JPH02186979A - 組織の極低温保存方法とそのための組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は組織の極低温保存（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａ
ｔ　１ｏｎ）、特に組織内に拡散して凍結及び／または
冷凍及び解凍中の損傷を防止する極低温保存溶液に関す
る。

極低温生物学者が種々の種類の細胞及び組織の冷凍、解
凍及び復元に充分な成功を収めていないことが知られて
いる。また、極低温生物学者は、慣習的な方法では、器
官のような複雑な細胞塊の冷凍に成功していない。角膜
のようなあまり複雑でない細胞物質または組織では、極
低温生物学者は比較的成功しているが、移植片損傷の許
容し難く高い発生率に直面している。

細胞内での氷結晶の形成によって冷凍または解凍中の細
胞損傷を生ずることが一般に受入れられており、この氷
の結晶が細胞の部分を粉砕するまたは細胞を完全に維持
するフィラメントの組織を破壊すると考えられる。この
種の損傷を避けるために、低温生物学者は細胞膜または
細胞壁に含まれる水が冷凍される前に細胞膜または細胞
壁を通って拡散するための充分な時間があるように、細
胞サンプルを徐々に冷却する。しかし、冷却速度が緩慢
すぎ、細胞外の氷の形成中に多すぎる水が細胞から抽出
されすぎると、細胞内に高濃度の塩が残されて、蛋白質
を変性させ、細胞構造を破壊する。水の脱出が細胞を収
縮させ、膜物質を損傷させ、それによって解凍中の再水
和時に細胞が漏出するかまたは破裂する場合には、細胞
容積の変化によって脱水損傷が生ずることを示す一連の
証拠が存在し、ますます増加している。

細胞の極低温保存の他のアプローチは細胞材料を水分子
が氷の結晶を形成する機会がないような、特に迅速な速
度で冷凍するガラス化法として知られた方法である。こ
の代りに、細胞材料は非常に粘稠で過冷却される液体に
変化する。この方法は有望に思われるが、この方法は通
常の方法で極低温保存することのできない生物学サンプ
ルのガラス化に用いられて現在までに成功していない。

ガラス化方法に組合せて極低温保存に併用される他の方
法は、冷凍する前の細胞材料への極低温保護剤（ｃｒｙ
Ｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）の潅流であり、最も一般的に
用いられる極低温保護剤はグリセロールである。極低温
保護剤は冷凍中の細胞各部を保護する“凍結防止”液と
して作用する。しかし、極低温保護剤の使用に伴う困難
は極低温保護剤が凍結防止液として機能するために必要
な高濃度レベルでは、極低温保護剤が有害であり、細胞
の損傷または破壊を生じうろことである。

細胞材料の冷凍に現在最も一般的に用いられる方法は、
極低温保護剤とガラス化法との併用である。冷却速度と
極低温保護剤の濃度とを細心に調節することによって、
当業者はヒトの血液細胞、角膜、皮膚、膵臓ランゲルハ
ンス島、その他の全組織及び組織培養細胞を保存するこ
とができている。しかし、これらの方法を用いても細胞
材料への損傷、しばしば広範囲な損傷が経験されている
。

さらに、より複雑な組織と器官の極低温保存にはこのよ
うな材料が多くの細胞と多くの細胞の種類とを含み、独
自の冷凍−解凍レシメンを必要とするために、慣習的方
法は適していない。さらに、上記方法は細胞内の氷の形
成を避けるが、氷は細胞の外側にも形成され、血管を損
傷し、器官の構造的一体性を危険にさらすことになる。

上記問題を避ける１つのアプローチは過圧下での細胞材
料の冷凍である。ファヒー（Ｆａｈｙ）によって実施さ
れ、サイエンス　ニュース（ＳｃｉｅｎｃｅＮｅｗｓ）
、　　１３２巻、　１９８７年８月２７日号、１３９頁
に述べられている、この方法は極低温保護剤の高濃度混
合物のウサギ腎臓への潅流とその後の腎臓の１０００気
圧下での約−１５０℃までへの冷却とを含むものであっ
た。ファヒーによると、過圧は氷の形成に必要な水の膨
張を抑制し、保存に必要な、有害と考えられる極低温保
護剤の必要量を減する。

