ−ｄ、中において、
室温下に少くとも１週間安定であった。
ＩＨ−デカップル”Ｐ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄａ）　　
：　１４６−８（ｓ）。
５Ｉｐ−カップル’Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄａ）　　
：　７．５８　（ｄ−２Ｈ。
ＡｒＨ）　、７．２３　（ｍ、　０．３２Ｈ，）　／レ
ニン）　、７．１８　（ｍ。
０．４８Ｈ，ｌ−レニン）　、７．０４　（ｍ、　４Ｈ
，Ａｒｃ）　、３．９４（ｍ％１１．　ＣＨＯＰ）　、
３．６８　（ｍ、　２Ｈ，ＣＨｘＯＰ）　、３．５７（
ｍ、　２Ｈ，ＮＣＨ）　、３．４９　（ｂｒ　ｍ、　Ｉ
Ｈ−、ＮＣＨｚつ、３．１８（ｂｒ　ｍｓ　２Ｈ％ＮＣ
Ｈ，”及びＮＣＨ、つ、２．９６　（ｂｒ　ｍ。
ＩＨ，ＮＣＪ’）　、２．８８　（ｑ、　Ｊ−７，２Ｈ
，ＯＣＨ，ＣＨ３）、２．７４　（ｔ％Ｊ−６，２Ｈ％
ＣＨ＊ＣＮ）　、２．３１　（ｓｌｏ、４８Ｈ。
トルエン）　、２．３０　（ｓ、　６Ｈ，０Ａｃ）　、
２．２３　（見か１す上明白なｔ％Ｊ−８，２Ｈ，ＣＨ
，Ｃｏ）、１．５７　（見かけ上明白なｄｄ、　２Ｈ，
ＡｒＣ）ｉｇ）　、１．６３　（ｂｒ　ＩＩＩ、　２Ｈ
％　ＣＨｚ”Ｃ０Ｐ）　、Ｌ−３７（ｂｒ　ｍ、　２Ｈ
，ＣＭ、’Ｃ０Ｐ）　、　１．１３　（見かけ上明白な
【、１２Ｈ％ＣＨ（ｃＨｉ）ｔ）　、及び１．０３（ｔ
。
Ｊ雪７．３Ｈ，ＯＣＨ，ＣＨ３）　　。
実施例２〜４ ホスホラミダイト主１〜豆旦の製造 ホスホラミダイト９ｂ−９ｄを、実施例１のホスホラミ
ダイト９ａの製造に対して記述した如くＮ−ヒドロキシ
サクシニミジルエステル７ｂ〜７ｄから製造した。最終
のホスホラミダイトはピリジンの存在下にシリカゲルで
精製した。トルエン中ピリジン（４％）は好適な流出剤
であることがわかった。クロマトグラフィーの画分は、
ペンタ７９５％ピリジンで処理して不活性化したＴＬＣ
により好適に分析できた。純粋なホスホラミダイトを含
有する画分を一緒にし、乾燥ピリジン（４ＸｌＯ−）及
び乾燥トルエン（２ＸｌＯｄ）と共蒸発させ、そして真
空乾燥した。
ＩＨ−デカップル”Ｐ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄｉ）　　
：９ｂ　、１４７．０（ｓ）及び１４６．９（ｓ）。
氾　１４６．９（ｓ） ９ｄ　　１４７．０（ｓ）及びＭ６．９（ｓ）２つの燐
シグナルがＮＭＲによって観察される場合、２つのシグ
ナルは７０°Ｃまで暖めた時に１つのシグナルに融合し
た。（上記化合物のすべてのＮＭＲスペクトルはアミド
結合の周囲における制限が種々の回転によって最良に説
明される）。
実施例５ 自動化されたオリゴヌクレオチド合成は、ｍ作者の手引
に記述されている一般的な方法に従い、デュポンΦコー
ダー（Ｃｏｄｅｒ＠）に関して行なった。配列ｒ５’　
−ＸＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ３’Ｊを入力
し、次のオプションを選択した＝（１）末端処理工程を
用いるか？ハイ。
（２）５’末端ＤＭＴを除去するか？イイエ。
（３）ＤＭＴを集めるか？ハイ。（４）合成スケール１
Ｐモル。装置にデュポン社から市販されている試剤を仕
込み、そしてホスホラミダイト９ａの、乾燥アセトニト
リル９０．１Ｍ溶液を、自動化されたビン交換機能の代
りに手動のライン・パージ（３ｘ５０．ｃｃｇ）を用い
てｒＸＪポート（ｐｏｒｔ）に配置した。合成カラムに
おける出発物質は長鎖のアルキルアミンで調節された細
孔ガラス上のＮ−アニソイル−５′−ジメトキシトリチ
ル−２′−デオキシシチジン（１Ｐモル）であった。ホ
スホラミダイト９ａの使用中又は使用後に、いずれの変
更もしないで自動化された合成を行なった。
遊離されるジメトキシトリチルの分析は、固体担体上で
付加されてない１７量体の全収率がホスホラミダイト９
ａを用いる前に７５％であることを示した。（それ故に
サイクル当りの平均カップリング効率は９８．３％であ
った。）自動化された合成が完了した後、固体の担体を
合成カラムから取り出し、そして濃水際化アンモニウム
（４−）と１時間撹拌した。次いで固体担体を、グラス
クールの詰め物を通して薬ビン中に濾去し、そしてこの
薬ビンに更なる濃水酸化アンモニウム（約１ａｊｌ）を
入れた。薬ビンをしっかりと密閉し、そして５５°Ｃま
で４時間加熱した。（それより長い脱保護は、かなりの
量の非蛍光オリゴヌクレオチド副生物の生成を引き起こ
すことがある。）冷却後、アンモニア溶液を真空下に濃
縮した。
深橙色の残りを水（１０００ｔｉｉ）中に溶解した。
この溶液の一部（１０に）及び０．０５Ｍ水性トリス緩
衝液（９９０ｄ、ｐＨ８、２）を光路長１ｃＩＩｌのＵ
Ｖセル中に入れた。吸光度はそれぞれ最大吸収２６０及
び４９３ｎｍにおいて０．８１３及び０．１８６であり
、粗生成物が８１．３　０ＤＵ（２６０ｎ　ｍ）又は１
８．６　０ＤＵ　（４９３ｎｍ）の相当することを示し
た。発色団の吸光度（４９３ｎｍで７２．６００及び２
６０ｎｍで２３，０００；参照プローバーら、サイエン
ス、２３８．３３６〜４１　（１９８７）がオリゴヌク
レオチドへの結合によって変化しないということを仮定
して、粗蛍光オリゴヌクレオチドの収率は２５％であっ
た。粗生成物の、２６０ｎｍ及び５００ｎｍでの検知を
行なうＨＰＬＣ（２０ｃｍのＣＢ逆相カラム、０．１Ｍ
氷水性トリエチルアンモニウムアセテート中〜２５％ア
セトニトリルのグラジェントで２５分間１ｍＪ２／分で
流出）での分析は、２６０ｎｍでの最大ピークが５００
ｎｍで吸収する唯一の重要な生成物（〉９０％）である
ことを示した。
粗生成物の残りは３００Ａ’ＣＢダイナマクス（Ｄｙｎ
ａｎ＋ａｘ＠）カラム（ｌＸ２５ｃｍ）での分取用ＨＰ
ＬＣで精製した。カラムは０．１Ｍ水水性トリエチルア
ンモニウムアセテート中上セトニトリル５〜２０％グラ
ジェントを用い、５−７分の流速で３５分間にわたり流
出させた。主ピーク（２２分）を集め、真空下に乾燥し
た。精製したオリゴヌクレオチドを水中に溶解し、前の
ようにＵＶで分析した。収量は３８．６　０ＤＵ　（２
６０ｎｍ）及びｌ　５−２　０ＤＵ　（４９３ｎｍ）で
あった。オリゴヌクレオチド生成物の吸光係数がそのサ
ブユニットの吸光係数（２６０ｎｍで１９２，０００）
であると仮定するならば、精製した生成物の収率は２０
％であった。精製した生成物に対して４９３及び２６０
ｎｍで観察される吸光度の比（２゜５４：ｌ）はオリゴ
ヌクレオチド当り１つの５Ｆ５０５発色団を含む生成物
に対して計算された理論比（２，６４：　ｌ）の実験誤
差内であった。この生成物を凍結乾燥し、無菌の蒸留水
に溶解し、そして使用するまで一２５°Ｃで凍結して貯
蔵した。
実施例６ 他の蛍光付加したオリゴヌクレオチドの製造実施例５の
方法に従い、ＳＦ５１２−４ＨＰ−ｐ−、，５Ｆ５１９
〜４　ＨＰ　−ｐ−１及び５Ｆ５２６−４ＨＰ−ｐ−基
を、同一のオリゴヌクレオチドの５′−位にホスホラミ
ダイト９ｂ〜９ｄで結合させた。生成物の最大ＵＶ吸収
はそれぞれ５００．５１１．及び５１８ｎｍであった。
統いて実施例５の方法に従い、サクシニルフルオレラセ
ン染料を異なる塩基配列のオリゴヌクレオチドに結合さ
せた。
実施例７ の各に混合した：Ｍ１３ｍｐ１ｇ−Ｍ鎖ＤＮＡテンプレ
ート（Ｎ、Ｅ、バイオラプズ（ＢｉｏＬａｂｓ）　　；
　０　。
２５ｔｑ／１ｔｉ）ｌ　２．ｃｃｉ２．５Ｆ５０５−４
ＨＰ−ｐＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣプライマ
ー溶液（実施例５　：　０．３０　０ＤＵ　（２６０ｎ
ｍ）／、ｃｆ−１，５ｐ　Ｍ）　３１１１、ｌＯ×タグ
（Ｔａｇ）ポリメラーゼ反応緩衝液（１６６ｍＭ　（Ｎ
Ｈ４）　ｚｓＯ４；６７０ｍＭトリス−１（（１、ｐＨ
８，８；６７ｍＭＭ　ｇ　Ｃｌ　ｘ　；　ｌ　ＯＯｍ　
