JPH02176457A - パルス志向電気泳動 - Google Patents
パルス志向電気泳動Info
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- JPH02176457A JPH02176457A JP1239780A JP23978089A JPH02176457A JP H02176457 A JPH02176457 A JP H02176457A JP 1239780 A JP1239780 A JP 1239780A JP 23978089 A JP23978089 A JP 23978089A JP H02176457 A JPH02176457 A JP H02176457A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［発明の背凧］
本発明は電気泳動の分野に関するものであって、二
遺伝子光学及び分子生物学におけるその応用に関して格
別の興味を持たせるーｂのである。
別の興味を持たせるーｂのである。
新種のパルス領域電気泳動である本発明は、電極配列の
配置によるよりもむしろパルス発振ルーチンによる分離
を受ける粒子の有効電界角の決定を可能ならしめる。そ
のうえ、本電気泳動技術は初めてゲルマトリックスを通
して増進的に分離を受ける粒子を移動させることを可能
ならしめる。
配置によるよりもむしろパルス発振ルーチンによる分離
を受ける粒子の有効電界角の決定を可能ならしめる。そ
のうえ、本電気泳動技術は初めてゲルマトリックスを通
して増進的に分離を受ける粒子を移動させることを可能
ならしめる。
ざらに、本発明は従来のパルス領ｂＸ電気泳動を使用し
て分解可能であるものより大きな粒子（分子）を高度の
分解能及び高速度で分離可能ならしめ、また選択可能な
狭い範囲の大きさ（分子量）に粒子を分離可能ならしめ
る。
て分解可能であるものより大きな粒子（分子）を高度の
分解能及び高速度で分離可能ならしめ、また選択可能な
狭い範囲の大きさ（分子量）に粒子を分離可能ならしめ
る。
たとえば、巨大分子の混合物のような粒子がゲルマトリ
ックスを通して、電場によって移動される電気泳動は定
性分析並びに分離、回収及び生成用に広く使用されてい
る技術である。それは染色体、タンパク質及び核酸の研
究に特に重要である。
ックスを通して、電場によって移動される電気泳動は定
性分析並びに分離、回収及び生成用に広く使用されてい
る技術である。それは染色体、タンパク質及び核酸の研
究に特に重要である。
染色体を構成するＤＮＡ分子は、溶液の熱環境中を動き
まわる糸のゆるんだ束に似ているランダムコイルとして
存在することが知られている。そのようなりＮＡコイル
１０を第１図に示す。沈降又は光散乱に測定されるとき
、大きなりＮＡ分子の流体力学的半径は異常に大きいこ
とがありうる。
まわる糸のゆるんだ束に似ているランダムコイルとして
存在することが知られている。そのようなりＮＡコイル
１０を第１図に示す。沈降又は光散乱に測定されるとき
、大きなりＮＡ分子の流体力学的半径は異常に大きいこ
とがありうる。
たとえば、６００ ｋｂ （ｋｂ＝キロＪ巴基対、１．
０００ヌクレオチド対からなる核酸に対する長さの単位
）のＤＮＡ分子は直径がおよそ４Ｘ１０’ａであり、一
方アガロースゲルの小孔はおよそ１×１０’ＣＭの直径
を有する。
０００ヌクレオチド対からなる核酸に対する長さの単位
）のＤＮＡ分子は直径がおよそ４Ｘ１０’ａであり、一
方アガロースゲルの小孔はおよそ１×１０’ＣＭの直径
を有する。
電気泳動中、ＤＮＡ分子の大きなランダムコイルはゲル
マトリックス１２を通過するために圧縮された一直線に
配列されたコイル１４の形に電場によって変形されなけ
ればならない。以下に記述するように開示する発明の技
術を使用すれば、電気泳動中に、ＤＮＡコイル１０が第
２図に示すように一連の球状の小塊１６に圧縮されるこ
とがいまや初めて示される。球状の小塊１６はおのおの
１０ｋｂもの多ｍのＤＮＡを含む。一連の球状の小塊１
６はゲルマトリックス１２中を・−直線に配列された型
で移動する。球状の小塊の連続の整列度は電場強度によ
って決定されてＥ２として変化する。
マトリックス１２を通過するために圧縮された一直線に
配列されたコイル１４の形に電場によって変形されなけ
ればならない。以下に記述するように開示する発明の技
術を使用すれば、電気泳動中に、ＤＮＡコイル１０が第
２図に示すように一連の球状の小塊１６に圧縮されるこ
とがいまや初めて示される。球状の小塊１６はおのおの
１０ｋｂもの多ｍのＤＮＡを含む。一連の球状の小塊１
６はゲルマトリックス１２中を・−直線に配列された型
で移動する。球状の小塊の連続の整列度は電場強度によ
って決定されてＥ２として変化する。
今日までは、非常に巨大な分子の電気泳動分離に対して
効果的な方法は開示されなかった。たとえば、既知の電
気泳動技術を利用すれば、最大１０．０００ｋｂの大き
さが可能であるが、日常の仕小に取扱える最大のＤＮＡ
分子の大きさは２，０００ｋｂである。
効果的な方法は開示されなかった。たとえば、既知の電
気泳動技術を利用すれば、最大１０．０００ｋｂの大き
さが可能であるが、日常の仕小に取扱える最大のＤＮＡ
分子の大きさは２，０００ｋｂである。
従来のゲル電気泳動を使用すれば、およそ５０ｋｂまで
のＤＮＡ分子又はラムダバクテリオファージＤＮＡの大
きさまでのＤＮＡ分子が分離できる。
のＤＮＡ分子又はラムダバクテリオファージＤＮＡの大
きさまでのＤＮＡ分子が分離できる。
マトリックスとしては、その比較的大きな孔寸法（上に
研究したように、ｌＸ１０”５ｃｍ＞及びそれがＤＮＡ
分子と結合しないがゆえに、アガロースが選ばれる。分
離は言過水平又は垂直ゲル中で行われ、分子の移動はお
よそ５０ｋｂまでは大きさに依存づる。この大きさ以上
では、ＤＮＡ分子は共通移動度で移動する傾向があり、
すなわち大きなりＮＡ分子はすべてゲル中で一緒に移動
する。
研究したように、ｌＸ１０”５ｃｍ＞及びそれがＤＮＡ
分子と結合しないがゆえに、アガロースが選ばれる。分
離は言過水平又は垂直ゲル中で行われ、分子の移動はお
よそ５０ｋｂまでは大きさに依存づる。この大きさ以上
では、ＤＮＡ分子は共通移動度で移動する傾向があり、
すなわち大きなりＮＡ分子はすべてゲル中で一緒に移動
する。
高Ｌｆｆｉ（すなわち、おおよそ６００ ｋｂまでの）
の粒子はグル濃度を０．０３５％の低さに下げまたｌｆ
電界強度下げることによって分解できるが、この方法に
対する欠点がある。ａｉも明白に、ゲル濃度の劇的な低
下は分解能に不都合に影響し、実験条件を＆Ｉｊ ’ｍ
Ｌ ｆｌ くする。そのうえ、低）したゲル濃度及び
電界強度を使用する電気泳動的移動は完了するのに１週
間又はそれ以上かかる。
の粒子はグル濃度を０．０３５％の低さに下げまたｌｆ
電界強度下げることによって分解できるが、この方法に
対する欠点がある。ａｉも明白に、ゲル濃度の劇的な低
下は分解能に不都合に影響し、実験条件を＆Ｉｊ ’ｍ
Ｌ ｆｌ くする。そのうえ、低）したゲル濃度及び
電界強度を使用する電気泳動的移動は完了するのに１週
間又はそれ以上かかる。
本発明者によって開発されて米国ｖｆ訂第４．４７３．
４５２月（その開示は参照によって本明細書中に組み込
まれてる）に記述されたパルス領域電気泳動はゲルマト
リックス中の巨大ＤＮＡ分子の分離を改善する。この技
術に従って、故意に交互にされた電場は、既知の電気泳
動法に要求された一定不変の電場よりもむしろ、粒子を
分離するために使用される。よりｉ！ｆｓには、粒子は
等しい強度の電場を使用して分離されるが、この電場は
お互いに横切るようにしており、粒子の質量に関係した
周波数でお互いに相の高強度と低強度の間に交互に起こ
るようにしており、そして電場のそれぞれの方向に対し
て全体的に横断方向に粒子を移動するようにしている。
４５２月（その開示は参照によって本明細書中に組み込
まれてる）に記述されたパルス領域電気泳動はゲルマト
リックス中の巨大ＤＮＡ分子の分離を改善する。この技
術に従って、故意に交互にされた電場は、既知の電気泳
動法に要求された一定不変の電場よりもむしろ、粒子を
分離するために使用される。よりｉ！ｆｓには、粒子は
等しい強度の電場を使用して分離されるが、この電場は
お互いに横切るようにしており、粒子の質量に関係した
周波数でお互いに相の高強度と低強度の間に交互に起こ
るようにしており、そして電場のそれぞれの方向に対し
て全体的に横断方向に粒子を移動するようにしている。
（ここに使用された゛横断″という術語は９０度又番ユ
それに近い角度に限定されるｂのではなく、他の実質的
な交差角を含む）。
それに近い角度に限定されるｂのではなく、他の実質的
な交差角を含む）。
このように、電場は１つおきの組の電極の間でパルスに
され、分離を受ける粒子の周期的な緩和と再配向を強制
する。パルス時間は分子の寸法分解を成し遂げるための
分子の再配向１ｔｔｔ？ｌとおおよそ等しい。電場の方
向が変化させられるとき、小粒子はそれ自身を迅速に配
向させ°て新経路に沿う新しい移動を開始する。他方、
大きな粒子はそれらが電場の方向に再配向されるまで実
質的に動かないままでいる。それから、それらも新しい
方向に移動し始める。その時までに、小さい粒子はそれ
らの先に動いてしまっているであろう。このように、大
きさによる分離が起こる。
され、分離を受ける粒子の周期的な緩和と再配向を強制
する。パルス時間は分子の寸法分解を成し遂げるための
分子の再配向１ｔｔｔ？ｌとおおよそ等しい。電場の方
向が変化させられるとき、小粒子はそれ自身を迅速に配
向させ°て新経路に沿う新しい移動を開始する。他方、
大きな粒子はそれらが電場の方向に再配向されるまで実
質的に動かないままでいる。それから、それらも新しい
方向に移動し始める。その時までに、小さい粒子はそれ
らの先に動いてしまっているであろう。このように、大
きさによる分離が起こる。
本発明の技術を使用するならば、いまや特別にｖＡ節さ
れた電場によって配向されたときゲルマトリックス中の
個々の粒子、たとえばＤＮＡ分子の動的分子配座を直接
決定することが初めて可能である。ＬＸ下の実施例５に
記述するように蛍光顕微趙検査／イメージプロセシング
を使用するとき、パルス領域電気泳動中、非常に複雑な
方法で適用した電場によるＤＮＡ分子の配向した球状の
小塊の連続が測定され、そしてこの過程中に整列が完了
するまで電気泳動移動度は遅らされる。電場の方向の変
化によって、球状の小塊の連続Ｃよさまざまな新しい方
向に１０時に移動する（すなわち、球状の小塊はいくぶ
ん独立して移動するように見える）。結局は、球状の小
塊の連続のいくらかの部分が印加された電場による再配
向を支配してゲルマトリックス中をその創造された径路
に沿って球状の小塊の残りを引張る。球状の小塊の連り
の整列を完了するために必要な時間は大きさと直接的に
変化し、すな°わら類似した電界強度を使用しても、Ｉ
Ｃｌｂ（１ｍｂ＝１．０ＯＯｋｂ）の分子は再配向に１
時間を必要と１ｙるし、一方１０ｋｂの分子は僅か１０
秒を要するだけである。
れた電場によって配向されたときゲルマトリックス中の
個々の粒子、たとえばＤＮＡ分子の動的分子配座を直接
決定することが初めて可能である。ＬＸ下の実施例５に
記述するように蛍光顕微趙検査／イメージプロセシング
を使用するとき、パルス領域電気泳動中、非常に複雑な
方法で適用した電場によるＤＮＡ分子の配向した球状の
小塊の連続が測定され、そしてこの過程中に整列が完了
するまで電気泳動移動度は遅らされる。電場の方向の変
化によって、球状の小塊の連続Ｃよさまざまな新しい方
向に１０時に移動する（すなわち、球状の小塊はいくぶ
ん独立して移動するように見える）。結局は、球状の小
塊の連続のいくらかの部分が印加された電場による再配
向を支配してゲルマトリックス中をその創造された径路
に沿って球状の小塊の残りを引張る。球状の小塊の連り
の整列を完了するために必要な時間は大きさと直接的に
変化し、すな°わら類似した電界強度を使用しても、Ｉ
Ｃｌｂ（１ｍｂ＝１．０ＯＯｋｂ）の分子は再配向に１
時間を必要と１ｙるし、一方１０ｋｂの分子は僅か１０
秒を要するだけである。
各方向のパルスの長さはお互いに分ｌ１１１１される分
子の大きさを決定する。速いパルスは小さな分子の分離
