JPH02174800A

JPH02174800A - 人尿トリプシンインヒビターの取得方法

Info

Publication number: JPH02174800A
Application number: JP63327839A
Authority: JP
Inventors: Kazuhiko Arai; 一彦新井; Toshihiko Umeda; 俊彦梅田; Kuniko Senoo; 妹尾　邦子; Hiroyasu Suzuki; 弘康鈴木
Original assignee: Denki Kagaku Kogyo KK
Current assignee: Denka Co Ltd
Priority date: 1988-12-27
Filing date: 1988-12-27
Publication date: 1990-07-06

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野〕本発明は、急性膵炎や急性循環不全治療薬として有用な
人尿トリプシンインヒビターの取得方法に関する。

〔従来の技術〕

人尿中にトリプシンインヒビターが含有されていること
は知られている。人尿トリプシンインヒビター（以下、
ＵＴＩと略す）は、分子量６８０００、等電点ｐＨ２−
３の糖のタンパク賞であり、特にトリプシン、キモトリ
プシン、プラスミンなどを阻害する〔須見ら、日本生理
誌３９．５３　（１９７７）　）ことから、抗炎症剤と
して臨床応用されている。

人尿からＵＴＩを濃縮回収する方法としては、トリクロ
ロ酢酸、硫酸アンモニウム、メタノールを組み合わせた
沈澱法（Ｎ、Ｒ，Ｓｃｈｕｌｍａｎ　；　Ｊ、Ｂｉｏｌ
。

Ｃｈｅａ＋、、２１３，６５５　（１９５５）　）　、
ベントナイトを用いる方法（Ｔ、＾、Ａｓｔｒｕｐ　；
　５ｃａｎ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｌａｂ、［ｎｖｅｓｔ、、１１．１８１　　（１９５９
）　）　、ＤＥＡＥ−セルロースを用いる方法（Ｇ、Ｊ
、Ｐｒｏｋｓｃｈ　；　Ｊ。

Ｌａｂ　＆　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ、、　　７９，４９１
　　（１９７２）　）、固定化トリプシンを用いる方法
（特開昭５１−１２３８１０号公報）、キトサンを用い
る方法（特開昭６０−２６０５１８号公報）などがある
。

〔発明が解決しようとする課題〕

大量の人尿からＵＴＩを回収する際に、操作が簡便であ
ること、効率がよいこと、再現性がよいこと、コストが
安いこと、ＵＴＩの分解、失活がないこと、さらに望ま
しくは、ＵＴＩに選択性が高いこと等が要求されている
。

しかし、前記ＵＴＩ濃縮回収法では、これらの条件を満
足することができず、これらに代わる吸着剤の探索が望
まれている。

ＤＥＡＥ−セルロースをはじめとするイオン交換原理に
基づく吸着剤は、尿の物性、例えば、ｐＨ、電気伝導度
により太き（影響され、ＵＴＩの吸着性が変動する。吸
着を完全に行うためには、尿の希釈、脱塩、透析などが
必要であるが、工業規模での実施には問題が多い。

また、有機溶媒を用いる沈澱法では、大量の有機溶媒を
用いるため安全性、作業者への影響などが懸念される。

カオリン、ベントナイト等を用いる方法では、濾過性、
沈降性など、操作性に問題がある。

キトサンを用いる方法では、対尿当りの添加量が２〜３
％と多量に必要であり、効率が悪い。

固定化トリプシンを用いる方法は、ＵＴＩに対する選択
性が非常に・高い方法ではあるが、ＵＴＩの分解が認め
られる。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、人尿を弱酸性条件下、水酸化アルミニウムゲ
ルまたは合成ケイ酸アルミニウムよりなる吸着剤と接触
させ、次いで該吸着剤からアルカリ性溶液で溶出するこ
とを特徴とるす人尿トリプシンインヒビターの取得方法
である。

また、本発明は、人尿が６ケイ酸マグネシウムによって
処理されたものである人尿トリプシンインヒビターの取
得方法にも関する。

水酸化アルミニウムゲルまたは合成ケイ酸アルミニウム
はそれぞれ式ＡＩ！Ｏｓ　　・ＹＨｌ　ＯまたはＡＩ、
０２　　・９ＳｉＯオ　・ＹＨ，０（式中、ｙは化合物
の含水量によって定められる化合物１分子中の水の分子
数を示し、それぞれ０．３〜０．６．２．２〜４．９の
値をとる）で示される。これら吸着剤は、それぞれ例え
ば、キョーワード・２００、キョーワード・７００（協
和化学工業■製）の商品名で市販されている。