Ｍ　　β−メルカフトエタノル；　６７μＭ　ＥＤＴＡ
　；　１．７ａ＋ｇ／ｍＪ２牛の血清アルブミン）３に
、及びＨ，０５に。多管を沸とう水浴中で２分間沸とう
させ、次いで１５分間にわたって室温まで冷却した。４
つの管にヌクレオチド溶液５にを添加した。１つの管に
はｄｄＡ混合物、他にはｄｄｅ混合物、他にはｄｄＧ混
合物、そして他にはｄｄＴ混合物を入れた。これらの混
合物はジデオキシ及びデオキシヌクレオチドトリホスフ
ェートを次の濃度で含有する。
次の成分を４つの１．５ｍのエツペンドルフ管ｄｄＡ混
合物　ｄｄＣ混合物　ｄｄＧ混合物　ｄｄＴ混合物ｄｄ
ＡＴＰ　　３００　ｍＭ ｄｄｅＴＰ　　　＝　　　　１００ｍ　　　　　−−−
−ｄｄＧＴＰ　　　−−−−１５０ｍＭ　　　　−−ｄ
ｄＴＴＰ　　　−−−−−−５００ｍＭｄＡＴＰ　　　
２５　ａ＋Ｍ　　　２５０　ｍＭ　　　２５０　ｍＭ　
　　２５０　ｍｕｄＣＴＰ　　２５０　ｍＭ　　　　２
５　ｍＭ　　　２５０　ｍＭ　　　２５０　ｍＭｄＧＴ
Ｐ　　２５０　ｍＭ　　　２５０　ｍＭ　　　　２５　
ｍＭ　　　２５０　ｍＭｄＴＴＰ　　２５０　ｍＭ　　
　２５０　ｍＭ　　　２５０　ｍＭ　　　　２５　ｍＭ
４０ｍＭジチオスレイトール１ｍ及びタグＤＮＡポリメ
ラーゼ（セタス（Ｃｅｔｕｓ）　；　５単位／４）ｌＩ
Ｉｉを６管に添加することによって反応を開始した。反
応物を６５℃に３０分間保温した、各反応物を、Ｈ，０
で予じめ洗浄したＧ−５０セレクト（Ｓｅｌｅｃｔ）　
−Ｄ回転カラム（５プライム（Ｐｒｉｍｅ）→３３プラ
イム；　Ｐａｏｌｉ、　Ｐ　Ａ　）中を通過させた。
各カラム流出物を集め且つ真空乾燥した。各ペレットを
９５％（Ｖ　／　Ｖ　）ホルムアミド中に再懸濁し、６
８℃に１０分間保温した。各試料３Ｉ４を８％ポリアク
リルアミド−８Ｍ尿素配列決定ゲル上に負荷し、製造業
者の教示に従ってゲネシス（Ｇｅｎｅｓｉｓ＠）　２０
００　　Ｄ　Ｎ　Ａ分析系で分析した。
本実施例の４つの試料の電気泳動中に検出された蛍光放
射の一部を第１図に示す。連鎖端のパターンはＭ１３ｍ
ｐ１８の一部分の配列を正確に相定せしめる。これは（
ｉ）ＳＦ５０５−４ＨＰ残基の存在が、プライマーのＤ
ＮＡテンプレートとハイブリッドを形成する能力を妨害
しないこと、（ｉｉ）ＳＦ５０５−４ＨＰプライマーが
ＤＮＡポリメラーゼで延鎖しうる基質であること、そし
て（瓜）プライマー生成物がその特性蛍光によって検知
できることを示す。
５Ｆ５０５−４ＨＰ−ｐＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣ
ＧＡＣプライマー（実施例５）を、ＤＮＡの特別なセグ
メントを拡大する方法であり且つ米国特許第４，６８３
．１９５号及び第４．６８３゜２０２号に詳細に記述さ
れているポリメラーゼ連鎖反応の一部として使用した。
拡大すべき配列はＭ１３ｍｐ１８の３３７の塩基対セグ
メントであった。ポリメラーゼ連鎖反応に用いた第２の
プライマーは、標準的な自動化法によって製造した配列
ＡＡＡＣＣＡＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣ（５’→３′）を
有する標識されてない１７量体オリゴデオキシヌクレオ
チドであった。次の成分を混合した：Ｈ，０６２／ｄ、
ｌＯＸタグ・ポリメラーゼ反応緩衝液（１６６ｍＭ（Ｎ
Ｈ＋）＊ＳＯ４；　６７０ｍＭトリス−ＨＣ１％ｐＨ８
，８；　６７ｍＭ　ＮｇＣｌ＊：１００ｍＭ　β−メル
カプトエタノール１６７μＭ　Ｅ　ＤＴＡ　；　ｌ　、
７ｍｇ／−牛の血清アルブミン）１０／Ｊ、デオキシヌ
クレオチドトリホスフェート溶液（１，２５ｍＭ　　ｄ
ＡＴＰ；１．２５ｍＭｄＣＴＰ　；　１．２５ｍＭ　ｄ
ＧＴＰ　；　１．２５ｍＭｄＴＴＰ）１６Ｊ４１，５Ｆ
５０５−４ＨＰ−ｐＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡ
Ｃプライマー溶液（実施例５　；　０．３０　０ＤＵ　
（２６０ｎモル）／ｄ−１，５μＭ）５ｍ％ＡＡＡＣＣ
ＡＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣプライマー溶液（０，３００
ＤＵ（２６０ｎｍ）／１ａｌｌ−１，８μＭ）５μＭ、
Ｍ１３ｍｐ　１８−重鎖ＤＮＡ　（Ｎ、Ｅ、バイオラプ
ズ、ｌｎｇ／Ａの濃度に希釈）１越、及びタグＤＮＡポ
リメラーゼ（セタス；５単位／ｌ１１）ｌ／４ｇ。
この反応混合物を１分間９４°Ｃまで加熱し、４５℃ま
で冷却し、２分間保温し、次いで７２℃まで加熱し、そ
して３分間保温した。この温度サイクルを更に２４回繰
返した。反応におけるＤＮＡを、５Ｍ酢酸アンモニウム
ｌｏｏｍ及びエタノールｔ　ｏ　ｏｇｇの添加によって
沈殿させた。沈殿したＤＮＡを遠心分離によって集め、
真空下に乾燥し、９５％（ｖ／ｖ）ホルムアミドｔｏｏ
Ｉ４１中に再懸濁させ、そして６８℃に１０分間保温し
た。この試料ｌＡを８％ポリアクリルアミド−８Ｍ尿素
配列決定ゲル上に負荷し、製造業者の教示に従ってゲネ
シス■２０００ＤＮＡ分析系（デュポン社）で分析した
。
ポリメラーゼ連鎖反応生成物の電気泳動中に検知された
蛍光放射を第２図に示す。また平行なレーンで電気泳動
させた標識した制限フラグメントからなるサイズ・マー
カーも示されている。このサイズ・マーカーは標準的な
方法により５Ｆ５１９−ｄｄＣＴＰ　［ニューイングラ
ンド・ニュークリア（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃ
ｌｅａｒ）　］で末端標識したｐＢＲ３２２Ｍｓｐｌ制
限フラグメント（Ｎ、Ｅ。
バイオラブズ）である。第２図はポリメラーゼ連鎖反応
の主な生成物が予想されるようにサイズで凡そ３３７の
塩基対のＤＮＡフラグメントであることを示す。これは
（ｉ）５’　−５Ｆ５０５−４ＨＰ残基の存在がポリメ
ラーゼ連鎖反応におけるオリゴデオキシヌクレオチドの
使用を妨害しないこと及び（ｉｉ）ポリメラーゼ連鎖反
応の生成物がその特性蛍光によって検出できることを示
す。
本発明の特徴及び態様は以下の通りである＝１、式 ％式％ １式中、リポータ−は保護された蛍光リポータ−及び保
護されてない蛍光リポータ−からなＡは一〇−−３−−
ＮＲ１及び−ＣＲＲ’からなる群から選択され、但しＲ
及びＲ１は独立にＨ，Ｃ，〜Ｃ１゜分岐鎖アルキル、Ｃ
２〜Ｃ１゜直鎖アルキル、Ｃ６〜Ｃ１゜アリールＳＣ１
〜Ｃ１□アルカリール、及び０７〜ＣＩ！アラルキルか
らなる群から選択され；そして Ｑは 及びこれらの塩からなる群から選択され、但しＲ１及び
Ｒ３は独立にＣ１〜Ｃ１゜分岐鎖アルキル及びＣＩ”−
Ｃ１１１直鎖アルキルからなる群から選択され；Ｒ６は
−（ＣＲＲ’）ｍ（Ａ）、（ＣＲＲ’）ｍ−１からなる
群から選択され、なおＲ％Ｒ’％及びＡは上述の通りで
あり、ｍ＝１〜６、ｎ”０〜ｌ、ｐ＝１−１０１及びＱ
−０〜ｌＯであり、なお但し２　ｍ　＋　ｎ≦１２及び
更に２くｒ１＋ｐ＋ｑ！ｌ；１３であり；ＸはＦ、（１
、ＢｒＳ　Ｉ、イミダゾルー１−イル、１，２．４トリ
アゾル−１−イル、テトラゾルーｌ−イル、及びｌ−ヒ
ドロキシベンゾトリアゾル０−イルからなる群から選択
され；そしてＹはいずれかのホスフェート保護基である
１の化学化合物。
２、Ａが一〇−である上記ｌの化合物。
３、Ｙが ４−ＣＩ−ＣＨＩ４−０−１２−ＣＩ−ＣＩＨ，−０−
１４−ＮＯｘ−ＣａＨａ−０−１４−Ｎ０２−ＣＪ４Ｃ
ＪＣＪ−０−１２，４−ＮＯ！−ＣｓＨ３ＣＨＩＣＨ！
−０−１２，４−ＣＨＩ−Ｃ，Ｒ３−０−１２，３〜Ｃ
１ｉ−ＣＪｉ−０−１ＮＣＣＨＩＣＨ，０−１ＮＣＣＨ
ｚＣ（ＣＨＩ）　ｘ−０−１ＣＨ，０−１（Ｚ）３ＣＣ
Ｈ！−０−１（Ｚ）、ｃｃ　（ｃｕｔ）　、−ｏ−１Ｒ
’　５−１Ｒ’　５ＣＨｚＣＨｚ−０−１Ｒ’　５ｏ２
ｃｏ、ｃｏ、−ｏ−１及びＲ’　ＮＨ−からなる群から
選択され、但しＺはＣＨＩ、Ｂｒ及び■からなる群から
選択され、そしてＲ′はＨ，Ｃ，〜Ｃ１゜分岐鎖アルキ