ファヒーは極低温保護剤の使用に伴って水分子が氷の結
晶格子に凝集することを困難にすると報告している。極
低温保護剤は凝固点を低下させ、物質が非晶質ガラスに
変る温度を上昇させるといわれている。ファヒーの報告
によると、極低温保護剤混合物は毒性を最小にし、物質
のガラス形成力を最大にし、細胞の内外の極低温保護剤
レベルを調節する。ファヒーによると、極低温保護剤と
過圧とを用いると、サンプルを氷の形成を避けるために
非常に迅速な速度でサンプルを冷却する必要がなくなる
。このことは器官のように大きい物体を迅速かつ完全に
冷却することを容易にすると報告されているが、現在こ
の方法では器官が充分に極低温保存されないと考えられ
ている。

本発明は動物性及び植物性（以下では一般に生物学的と
呼ぶ）細胞材料を低温で保存するための新しい極低温保
護剤にも関する。この極低温保護剤は極低温保存に必要
な濃度において無害であり、特別な注意、細心に制御し
た冷却レジメンその他の上記の高圧の使用のような特別
な処理の必要を避けて簡単化した方法による極低温保存
を可能にする。

本発明によって用いる極低温保護剤は脂肪酸残基を含ま
ないホスホグリセリドのホスホモノエステル及びホスホ
ジエステル異化生成物であり、従ってリゾリン脂質誘導
体を含まない。ここで予定するホスホエステルは動物及
び種々な植物の細胞組織内に低濃度で自然に生ずるが、
ホスホエステルの濃度と組成はホスホエステルが存在す
る器官、組織及び生物種の健康及び状態に非常に依存す
る。

本発明の方法は冷凍温度に近いかまたはこれを超える温
度にまで温度を減することによって保存すべき細胞材料
内に、本発明の極低温保護剤を拡散することを含む。拡
散は例えば、ホスホエステル異化生成物の薄い水溶液中
への細胞材料の直接の浸せきのような技術上認められた
方法によって達成される。充分に理解されていない理由
から、本発明の極低温保護剤溶液中に浸せきした細胞材
料は溶液からホスホエステル異化生成物を抽出して、そ
の細胞構造内に吸収する。細胞材料中に極低温保護剤が
拡散した後に、通常の方法によって、好ましくは凍結（
固体）状態にまで進行するような徐冷によって冷却する
。本発明によると水の通常の凝固点より充分に低い温度
において、細胞内外に氷の形成を生ずることなく、保存
が行われうることが観察されている。このことは、本発
明の極低温保護剤が少なくとも一部は凝固点降下剤また
は凍結防止剤として作用して、氷形成のプロセスまたは
動力学をさらに抑制することを示唆する。

生物学的細胞材料を保存温度にまで温度低下させた後に
、無限の期間保存することができる。使用の用意がとと
のった場合に、材料の温度を好ましい温度にまで徐々に
高める。本発明の極低温保護剤を用いると、市販の極低
温保護剤で処理して、同条件下で保存した細胞材料に比
べて、極低温保存後の細胞損傷が著しく低下することが
判明している。

本発明の極低温保護剤は生体材料に通常存在するホスホ
グリセリドの異化生成物である。従って、技術上周知の
他の極低温保護剤に比べて、本発明のホスホエステル異
化生成物は明白な毒性を示すことなく比較的高濃度で用
いられる。このことは、冬眠する動物が高レベルの異化
生成物グリセロールホスホリルコリンを自然に得るが、
非冬眠期間にはこの物質が比較的低レベルであるという
観察によって、またさらに精液中に高レベルのグリセロ
ールホスホリルコリンが存在するという観察によって支
持される。

上記その他の理由の検討から、本発明の極低温保護剤は
先行技術の極低温保護剤を超えた改良を含む。

先行技術の極低温保護剤は例えば印母細胞、精子、胎児
、血液細胞、角膜のような少ない細胞から成る組織及び
心臓弁のような種々な細胞材料の保存に用いられている
。しかし、先行技術の極低温保護剤は例えば心臓、肝臓
及び腎臓のような器官の複雑な細胞材料の冷凍保存には
適していなかった。先行技術の極低温保護剤の使用を限
定する多くの理由がある。１つの限定は極低温保護剤が
組織材料中に深く浸透することができず、そのために冷
凍によって生ずる損傷に対する保護が表面にのみまたは
外部組織にのみ限定されることである。本発明の極低温
保護剤は組織材料中に浸透して容易に分散されるので、
本発明の極低温保護剤の使用によって極低温保存法とそ
の用途は拡大される。