をもたらし、一方遅いパルスは大きな分子の分離をもた
らすものである。このように、パルス時間の変化は分子
の電気泳動移動度を寸法依存の仕方に選択的に調節する
。
子の大きさを決定する。速いパルスは小さな分子の分離
をもたらし、一方遅いパルスは大きな分子の分離をもた
らすものである。このように、パルス時間の変化は分子
の電気泳動移動度を寸法依存の仕方に選択的に調節する
。
所定の分子ｈ１に対して、電気泳動麿はパルス時間を変
化させることによって調節される。最小の大きさの移ａ
度はパルス時間が配向時間に等しいときに得られる。こ
れは共鳴時間と呼ばれる。球状の小塊の連りの配向過程
は配向中の移ｌｌＦ！層を遅らせるから、最大量の遅れ
はパルス時間が配向時間に等しいときに生じる。しかし
ながら、パルス時間が配向時間を越えるならば、そのと
ぎはほんの一部の移動度だけが配向遅延効果を受け、そ
の結果移動度が増大する。結局、パルス時間が配向時間
より短いとき、球状の小塊の連続は完全に配合するのに
十分な時間を持たなく、その結果２つの加えられた電場
によって決定される中間の配向を生じる。このように、
球状の小塊の連続が所定の印加された電場で完全に配向
するために必要とする配向の開は最小化され、配向効宋
は速瓜を近くするから、その結果生じる移ｆ＋！１度は
共鳴時間誘棚移動度に比例して増大するが、従来のゲル
電気泳動より小さい。
化させることによって調節される。最小の大きさの移ａ
度はパルス時間が配向時間に等しいときに得られる。こ
れは共鳴時間と呼ばれる。球状の小塊の連りの配向過程
は配向中の移ｌｌＦ！層を遅らせるから、最大量の遅れ
はパルス時間が配向時間に等しいときに生じる。しかし
ながら、パルス時間が配向時間を越えるならば、そのと
ぎはほんの一部の移動度だけが配向遅延効果を受け、そ
の結果移動度が増大する。結局、パルス時間が配向時間
より短いとき、球状の小塊の連続は完全に配合するのに
十分な時間を持たなく、その結果２つの加えられた電場
によって決定される中間の配向を生じる。このように、
球状の小塊の連続が所定の印加された電場で完全に配向
するために必要とする配向の開は最小化され、配向効宋
は速瓜を近くするから、その結果生じる移ｆ＋！１度は
共鳴時間誘棚移動度に比例して増大するが、従来のゲル
電気泳動より小さい。
電界角（２つの交互に印加された電場間に測定された角
度）に関して分離依存に対する分子基準は不明瞭なまま
であるが、パルス領ＩＩ電気泳動における印加された電
場間の角度は分離に深い影響を持つことが知られている
。約６００ ｋｂ以下の分子は電界角が９０度であると
きかなりよく分解される。しかしながら、鈍角は約６５
０ｋｂより大きい分子に対して最善の分離を与える。
度）に関して分離依存に対する分子基準は不明瞭なまま
であるが、パルス領ＩＩ電気泳動における印加された電
場間の角度は分離に深い影響を持つことが知られている
。約６００ ｋｂ以下の分子は電界角が９０度であると
きかなりよく分解される。しかしながら、鈍角は約６５
０ｋｂより大きい分子に対して最善の分離を与える。
９８４）は電場勾配を利用するパルス電気波ｆ！ＩＪ装
置を設計した。′Ｆｉ場勾配は測定間隔にわたる電界強
度の変化社、すなわちボルト／ｃｍ２である。電場勾配
を利用Ｊることの結果として、２つの印加された！ｆ電
場間角度は９０度から１３５度に変化した。この￥［で
分子が経験する平均角は鈍角である。分解能は十分であ
るけれど、電場勾配はＤＮＡバンドパターンの広範囲に
わたるゆがみをｂたらし、そこではＤＮＡはまっすぐな
道の中を移動しなくて曲線の径路中を移動し、隣接した
バンドを比較することを困難ならしめる。
置を設計した。′Ｆｉ場勾配は測定間隔にわたる電界強
度の変化社、すなわちボルト／ｃｍ２である。電場勾配
を利用Ｊることの結果として、２つの印加された！ｆ電
場間角度は９０度から１３５度に変化した。この￥［で
分子が経験する平均角は鈍角である。分解能は十分であ
るけれど、電場勾配はＤＮＡバンドパターンの広範囲に
わたるゆがみをｂたらし、そこではＤＮＡはまっすぐな
道の中を移動しなくて曲線の径路中を移動し、隣接した
バンドを比較することを困難ならしめる。
研究者達はあとでお互いに１２０度に配向した２つの均
質な（通常のｉＴｌ場を使用することによってバンドの
ゆがみを除いた。上述のＷＪｕ勾配方法とともに、両器
械ともおおよそ１０，０ＯＯｋｂまで分解することがで
きる。
質な（通常のｉＴｌ場を使用することによってバンドの
ゆがみを除いた。上述のＷＪｕ勾配方法とともに、両器
械ともおおよそ１０，０ＯＯｋｂまで分解することがで
きる。
道のゆがみはまた、電場が周期的に角度１８０度に全く
逆転する電場反転ゲル電気泳動（ＦＩＧＥ）又は逆電場
電気泳動（ＲＦＥ）を使用して除くことができる。この
方法は交互のパルス時間が等しくない、すなわち前方へ
のパルス時間が後方へのパルス時間より良いパルス領Ｖ
ｉ電気泳動のほかの変形物とは相違する。この方法を使
用して分解できる分子量の範囲はおおよそ１，２００
ｋｂに限定される。
逆転する電場反転ゲル電気泳動（ＦＩＧＥ）又は逆電場
電気泳動（ＲＦＥ）を使用して除くことができる。この
方法は交互のパルス時間が等しくない、すなわち前方へ
のパルス時間が後方へのパルス時間より良いパルス領Ｖ
ｉ電気泳動のほかの変形物とは相違する。この方法を使
用して分解できる分子量の範囲はおおよそ１，２００
ｋｂに限定される。
このようにして、パルス領１１！１電気泳！ｅｉよ粒そ
の電気泳動分離に改善された結果を与えてぎたという事
実にもかかわらず、その方法は重大な制限を受けること
、たとえばヒトの染色体の大きさのＤＮＡ分子（１００
ｍｏｂ ； ｌｌ１ａｂ−１，０ＯＯｋｂ）はパルス領
域電気泳動を使用して分解できないことがしばらくの間
知られてきた。先行技術の制限を解消する必要性もまた
しばらくの間知られていたが、前記の制限を首屈よく解
消する提案は今まで全く提出されなかった。
の電気泳動分離に改善された結果を与えてぎたという事
実にもかかわらず、その方法は重大な制限を受けること
、たとえばヒトの染色体の大きさのＤＮＡ分子（１００
ｍｏｂ ； ｌｌ１ａｂ−１，０ＯＯｋｂ）はパルス領
域電気泳動を使用して分解できないことがしばらくの間
知られてきた。先行技術の制限を解消する必要性もまた
しばらくの間知られていたが、前記の制限を首屈よく解
消する提案は今まで全く提出されなかった。
し発明の概要］
本発明はパルス発振ルーチンのパルス領域電気泳動へ適
用することによって変形する粒子を電気泳動分離する方
法に内けられる。ここではパルスはパルスのベクトル合
計によって決定される分離を受ける粒子によって受ける
有効電界角を定めるように変調される。本発明の一実施
態様において、パルス時間は分離を受１プる粒子の配向
を定めるように調節される。第２の実ＩＮ態様において
、パルスの強度は粒子の配向を定めるように調節される
。
用することによって変形する粒子を電気泳動分離する方
法に内けられる。ここではパルスはパルスのベクトル合
計によって決定される分離を受ける粒子によって受ける
有効電界角を定めるように変調される。本発明の一実施
態様において、パルス時間は分離を受１プる粒子の配向
を定めるように調節される。第２の実ＩＮ態様において
、パルスの強度は粒子の配向を定めるように調節される
。
本発明は、非常に望ましい結果が、一連の交ｎのパルス
がたとえばＤＮＡ分子の球状の小塊の連続をゲルマトリ
ックス中を増進的に（すなわら、球状の小塊の連続は各
パルスで単一の球状の小塊の直径又はそれ以下移動でき
る）移動するために使用されるようなパルス発振の従来
のパルス領域電気泳動に応用することによって得られる
という驚くべき発見に基づいている。
がたとえばＤＮＡ分子の球状の小塊の連続をゲルマトリ
ックス中を増進的に（すなわら、球状の小塊の連続は各
パルスで単一の球状の小塊の直径又はそれ以下移動でき
る）移動するために使用されるようなパルス発振の従来
のパルス領域電気泳動に応用することによって得られる
という驚くべき発見に基づいている。
パルス志向電気泳動（ＰＯＥ）と称せられるこの新技術
の重要な利点の一つは、電極配列の配置によるよりむし
ろ、パルス発振ルーチンによって分離を受ける粒子の有
効電界角の単純かつ動的な決定を可能にするということ
である。この技術は、たとえば、別のやり方では実行不
能である蛍光顕微鏡検査法を使用するゲル電気泳動中の
ＤＮＡ分子の上述のイメージングのような実験を可能に
する。新技術のもう一つの重要な利点は、分離を受ける
粒子がゲルマトリックス中を増進的に移動できることで
ある。対照的に、従来のパルス領域電気泳動を使用する
ならば、ただ仝休として粒子の全体の動きを任意の分子
の分離を生じるように調節できるだけである。新技術の
もう一つのψ大な利点は、高分解能で電気泳動分離でき
る粒子の質ｆｆｌ範囲を劇的に拡大することである。非
限定の例として、新技術は１２，０００ｋｂの大きさの
粒子を分解できる（実施例２参照）が、従来のパルス領
域電気泳動の上限は約１０．０ＯＯｋｂである。
の重要な利点の一つは、電極配列の配置によるよりむし
ろ、パルス発振ルーチンによって分離を受ける粒子の有
効電界角の単純かつ動的な決定を可能にするということ
である。この技術は、たとえば、別のやり方では実行不
能である蛍光顕微鏡検査法を使用するゲル電気泳動中の
ＤＮＡ分子の上述のイメージングのような実験を可能に
する。新技術のもう一つの重要な利点は、分離を受ける
粒子がゲルマトリックス中を増進的に移動できることで
ある。対照的に、従来のパルス領域電気泳動を使用する
ならば、ただ仝休として粒子の全体の動きを任意の分子
の分離を生じるように調節できるだけである。新技術の
もう一つのψ大な利点は、高分解能で電気泳動分離でき
る粒子の質ｆｆｌ範囲を劇的に拡大することである。非
限定の例として、新技術は１２，０００ｋｂの大きさの
粒子を分解できる（実施例２参照）が、従来のパルス領
域電気泳動の上限は約１０．０ＯＯｋｂである。
それ以上の利点は、新しい電気泳動技術は、同じゲル中
で従来のパルス領ｔ！ｔ１ｆ気泳動に比べて狭い質量範
囲内に粒子を分解できることである。非限定の例として
、新技術は同じゲル中で３５０〜お時に８５０〜２５０
０ｋｂの範囲内の分解能を実質的に持たない（実施例４
；３０．３０〜６０秒分＃ｉ参照）。分離図はかくして
従来の電気泳動に比べてＳ字状に記述することができる
（第３図参照）。
で従来のパルス領ｔ！ｔ１ｆ気泳動に比べて狭い質量範
囲内に粒子を分解できることである。非限定の例として
、新技術は同じゲル中で３５０〜お時に８５０〜２５０
０ｋｂの範囲内の分解能を実質的に持たない（実施例４
；３０．３０〜６０秒分＃ｉ参照）。分離図はかくして
従来の電気泳動に比べてＳ字状に記述することができる
（第３図参照）。
本発明のこれら及びほかの利点は、その上の創意に富む
調節同様に、以下の詳細な記述から明らかになるであろ
う。
調節同様に、以下の詳細な記述から明らかになるであろ
う。
［発明の詳細な記述１
上述のように、本発明の電気泳動方法はパルス志向電気
泳動（ＰＯＥ）と称せられ、新種のパルス領域の電気泳
動である。本発明は、交互のパルスがゲルマトリックス
中を増進的に変形する粒子を移動するように変調される
パルス発振ルーチンの、たとえば米国特許用４，４７３
．４５２号に発表されたような従来のパルス領域電気泳
動技術に応用することによって非常に望ましい結果が生
じるという驚くべき発見に基づいている。かくして、分
離を達成するために一致すると等しい強度の単純な交互
のパルスに頼る従来のパルス領域電気泳動と違って、本
発明の方法はパルスのベクトル合計によって決定される
分離を受ける粒子の有効電界角を、単純にと動的にと両
方に定めるような方法に交互のパルスが変調されるパル
ス発振ルーチンに頼っている。本発明の一実施態様にお
いて、パルス時間は分離を受ける粒子の配向を定めるよ
うに調節される。第２の実施態様において、パルスの強
度は粒子の配向を定めるように調節される。
泳動（ＰＯＥ）と称せられ、新種のパルス領域の電気泳
動である。本発明は、交互のパルスがゲルマトリックス
中を増進的に変形する粒子を移動するように変調される
パルス発振ルーチンの、たとえば米国特許用４，４７３