ル、ｃｌ〜Ｃ１゜直鎖アルキル、Ｃ１〜Ｃ１゜アリール
、ＣＦ〜Ｃ＋Ｚアルロリール、及び０７〜ＣＩ！アラル
キルからなる群から選択される上記ｌの化合物。
４、ＹがＮＣＣＨ，ＣＨＩ０−１ＣＨ３０−１及び２−
Ｃ１−ＣａＨａ−Ｏ−からなる群か選択される上記３の
化合物。
５、リポータ−がキサンチン、ローダミン、フィコビリ
プロティン、ベンズイミダゾール、エチジウム、グロピ
リジウム、アンスラシフリン、ミスラマイシン、アクリ
ジン、アクチノマイシン、メロシアニン、クマリン、ピ
レン、クリセン、スチルベン、アンスラセン、ナフタレ
ン、サリチル酸、ベンズ−２−オキサ−１−ジアゾール
、及びフルオレスカミンからなる群から選択される上記
１．２．３又は４の化合物。
６、Ｑが −Ｐ−ＮＲ”Ｒ３及び　−Ｐ−Ｎ巳Ｒ４Ｙ　　　　　　
　　　　　Ｙ からなる群から選択される上記５の化合物。
７、リポータ−がキサンチンである上記６の化金物。
８、キサンチンが構造式 Ｒ５ ｓ ［式中、Ｒ’及ヒＲ’ｌｉ＆立１．：　−Ｈ％Ｃ、〜Ｃ
、フルキル、−Ｆ、−Ｃ１、−Ｂｒ１　１％Ｃ１〜Ｃ，
アルコキシ、及び−ＣＮからなる群から選択され：Ｒ？
はＣ，−Ｃ，アルキルであり；そしてＲ８はアルキル又
はアリールからなる群から選択される］ のものである上記７の化合物。
９、Ｒ１及びＲ３が−ＣＨ（ＣＨｓ）ｚである上記８の
化合物。
１０、構造式 〔式中、ＲＩ及びＲ’ハ独立ｉ：　Ｈｓ　Ｃｒ〜Ｃａ　
７　ルキシ、Ｆ％Ｃ１，Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１〜Ｃ４アルコキ
シ及び−ＣＮからなる群から選択され；Ｂはｌ−チミニ
ル、！−シトシニル、■−ウラシニル、９−アデニニル
及び９−グアニニルからなる群から選択され、ＨｅはＨ
及びＯＨからなる群から選択され；そしてｎ＝０〜約１
００であるＪ の化学化合物。
【図面の簡単な説明】
第１図は、実施例７で製造した４つの試料に対し、電気
泳動中に観察された蛍光放射と時間のプロットを示し、
そして 第２図は実施例８で製造したＤＮＡの拡大試料の電気泳
動中に観察された蛍光放射と時間のプロット及びサイズ
・マーカー（ｓｉｚｅ　ｍａｒｋｅｒ）の同様のプロッ
トを示す。 特許出願人　イー・アイ・デュポン・デ・ニ外１名 ＦＩＧＵＲＥｌ 螢光放射と時間

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、式 リポーター−Ａ−Ｑ ［式中、リポーターは保護された蛍光リポーター及び保
    護されてない蛍光リポーターからなる群から選択され； Ａは−Ｏ−、−Ｓ−、▲数式、化学式、表等があります
    ▼、及び▲数式、化学式、表等があります▼ からなる群から選択され、但しＲ及びＲ＾１は独立にＨ
    、Ｃ＿３〜Ｃ＿１＿０分岐鎖アルキル、Ｃ＿１〜Ｃ＿１
    ＿０直鎖アルキル、Ｃ＿３〜Ｃ＿１＿０アリール、Ｃ＿
    ７〜Ｃ＿１＿２アルカリール、及びＣ＿７〜Ｃ＿１＿２
    アラルキルからなる群から選択され；そして Ｑは ▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、
    表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼
    、▲数式、化学式、表等があります▼、及び▲数式、化
    学式、表等があります▼及びこれらの塩からなる群から
    選択され、但しＲ＾２及びＲ＾３は独立にＣ＿３〜Ｃ＿
    １＿０分岐鎖アルキル及びＣ＿１〜Ｃ＿１＿０直鎖アル
    キルからなる群から選択され；Ｒ＿４は−（ＣＲＲ＾１
    ）＿ｍ（Ａ）＿ｎ（ＣＲＲ＾１）＿ｍ−、▲数式、化学
    式、表等があります▼、及び▲数式、化学式、表等があ
    ります▼ からなる群から選択され、なおＲ、Ｒ＾１、及びＡは上
    述の通りであり、ｍ＝１〜６、ｎ＝０〜１、ｐ＝１〜１
    ０、及びｑ＝０〜１０であり、なお但し２ｍ＋ｎ≦１２
    及び更に２≦ｎ＋ｐ＋ｑ≦１３であり；ＸはＦ、Ｃｌ、 Ｂｒ、Ｉ、イミダゾル−１−イル、１，２，４−トリア
    ゾル−１−イル、テトラゾル−１−イル、及び１−ヒド
    ロキシベンゾトリアゾル−Ｏ−イルからなる群から選択
    され；そしてＹはいずれかのホスフェート保護基である
    ］の化学化合物。 ２、構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ＾５及びＲ＾６は独立にＨ、Ｃ＿１〜Ｃ＿４
    アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ＿１〜Ｃ＿４アルコ
    キシ及び−ＣＮからなる群から選択され；Ｂは１−チミ
    ニル、１−シトシニル、１−ウラシニル、９−アデニニ
    ル及び９−グアニニルからなる群から選択され；Ｒ＾９
    はＨ及びＯＨからなる群から選択され；そしてｎ＝０〜
    約１００である］ の化学化合物。
JP1238413A 1988-09-15 1989-09-16 ５’―付加オリゴヌクレオチドの製造のための試剤 Pending JPH02174792A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US244982 1988-09-15
US07/244,982 US4997928A (en) 1988-09-15 1988-09-15 Fluorescent reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH02174792A true JPH02174792A (ja) 1990-07-06

Family

ID=22924865

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP1238413A Pending JPH02174792A (ja) 1988-09-15 1989-09-16 ５’―付加オリゴヌクレオチドの製造のための試剤

Country Status (6)

Country Link
US (1) US4997928A (ja)
EP (1) EP0359225B1 (ja)
JP (1) JPH02174792A (ja)
CA (1) CA1338597C (ja)
DE (1) DE68925446T2 (ja)
DK (1) DK453689A (ja)

Families Citing this family (117)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5262536A (en) * 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5188934A (en) * 1989-11-14 1993-02-23 Applied Biosystems, Inc. 4,7-dichlorofluorescein dyes as molecular probes
US5654442A (en) * 1989-11-14 1997-08-05 The Perkin-Elmer Corporation 4,7-dichlorofluorescein dyes as molecular probes
US5391785A (en) * 1990-01-16 1995-02-21 La Jolla Pharmaceutial Company Intermediates for providing functional groups on the 5' end of oligonucleotides
US5210015A (en) * 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