本発明によると、極低温保護剤は冷却、貯蔵温度までの
完全冷却の前の組織材料中に拡散する。

本発明によって考える極低温保護剤は脂肪酸残基を含ま
ないホスホグリセリドのホスホモノエステルまたはホス
ホジエステル異化生成物であり、従ってリゾリン脂質を
含まない。ホスホエステルは代謝中のリン脂質への酵素
の作用によって自然に生ずる物質であるが、技術上認め
られた方法によって合成することができる。従って、本
発明によってここに用いるホスホモノエステルまたはホ
スホジエステル異化生成物は、この物質が自然に発生し
たか合成されたかに関係なく、本発明の極低温保護剤の
化学構造と同じであることを意味する。

本発明による極低温保護剤の原料であるホスホグリセリ
ドは次の一般式： 〔式中、Ｒ１とＲ２は脂肪酸であり、Ｘはアルコール（
オール）官能基を有する残基、典型的には３００原子量
単位（ダル）・ン）を超えない分子量の残基である〕 で示される。上記化合物の異化は種々な酵素の作用によ
って生ずる。ホスホグリセリドのこの酵素修飾は技術上
周知である。例えば、酵素ホスホリパーゼＡ１はグリセ
リドバックボーンの１位置から脂肪酸を除去し、ホスホ
リパーゼＡ２はその２位置から脂肪酸を除去する。同様
に、ホスホリパーゼＡ１とＡ２の混合物のホスホリパー
ゼＢはグリセリドバックボーンから２つの脂肪酸残基の
連続除去を行う。ホスホリパーゼＣはリン酸とグリセロ
ールとの間でバックボーンを加水分解し、ホスホリパー
ゼＤは極性ヘッド基（ｐｏｌａｒ　ｈｅａｄｇｒｏｕｐ
）を除去して、ホスファチジン酸を残す。

これらの酵素反応は技術上周知であり、例えばレーニン
ガー（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ）によってバイオケミストリ
ー（Ｂｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２版、ワース出版社
（Ｗｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ）　（＝　：ｚ−ヨ
ーク’）　２７９〜３０Ｂ頁、特に２９０〜２９１頁に
述べられており、ミチャード（Ｍｉｃｈａｒｄ）　、ゲ
ルハード（Ｇｅｒｈａｒｄ）によってバイオケミカル　
パスウエイズ（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＰａｔｈｗａｙ
ｓ）　、ベーリンゲル　マンハイム　バイオケミカルス
ＣＢｏｅｒｌｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｌｏｃｈ
ｅｔｎｌｃａＩｓ＞（インデイアナポリス）、チャート
セクションＣ７〜Ｃ８（’１９８２）にチャート形式で
構造的に示されており、これらの両方はここに参考文献
として関係する。

上記の極低温保護剤の定義によると、グリセリドバック
ボーンからの単独脂肪酸基の開裂によって形成される生
成物であるリゾリン脂質は本発明の範囲から除かれる。

この種の物質を除外する理由は、リゾリン脂質は細胞材
料中に限定された濃度で認容されうるが、高濃度は有害
であり、細胞の結合性に損傷を与えることが知られてい
る。

本発明のために好ましいホスホエステル極低温保護剤化
合物は次の一般式によって示される：ｘ−ｏ−ｐ−ｏ−
ｘ 〔式中、各Ｘは独立的に上記の残基である〕入手が容易
であることから、グリセロールホスホリルコリン、グリ
セロールホスホリルエタノールアミン、グリセロールホ
スホリルセリン、グリセロールホスホリルグリセロール
、グリセロールホスホリルイノシトール、ホスホリルグ
リセロール、ホスホリルコリン、ホスホリルエタノール
アミン及びセリンエタノールアミンホスホリルジエステ
ルが好ましい。特に好ましい物質はグリセロール３−ホ
スホリル化合物であり、最も好ましい物質はグリセロー
ル３−ホスホリルコリンである。本発明の最も好ましい
極低温保護剤はホスホグリセリドの異化生成物の混合物
である。