．４５２号に発表されたような従来のパルス領域電気泳
動技術に応用することによって非常に望ましい結果が生
じるという驚くべき発見に基づいている。かくして、分
離を達成するために一致すると等しい強度の単純な交互
のパルスに頼る従来のパルス領域電気泳動と違って、本
発明の方法はパルスのベクトル合計によって決定される
分離を受ける粒子の有効電界角を、単純にと動的にと両
方に定めるような方法に交互のパルスが変調されるパル
ス発振ルーチンに頼っている。本発明の一実施態様にお
いて、パルス時間は分離を受ける粒子の配向を定めるよ
うに調節される。第２の実施態様において、パルスの強
度は粒子の配向を定めるように調節される。
パルス領域電気泳動に使用するために適プるどのような
器械も本発明によって使用可能である。
器械も本発明によって使用可能である。
典型的な実験室の器械を第４図の斜視図に示す５、器械
は開放頂部の、電気絶縁材料、たとえばおおよそ８イン
チ×８インチの寸法を持つ１／２インチのブレクシガラ
ス製の方形の電気泳動室から成る。器械は！ＩＩＩ液循
環入口及び出口２０並びに緩衝液出入口２２を持ってい
る。器械は第５図に描くようにダイオードに接続される
電極２６によって囲まれた一般に電気泳動に使用される
厚板状ゲル（好ましくはアガロースゲル又はアクリルア
ミドゲル）用字ｆｆ！２４を有する。電極はおのおの約
１．９ｃ（約３／４インチ）に垂直に延伸した約２．５
１離れて配列された細い［０，０８１Ｃａ（０，０３２
インチ）１白金の針金である。
は開放頂部の、電気絶縁材料、たとえばおおよそ８イン
チ×８インチの寸法を持つ１／２インチのブレクシガラ
ス製の方形の電気泳動室から成る。器械は！ＩＩＩ液循
環入口及び出口２０並びに緩衝液出入口２２を持ってい
る。器械は第５図に描くようにダイオードに接続される
電極２６によって囲まれた一般に電気泳動に使用される
厚板状ゲル（好ましくはアガロースゲル又はアクリルア
ミドゲル）用字ｆｆ！２４を有する。電極はおのおの約
１．９ｃ（約３／４インチ）に垂直に延伸した約２．５
１離れて配列された細い［０，０８１Ｃａ（０，０３２
インチ）１白金の針金である。
１つの例として、電極の針金は室の内底へ、それぞれの
内側壁に沿って、各１金が下へ延びつつ、室の内底の約
１．９α（約３／４インチ）上に水平な列に配列された
それぞれの穴を通って室に入ることができる。所望のｆ
ｆｌ場を発生さゼるために、′Ｎｉ極２６は第５図に示
すように相互に接続される。
内側壁に沿って、各１金が下へ延びつつ、室の内底の約
１．９α（約３／４インチ）上に水平な列に配列された
それぞれの穴を通って室に入ることができる。所望のｆ
ｆｌ場を発生さゼるために、′Ｎｉ極２６は第５図に示
すように相互に接続される。
特に、直流電力供給器２８［たとえばエレクトロニック
メシャメンツ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｈｅａｓｕ
ｒｅ−ｍｃｎｔｓ ）モデル ＴＣＲ６００Ｓ１．６］
は電力供給器２８からの直流電力に選ばれた出力を接続
するためにコンピューター３２（たとえばＩＢＭＡＴコ
ンピュコンピューターられたアトトロン（＾ｄｔｒｏｎ
） ＤＧＳ −１６パルス発生器又はリンドバーグ エ
ンタプライズイズ コントロール（Ｌｉｎｄｂａｒｇ
Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ） ４−Ｃｈ
ａｎｎｅｌＣＴシリーズによって制御される継電器３０
（たとえばＤＰＤＴ、１１５ボルト交流継ｆｆｉ鼎）へ
直流を供給する。コンピューター３２はまた電力供給器
の電位を変えることができるように直流電力供給器２８
を１ＩＩＩＩＩＩする。継電器３０の出力は各電極に対
するそれぞれのダイオード３４を通って〈第５図に見ら
れるように）電［１２６に接続される。
メシャメンツ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｈｅａｓｕ
ｒｅ−ｍｃｎｔｓ ）モデル ＴＣＲ６００Ｓ１．６］
は電力供給器２８からの直流電力に選ばれた出力を接続
するためにコンピューター３２（たとえばＩＢＭＡＴコ
ンピュコンピューターられたアトトロン（＾ｄｔｒｏｎ
） ＤＧＳ −１６パルス発生器又はリンドバーグ エ
ンタプライズイズ コントロール（Ｌｉｎｄｂａｒｇ
Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ） ４−Ｃｈ
ａｎｎｅｌＣＴシリーズによって制御される継電器３０
（たとえばＤＰＤＴ、１１５ボルト交流継ｆｆｉ鼎）へ
直流を供給する。コンピューター３２はまた電力供給器
の電位を変えることができるように直流電力供給器２８
を１ＩＩＩＩＩＩする。継電器３０の出力は各電極に対
するそれぞれのダイオード３４を通って〈第５図に見ら
れるように）電［１２６に接続される。
第５図に例示されている器械は別々の電極配列の２極式
の操作を可能にする２組のダイオード３４を使用するこ
とで本質的に米国特許部４，４７３．４５２号に記述さ
れている器械と相違する。
の操作を可能にする２組のダイオード３４を使用するこ
とで本質的に米国特許部４，４７３．４５２号に記述さ
れている器械と相違する。
ダイオード３４は類似の電気的分離を与えるために大き
なマルチゲンジ（ｍｕ ｌ ｔ １ｏａｎＱｅｄ ）継
ｉａ（図示しない）によって取り替えることができる。
なマルチゲンジ（ｍｕ ｌ ｔ １ｏａｎＱｅｄ ）継
ｉａ（図示しない）によって取り替えることができる。
しかしながら、非常に早い（１秒より短かい）パルス発
振が必要であるときはダイオード３４を使用することが
最も良い。米国特訂第４，４７３゜４５２号に記述され
た器械の場合のように、現在例示されている器械はお互
いに直交する、以下に記述されるように選ばれたパルス
発振ルーチンに従ってお互いに関して相を越えて高強度
と低強度の間に交互に現れる、そして発生されたＴｉ場
のそれぞれの方向に対して横切る全体の方向でゲルマ！
・リツクスを通して増進的に分離を受ける粒子を移動さ
せる電場を発生する。電極のデザインの新規な二極性に
より、どのような意味のある電極誘導の電場ゆがみもな
しに高強度と低強度を交互にすることに加えて、所望な
らば同時に、今や初めて極性を変えることができる。
振が必要であるときはダイオード３４を使用することが
最も良い。米国特訂第４，４７３゜４５２号に記述され
た器械の場合のように、現在例示されている器械はお互
いに直交する、以下に記述されるように選ばれたパルス
発振ルーチンに従ってお互いに関して相を越えて高強度
と低強度の間に交互に現れる、そして発生されたＴｉ場
のそれぞれの方向に対して横切る全体の方向でゲルマ！
・リツクスを通して増進的に分離を受ける粒子を移動さ
せる電場を発生する。電極のデザインの新規な二極性に
より、どのような意味のある電極誘導の電場ゆがみもな
しに高強度と低強度を交互にすることに加えて、所望な
らば同時に、今や初めて極性を変えることができる。
ゲルマトリックスを通り抜ける粒子の増進的な移動に対
する効果と同様に、本発明のパルス発振ルーチン、分離
を受ける粒子の有効電界角の測定は、非限定の例として
、パルス時間が分離を受ける粒子の配向を定めるように
調節される一つの特別のパルス発揚ルーチンを説明して
いる第６図を参照することによって最もよく記述される
。
する効果と同様に、本発明のパルス発振ルーチン、分離
を受ける粒子の有効電界角の測定は、非限定の例として
、パルス時間が分離を受ける粒子の配向を定めるように
調節される一つの特別のパルス発揚ルーチンを説明して
いる第６図を参照することによって最もよく記述される
。
第６４α争図によって説明されるパルス発振ルーチンは
以下の通りである。３秒のＳ−Ｎパルスに続いて５秒の
Ｅ−Ｗパルス、それに続いて３秒のＳ−Ｎパルス、これ
に続いて５秒のＥ−Ｗパルス。
以下の通りである。３秒のＳ−Ｎパルスに続いて５秒の
Ｅ−Ｗパルス、それに続いて３秒のＳ−Ｎパルス、これ
に続いて５秒のＥ−Ｗパルス。
ステップタイム（比率及び／又は絶対時間として表現さ
れ、また従来のパルス領域電気泳動の電界角に対する操
作と類似の）と称ヒられるこれらの短い志向するパルス
は、この場合には１６秒であるスイッチタイム（従来の
パルス領１Ｉｉ１電気泳θ）のパルス時間に機能上類似
している）と称せられる良いパルスを造り上げ、続いて
３秒のＳ−Ｎパルスが１６秒のスイッチタイムに対して
５秒のＷＥパルスと交互に現れ、続いて３秒のＳ−Ｎパ
ルスが１６秒のスイッチタイムに対して５秒のＷＥパル
スと再び交Ｈする。
れ、また従来のパルス領域電気泳動の電界角に対する操
作と類似の）と称ヒられるこれらの短い志向するパルス
は、この場合には１６秒であるスイッチタイム（従来の
パルス領１Ｉｉ１電気泳θ）のパルス時間に機能上類似
している）と称せられる良いパルスを造り上げ、続いて
３秒のＳ−Ｎパルスが１６秒のスイッチタイムに対して
５秒のＷＥパルスと交互に現れ、続いて３秒のＳ−Ｎパ
ルスが１６秒のスイッチタイムに対して５秒のＷＥパル
スと再び交Ｈする。
説明の目的のために、パルス発振はそれから停止されそ
して第６ ｄａ１図に例示されたパルス発振ルーチンに
よって決定される有効電界角を第６誹す十因に示す。こ
の図において、矢印の方向は第６！ａ？図のパルス発振
ルーチンによって決定される電場の配向に相当し、矢の
長さはそれぞれのスイッチタイムに比例する。分離を受
ける粒子のコイル配向、又は増進的移動（この場合には
、スイッチタイムは共鳴時間より短い）を第６ 、（ｃ
Ｊ図に示す。
して第６ ｄａ１図に例示されたパルス発振ルーチンに
よって決定される有効電界角を第６誹す十因に示す。こ
の図において、矢印の方向は第６！ａ？図のパルス発振
ルーチンによって決定される電場の配向に相当し、矢の
長さはそれぞれのスイッチタイムに比例する。分離を受
ける粒子のコイル配向、又は増進的移動（この場合には
、スイッチタイムは共鳴時間より短い）を第６ 、（ｃ
Ｊ図に示す。
その他の例として、パルスが継続時間と等しいならば、
その時は分離を受ける粒子の結果とじて生じる軌道は４
５度（有効電界角９０度）、パルスが３：５の比を有す
るならば、その時は軌道は６０度（有効電界角１２０度
）であることに気づく。もしステップタイムがスイッチ
タイムの半分に等しいなら（ＰＯＥのこの変化したもの
は直交ＰＯＥ又は０ＰＯＥと称せられる）、９０度の有
効電界角が作られる。
その時は分離を受ける粒子の結果とじて生じる軌道は４
５度（有効電界角９０度）、パルスが３：５の比を有す
るならば、その時は軌道は６０度（有効電界角１２０度
）であることに気づく。もしステップタイムがスイッチ
タイムの半分に等しいなら（ＰＯＥのこの変化したもの
は直交ＰＯＥ又は０ＰＯＥと称せられる）、９０度の有
効電界角が作られる。
巨大ＤＮＡ分子の劇的な分離を９０度の有効電界角を使
用して生み出すことができる。たとえば、サツカロミセ
ス セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒｖｉｓｉａｅ ）染色体は
６０秒のＮ−８，６０秒のＥ−Ｗ＝Ｅステップタイム及
び１２０秒のスイッチタイム（ステップ比−１）を使用
して優れた結果でもって分離される。この力試は迅速な
操作時間という付加的な利点を有する。たとえば、９０
度の電界角を使用して、酵母の染色体はＰＯＥによって
発生される６０度の電界角を使用する実験時間の４分の
１（１日月４日）で分解できる。その上、０ＰＯＥ法は
ＰＯＥ法を使用してできるのより大きさの接近した粒子
を分離するために使用できる。このように、ＯＰＯＥｇ
ｈ東は実施例４に示すように、狭い寸法範囲内の正確か
つ劇的な分離を与えるために利用することができる。比
較的狭い範囲の分離の利点は大きさの非常に接近した分
子をきわどく分離するときに有用でありうる。
用して生み出すことができる。たとえば、サツカロミセ
ス セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒｖｉｓｉａｅ ）染色体は
６０秒のＮ−８，６０秒のＥ−Ｗ＝Ｅステップタイム及
び１２０秒のスイッチタイム（ステップ比−１）を使用
して優れた結果でもって分離される。この力試は迅速な
操作時間という付加的な利点を有する。たとえば、９０