IL99465A (en) * 1990-09-14 2001-04-30 Hoechst Ag Process for the chemical synthesis of oligonucleotides and certain novel 5'-dansyl ethoxycarbonyl oligonucleotide intermediates thereof
US5371241A (en) * 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
GB9118785D0 (en) * 1991-09-03 1991-10-16 Amersham Int Plc Labelled primers for nucleic acid probes
US6048975A (en) * 1991-09-12 2000-04-11 Hoechst Aktiengesellschaft Process for the chemical synthesis of oligonucleotides
WO1993014224A1 (en) * 1992-01-14 1993-07-22 Applied Biosystems, Inc. Size-calibration dna fragment mixture and method
US6436635B1 (en) * 1992-11-06 2002-08-20 Boston University Solid phase sequencing of double-stranded nucleic acids
US5795714A (en) * 1992-11-06 1998-08-18 Trustees Of Boston University Method for replicating an array of nucleic acid probes
US20060084092A1 (en) * 1993-01-05 2006-04-20 Gelfand David H Homogeneous assay system
US6194144B1 (en) 1993-01-07 2001-02-27 Sequenom, Inc. DNA sequencing by mass spectrometry
ATE220114T1 (de) * 1993-03-19 2002-07-15 Sequenom Inc Dns-sequenzbestimmung durch massenspektrometrie auf dem weg des abbaus mit exonuklease
US5436134A (en) * 1993-04-13 1995-07-25 Molecular Probes, Inc. Cyclic-substituted unsymmetrical cyanine dyes
US5545535A (en) * 1993-04-13 1996-08-13 Molecular Probes, Inc. Fluorescent assay for bacterial gram reaction
US5445946A (en) * 1993-04-13 1995-08-29 Molecular Probes, Inc. Intravacuolar stains for yeast and other fungi
US5658751A (en) * 1993-04-13 1997-08-19 Molecular Probes, Inc. Substituted unsymmetrical cyanine dyes with selected permeability
DE4326466A1 (de) * 1993-08-06 1995-02-09 Boehringer Mannheim Gmbh Infrarot-Farbstoff-markierte Nucleotide und ihre Verwendung in der Nucleinsäure-Detektion
JP3419850B2 (ja) * 1993-10-26 2003-06-23 株式会社日立製作所 核酸分別方法
US8236493B2 (en) * 1994-10-21 2012-08-07 Affymetrix, Inc. Methods of enzymatic discrimination enhancement and surface-bound double-stranded DNA
US6974666B1 (en) * 1994-10-21 2005-12-13 Appymetric, Inc. Methods of enzymatic discrimination enhancement and surface-bound double-stranded DNA
US7803529B1 (en) 1995-04-11 2010-09-28 Sequenom, Inc. Solid phase sequencing of biopolymers
US20060063193A1 (en) * 1995-04-11 2006-03-23 Dong-Jing Fu Solid phase sequencing of double-stranded nucleic acids
US6864059B2 (en) * 1996-01-23 2005-03-08 Affymetrix, Inc. Biotin containing C-glycoside nucleic acid labeling compounds
US6613508B1 (en) * 1996-01-23 2003-09-02 Qiagen Genomics, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid molecules utilizing sizing techniques
US6965020B2 (en) 1996-01-23 2005-11-15 Affymetrix, Inc. Nucleic acid labeling compounds
US6027890A (en) * 1996-01-23 2000-02-22 Rapigene, Inc. Methods and compositions for enhancing sensitivity in the analysis of biological-based assays
US20010018514A1 (en) * 1998-07-31 2001-08-30 Mcgall Glenn H. Nucleic acid labeling compounds
US20040210045A1 (en) * 1996-01-23 2004-10-21 Mcgall Glenn Nucleic acid labeling compounds
US7282327B2 (en) * 1996-01-23 2007-10-16 Affymetrix, Inc. Nucleic acid labeling compounds
US6312893B1 (en) 1996-01-23 2001-11-06 Qiagen Genomics, Inc. Methods and compositions for determining the sequence of nucleic acid molecules
US7423143B2 (en) * 1996-01-23 2008-09-09 Affymetrix. Inc. Nucleic acid labeling compounds
US7291463B2 (en) * 1996-01-23 2007-11-06 Affymetrix, Inc. Nucleic acid labeling compounds
EP0880598A4 (en) * 1996-01-23 2005-02-23 Affymetrix Inc RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM
US6162931A (en) 1996-04-12 2000-12-19 Molecular Probes, Inc. Fluorinated xanthene derivatives
DE19637042A1 (de) 1996-09-12 1998-03-19 Boehringer Mannheim Gmbh Heterocyclische Verbindungen und deren Verwendung in der Detektion von Nucleinsäuren
US6140053A (en) * 1996-11-06 2000-10-31 Sequenom, Inc. DNA sequencing by mass spectrometry via exonuclease degradation
US5696157A (en) * 1996-11-15 1997-12-09 Molecular Probes, Inc. Sulfonated derivatives of 7-aminocoumarin
US5830912A (en) * 1996-11-15 1998-11-03 Molecular Probes, Inc. Derivatives of 6,8-difluoro-7-hydroxycoumarin
DE69825601T2 (de) * 1997-02-12 2005-04-28 Chan, Eugene Y, Brookline Verfahren zur analyse von polymeren
US6130101A (en) * 1997-09-23 2000-10-10 Molecular Probes, Inc. Sulfonated xanthene derivatives
US6268131B1 (en) 1997-12-15 2001-07-31 Sequenom, Inc. Mass spectrometric methods for sequencing nucleic acids
US6153411A (en) 1998-10-30 2000-11-28 American Water Works Company, Inc. Methods and kits for detection of Cryptosporidium parvum using immunomagnetic separation and amplification
US6664047B1 (en) 1999-04-30 2003-12-16 Molecular Probes, Inc. Aza-benzazolium containing cyanine dyes
JP2003522119A (ja) 1999-05-24 2003-07-22 インビトロジェン コーポレイション 標識されたオリゴヌクレオチドの脱ブロック化方法
US7097973B1 (en) 1999-06-14 2006-08-29 Alpha Mos Method for monitoring molecular species within a medium
DE60006680T2 (de) * 1999-07-07 2004-09-16 Exiqon A/S Synthese von stabilem chinon- und photoreaktivem keton-phosphoramidit-reagenz für festphasensynthese von photoreaktiven oligomer-konjugaten
US6531591B1 (en) 1999-07-07 2003-03-11 Exiqon A/S Synthesis of stable quinone and photoreactive ketone phosphoramidite reagents for solid phase synthesis of photoreactive-oligomer conjugates
EP1136569A3 (en) * 2000-03-24 2004-01-28 Bayer Corporation Nucleic acid probes having highly hydrophilic non-nucleosidic tags with multiple labels, and uses thereof
US7019129B1 (en) 2000-05-09 2006-03-28 Biosearch Technologies, Inc. Dark quenchers for donor-acceptor energy transfer
US20070172866A1 (en) * 2000-07-07 2007-07-26 Susan Hardin Methods for sequence determination using depolymerizing agent
CN101525660A (zh) * 2000-07-07 2009-09-09 维西根生物技术公司 实时序列测定
US7169922B2 (en) * 2000-08-04 2007-01-30 Invitrogen Corporation Derivatives of 1,2-dihydro-7-hydroxyquinolines containing fused rings
ATE415399T1 (de) 2000-08-04 2008-12-15 Molecular Probes Inc Kondensierte ringe enthaltende 1,2-dihydro-7- hydroxychinolinderivate
DE60126297T2 (de) 2000-09-29 2007-11-15 Molecular Probes, Inc., Eugene Modifizierte carbocyaninfarbstoffe und deren konjugate
AU2002227156A1 (en) * 2000-12-01 2002-06-11 Visigen Biotechnologies, Inc. Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity
EP1385829A4 (en) 2001-03-12 2005-10-19 Affymetrix Inc NUCLEIC ACID MARKING COMPOUNDS
PL373962A1 (en) 2001-05-21 2005-09-19 Aclara Biosciences, Inc. Methods and compositions for analyzing proteins
US7668697B2 (en) * 2006-02-06 2010-02-23 Andrei Volkov Method for analyzing dynamic detectable events at the single molecule level
US20030148391A1 (en) * 2002-01-24 2003-08-07 Salafsky Joshua S. Method using a nonlinear optical technique for detection of interactions involving a conformational change
US20040229380A1 (en) * 2002-05-21 2004-11-18 Po-Ying Chan-Hui ErbB heterodimers as biomarkers
US7005518B2 (en) * 2002-10-25 2006-02-28 Li-Cor, Inc. Phthalocyanine dyes
US20040091850A1 (en) * 2002-11-08 2004-05-13 Travis Boone Single cell analysis of membrane molecules