ホスホグリセリドの異化生成物は大ていの組織で自然に
生成される。組織に自然に生ずる異化生成物の濃度は組
織の健康、生体材料中の組織の出所に依存して変化する
。これらの物質とその検出、体内での分布及び分析方法
はバラニイ（Ｂａｒａｎｙ）とグロネック（Ｇｌｏｎｅ
ｋ）による“Ｐ−３１ＮＭＲによる罹患状態の確認（Ｉ
ｄｅｎｔｉｆｌｃａｔｌｏｎ　ｏｆ　ｄｉｓｅａｓｅｄ
ｓｔａｔｅ　ｂｙ　Ｐ−３１ＮＭＲ）”、デイ、ゴーレ
ンシュタ・ｒン（Ｄ、　Ｇｏｒｅｎｓｔｅｉｎ）編集の
「リン−３１ＮＭＲ：原レス（ＡｃａｄｅＩＩＩｉｃ　
Ｐｒｅｓｓ）　、　１９８４．５１１〜５４５頁；５ｃ
ｉｅｎｃｅ）Ｊ、“結晶レンズ中のリン酸塩含有代謝産
物の分布（Ｄｌｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈｏｓ
ｐｈａｔｉｃｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　
ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ　１ｅｎｓ）”　２６巻。

５３７〜５４４頁、１９８５；ファーガソン（ｐｅｒｇ
ｕｓｏｎ）等のサイエンス（Ｓｃ１ｅｎｅｅ）　　“ｌ
・リパトゾーナ　ブルセイ変体表面蛋白質を膜に固定す
るグリコシルーホスファチジルイノシトール成分（Ｇｌ
ｙｃｏｓｙｌ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ　Ｉｎｏｓｉ
ｔｏｌ　Ｍｏ１ｅｔｙ　ｔｈａｔ　ａｎｃｈｏｒｓＴｒ
ｙｐａｎｏｓｏｎａ　Ｂｒｕｃｅｉ　Ｖａｒｉａｎｔ　
５ｕｒｆａｃｅ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｔｏ　ｔｈ
ｅ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ”　２３９巻、　７５３〜７５９
頁、　　１９８８年２月１２日号；ライアー（Ｒｌａｒ
）等、生殖と生殖不能（Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　
５ｔｅｒｉｌｉｔｙ）“哺乳動物精巣上体の生理学と生
化学の研究：精巣上体の生化学的組成、比較研究（Ｓｔ
ｕｄｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｈｙｓｌｏｌｏｇｙａｎｄ　
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｍａｍｍａｌｌａｎ
　ＥｐｉｄｌｄｙＩＩｌｉｓ：Ｂｌｏｃｈｅｍｌｃａｌ
　Ｃｏｍｐｏｓｌｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｐｉｄｉｄｙｍｌ
ｓ、　ＡＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　５ｔｕｄｙ）”２４
巻、５号、　８５５〜３６３頁。

１９７３年、５月及びコーエン（Ｃｏｈｅｎ）等、ノイ
ロケミカル　リサーチ（Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）“脳のＰ−３１核磁気共鳴分析：正
常酸素及び無酸素脳スライス（Ｐ−３１ｎｕｃｌｅａｒ
　Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｒｅ５ｏｎａｎｃｅＡｎａｌｙｓ
ｉｓ　ｏｆ　Ｂｒａｌｎ：　Ｎｏｒｍａｘｉｃ　ａｎｄ
　Ａｎｏｘｉｃ　ＢｒａｉｎＳｌｌｃｅｓ）　’　９巻
、６号、　７８５〜８０１頁、　１９８４において考察
されており、これらはホスホグリセリドの異化生成物、
それらの構造及びそれらの検出の開示に関して、参考文
献としてここに関係する。