度の電界角を使用して、酵母の染色体はＰＯＥによって
発生される６０度の電界角を使用する実験時間の４分の
１（１日月４日）で分解できる。その上、０ＰＯＥ法は
ＰＯＥ法を使用してできるのより大きさの接近した粒子
を分離するために使用できる。このように、ＯＰＯＥｇ
ｈ東は実施例４に示すように、狭い寸法範囲内の正確か
つ劇的な分離を与えるために利用することができる。比
較的狭い範囲の分離の利点は大きさの非常に接近した分
子をきわどく分離するときに有用でありうる。
ノを常に広い寸法ｗｉ囲にわたり優れた分離を得るため
、適切なステップタイム（スイッチタイムの１／２に等
しい）と結び付けたいろいろなスイッチタイムからなる
プログラムの使用は効果的である。たとえば、６０．６
０−１２０秒、３０．３０−６０秒及び１５．１５−３
０秒のパルスの組合せは完全なサツカロミセス セレビ
シェ（Ｓ、 ｃｅｒｃｖｉｓｉａｃ）ゲノム（大きさ２
５００ｋｂ、１６個の染色体）のすばらしい分離を生じ
る。
、適切なステップタイム（スイッチタイムの１／２に等
しい）と結び付けたいろいろなスイッチタイムからなる
プログラムの使用は効果的である。たとえば、６０．６
０−１２０秒、３０．３０−６０秒及び１５．１５−３
０秒のパルスの組合せは完全なサツカロミセス セレビ
シェ（Ｓ、 ｃｅｒｃｖｉｓｉａｃ）ゲノム（大きさ２
５００ｋｂ、１６個の染色体）のすばらしい分離を生じ
る。
鈍角（１２０度）の電界角を使用するパルス領域で得た
分離に匹敵するように、３：５の志向パルス比を長い全
体の方向のスイッチングタイムに関して使用することが
できる。たとえば、３秒のＮ続いて５秒のＷ１繰返して
全部で１２０秒（すなわち、１５組のパルス）のパルス
発振を行い次いで３秒のＮ）２いて５秒のＥ全部で１２
０秒のパルス発振をすることは従来のパルス領１ｉ！電
気ｖｋｉｌＪに類似する正味の軌道を生じるであろう。
分離に匹敵するように、３：５の志向パルス比を長い全
体の方向のスイッチングタイムに関して使用することが
できる。たとえば、３秒のＮ続いて５秒のＷ１繰返して
全部で１２０秒（すなわち、１５組のパルス）のパルス
発振を行い次いで３秒のＮ）２いて５秒のＥ全部で１２
０秒のパルス発振をすることは従来のパルス領１ｉ！電
気ｖｋｉｌＪに類似する正味の軌道を生じるであろう。
ステップタイムを変化させることは大きさの分解能に影
響しうる。ステップタイム（１ステツプ比に等しく、た
とえば３秒のＮ、５秒のＥ−Ｗ−Ｅ＝８秒のステップタ
イム）がスイッチングタイムより短いならば、その時は
ＰＯＥ法は変数たとえばパルス時間及び電界強度が類似
した分離を生じる同等である従来のパルス領域電気泳動
と幾分か同等になる。ステップタイムを変化させるが同
の大きさＩｉ！凹を有する１６個の染色体の酵母染色体
ＤＮＡに対し、１２０秒のスイッチ時間及びミリ秒〜８
秒の範囲のステップ時間を含むパルス発振ルーヂンに関
してＨ持される。
響しうる。ステップタイム（１ステツプ比に等しく、た
とえば３秒のＮ、５秒のＥ−Ｗ−Ｅ＝８秒のステップタ
イム）がスイッチングタイムより短いならば、その時は
ＰＯＥ法は変数たとえばパルス時間及び電界強度が類似
した分離を生じる同等である従来のパルス領域電気泳動
と幾分か同等になる。ステップタイムを変化させるが同
の大きさＩｉ！凹を有する１６個の染色体の酵母染色体
ＤＮＡに対し、１２０秒のスイッチ時間及びミリ秒〜８
秒の範囲のステップ時間を含むパルス発振ルーヂンに関
してＨ持される。
巨大ＤＮＡ分子について、ステップ時間は分離にもつと
はつきりした効果を有する。たとえば、サツカロミセス
ボンベ（し」旦魁猥−） （３個の大きな染色体を
含有し、大きさは３．５及び８ｍｏｂ）から得た染色体
のＤＮＡ分子は、ステップタイムを３０．５０秒対３．
５秒に変えただけで、同一条件（３，６００秒のスイッ
チタイム、２ボルト／ＣＭの電界強度）のもとで実験し
たときいろいろな分離を示す。良いステップタイムはＱ
ｍｇｂの染色体の分子の電気泳動移動度の増加及び大
きな分解能を生じる。すぐれた高い分子量分解能はゲル
中に大きな間隔を置いた操作に起因しなくて、むしろ良
いステップタイムがこの寸法範囲に良好な分解能を与え
る。
はつきりした効果を有する。たとえば、サツカロミセス
ボンベ（し」旦魁猥−） （３個の大きな染色体を
含有し、大きさは３．５及び８ｍｏｂ）から得た染色体
のＤＮＡ分子は、ステップタイムを３０．５０秒対３．
５秒に変えただけで、同一条件（３，６００秒のスイッ
チタイム、２ボルト／ＣＭの電界強度）のもとで実験し
たときいろいろな分離を示す。良いステップタイムはＱ
ｍｇｂの染色体の分子の電気泳動移動度の増加及び大
きな分解能を生じる。すぐれた高い分子量分解能はゲル
中に大きな間隔を置いた操作に起因しなくて、むしろ良
いステップタイムがこの寸法範囲に良好な分解能を与え
る。
低い電界強度は３■ｇｂより大きいＤＮＡ分子の好結果
の分解のために必要と思われる。たとえば、サツカロミ
セス ボンベ（互ユ且９！１Ａ−）は約３ボルト／ＣＩ
よりいちじるしく大きい電界強度では分解されなかった
。−殻内に言って、最適のパルスタイム又は移動度を最
小化するために必要なスイッチングタイム（又は共鳴時
間）は電界強度に反比例する。たとえば、ＰＯＥ法を使
用する酵母染色体分離用の典型的な条件は、１２０ボル
ト（第４図及び第５図に例示したような電気泳動室を使
用するなら約６ボルト／Ｃ−の電界強度）及び１２０秒
のスイッチタイム（３，５秒のステップタイム）である
が、６０ボルトを使用づる２４０秒のスイッチタイムも
類似した分離結果を生じる。
の分解のために必要と思われる。たとえば、サツカロミ
セス ボンベ（互ユ且９！１Ａ−）は約３ボルト／ＣＩ
よりいちじるしく大きい電界強度では分解されなかった
。−殻内に言って、最適のパルスタイム又は移動度を最
小化するために必要なスイッチングタイム（又は共鳴時
間）は電界強度に反比例する。たとえば、ＰＯＥ法を使
用する酵母染色体分離用の典型的な条件は、１２０ボル
ト（第４図及び第５図に例示したような電気泳動室を使
用するなら約６ボルト／Ｃ−の電界強度）及び１２０秒
のスイッチタイム（３，５秒のステップタイム）である
が、６０ボルトを使用づる２４０秒のスイッチタイムも
類似した分離結果を生じる。
電極配列の配置よりもむしろパルス発振ルーヂンによる
有効電界角の決定は別のやり方では遂行不可能な実験を
可能にＪる。上に占き留め、また以下の実施例５に記述
するように、本発明者は蛍光顕微鏡検査法を使用してゲ
ル電気泳動中ＤＮＡ分子を描くことができた。使用した
装置は本質的には顕微鏡の載物台上に据え付番ノだ小さ
なＰＯＥ電気泳動室である。現時点では、ＤＮＡの電気
泳動配座に関する電界角の効果は研究されつつあり、ま
た従来のパルス領ｊａｍ気泳動によって教示されるよう
に電極を移動することにより電界角を変化させることは
顕微鏡の載物台の物理的な制限から実用的でない。しか
しながら、現在の技術を使用すれば、所望の角度を与え
るようにパルスのプログラム作製を単に調節づることに
よって電界角を変えることができる。
有効電界角の決定は別のやり方では遂行不可能な実験を
可能にＪる。上に占き留め、また以下の実施例５に記述
するように、本発明者は蛍光顕微鏡検査法を使用してゲ
ル電気泳動中ＤＮＡ分子を描くことができた。使用した
装置は本質的には顕微鏡の載物台上に据え付番ノだ小さ
なＰＯＥ電気泳動室である。現時点では、ＤＮＡの電気
泳動配座に関する電界角の効果は研究されつつあり、ま
た従来のパルス領ｊａｍ気泳動によって教示されるよう
に電極を移動することにより電界角を変化させることは
顕微鏡の載物台の物理的な制限から実用的でない。しか
しながら、現在の技術を使用すれば、所望の角度を与え
るようにパルスのプログラム作製を単に調節づることに
よって電界角を変えることができる。
同様に、本技術は実施例６に記述するように、電気法ｖ
Ｊ１ｉ屈折の研究にうまく応用できた。本発明者はゲル
分析電気泳動に取り替りつるＤＮＡ分子を大きさによっ
て分けるための新しい分光学的方法を現在開発中である
。印加された電場によって配向されたゲルマトリックス
中のＤＮＡ分子の動的分子配座を直接決定するために偏
光が使用されている。器械はある程度小型の電気泳動室
を使用する。蛍光顕微鏡検査法を使用するＤＮＡ分子の
イメージングの場合のように、電界角の制御のための要
求があり、そして小型のＰＯＥ器械（小型のＰＯＥ器械
が６．４５（：ＩＲ２（１平方インチ）の寸法があるこ
とを除いて、第４図及び第５図に例示したものと同一）
を使用するＰＯＥ法は、ＰＯＥ室中にどのような電極誘
導電場のゆがみもなく、ＤＮＡ粒子の後向き及び前向き
の移シ」を可能にするため、ここに記載したように、双
極分離電極の能力のためにこの応用に対して比類なくよ
く研究されている。ＤＮＡ粒子の後向き及び前向きの運
動はＰＯＥ室の重要な特徴であり、かつ電界角の非常に
便利な制御を可能にすると同様にレーザー放射線から離
れる移動から試料を留置する。
Ｊ１ｉ屈折の研究にうまく応用できた。本発明者はゲル
分析電気泳動に取り替りつるＤＮＡ分子を大きさによっ
て分けるための新しい分光学的方法を現在開発中である
。印加された電場によって配向されたゲルマトリックス
中のＤＮＡ分子の動的分子配座を直接決定するために偏
光が使用されている。器械はある程度小型の電気泳動室
を使用する。蛍光顕微鏡検査法を使用するＤＮＡ分子の
イメージングの場合のように、電界角の制御のための要
求があり、そして小型のＰＯＥ器械（小型のＰＯＥ器械
が６．４５（：ＩＲ２（１平方インチ）の寸法があるこ
とを除いて、第４図及び第５図に例示したものと同一）
を使用するＰＯＥ法は、ＰＯＥ室中にどのような電極誘
導電場のゆがみもなく、ＤＮＡ粒子の後向き及び前向き
の移シ」を可能にするため、ここに記載したように、双
極分離電極の能力のためにこの応用に対して比類なくよ
く研究されている。ＤＮＡ粒子の後向き及び前向きの運
動はＰＯＥ室の重要な特徴であり、かつ電界角の非常に
便利な制御を可能にすると同様にレーザー放射線から離
れる移動から試料を留置する。
本発明の第２の実１ｆＭｓ様において、パルスの強度は
分離を受ける粒子の配向を定めるように調節される。多
重電位パルス電気泳動（ＭＰＰＥ）と称せられるＰＯＥ
のこの変形物は、調節されるものがパルスタイムよりも
むしろパルス強度であることを除いて、ＰＯＥと類似し
たやり方で操作される。非限定の例として、ＭＰＰＥを
使用すれば３．３秒のステップタイムが３＝５の電場比
（すなわち、３ｏボルトのＮ−８，５０ボルトのＥ−Ｗ
−Ｅ）とともに使用できる。これは３．５秒のステップ
タイム（機能的に分離によって判定したとき）と機能的
に同等である。絶対的な及び相対的な電界強度は動的パ
ルス制御と類似したやり方で実験中ｔＩＩＩ ＩＩＩさ
れる。
分離を受ける粒子の配向を定めるように調節される。多
重電位パルス電気泳動（ＭＰＰＥ）と称せられるＰＯＥ
のこの変形物は、調節されるものがパルスタイムよりも
むしろパルス強度であることを除いて、ＰＯＥと類似し
たやり方で操作される。非限定の例として、ＭＰＰＥを
使用すれば３．３秒のステップタイムが３＝５の電場比
（すなわち、３ｏボルトのＮ−８，５０ボルトのＥ−Ｗ
−Ｅ）とともに使用できる。これは３．５秒のステップ
タイム（機能的に分離によって判定したとき）と機能的
に同等である。絶対的な及び相対的な電界強度は動的パ
ルス制御と類似したやり方で実験中ｔＩＩＩ ＩＩＩさ
れる。
本技術を使用して得られる電界角の動的制御は実験中に
電界角を変化させることによって類のない分離を達成す
ることを可能にする。電界角を変えるためいくつかの方
法があり、それらは１）１スイッチタイム間隔の間じゆ
う電界角を変える、 ２）多くのスイッチタイム間隔を通して電界角を変える
、 ３）１ステップ間隔中に電界角を変えるくこれｉよステ
ップ内にステップを配置することを結果として生じる）
、及び ４）電界強度とスイッチタイムの両方を変える（ＰＯＥ
とＭＰＰＥの組合せ）ことである。
電界角を変化させることによって類のない分離を達成す
ることを可能にする。電界角を変えるためいくつかの方
法があり、それらは１）１スイッチタイム間隔の間じゆ
う電界角を変える、 ２）多くのスイッチタイム間隔を通して電界角を変える