US20090186343A1 (en) * 2003-01-28 2009-07-23 Visigen Biotechnologies, Inc. Methods for preparing modified biomolecules, modified biomolecules and methods for using same
US7402398B2 (en) * 2003-07-17 2008-07-22 Monogram Biosciences, Inc. Measuring receptor homodimerization
NZ545873A (en) 2003-08-11 2009-05-31 Monogram Biosciences Inc Detecting and profiling molecular complexes
US7432372B2 (en) * 2003-10-31 2008-10-07 Invitrogen Corporation Fluorinated resorufin compounds and their application
US20050214807A1 (en) * 2003-11-19 2005-09-29 Iain Johnson Environmental sensitive fluorogenic compounds and their application for singlet oxygen and protein detection
US7776529B2 (en) 2003-12-05 2010-08-17 Life Technologies Corporation Methine-substituted cyanine dye compounds
US7446202B2 (en) 2003-12-05 2008-11-04 Molecular Probes, Inc. Cyanine dye compounds
US20050123935A1 (en) * 2003-12-09 2005-06-09 Richard Haugland Pyrenyloxysulfonic acid fluorescent agents
US8039642B2 (en) 2003-12-09 2011-10-18 Life Technologies Corporation Pyrenyloxysulfonic acid fluorescent agents
US7939267B2 (en) * 2004-11-04 2011-05-10 Laboratory Corporation Of America Holdings Detection of activation of endothelial cells as surrogate marker for angiogenesis
US7598390B2 (en) 2005-05-11 2009-10-06 Life Technologies Corporation Fluorescent chemical compounds having high selectivity for double stranded DNA, and methods for their use
WO2007030521A1 (en) * 2005-09-06 2007-03-15 Invitrogen Corporation Control of chemical modification
EP1954838B1 (en) 2005-11-14 2014-02-26 Life Technologies Corporation Coded molecules for detecting target analytes
DE502005008153D1 (de) 2005-11-23 2009-10-29 Roche Diagnostics Gmbh Polynukleotid mit Phosphatmimetikum
US20080091005A1 (en) * 2006-07-20 2008-04-17 Visigen Biotechnologies, Inc. Modified nucleotides, methods for making and using same
US20080241951A1 (en) * 2006-07-20 2008-10-02 Visigen Biotechnologies, Inc. Method and apparatus for moving stage detection of single molecular events
US20080241938A1 (en) * 2006-07-20 2008-10-02 Visigen Biotechnologies, Inc. Automated synthesis or sequencing apparatus and method for making and using same
US7888506B2 (en) * 2007-01-26 2011-02-15 Duquesne University Of The Holy Spirit Composition, synthesis, and use of a new class of fluorophores
US8586743B2 (en) 2007-01-30 2013-11-19 Life Technologies Corporation Labeling reagents and methods of their use
US8357277B2 (en) * 2007-11-27 2013-01-22 Laboratory Corp. of America Holdings Enhanced method for detecting and/or quantifying an analyte in a sample
WO2009086197A1 (en) * 2007-12-20 2009-07-09 Monogram Biosciences, Inc. Her-2 diagnostic methods
PT2757091T (pt) 2008-04-01 2017-07-24 Biosearch Tech Inc Sondas de fluoróforo e supressor de fluorescência de ácido nucleico estabilizadas
US9182406B2 (en) * 2008-08-04 2015-11-10 Biodesy, Inc. Nonlinear optical detection of molecules comprising an unnatural amino acid possessing a hyperpolarizability
EP3216874A1 (en) 2008-09-05 2017-09-13 TOMA Biosciences, Inc. Methods for stratifying and annotating cancer drug treatment options
US20120295259A1 (en) 2011-05-19 2012-11-22 Laboratory Corporation Of America Holdings Methods for Determining the Likelihood of Survival and for Predicting Likelihood of Metastasis in Cancer Patients
WO2011026085A2 (en) 2009-08-31 2011-03-03 Promega Corporation Reactive cyanine compounds