本発明では、尿をそのまま用いてもよいが、予め尿をｐ
Ｈ８〜９、望ましくは８．５として夾雑するムコ多Ｉ！
類等の不純物を沈澱させ、濾過その他の手段により除去
したものを用いるのが望ましい。

吸着剤と接触させる場合には、これらの尿に適当な酸、
例えば酢酸を添加し、ｐＨを３〜５、望ましくは３．５
〜４．５に調整し、生じる不純物を遠心分離などで除去
後接触させる。略加する吸着剤の量は、可能な限り多い
方がよいが、人尿当り０．２５〜２％が望ましく、実用
的には０．５〜１％程度が適当である。吸着時間は、０
．５時間以上であればよいが、より完全に吸着させるた
めには１〜２時間攪拌吸着させるのがよい、目的の因子
を吸着した吸着剤は、攪拌を止め静置することで沈降さ
せ、デカンテーション、サイホン原理で上清を除去し、
吸引濾過などにより水または緩衝液で吸着剤を洗浄し、
アルカリ性溶液、好ましくは９８１０〜１２の溶液で溶
出を行う０弱アルカリ溶液としては、１〜２Ｎアンモニ
ア水、１〜２Ｎ炭酸ナトリウム水溶液などが使用可能で
ある。

溶出液中のＵＴＩを濃縮するためには、硫酸アンモニウ
ムのような塩類を溶出液に加えて因子を沈澱□させる方
法が、大量処理には一般的に使用可能である。ただし、
アセトンのような水和性有機溶媒による沈澱法、凍結乾
燥法などに変更しても一向に問題はない。

本発明に用いる人尿は、ある種の吸着剤で予備的に不純
物を除去し精製されていてもよい。これら前処理吸着剤
としては、ＵＴＩ以外のタンパク質を効率よく吸着し、
ＵＴＩの失活、ロスの極力少ないものであればいずれで
もよい０例えば、式２Ｍｇ０・６ＳｉＯｔ−ｙＨ！Ｏ（
式中、ｙは前記と同義で、１．２〜２．８の値をとる）
で示される６ケイ酸マグネシウムが利用できるが、これ
はキョーワードの６００（協和化学工業■製）の商品面
で市販されている。

人尿を、適当な酸、例えば酢酸でｐＨを３〜５、のぞま
しくは３．５〜４．５に調整し、前処理吸着剤を人尿当
り０．２５〜２％、実用的には０．５〜１％添加し、０
．５時間以上、のぞましくは１〜２時間攪拌吸着させ、
遠心分離、吸引濾過などにより吸着剤を除くことで、予
備的に不純物を除去した前処理尿を得ることが可能であ
る。前処理吸着剤としては、その他、中性アルミナ、酸
性アルミナ、フロリシール等を用いてもよい。

これら前処理尿を用いることで、より比活性の高いＵＴ
Ｉを吸着剤から回収することが可能である。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、
前処理吸着剤との組合せなどこれらに限定されるもので
はない。

実施例１正常人尿１０１を、ＩＮ水酸化ナトリウム溶液でｐｏａ
、ｓとし、生じた沈澱を８０００回転、１５分間遠心分
離で除去後、酢酸でρ■を４．０に調整した。再度生じ
た沈澱を同様に遠心分離で除去し酸処理尿を得た。この
酸処理尿に、５０ｇの水酸化アルミニウムゲル（キヨー
ワード＠２００；協和化学工業■製）を添加し、室温に
て２時間攪拌した。１時間の静置後、上清と吸着剤をデ
カンテーションで分離し、さらに吸引濾過により水で吸
着剤を洗浄した。この洗浄吸着剤を１％アンモニア５０
０ｍｌで１時間攪拌溶出を行い、１００００回転、１０
分間の遠心分離により溶出液を得た。

溶出液に硫酸アンモニウムを８０％飽和となるように加
え、５時間放置後１００００回転、１０分間の遠心分離
により得られた沈澱を、リン酸緩衝生理食塩水（Ｐ　Ｂ
　Ｓ）に対して透析を行い、ＵＴＩ標品とした。