、 ３）１ステップ間隔中に電界角を変えるくこれｉよステ
ップ内にステップを配置することを結果として生じる）
、及び ４）電界強度とスイッチタイムの両方を変える（ＰＯＥ
とＭＰＰＥの組合せ）ことである。
今、最初の２つの選択はいちじるしい効果を有すること
が見出され、電界角の動的制御を初めて可能にする。第
２の２つの選択もまた類似した顕著な効果を示すことが
期待され電界角の動的制御を可能にする。
が見出され、電界角の動的制御を初めて可能にする。第
２の２つの選択もまた類似した顕著な効果を示すことが
期待され電界角の動的制御を可能にする。
本発明は以下の実施例で詳細に説明されるであろう。こ
れらの実施例は説明に役立てる目的で含めたのであって
本発明を限定するものとしてみなされるべきではない。
れらの実施例は説明に役立てる目的で含めたのであって
本発明を限定するものとしてみなされるべきではない。
実施例１
巨大ＤＮＡ分子の電気泳動速度の選択的変化及び分解
スイッチタイムの変化による酵母染色体分子の電気泳動
移動度の変化を第７図に示す。この図に示したプロット
は、以下に示す同じ一般的な電気泳動条件で、おのおの
が１６個の大きさの異なる分子（その内大きさが１５０
ｋｂ〜２５００ｋｂの範囲である１４個が分解された）
からなる同一の酵母染色体ＤＮＡ分子を含有する９個の
ゲルを実験することによって発生した。電気泳動条件は
、１２０ボルト（Ｍ界強度４．２５ボルト／ｃｌ、１．
０％の＾ゲル温度７ガロース（ＦＭＣ？Ｊ製）、１／２
のＴＢＥ緩衝液、３秒のＮ−８と５秒のＥ−Ｗ−Ｅとい
うステップタイム、及び第４図及び第５図に描いたのと
同一の器械。いろいろな実験の間の変更した唯一の変数
はスイッチタイムである。速疾はエチジウムブＤミドで
着色したゲルの写真上のバンドの位置を測定することに
よって得た。
移動度の変化を第７図に示す。この図に示したプロット
は、以下に示す同じ一般的な電気泳動条件で、おのおの
が１６個の大きさの異なる分子（その内大きさが１５０
ｋｂ〜２５００ｋｂの範囲である１４個が分解された）
からなる同一の酵母染色体ＤＮＡ分子を含有する９個の
ゲルを実験することによって発生した。電気泳動条件は
、１２０ボルト（Ｍ界強度４．２５ボルト／ｃｌ、１．
０％の＾ゲル温度７ガロース（ＦＭＣ？Ｊ製）、１／２
のＴＢＥ緩衝液、３秒のＮ−８と５秒のＥ−Ｗ−Ｅとい
うステップタイム、及び第４図及び第５図に描いたのと
同一の器械。いろいろな実験の間の変更した唯一の変数
はスイッチタイムである。速疾はエチジウムブＤミドで
着色したゲルの写真上のバンドの位置を測定することに
よって得た。
時々生じるどのような移動度の反転（すなわち、小さな
分子の電気泳動が大ぎな分子より更にゆっくりなとき）
をも観察するために、サツカロミセス セレビシェ（Ｓ
、 ｃｅｒｃｖｉｓｉａｅ ）の染色体の１） ＮＡ分
子を先ず挿入法を使用して１１１ＪＬ、次いで大きさを
従来のパルス領域電気ｖＫｅを使用して分解した。分解
された分子（おおよそ１４個のバンドからなる）を含有
するゲルの１片をパルス領域電気泳動ゲルから切り取っ
て更に分析するためにＰＯＥゲル中へ鋳込んだ。分解さ
れた分子はそれから３．５秒のステップタイム及び１２
０秒のスイッチタイムで実験した。大きさによる分子の
分離を第８図に示す。この図でパルス領域電気泳動分離
は水平軸に沿って、ＰＯＥ分離分離型直軸に沿って示さ
れている。
分子の電気泳動が大ぎな分子より更にゆっくりなとき）
をも観察するために、サツカロミセス セレビシェ（Ｓ
、 ｃｅｒｃｖｉｓｉａｅ ）の染色体の１） ＮＡ分
子を先ず挿入法を使用して１１１ＪＬ、次いで大きさを
従来のパルス領域電気ｖＫｅを使用して分解した。分解
された分子（おおよそ１４個のバンドからなる）を含有
するゲルの１片をパルス領域電気泳動ゲルから切り取っ
て更に分析するためにＰＯＥゲル中へ鋳込んだ。分解さ
れた分子はそれから３．５秒のステップタイム及び１２
０秒のスイッチタイムで実験した。大きさによる分子の
分離を第８図に示す。この図でパルス領域電気泳動分離
は水平軸に沿って、ＰＯＥ分離分離型直軸に沿って示さ
れている。
相対的な大きさの分離は第７図の垂直軸に沿って見るこ
とができる。図の検討結果はスイッチタイムは電気泳動
分離を調節するために変化させることができ、またＰＯ
Ｅ法は電気泳動速度の選択的変化と同様に巨大ＤＮＡ分
子を分解できることを示す。
とができる。図の検討結果はスイッチタイムは電気泳動
分離を調節するために変化させることができ、またＰＯ
Ｅ法は電気泳動速度の選択的変化と同様に巨大ＤＮＡ分
子を分解できることを示す。
第９図は違う軸についてプロットした第７図のデータ、
すなわち速度対１０秒〜２００秒の範囲のさまざまなス
イッチタイムに対する大ぎさのデータを示す。このよう
に、このグラフは所定のパルス時間に対する分子の大き
さによる速度の変化を示す。
すなわち速度対１０秒〜２００秒の範囲のさまざまなス
イッチタイムに対する大ぎさのデータを示す。このよう
に、このグラフは所定のパルス時間に対する分子の大き
さによる速度の変化を示す。
実施１１４２
ＰＯＥ法を使用した、ヒトのＤＮＡを含む超巨大ＤＮＡ
分子の分離 実施例１に記述した方法に従ってｖＡ！１１シた一ナツ
力ロミセス ボンベ（Ｓ、ｐｏａｂｅ ）及びサツカロ
ミセス セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の試
料をそれぞれ（第１０図に示す）レーン２及び３に載せ
た。
分子の分離 実施例１に記述した方法に従ってｖＡ！１１シた一ナツ
力ロミセス ボンベ（Ｓ、ｐｏａｂｅ ）及びサツカロ
ミセス セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の試
料をそれぞれ（第１０図に示す）レーン２及び３に載せ
た。
ヒトの白血球の！！ａｔ （非）Ｉｔ、１１限醒素消
化物を含有させたレーン層をアガロース挿入物中に洗浄
したヒトの白血球を包埋すること（ゲル挿入勘当りおお
よそ５μグのヒトのＤＮＡの濃度で）によって調製し、
次いで棟準制限酵素緩衝液中に５０１１１位の制限酵素
をもつ挿入物を一夜１漬した。反応はυ１限醇素緩衝Ｍ
混合物をデカントし過剰な０．５ＭのＥＤＴＡ （ＩＩ
Ｈ−９，５）及び１％の５ａｒｋｏｓｙｌ洗浄剤を添加
することによって停止した。
化物を含有させたレーン層をアガロース挿入物中に洗浄
したヒトの白血球を包埋すること（ゲル挿入勘当りおお
よそ５μグのヒトのＤＮＡの濃度で）によって調製し、
次いで棟準制限酵素緩衝液中に５０１１１位の制限酵素
をもつ挿入物を一夜１漬した。反応はυ１限醇素緩衝Ｍ
混合物をデカントし過剰な０．５ＭのＥＤＴＡ （ＩＩ
Ｈ−９，５）及び１％の５ａｒｋｏｓｙｌ洗浄剤を添加
することによって停止した。
反応は一連の非常に大きなフラグメントを生じるように
特殊な位置でＤＮＡを分割した。電気泳動条件は次のよ
うである。第４図及び第５図に描いた器械を使用して、
１／２倍のＴＢＥ中の１．０％の低ゲル化温度ゲル、３
０秒のＮ−８と５０秒のＥ−Ｗ−Ｅというステップタイ
ム、３．６００秒のスイッチタイム、１ボルト／１の電
界強度及び１０日間の実！１４時間。
特殊な位置でＤＮＡを分割した。電気泳動条件は次のよ
うである。第４図及び第５図に描いた器械を使用して、
１／２倍のＴＢＥ中の１．０％の低ゲル化温度ゲル、３
０秒のＮ−８と５０秒のＥ−Ｗ−Ｅというステップタイ
ム、３．６００秒のスイッチタイム、１ボルト／１の電
界強度及び１０日間の実！１４時間。
第１０図の矢印は最大のｐｏｍｂｅ染色体（レーン２）
と比較して大きさが少なくとも１２．０００ｋｔｌの全
く異なったバンドの存在を示す。消化物はヒトのＤＮＡ
配列の適切な交雑によるす（ｊシブ０ツ５分析によって
完全なものにされると判断された。これはどの方法によ
っても分別できる大きさとしては最大な大きさのＤＮＡ
分子である。
と比較して大きさが少なくとも１２．０００ｋｔｌの全
く異なったバンドの存在を示す。消化物はヒトのＤＮＡ
配列の適切な交雑によるす（ｊシブ０ツ５分析によって
完全なものにされると判断された。これはどの方法によ
っても分別できる大きさとしては最大な大きさのＤＮＡ
分子である。
実施例３
非常に巨大なりＮＡ分子の分解
酵素調製品ノボチーム（ＮｏｖｏＺｙｉ＋ ） ２３４
（Ｎｏｖｏ研究所製）でじょうぶな細胞壁を除去するた
めに付加的工程を含めたことを除いて、実施例１のサツ
カロミス セレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｃ）
の調製に使用した方法に従ってサツカロミセスボンベ（
シュ旦９！上ｅ）ＤＮＡをｇ！Ｊ製した。サツカロミセ
ス ボンベ（Ｓ、ｐｏｍｂｅ ） ｇ１入物を１％の低
ゲル温度アガロースゲル（ＦＭＣ社製）に載せた。
（Ｎｏｖｏ研究所製）でじょうぶな細胞壁を除去するた
めに付加的工程を含めたことを除いて、実施例１のサツ
カロミス セレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｃ）
の調製に使用した方法に従ってサツカロミセスボンベ（
シュ旦９！上ｅ）ＤＮＡをｇ！Ｊ製した。サツカロミセ
ス ボンベ（Ｓ、ｐｏｍｂｅ ） ｇ１入物を１％の低
ゲル温度アガロースゲル（ＦＭＣ社製）に載せた。
ボルト／ｃａｔの電界強度及び第４図及び第５図に描い
た器械の使用。その結果生じるエヂジウム着色したゲル
を第１１図に示す。第１１図に示された染色体ＤＮＡ分
子の分離は非常に大きなりＮＡ分子を大きさで分解する
ためのＰＯＥ法の能力を証明する。
た器械の使用。その結果生じるエヂジウム着色したゲル
を第１１図に示す。第１１図に示された染色体ＤＮＡ分
子の分離は非常に大きなりＮＡ分子を大きさで分解する
ためのＰＯＥ法の能力を証明する。
実施例４
ＯＰＯＥ法を使用する巨人ＤＮＡ分子の分離スイッチタ
イムに比較してステップタイム（全タイムＮ−Ｓプラス
Ｅ−Ｗ−Ｅ ）を変化させることによるステップ比１（
パルス長Ｎ−８対パルスＥ？Ｅ−Ｗ−Ｅ）の効果の特徴
を述べるために以下の実験を行った。ステップ比が１に
等しいことを除いて、実験条ｆ４はすべて実施例１に記
述したものと同一であった。
イムに比較してステップタイム（全タイムＮ−Ｓプラス
Ｅ−Ｗ−Ｅ ）を変化させることによるステップ比１（
パルス長Ｎ−８対パルスＥ？Ｅ−Ｗ−Ｅ）の効果の特徴
を述べるために以下の実験を行った。ステップ比が１に
等しいことを除いて、実験条ｆ４はすべて実施例１に記
述したものと同一であった。
実験結束を第１２図〜第１５図に示す。第１２図はいろ
いろなスイッチタイムといろいろなステップタイムの複
合グラフである。この図はいろいろな変数のすべての間
のやや複雑な関係を示す。
いろなスイッチタイムといろいろなステップタイムの複
合グラフである。この図はいろいろな変数のすべての間
のやや複雑な関係を示す。
６０．６０−１２０秒の線が９０〜２５００ｋｂの範囲
ですばらしい分解力を示しほかの場合にＣ１弱な分解能
を示ずことに特に気づかされる。
ですばらしい分解力を示しほかの場合にＣ１弱な分解能
を示ずことに特に気づかされる。
第１３図〜第１５図はステップタイムによりデータを一
団にまとめる。第１３図は７００〜２５００ｋｂの範囲
に最善の分解能を示す。第１４図は２００〜４００ｋｂ
の範囲に優れた分解能を示ず（１５，１５秒のステップ
タイム及び３０秒のスイッチタイム）。一方策１５図は
４００〜８００ｋｂの範囲に最大の分解能を示す（３０
，３０秒のステップタイム、及び６０秒のスイッチタイ
ム）。
団にまとめる。第１３図は７００〜２５００ｋｂの範囲
に最善の分解能を示す。第１４図は２００〜４００ｋｂ
の範囲に優れた分解能を示ず（１５，１５秒のステップ
タイム及び３０秒のスイッチタイム）。一方策１５図は
４００〜８００ｋｂの範囲に最大の分解能を示す（３０
，３０秒のステップタイム、及び６０秒のスイッチタイ
ム）。
第１２図〜第１５図のｌｌｌｗＡかられかるように、ス
イッチタイムとステップ比の選ばれた組合せによって定
められる、ＰＯＥ法を使用する分解能の範囲は、たとえ
ば第９図に示したＰＯＥのそれに比べて比較的狭い。
イッチタイムとステップ比の選ばれた組合せによって定
められる、ＰＯＥ法を使用する分解能の範囲は、たとえ