正常な非極低温保存条件下で組織内に自然に生ずるホス
ホグリセリド異化生成物の濃度はかなり変化するが、こ
の濃度は組織の冷却、冷凍及び解凍を維持する濃度より
も低いと考えられる。従って、本発明によると、細胞材
料を本発明の方法によって冷凍するよりも実質的に前に
、ホスホグリセリド異化生成物の濃度は増加しなければ
ならない。一般に、細胞材料内のホスホグリセリドの異
化生成物の濃度は細胞材料内に通常台まれる母の少なく
とも２倍、好ましくは少なくとも１０倍である。この濃
度は細胞材料の全重量のＯＪ％から有害レベルまたは飽
和レベルまでの範囲内、好ましくは８．０％から飽和レ
ベルまでの範囲内で変化する。本発明の好ましい実施態
様では、細胞材料が異化生成物によって飽和されるまで
、異化生成物は細胞材料中に分散する。細胞材料を飽和
するために必要な異化生成物のこの濃度は冷凍すべき細
胞材料の性質に依存して変化する。

本発明の極低温保存溶液は被冷凍組織にとって有害でな
い、例えばｐＨ調節剤、緩衝剤、オスモル濃度調節剤及
び保存剤のような、他の成分を含む極低温保護剤の水溶
液である。使用する水溶液中の極低温保護剤は好ましく
は約１〜５００ｍＭ、特に好ましくは約１０〜１５ｍＭ
の範囲内である。この濃度は重要ではないが、この濃度
が大ていの細胞材料中へ極低温保護剤を分散させるため
に望ましい範囲であることが判明している。ｐＨ調節剤
は生理的に許容できるｐＨ６，５〜７．５を与えるため
に充分な量で溶液に加えられる。適当なｐＨ調節剤には
例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、塩酸、リン
酸、硫酸等がある。適当な緩衝剤には、例えば無機リン
酸塩、エチレンジアミン四酢酸、トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン、炭酸水素塩等がある。浸透性調節
剤は浸透性を約２００〜５００ｍｏｓｍ、／）ｃｇ、好
ましくは３００〜４００ｍｏｓｍ、／　ｋｇに維持する
ために充分な量に加えられる。適当なオスモル濃度調節
剤には例えばソルビン酸、塩化ベンズアルコニウム、エ
チレンジアミン四酢酸及びゲンタマイシンがある。

極低温保護剤は技術上記められた方法を用いて溶液から
細胞材料中に拡散する。ホストから細胞材料を摘出した
後に、極低温保護剤の上記水溶液中に細胞材料を浸せき
するという簡単な方法を実施する。細胞材料を極低温保
存溶液中に浸せきすると、充分に理解されない理由から
、細胞材料は溶液から選択的に極低温保護剤を吸収する
。これによって細胞材料内で極低温保護剤の濃縮が生ず
る。極低温保護剤の溶液への細胞材料の浸せき時間は被
保存細胞材料の性質に依存する。例えば、極低温保護剤
は角膜のような低密度材料中に迅速に拡散し、浸せき時
間はこのような材料に適した１分間〜１時間である。密
度の大きい材料には３時間以上までの長い時間が必要で
ある。

溶液への浸せきによる細胞材料への極低温保護剤の拡散
は、例えば角膜及び皮膚組織のような低密度材料に適し
ている。例えば心臓、腎臓、肝臓等の器官のような高密
度材料には、器官を通る血管から極低温保護剤を注入ま
たはボンピング（ｐｕｍｐｉｎｇ）　　（潅流）するこ
とによって細胞材料に極低温保護剤を拡散させることが
好ましい。

本発明の極低温保護剤は精液及び血液のような液体の極
低温保存にも適している。本発明のこの実施態様では、
濃縮形の適当壷の極低温保護剤を、液体中の最終濃度が
上記濃度範囲に入るように、保存液中に混合する。

細胞材料中に極低温保護剤が拡散した後に、細胞材料は
極低温保存できる状態になる。極低温保存を達成するた
めに、細胞材料の温度を好ましくは０℃以下に、特に０
℃〜−４０℃の範囲内の温度に低下させる。拡散した極
低温保護剤を含む細胞材料を約５分間〜２４時間までの
期間内に冷却する。

好ましくは、１〜５時間の期間にわたって細胞材料を徐
々に冷却する。室温の細胞材料を好ましい極低温保存温
度に予めセットした冷却室に入れることは、細胞材料を
好ましい貯蔵温度に徐々に冷却する満足すべき手段であ
る。

本発明の溶液は動物及び植物の両方の細胞材料の極低温
保存に適している。この溶液は角膜；心臓、血液及び血
管のような心血管系の組織；肺組織のような呼吸系の組
織；肝臓及び膵臓組織のような消化器系の組織；腎臓の
組織のような泌尿管の組織；神経組織；例えば鍵のよう
な筋骨格系の組織；及び胎児組織の極低温保存に特に有
用である。植物型材料の例には例えば球根、塊茎、根茎
、植物の胚がある。