ＵＴＩ活性は、Ｍｕｒａｍａｔｓｕ等の方法（Ｊ、Ｂｉ
ｏｃｈｅｖｂ、、　　５７．４０２．１９６５）に準拠
し、トリプシンとＵＴＩ標品を反応させた後に残存する
酵素活性を、Ｌｏｗｒｙ法によるカゼイン分解法で測定
した。

その結果、尿１０２より７６０００単位のＵＴＩが回収
され、比活性は５５２単位／■・タンノクク質であった
。

実施例２正常人尿５０７を、実施例１と同様に処理し酸処理尿を
得た。この酸処理尿に５００ｇの６ケイ酸マグネシウム
（キラーワード・６００；協和化学工業■製）を添加し
、室温にて２時間攪拌した。

吸引濾過により吸着剤を除去し、前処理尿に２５０ｇの
水酸化アルミニウムゲル（キラーワードの２００）を添
加し、室温にて２時間攪拌した。１時間の静置後、上滑
と吸着剤をデカンテーションで分離し、さらに吸引濾過
により水で吸着剤を洗浄した。この洗浄吸着剤を、１％
アンモニア溶液２５００ｍＪＩで１時間攪拌溶出を行い
、８０００回転、３０分間の遠心分離により溶出液を得
た。

溶出液に、硫酸アンモニウムを８０％飽和となるように
加え、ａｏｏｏ回転、３０分間の遠心分離により得られ
た沈澱を、ＰＢＳに対して透析を行いＵＴＩ標品とした
。

その結果、尿５０７１より４６２５００単位のＵＴＩが
回収され、比活性は、８１３単位／■・タンパク質であ
った。

実施例３正常人尿１０１を、ＩＮ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ８
，５とし、生じた沈澱を８０００回転、１５分間遠心分
離で除去後、ＩＮ塩酸でｐＨを４．０に調整した。再度
生じた沈澱を同様に遠心分離で除去し酸処理尿を得た。

この酸処理尿に、５０ｇの合成ケイ酸アルミニウム（キ
ツーワード＠７００；協和化学工業■製）を添加し、室
温にて２時間攪拌した。１時間の静置後、上清と吸着剤
をデカンテーションで分離し、さらに吸引濾過により水
で吸着剤を洗浄した。この洗浄吸着剤を１％アンモニア
５００ｍｌで１時間攪拌溶出を行い、１００００回転、
１０分間の遠心分離により溶出液を得た。

その結果、尿１（ｌより６９０００単位のＵＴＩが回収
され、比活性は５１１単位／■・タンパク質であった。

比較例正常人尿ｌＯｌを、ＩＮ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ，
５とし、生じた沈澱を８０００回転、１５分間遠心分離
で除去後、ＩＮ塩酸でｐ）ｌを５．５に調整した。この
酸処理尿に、２５０ｇのキトサン（フローナックＮ；共
和油脂工業梧鶏製）を添加し、室温にて２時間攪拌した
。吸引濾過により吸着剤を回収し、さらに水で吸着剤を
洗浄した。この洗浄吸着剤を３Ｎアンモニアｓ　ｏ　Ｑ
ｍｊ！で１時間攪拌溶出を行い、遠心分離により溶出液
を得た。溶出液に硫酸アンモニウムを８０％飽和となる
ように加え、得られた沈澱を、リン酸緩衝生理食塩水（
ＰＢＳ）に対して透析を行い、ＵＴＩ標品とした。

その結果、尿１（ｌより４４８４０単位のＵＴＩが回収
され（実施例１の約５９％）、比活性は３４４単位／■
・タンパク質であった。

〔発明の効果〕本発明の方法により、大量の人尿中から人尿トリプシン
インヒビターを簡便かつ効率的に回収することが可能と
なった。さらに、人尿トリプシンインヒビター以外のタ
ンパク質を効率よく吸着する吸着剤との組合せにより、
高純度の人尿トリプシンインヒビターを回収することも
可能となった。

Claims

【特許請求の範囲】１、人尿を弱酸性条件下、水酸化アルミニウムゲルまた
は合成ケイ酸アルミニウムよりなる吸着剤と接触させ、
次いで該吸着剤からアルカリ性溶液で溶出することを特
徴とする人尿トリプシンインヒビターの取得方法。２、人尿が、６ケイ酸マグネシウムによって処理された
ものである請求項１項記載の人尿トリプシンインヒビタ
ーの取得方法。