WO2011087707A1 (en) 2009-12-22 2011-07-21 Elitech Holding B.V. Hypertheromostable endonuclease iv substrate probe
US8623324B2 (en) 2010-07-21 2014-01-07 Aat Bioquest Inc. Luminescent dyes with a water-soluble intramolecular bridge and their biological conjugates
EP3572528A1 (en) 2010-09-24 2019-11-27 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Direct capture, amplification and sequencing of target dna using immobilized primers
GB2503604B (en) 2011-03-21 2020-04-22 Biodesy Llc Classification of kinase inhibitors using second harmonic optical techniques
SG194722A1 (en) 2011-05-09 2013-12-30 Fluidigm Corp Probe based nucleic acid detection
ES2570591T3 (es) 2011-05-24 2016-05-19 Elitechgroup B V Detección de Staphylococcus aureus resistente a meticilina
WO2013078244A1 (en) 2011-11-21 2013-05-30 Promega Corporation Carboxy x rhodamine analogs
HK1205163A1 (en) 2012-02-17 2015-12-11 Nvs Technologies Inc. Polymer scaffolds for assay applications
WO2014059352A2 (en) 2012-10-12 2014-04-17 NVS Technologies, Inc. Polymers having orthogonal reactive groups and uses thereof
US9914979B2 (en) 2013-03-04 2018-03-13 Fry Laboratories, LLC Method and kit for characterizing microorganisms
WO2014152921A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 NVS Technologies, Inc. Surface oxidation for sequestering biomolecules and related methods
WO2014152298A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Promega Corporation New silicon and germanium dyes for use in genetic identity
EP2981828A1 (en) 2013-04-05 2016-02-10 Laboratory Corporation of America Holdings Systems and methods for facilitating diagnosis, prognosis and treatment of cancer based on detection of her3 activation
SG11201609344VA (en) 2014-05-09 2016-12-29 Biosearch Technologies Inc Cosmic quenchers
WO2015175870A1 (en) 2014-05-16 2015-11-19 Life Technologies Corporation Carbopyronone compounds useful as diagnostic adjuvants
US9988670B2 (en) 2014-12-12 2018-06-05 Elitechgroup B.V. Methods and compositions for detecting antibiotic resistant bacteria
US10266903B2 (en) 2014-12-12 2019-04-23 Elitechgroup, Inc. Methods and compositions for detecting antibiotic resistant bacteria
EP3237906B8 (en) 2014-12-23 2020-10-28 Bluelight Therapeutics, Inc. Attachment of proteins to interfaces for use in nonlinear optical detection
BR112017022117A2 (pt) 2015-04-15 2018-07-10 Biosearch Technologies, Inc. “sondas duplas supressoras”
CA3016914C (en) 2016-03-15 2019-08-27 Laboratory Corporation Of America Holdings Methods of assessing protein interactions between cells
US9896538B2 (en) 2016-03-28 2018-02-20 Aat Bioquest, Inc. Polyfluoreno[4,5-cde]oxepine polymers and conjugates thereof
US11155857B2 (en) 2016-06-27 2021-10-26 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for measuring RNA translation rates
US20230131000A1 (en) 2020-01-30 2023-04-27 Aat Bioquest, Inc. UV Excitable Polyfluorene Based Conjugates and Their Use in Methods of Analyte Detection
CA3223867A1 (en) 2021-06-30 2023-01-05 Gerassimos Makrigiorgos Compositions and methods for enrichment of nucleic acids using light-mediated cross-linking
KR20240099319A (ko) 2021-10-26 2024-06-28 카리부 바이오사이언시스 인코포레이티드 엑소뉴클레아제-커플링된 실시간 엔도뉴클레아제 활성 검정
WO2026050087A1 (en) 2024-08-27 2026-03-05 Caribou Biosciences, Inc. Real-time crispr endonuclease activity assay

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4275149A (en) * 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4374925A (en) * 1978-11-24 1983-02-22 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4547569A (en) * 1982-11-24 1985-10-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Intercalating agents specifying nucleotides