ば第９図に示したＰＯＥのそれに比べて比較的狭い。
実施例５
蛍光顕微鏡検査によって示されたゲル電気泳動の間じゆ
うのＤＮＡ分子配座の変化を研究するために使用された
ＰＯＥ法 上世光（ｅｐｉｒｌｕｏｒｅｓｃｃｎｃｅ ） ？イク
ロコビーを使用して、適当な発色団、たとえば４′ ６
−ジアミンノー２−フエニルインドールニ塩化物で着色
した甲−のＤＮＡ分子を検査することができる。
うのＤＮＡ分子配座の変化を研究するために使用された
ＰＯＥ法 上世光（ｅｐｉｒｌｕｏｒｅｓｃｃｎｃｅ ） ？イク
ロコビーを使用して、適当な発色団、たとえば４′ ６
−ジアミンノー２−フエニルインドールニ塩化物で着色
した甲−のＤＮＡ分子を検査することができる。
換言すれば、光学顕微鏡検査はおおよそ０．２μの分解
能に蛍光を使用して単一分子を検査することができる。
能に蛍光を使用して単一分子を検査することができる。
この実験において、Ｆ蛍光顕微鏡検査法を電気泳動の間
じゆうのＤＮＡ配座の変化を研究するためにＰＯＥ法と
結び付けた。第１６図に示した改造した顕微鏡室を使用
するＰＯＥ法は大変さまざまな有効電界角を生じること
ができるからこれらの研究に対し不可欠である。変化す
る電界角の通例の制限を超えて、顕微鏡の載物台は固有
の空間の制限による付加的υ１限を丞した。改造した室
を使用するＰＯＥ法はまた、もし必要ならばこれらの角
度を動的かつ迅速に変えることができる。
じゆうのＤＮＡ配座の変化を研究するためにＰＯＥ法と
結び付けた。第１６図に示した改造した顕微鏡室を使用
するＰＯＥ法は大変さまざまな有効電界角を生じること
ができるからこれらの研究に対し不可欠である。変化す
る電界角の通例の制限を超えて、顕微鏡の載物台は固有
の空間の制限による付加的υ１限を丞した。改造した室
を使用するＰＯＥ法はまた、もし必要ならばこれらの角
度を動的かつ迅速に変えることができる。
第１６図は標準的なカバースリップ（１８Ｘ１８ｍのガ
ラス）で囲まれた９暦の７ガロ一スゲルーＤＮＡｎ合物
（３〜１０μｍ）を保持するスライドを右する改造され
たＰＯＥ室の図を示す。試料付きのホルダーは標準的な
顕微鏡の載物台上にきちんとはまる。スライドをホルダ
ー（ガラス又はプレクシガラス製）中に置き、白金電極
４２をアガロースの電気的接続しん４４で３０％のグリ
セ［１−ルーアガロースの小滴を置くゲルのスライド−
カバースリップのサンドウイツヂと電気的に接触させる
。グリセロールはゲルの乾燥を防ぐ。
ラス）で囲まれた９暦の７ガロ一スゲルーＤＮＡｎ合物
（３〜１０μｍ）を保持するスライドを右する改造され
たＰＯＥ室の図を示す。試料付きのホルダーは標準的な
顕微鏡の載物台上にきちんとはまる。スライドをホルダ
ー（ガラス又はプレクシガラス製）中に置き、白金電極
４２をアガロースの電気的接続しん４４で３０％のグリ
セ［１−ルーアガロースの小滴を置くゲルのスライド−
カバースリップのサンドウイツヂと電気的に接触させる
。グリセロールはゲルの乾燥を防ぐ。
ホルダーの電気的コネクタ４６は双極ダイオード及び第
５図に先に提示したものと同一であるパルス発振手段４
８（図示しない）に対し接続を与える。
５図に先に提示したものと同一であるパルス発振手段４
８（図示しない）に対し接続を与える。
第１７図は、いろいろなＰＯＥ条件（第１６図に示した
ＰＯＥ室を使用する）に従って１．０％の低ゲル化温度
アガロース（１／２倍のＴＢ Ｅｌｌ液液中に包理して
ＤΔＰＩで着色したバクテリＡファージＤＮＡ（６３０
ｋｂ）の写真の再生物を示す。像はツアイスのモデル４
８７９０２−０００フイルターバツク及びツアイスの１
００倍のプラン ネオツルア（Ｐｌａｎ Ｎｅｏｆｌｕ
ａｒ ）油浸漬対物レンズを利用する上置光を使用する
ツアイスのアクジオプラン（八ｘｉｏｐｌａｎ） ｆＩ
ｍＭによって得た。
ＰＯＥ室を使用する）に従って１．０％の低ゲル化温度
アガロース（１／２倍のＴＢ Ｅｌｌ液液中に包理して
ＤΔＰＩで着色したバクテリＡファージＤＮＡ（６３０
ｋｂ）の写真の再生物を示す。像はツアイスのモデル４
８７９０２−０００フイルターバツク及びツアイスの１
００倍のプラン ネオツルア（Ｐｌａｎ Ｎｅｏｆｌｕ
ａｒ ）油浸漬対物レンズを利用する上置光を使用する
ツアイスのアクジオプラン（八ｘｉｏｐｌａｎ） ｆＩ
ｍＭによって得た。
生じる像を低光度操作を可能にする浜松Ｃ−２４００シ
リコン補力標的ビデオカメラ（浜松ホトニック社製）に
よって補力した。ビデオカメラからの信号はデジタル化
、貯蔵及びイメージ増強を含むさらに進んだデータ処理
のためイメージブロセツナ−［インビジョン（１ｎｏｖ
ｉｓｉｏｎ ）社製１へ供給した。第１１図の′１７貞
はビデオモニターからの一場面であった。
リコン補力標的ビデオカメラ（浜松ホトニック社製）に
よって補力した。ビデオカメラからの信号はデジタル化
、貯蔵及びイメージ増強を含むさらに進んだデータ処理
のためイメージブロセツナ−［インビジョン（１ｎｏｖ
ｉｓｉｏｎ ）社製１へ供給した。第１１図の′１７貞
はビデオモニターからの一場面であった。
写真の解釈を容易にするために、ＩＩ要図をそれぞれの
根源写真の右に置いた。
根源写真の右に置いた。
第１７ｉａ１図はＳ−Ｎ方向（図の右手側の矢によって
示した）の、約３ボルト／ａＸの印加電界強度をもった
従来の電気泳動の３分後の３つの異なったＤＮＡ分子を
示す。分子は？ｔ２Ｗ方向に大きく伸ばされておりかつ
折りたたまれている。
示した）の、約３ボルト／ａＸの印加電界強度をもった
従来の電気泳動の３分後の３つの異なったＤＮＡ分子を
示す。分子は？ｔ２Ｗ方向に大きく伸ばされておりかつ
折りたたまれている。
第１７擾ｂ＃図は代表的なＰＯＥ実１１ｉ（Ｔｉ電気泳
動３分後）、３秒のＷ、５秒のＮ−８−Ｎ、４０秒のス
イッチタイム及び３ボルト／ｃ１１の電界強度、の間じ
ゆうのＤＮＡ配座の変化を説明する。写真は付与したＰ
ＯＥ条件から期待されるおおよそ６０度の平均配向をも
つ３つの異なるＤＮＡ分子を示す。これらの分子と第１
７７８ン図との比較は、電場の方向を変えることにより
生じる電場継続を示す寸法比（Ｉ直距離対水平距離）を
もつステップの存在を示ず。小さなステップ比をもつ放
出パルスは小さなりＮＡステップ（ステップは写真中に
明瞭に見られる）を生じるであろう。一般に、ＰＯＥ！
ｉｔ！ＩＩ！！分子は従来の電気泳動処理した相当する
ものより濃縮される。これらの結果は、ＰＯＥ法はゲル
中の分子を任意の所望の方向に現実に配向することを疑
う余地なく示１．。
動３分後）、３秒のＷ、５秒のＮ−８−Ｎ、４０秒のス
イッチタイム及び３ボルト／ｃ１１の電界強度、の間じ
ゆうのＤＮＡ配座の変化を説明する。写真は付与したＰ
ＯＥ条件から期待されるおおよそ６０度の平均配向をも
つ３つの異なるＤＮＡ分子を示す。これらの分子と第１
７７８ン図との比較は、電場の方向を変えることにより
生じる電場継続を示す寸法比（Ｉ直距離対水平距離）を
もつステップの存在を示ず。小さなステップ比をもつ放
出パルスは小さなりＮＡステップ（ステップは写真中に
明瞭に見られる）を生じるであろう。一般に、ＰＯＥ！
ｉｔ！ＩＩ！！分子は従来の電気泳動処理した相当する
ものより濃縮される。これらの結果は、ＰＯＥ法はゲル
中の分子を任意の所望の方向に現実に配向することを疑
う余地なく示１．。
第１７７ｃ１図は４０秒のＮ続いて４０秒のパルスを発
振するＬ第１７．７ｂＪ図に関連して、上記と同じ条件
］ことの効果を示す。再び、３つの異なる分子を提出す
る。分子は一連の直交切断面へパルスによってよく配向
される。そのＦ１分子は先の実験におけるよりもつと伸
びているように思える。
振するＬ第１７．７ｂＪ図に関連して、上記と同じ条件
］ことの効果を示す。再び、３つの異なる分子を提出す
る。分子は一連の直交切断面へパルスによってよく配向
される。そのＦ１分子は先の実験におけるよりもつと伸
びているように思える。
実施例６
ゲル電気泳動の間じゆうのＤＮＡ分子の電気的複屈折を
研究するために使用されたＰＯＥ法電気泳動中の問じゆ
うのゲル中のＤＮＡ分子の配向は屈折率（複屈折）の変
化を観察することによって研究できる。電場にかけられ
るとき、ＤＮＡ分子は伸ばされて電場によって整列させ
られ、それによって屈折率が変化する。時間による複屈
折の変化を測定することによって、印加された電場によ
る分子の配向としてＤＮＡの球状の小塊の連続の動きの
詳細を理解することができる。
研究するために使用されたＰＯＥ法電気泳動中の問じゆ
うのゲル中のＤＮＡ分子の配向は屈折率（複屈折）の変
化を観察することによって研究できる。電場にかけられ
るとき、ＤＮＡ分子は伸ばされて電場によって整列させ
られ、それによって屈折率が変化する。時間による複屈
折の変化を測定することによって、印加された電場によ
る分子の配向としてＤＮＡの球状の小塊の連続の動きの
詳細を理解することができる。
本実験の複屈折測定は、小さな周波数差（２つの周波数
のレーザーによって供給される）によって相違するレー
ザー光線（赤色光線）の２つの直交偏光面の位相差を測
定することによってなされる。より詳細には、印加され
た電場によって分子が整列するとき、屈折率は分子の整
列と共に変化し、レーザーで発生された標準に比較して
位相ｉ１によって測定される透過光線に位相差を生じる
。
のレーザーによって供給される）によって相違するレー
ザー光線（赤色光線）の２つの直交偏光面の位相差を測
定することによってなされる。より詳細には、印加され
た電場によって分子が整列するとき、屈折率は分子の整
列と共に変化し、レーザーで発生された標準に比較して
位相ｉ１によって測定される透過光線に位相差を生じる
。
時間（１場印加の機関）の凶数として得られた位相差の
データはデジタル化されて後の検索及び解析のためにコ
ンピューターにしまっておく。正確な器械的必要条件は
次のようである。
データはデジタル化されて後の検索及び解析のためにコ
ンピューターにしまっておく。正確な器械的必要条件は
次のようである。
第１８図は使用される器械設備の略図である。
レーザー５０は二重周波数ヘリウムーネオン［Ａブトラ
（Ｏｐｔｒａ ）社製ビアボデー（Ｐｅａｂｏｄｙ ）
、ＭＡＩであり、放射された光Ｉｉｌは小型のＰＯＥ器
械５４［このＩ ２７が６．４５ａ１２ （１インチ平
方）の寸法があることを除いて第４図及び第５図に例示
されたものと同一）を通り抜番ノる方向に鏡５２で反射
される。それから光線は電気泳動ｍ固液（１１５のＴＢ
Ｆ）は勿論透明なりＮＡ−アガロ−スゲル挿入物を含有
するＰＯＥ室を通り抜け、最後に透過光線はＵ Ｄ ’
ｒ −２０１Ａ増幅器に接続した検出器５６（シリコン
光検出器、ＰＩＮ ３ＣＤ）［両方ともユナイテッド
デイｔクター７クノロジー（Ｕｎｉｔｅｄ Ｄｅｔｅｃ
ｔｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｔｏｇｙ）社製１に衝突する。検
出器の増幅器（略図には丞されていない）からの信号は
、透過光線とレーザーで放出されるＭ単信号との位相差
を測定する位相ｉｔ ５８［モデル６０００、クラーク
ヘス（Ｃ１ａｒｋｅ−Ｈｅｓｓ ）社ｔＪ］へ供給さ
れる。測定された位相差はＩＭＳ ＡＴコンピュータ
ー６０に取付Ｇプられたデジタルボード［商品名ラブマ
スター（ＬａｂＨａｓｔｅｒ） 、サイエンテイフイク
ソルーションズ（５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ５ｏｌｕｔ
ｉｏｎｓ）社製］へ１２ビツトのアナログによってデジ
タル化され、そしてアンクル スコープ（Ｕｎｋｃｌ
５ｃｏｐｅ ）ソフトウェア［アンクル ソフトウェア
（Ｕｎｋｅｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）社製］をデジタルボ
ード制御に対するアナログ及びデータ解析のために使用
する。コンピューター６０はまたヒユーレットバラカー
ド（）ｌｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ）６１１５△
プレシジヨン パワー サプライ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ
Ｐｏｗｅｒ ５ｕｐｐｌｙ） ６２によって電力を供
給される継電器に接続されたアトトロン（八ｄｔｒｏｎ
） ＤＯ３−１６Ｌアトトロン（Ａｄｔｒｏｎ）社製］
パルス合成機によってパルス制御操作を行う。
（Ｏｐｔｒａ ）社製ビアボデー（Ｐｅａｂｏｄｙ ）
、ＭＡＩであり、放射された光Ｉｉｌは小型のＰＯＥ器
械５４［このＩ ２７が６．４５ａ１２ （１インチ平
方）の寸法があることを除いて第４図及び第５図に例示
されたものと同一）を通り抜番ノる方向に鏡５２で反射
される。それから光線は電気泳動ｍ固液（１１５のＴＢ
Ｆ）は勿論透明なりＮＡ−アガロ−スゲル挿入物を含有
するＰＯＥ室を通り抜け、最後に透過光線はＵ Ｄ ’
ｒ −２０１Ａ増幅器に接続した検出器５６（シリコン
光検出器、ＰＩＮ ３ＣＤ）［両方ともユナイテッド
デイｔクター７クノロジー（Ｕｎｉｔｅｄ Ｄｅｔｅｃ
ｔｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｔｏｇｙ）社製１に衝突する。検
出器の増幅器（略図には丞されていない）からの信号は
、透過光線とレーザーで放出されるＭ単信号との位相差
を測定する位相ｉｔ ５８［モデル６０００、クラーク
ヘス（Ｃ１ａｒｋｅ−Ｈｅｓｓ ）社ｔＪ］へ供給さ
れる。測定された位相差はＩＭＳ ＡＴコンピュータ
ー６０に取付Ｇプられたデジタルボード［商品名ラブマ
スター（ＬａｂＨａｓｔｅｒ） 、サイエンテイフイク
ソルーションズ（５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ５ｏｌｕｔ
ｉｏｎｓ）社製］へ１２ビツトのアナログによってデジ
タル化され、そしてアンクル スコープ（Ｕｎｋｃｌ
５ｃｏｐｅ ）ソフトウェア［アンクル ソフトウェア
（Ｕｎｋｅｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）社製］をデジタルボ
ード制御に対するアナログ及びデータ解析のために使用
する。コンピューター６０はまたヒユーレットバラカー
ド（）ｌｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ）６１１５△
プレシジヨン パワー サプライ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ
Ｐｏｗｅｒ ５ｕｐｐｌｙ） ６２によって電力を供
給される継電器に接続されたアトトロン（八ｄｔｒｏｎ
） ＤＯ３−１６Ｌアトトロン（Ａｄｔｒｏｎ）社製］
パルス合成機によってパルス制御操作を行う。
小型ＰＯＥ室及び方法は二極分１１ｔ′ＩＩｉ極の能力
によって以下の実膿を可能ならしめるために欠くことが
できない、’＃ｉ記の電極は、本明細よ中に記述したよ
うに、ＰＯＥ室にどのような電極誘導の電場のゆがみを
も生じることなく、ＤＮＡｙＩの後向き及び前向きの移
動を可能にする。後向き及び前向きの移動はＰＯＥ沫の
重要な特徴であるばかりでなく、レーザー光線から脱出
する動きから試料を留首する。換言するならば、ＰＯＥ
室は迅速に変化する、均質な（−様な）電場を印加する
ことができた。
によって以下の実膿を可能ならしめるために欠くことが
できない、’＃ｉ記の電極は、本明細よ中に記述したよ
うに、ＰＯＥ室にどのような電極誘導の電場のゆがみを
も生じることなく、ＤＮＡｙＩの後向き及び前向きの移
動を可能にする。後向き及び前向きの移動はＰＯＥ沫の
重要な特徴であるばかりでなく、レーザー光線から脱出
する動きから試料を留首する。換言するならば、ＰＯＥ
室は迅速に変化する、均質な（−様な）電場を印加する
ことができた。
第１９ＪａＺ図は、第１８図に示す機械及び第１９１ｂ
１図に示すパルス発振ルーチンを使用する、小体積（８
０μｌのアガロースの塊）のアがロース中にアニールし
たラムダバクテリオファージＤＮＡ分子の電気泳動的に
誘導した複屈折の測定（！！！直軸は任意のｔＢ１位の
配向を示し、一方水平軸は時間である）を示す。アニー
ソングプロセスはエチジウム着色したゲルのＰＯＥ分析
によって判断したとき、大きさ２．０００ｋｂまでの鎖
状体（ＤＮＡ分子は末端でたった１木の補足的な鎖によ
ってお互いにくっついている）を生じる。ゲルの塊又は
挿入物は１０μりのＤＮＡを含有していた。印加された
Ｔｉ界強度は外部の調査用具で測定したとき２５ボルト
／ｃ１１であった。
１図に示すパルス発振ルーチンを使用する、小体積（８
０μｌのアガロースの塊）のアがロース中にアニールし
たラムダバクテリオファージＤＮＡ分子の電気泳動的に
誘導した複屈折の測定（！！！直軸は任意のｔＢ１位の
配向を示し、一方水平軸は時間である）を示す。アニー
ソングプロセスはエチジウム着色したゲルのＰＯＥ分析
によって判断したとき、大きさ２．０００ｋｂまでの鎖
状体（ＤＮＡ分子は末端でたった１木の補足的な鎖によ
ってお互いにくっついている）を生じる。ゲルの塊又は
挿入物は１０μりのＤＮＡを含有していた。印加された
Ｔｉ界強度は外部の調査用具で測定したとき２５ボルト
／ｃ１１であった。
第１９／ａ？図に提示したデータは次のように解析され
る。（ａ）印加された電場なしに基準線の信号を示す、
（ｂ）３０秒間のＮ−Ｓパルス（示されたすべてのパル
スは良さが３０秒である）後配向を示し、そして（Ｃ）
Ｓ−Ｎパルスのスタートは、（ｄ）Ｅ−Ｗパルスが始ま
るところで終る。（０）でパルスはＷ−Ｅ志向に逆転さ
れぞしてｍＮ−８パルスの開始を示す。パルス発蛋は第
１９Ｊｂケ図のダイアグラムに示したように（ｇ）まで
続き、電場が止められて分子が緩和されると（ｈｌによ
って示されたように最初の基準線に戻る。
る。（ａ）印加された電場なしに基準線の信号を示す、
（ｂ）３０秒間のＮ−Ｓパルス（示されたすべてのパル
スは良さが３０秒である）後配向を示し、そして（Ｃ）
Ｓ−Ｎパルスのスタートは、（ｄ）Ｅ−Ｗパルスが始ま
るところで終る。（０）でパルスはＷ−Ｅ志向に逆転さ
れぞしてｍＮ−８パルスの開始を示す。パルス発蛋は第
１９Ｊｂケ図のダイアグラムに示したように（ｇ）まで
続き、電場が止められて分子が緩和されると（ｈｌによ
って示されたように最初の基準線に戻る。
第１８図に示した器械の使用によって、ＰＯＥ法によっ
て有効電界角を変化させて分子配向に対するその効果を
研究することができる。このようにして、ＰＯＥ法は蛍
光及び二色法又は両法の組合せを利用して電場配向を研
究するために使用できる。
て有効電界角を変化させて分子配向に対するその効果を
研究することができる。このようにして、ＰＯＥ法は蛍
光及び二色法又は両法の組合せを利用して電場配向を研
究するために使用できる。
実施例７
ＭＰＰＥ法を利用する巨大ＤＮＡ分子の分離サツカロミ
セス セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒａｖｉｓｉａｅ）の試料
を実施例１に記述したように調製した。電気泳動条件は
、使用したステップ比が１に等しかったことを除いて同
一であった。使用したステップタイムは３．３秒、スイ
ッチタイムは１２０秒、そして電圧比は３：５（７５ボ
ルトのＮ−８，１２５ボルトのＥ −Ｗ−Ｅ ）であっ
た。
セス セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒａｖｉｓｉａｅ）の試料
を実施例１に記述したように調製した。電気泳動条件は
、使用したステップ比が１に等しかったことを除いて同
一であった。使用したステップタイムは３．３秒、スイ
ッチタイムは１２０秒、そして電圧比は３：５（７５ボ
ルトのＮ−８，１２５ボルトのＥ −Ｗ−Ｅ ）であっ
た。
結果（第２０図参照）は、ＭＰＰＥ効果は巨大分子の電
気泳動速度を、それらを大きさに分解すると同様に調節
することができることを示す。
気泳動速度を、それらを大きさに分解すると同様に調節
することができることを示す。
本発明は以下の図面について詳細に説明したが、図面は
説明の目的で含めたのであって発明を限定するものと解
すべきではない。
説明の目的で含めたのであって発明を限定するものと解
すべきではない。
第１図はゲルマトリックス中のＤＮＡの詰め込み状態及
び整列を説明する略図である。 第２図はＤＮＡのコイルを構成する一連の球状の小塊を
説明する略図である。 第３図は直交ＰＯＥ分離（第３ａ図）と従来のパルス領
域電気泳動分離（第３ｂ図）の比較を示す。第３ａ図の
点線はこの方法を使用して青だ分解能が狭い範囲である
ことを示す。第３ｂ図は従来のパルス領域電気泳動を使
用して得た幅広い分離を示す。 第４図は本発明のある特徴を説明するのに有用な電気泳
動室の斜視図である。 第５図は非望的な室の７８極の相η連結を示す部分的略
図兼部分的ブロックダイアグラムである。 第６図は本発明に従って使用することができるパルス発
振ルーチンを説明し、第６ａ図は例示したパルス発振ル
ーチン（１６秒のスイッチタイムをもつ３秒及び５秒の
パルス、陰影をｔ口）だ箱は所定の配向の電場を示す）
のステップタイム及びスイッチタイム並びに電場配向を
示し、第６ｂ図は第６ａ図のパルスのベクトル合計によ
って形成されたａ効電界角を示し、第６Ｃ図は第６ａ図
のパルス発振ルーチンに従って分離を受ける粒子の代表
的な配座を示１゜ 第７図はスイッチタイムの変化による酵母染色体の電気
泳動移動度の変化を説明するグラフである。 第８図は３．５秒のステップタイム及び１２０秒のスイ
ッチタイムのＰＯＥ分離が後に続くサツカロミセス セ
レビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｃｖｉｓｉａｅ）染色体のＤＮ
Ａ分子のパルス領域電気泳動の寸法分解能を説明する。 第９図は違う軸、すなわち速度対スイッチタイムの変化
に対する大きさについてプロットした第７図のデータを
示すグラフである。 ｆｆ１１０図Ｇ、ｔ１２．０ＯＯｋｂノヒト（７）ＤＮ
Ａ分子のＰＯＥ分離を示す。 第１１図は実施例３の１チジウム着色したゲルを示す。 レーン１及び２はそれぞれ菌株Ｓ Ｐ ５１８及び５Ｐ
５５３からのサツカロミセスボンベ（影」■すｌリエ）
染色体のＤＮＡ分子の分離を示す。 レーン４はサツカロミセス セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒｃ
ｖｉｓｉａｅ） （菌株ｐｈ３−６Ｄ）染色体の１）
Ｎ Ａ分子の分離を示す。 第１２図は実施例４に記述した直交ＰＯＥ法を利用して
行った実験を説明するグラフである。これは第１３図〜
第１５図に示したいろいろなスイッチタイムとステップ
タイムを説明する複合グラフである。すべてのステップ
比は１に等しい。 第１３図は３．３〜１２０秒、１５．１５〜１２０秒、
３０．３０〜１２０秒、及び６０．６０〜１２０秒のパ
ルスを説明するグラフである。 第１４図は５．５〜３０秒及び１５．１５〜３０秒のパ
ルスを説明するグラフである。 第１５図は１０．１０〜６０秒、１５．１５〜６０秒及
び３０．３０〜６０秒のパルスを説明するグラフである
。 第１６図は蛍光顕微鏡検査の研究に使用することかでき
るＰＯＥ顕微鏡検査室の略図である。 第１７図は実施例５に記述した蛍光顕微鏡検査実験によ
って明らかにされたＧバクテリオファージのゲル電気泳
動中のＤＮＡ分子の配座の変化を示す。第１７ａ図は３
分の従来の電気体ｗＪ侵の異なるＤＮＡ分子を示す。第
１７ｂ図は３分のＰＯＥ （３秒のＷ、５秒のＮ−５−
Ｎ及び４０秒のスイッチタイム）後のＤＮＡ配外の変化
を示寸。 第１７ｃ図は４０秒のＮ統いて４０秒のＷパルス発振の
効果を示す。写貞の説明を容易にする略図がそれぞれの
原画の右側である。 第１８図はゲル電気泳動の間じゆうのＤＮＡ分子の電気
的複屈折の研究に使用した器械の概要説明である。第１
８ａ図は実施例６に記述した器械の使用のダイヤグラム
である。第１８ｂ図はＰＯＥ室の平面図である。内部の
陰影を１・１けた四角はＤＮＡを含有するゲル挿入物で
あり、円は電極の位置を示す。第１８Ｃ図は電極の位置
を承り線を備えたＰＯＥ室を未踏す側面図である。 第１９図は鎖状化したラムダバクテリオファージ１）Ｎ
Ａ分子の電気泳動的に誘導された複屈折の測定を示ず。 第１９ａ図は第１９ｂ図（陰影を付１）だ箱は電場が所
定の方向であることを示す）のパルス発振ルーチンによ
って生じるラムダバクテリオファージＤＮＡ分子の配向
を示す。 第２０図は実施例７に記述したサツカロミセスセレビシ