FR2556726B1 (fr) * 1983-12-20 1987-02-20 California Inst Of Techn Compositions a base d'oligonucleotides monocatenaires et procede pour leur preparation
GB8509880D0 (en) * 1985-04-17 1985-05-22 Ici Plc Testing device
IT1202321B (it) * 1985-06-06 1989-02-02 Uni Degli Studi Di Parmo Nucleotidi ciclici fluorescenti biologicamente attivi
US4739044A (en) * 1985-06-13 1988-04-19 Amgen Method for derivitization of polynucleotides
CA1340806C (en) * 1986-07-02 1999-11-02 James Merrill Prober Method, system and reagents for dna sequencing
US4873355A (en) * 1987-05-29 1989-10-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for regioselectively preparing phosphorylated inositols and other cyclitols
GB8720394D0 (en) * 1987-08-28 1987-10-07 Ici Plc Nucleotide probes
US4965349A (en) * 1987-12-24 1990-10-23 Applied Biosystems, Inc. Method of synthesizing oligonucleotides labeled with ammonia-labile groups on solid phase supports
AU622899B2 (en) * 1988-05-04 1992-04-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Rutheniumcomplex-compounds

Also Published As

Publication number Publication date
DK453689A (da) 1990-03-16
CA1338597C (en) 1996-09-17
DE68925446D1 (de) 1996-02-29
EP0359225B1 (en) 1996-01-17
EP0359225A3 (en) 1991-09-25
DE68925446T2 (de) 1996-07-04
DK453689D0 (da) 1989-09-14
EP0359225A2 (en) 1990-03-21
US4997928A (en) 1991-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH02174792A (ja) ５’―付加オリゴヌクレオチドの製造のための試剤
US6117986A (en) Pyrimidines linked to a quencher
CA2145405C (en) Nucleotides labelled with an infrared dye and their use in nucleic acid detection
JP2678597B2 (ja) 分離されたオリゴヌクレオチド類を電気泳動的に検出する方法
US5942610A (en) Non-nucleoside 1,3-diol reagents and their use to label or modify synthetic oligonucleotides
US4876335A (en) Poly-labelled oligonucleotide derivative
US4849336A (en) Oligonucleotide derivatives and production thereof
US4908453A (en) Reagents for the preparation of 5'-biotinylated oligonucleotides
CN105348343B (zh) 发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物及其制备方法和应用
JPS62188970A (ja) 液相核酸サンドイツチアツセイおよびそこで有用なポリヌクレオチドプロ−ブ
CN104910229B (zh) 多聚磷酸末端荧光标记核苷酸及其应用
EA032482B1 (ru) Способ анализа нуклеиновой кислоты-мишени
EP1296997B1 (en) Base analogues
WO1987002708A1 (en) Lanthanide chelate-tagged nucleic acid probes
WO1987007611A1 (en) Process for dna labelling
US6087101A (en) Optical characterization of nucleic acids and oligonucleotides
US5969128A (en) Nucleic acid probes chemically modified at 5'(OH) and/or at 3'(OH) for the purpose of introducing one or more non-radioactive marking elements at these sites, and method for preparing the same
JPS6144353A (ja) 蛍光標識化されたポリヌクレオチドとその製法
US5859259A (en) Activated esters of 1-phenylpyrazolin-5-one for labeling amine-functionalized molecules
EP0310312A2 (en) Non-nucleotide reagents for substituting termini of oligonucleotides
JPS63241356A (ja) ポリヌクレオチドおよび／もしくはオリゴヌクレオチドの塩基配列決定法およびそれに用いる分析装置
JPS6144352A (ja) ポリデオキシリボヌクレオチドまたはポリリボヌクレオチドの螢光標識化法
JPS6157595A (ja) ポリデオキシリボヌクレオチドまたはポリリボヌクレオチドの酵素標識化法
Schubert et al. Fluorescent labelling of sequencing primers for automated oligonucleotide synthesis
Holletz et al. The use of carboxamide bonds for dye labelling of amino compounds in general and 3'-amino-2', 3'-dideoxyuridine in particular-synthesis of fluorescent labelled nucleosides, nucleotides and oligonucleotides