ェ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）染色体のＤＮＡ分子の
多ｉｆｉ電位パルス電気泳動（ＭＰＰＥ）分離を説明す
る。図は起源を示す矢印付きサツカロミセスセレビシェ
（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含有する１チジウム
ブロミドで着色したゲルを示す。
び整列を説明する略図である。 第２図はＤＮＡのコイルを構成する一連の球状の小塊を
説明する略図である。 第３図は直交ＰＯＥ分離（第３ａ図）と従来のパルス領
域電気泳動分離（第３ｂ図）の比較を示す。第３ａ図の
点線はこの方法を使用して青だ分解能が狭い範囲である
ことを示す。第３ｂ図は従来のパルス領域電気泳動を使
用して得た幅広い分離を示す。 第４図は本発明のある特徴を説明するのに有用な電気泳
動室の斜視図である。 第５図は非望的な室の７８極の相η連結を示す部分的略
図兼部分的ブロックダイアグラムである。 第６図は本発明に従って使用することができるパルス発
振ルーチンを説明し、第６ａ図は例示したパルス発振ル
ーチン（１６秒のスイッチタイムをもつ３秒及び５秒の
パルス、陰影をｔ口）だ箱は所定の配向の電場を示す）
のステップタイム及びスイッチタイム並びに電場配向を
示し、第６ｂ図は第６ａ図のパルスのベクトル合計によ
って形成されたａ効電界角を示し、第６Ｃ図は第６ａ図
のパルス発振ルーチンに従って分離を受ける粒子の代表
的な配座を示１゜ 第７図はスイッチタイムの変化による酵母染色体の電気
泳動移動度の変化を説明するグラフである。 第８図は３．５秒のステップタイム及び１２０秒のスイ
ッチタイムのＰＯＥ分離が後に続くサツカロミセス セ
レビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｃｖｉｓｉａｅ）染色体のＤＮ
Ａ分子のパルス領域電気泳動の寸法分解能を説明する。 第９図は違う軸、すなわち速度対スイッチタイムの変化
に対する大きさについてプロットした第７図のデータを
示すグラフである。 ｆｆ１１０図Ｇ、ｔ１２．０ＯＯｋｂノヒト（７）ＤＮ
Ａ分子のＰＯＥ分離を示す。 第１１図は実施例３の１チジウム着色したゲルを示す。 レーン１及び２はそれぞれ菌株Ｓ Ｐ ５１８及び５Ｐ
５５３からのサツカロミセスボンベ（影」■すｌリエ）
染色体のＤＮＡ分子の分離を示す。 レーン４はサツカロミセス セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒｃ
ｖｉｓｉａｅ） （菌株ｐｈ３−６Ｄ）染色体の１）
Ｎ Ａ分子の分離を示す。 第１２図は実施例４に記述した直交ＰＯＥ法を利用して
行った実験を説明するグラフである。これは第１３図〜
第１５図に示したいろいろなスイッチタイムとステップ
タイムを説明する複合グラフである。すべてのステップ
比は１に等しい。 第１３図は３．３〜１２０秒、１５．１５〜１２０秒、
３０．３０〜１２０秒、及び６０．６０〜１２０秒のパ
ルスを説明するグラフである。 第１４図は５．５〜３０秒及び１５．１５〜３０秒のパ
ルスを説明するグラフである。 第１５図は１０．１０〜６０秒、１５．１５〜６０秒及
び３０．３０〜６０秒のパルスを説明するグラフである
。 第１６図は蛍光顕微鏡検査の研究に使用することかでき
るＰＯＥ顕微鏡検査室の略図である。 第１７図は実施例５に記述した蛍光顕微鏡検査実験によ
って明らかにされたＧバクテリオファージのゲル電気泳
動中のＤＮＡ分子の配座の変化を示す。第１７ａ図は３
分の従来の電気体ｗＪ侵の異なるＤＮＡ分子を示す。第
１７ｂ図は３分のＰＯＥ （３秒のＷ、５秒のＮ−５−
Ｎ及び４０秒のスイッチタイム）後のＤＮＡ配外の変化
を示寸。 第１７ｃ図は４０秒のＮ統いて４０秒のＷパルス発振の
効果を示す。写貞の説明を容易にする略図がそれぞれの
原画の右側である。 第１８図はゲル電気泳動の間じゆうのＤＮＡ分子の電気
的複屈折の研究に使用した器械の概要説明である。第１
８ａ図は実施例６に記述した器械の使用のダイヤグラム
である。第１８ｂ図はＰＯＥ室の平面図である。内部の
陰影を１・１けた四角はＤＮＡを含有するゲル挿入物で
あり、円は電極の位置を示す。第１８Ｃ図は電極の位置
を承り線を備えたＰＯＥ室を未踏す側面図である。 第１９図は鎖状化したラムダバクテリオファージ１）Ｎ
Ａ分子の電気泳動的に誘導された複屈折の測定を示ず。 第１９ａ図は第１９ｂ図（陰影を付１）だ箱は電場が所
定の方向であることを示す）のパルス発振ルーチンによ
って生じるラムダバクテリオファージＤＮＡ分子の配向
を示す。 第２０図は実施例７に記述したサツカロミセスセレビシ
ェ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）染色体のＤＮＡ分子の
多ｉｆｉ電位パルス電気泳動（ＭＰＰＥ）分離を説明す
る。図は起源を示す矢印付きサツカロミセスセレビシェ
（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含有する１チジウム
ブロミドで着色したゲルを示す。
Claims (42)
- （１）粒子を分離するための分析用電気泳動方法であつ
て、変形しうる粒子の分離が可能で、粒子の高分解能分
析的及び予備的な電気泳動分離を成し遂げバンドのパタ
ンにするために、電場に対していくらかの角度を持ち、
いかなる方向にでも粒子を移動できるように、お互いに
いくらかの角度を持つて、あらゆる方向を有して時間と
共に変化する少なくとも１つの電場に適切な媒質中で粒
子をさらすこと、そして交互のパルスは、粒子が受ける
パルスのベクトル合計によつて決定されるように粒子の
有効電界角を定めるように変調されるパルス発振ルーチ
ンに従つて電場を変化させることを含むことを特徴とす
る分析用電気泳動方法。 - （２）上記パルスのパルス時間が粒子の有効電界角を定
めるように調節される請求項１記載の方法。 - （３）上記パルスのステップタイムが上記パルスのスイ
ッチタイムの半分に等しい請求項２記載の方法。 - （４）上記パルスのステップ比が電場に対しいくらかの
角度の全体の方向に粒子を移動するために有効であるど
のような比でもある請求項２記載の方法。 - （５）上記パルスのステップ比が１に等しい請求項２記
載の方法。 - （６）交互のパルスの上記パルスのパルスタイムが３：
５の比を有する請求項２記載の方法。 - （７）上記パルスのパルスタイムが粒子の有効電界角を
決定するように動的に調節される請求項２記載の方法。 - （８）上記パルスのパルスタイムが粒子の有効電界角を
決定するように単純に調節される請求項２記載の方法。 - （９）上記パルスの強度が粒子の有効電界角を定めるよ
うに調節される請求項１記載の方法。 - （１０）交互の上記パルスの強度が全強度の半分に等し
い請求項９記載の方法。 - （１１）交互の上記パルスの強度の比が電場に対しいく
らかの角度の全体の方向に粒子を移動させるために効果
的であるどのような比でもある請求項９記載の方法。 - （１２）交互の上記パルスの強度の比が１に等しい請求
項９記載の方法。 - （１３）交互の上記パルスの強度が３：５の比を有する
請求項９記載の方法。 - （１４）上記パルスの強度が粒子の有効電界角を決定す
るように動的に調節される請求項９記載の方法。 - （１５）上記パルスの強度が粒子の有効電界角を決定す
るように単純に調節される請求項９記載の方法。 - （１６）請求項１の分析用電気泳動方法を使用する電気
泳動中のＤＮＡ分子の電気的複屈折の測定。 - （１７）蛍光顕微鏡検査法及び請求項１の分析用電気泳
動方法を使用する電気泳動中のＤＮＡ分子配座変化の測
定。 - （１８）上記媒質が粒子のサイズより小さい有効孔サイ
ズを有するマトリックス媒質である請求項１記載の方法
。 - （１９）上記媒質がアガロースゲルである請求項１記載
の方法。 - （２０）上記媒質がアクリルアミドゲルである請求項１
記載の方法。 - （２１）上記粒子が染色体である請求項１記載の方法。
- （２２）上記染色体が真核生物に由来する請求項２１記
載の方法。 - （２３）上記粒子がヒトの染色体である請求項１記載の
方法。 - （２４）上記粒子が動物の染色体である請求項１記載の
方法。 - （２５）上記粒子が植物の染色体である請求項１記載の
方法。 - （２６）上記粒子が酵母の染色体である請求項１記載の
方法。 - （２７）上記粒子がヒトの染色体の断片である請求項１
記載の方法。 - （２８）上記粒子が小さなＤＮＡ粒子である請求項１記
載の方法。 - （２９）上記粒子が大きなＤＮＡ粒子である請求項１記
載の方法。 - （３０）分析用電気泳動のための装置であつて、分離さ
れるべき粒子の１つ又はそれ以上の試料を置くことがで
きる支持具； お互いにいくらかの角度にあり、電場のそれぞれの全体
の方向といくらかの角度の、しかしこれを横切る全体の
方向において前記粒子に作用する全体の方向を有する電
場を発生するための手段；及び 交互のパルスが前記粒子によつて受ける、前記パルスの
ベクトル合計によつて決定されるように前記粒子の有効
電界角を定めるように変調される、パルス発振ルーチン
に従つて前記電場を変化させるための手段からなること
を特徴とする装置。 - （３１）前記変化させる手段が前記粒子の有効電界角を
定めるように前記パルスの時間を調節する請求項３０記
載の装置。 - （３２）前記変化させる手段が前記粒子の有効電界角を
定めるように前記パルスの強度を調節する請求項３０記
載の装置。 - （３３）前記電界発生手段が電極及び前記パルス発振ル
ーチンに従つて独立して選択可能な電位に前記電極を保
持するための手段を含む請求項３０記載の装置。 - （３４）さらに前記電極の同時変化分極用手段を含む請
求項３３記載の装置。 - （３５）前記変化手段が各電極に２セットのダイオード
を接続することによつて成し遂げられる請求項３４記載
の装置。 - （３６）前記電極が双極隔離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）電極
である請求項３３記載の装置。 - （３７）前記媒質用の前記支持具は電気絶縁材料製の上
端開放の、長方形の電気泳動室であり、しかも前記室は
その底の上に前記媒質の１層を支えており； 前記室は前記媒質が前記電極によつて囲まれるように前
記室の内壁に接続された電極を有し、そして 前記電極は前記電場を変化させるために前記手段及び双
極ダイオードに接続されている 請求項３０記載の装置。 - （３８）前記媒質用の前記支持具はホールダー中に置か
れるスライドを含む顕微鏡検査室であり；前記スライド
は前記媒質及び前記粒子を保持し被覆小片で覆われ； 前記室は前記電場を発生するために前記スライド及び前
記被覆小片と電気的接触をさせる電極を有し；そして 前記電極は前記電場を変化させるために前記手段及び双
極ダイオードに接続されている 請求項３０記載の装置。 - （３９）分離されるべき粒子の１つ又はそれ以上の試料
が分析用電気泳動のために置かれる媒質を支持するため
の装置であつて、 その底の上に前記媒質の１層を支持する、電気絶縁材料
製の上端開放の、長方形の電気泳動室；前記媒質が電気
によつて囲まれるように前記室の内壁に接続された電極
を含み；かつ 前記室は２．５４ｃｍ（１インチ）平方の寸法があるこ
とを特徴とする装置。 - （４０）前記電極が双極隔離電極である請求項３９記載
の装置。 - （４１）分離されるべき粒子の１つ又はそれ以上の試料
が分析用電気泳動のために置かれる媒質を支持するため
の装置であつて、 標準的な顕微鏡載物台上にきちんとはまるホールダー； 前記ホールダー中に置かれて分離されるべき粒子の１つ
又はそれ以上の試料が置かれる媒質を保持するスライド
； 前記スライドを囲う被覆小片； 前記スライドと前記被覆小片の間に電気的な接触をさせ
る電極；及び 前記電極から双極ダイオード及び前記電極から電場を変
化させるための手段へ接続を与える前記ホールダー上に
置かれた電気コネクター からなることを特徴とする装置。 - （４２）大きさによつて分けられるべき１つ又はそれ以
上の試料が分析用電気泳動のために置かれる請求項４１
記載の装置。
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