次の例を参照することによって、本発明はさらにより良
く理解されるであろう。

例１ この例のために下記方法を用いてホスト動物から角膜を
摘出した。

ベンドパルビタール・ナトリウムの筋肉内致死量をネコ
に投与し、その眼を迅速に摘出した。眼球を無菌ガーゼ
内に固定し、検査して、角膜が無傷の上皮と最小のデス
メーヒダ（Ｄｅｓｍｅｔ’ｓ　ｆｏｌｄｓ）を有し、滴
（ｇｕｔｔａｔａ）を有さないことを確認した。

摘出中には、上皮の損傷または接触を避けるために、特
に注意した。冬眠の縁から１　ｍｍのところの強膜溝切
開をバード　パーカー（Ｂｉｒｄ　Ｐａｒｋｅｒ）＃１
５メスブレードによって、周囲を拡げた。この切開の３
ｍｍ部分にわたって、下部のブドウ膜組織がナックルと
して見えるような深さにした。この時点で、わん曲した
角膜鋏を用いて、損傷を避けて眼のブドウ膜のところま
で前眼房が維持されるように鋏を入れて、角膜を摘出し
た。摘出中は、過度の角膜屈曲と虹彩の角膜上皮との接
触を阻止するように注意した。強膜環が付着した角膜を
次に標準的なアイバンク検査室のプラットホーム上に内
皮側を上方にして、保存液に入れて置いた。

上記のように摘出した１才のネコの角膜２個をＮＭＲサ
ンプル管に入れたマクキャリー−カウフマン（Ｍｃｋａ
ｒｙ　Ｋａｕｆｍａｎ）組織培養保存液（ｐＨ７，４と
浸透性３２０±５ｍｏｓｍ、／ｋｇを有する標準アイバ
ンク保存液−以下ではＭ−に保存液）中に入れた。大量
のグリセロール３−ホスホリルコリン（ＧＰＣ）をＧ　
Ｐ　Ｃ３０ｍＭのＭ−に溶液を形成するために充分な量
でＭ−に保存液に加えた。インキュベーション期間中の
生体外角膜のｐＨ測定を可能にするために、ＧＰＣを加
えた。角膜を室温の保存液中に１時間保存し、その後に
角膜を標準Ｍ−に保存液中で数回すすぎ洗いして、ＧＰ
Ｃを除去した。角膜に対してＰ−３１ＮＭＲ分析を実施
し、ＧＰＣとＰ１シグナルの両方を記録した。

ＧＰＣ（ｐＨ感受性）磁気共鳴シグナルに比べたＰｉ（
ｐＨ感受性）磁気共鳴シグナルのシフト度が公知の確立
された方法（ブラニイとグロネック。

１９８４）によってｐＨ測定を可能にし、ｐＨ７，２に
おいて安定であることが判明した。角膜から発するＧＰ
Ｃシグナル強度はインキュベーション期間の結果として
、検出可能なリン全体の３０〜４０％に増加した。実験
は１０回くり返した。角膜を試験保存液から取出した後
、この保存液のみに対してＰ−３１ＮＭＲを実施し、こ
の保存液に最初に加えた３ｈ＋Ｍ　　Ｇ　Ｐ　Ｃは角膜
内に濃縮されるので、保存液中には殆んどまたは全＜Ｇ
ＰＣが存在しないことが判明した。角膜は透明な状態で
あり、角膜中のＧＰＣシグナルは大きく増加した。角膜
によって吸収されるＧＰＣｆｆｌと極低温保存液中に残
留するＧＰＣｆｆｉはインキュベーション時間、角膜の
大きさ及び保存液の量に依存する。

例２ 生後６か月のニューシーラント白ウサギ４匹の角膜を例
１に述べた標準的な方法を用いて摘出した。各対の１つ
を対照のに一８ｏｉ１組織培養保存液ＣｐＨ１，４と浸
透性３２０±５ｍｏｓ１１．／ｋｇを有する標準的な先
行技術アイバンク保存液）中に浸せきし、反対側の角膜
を３０ｍＭ濃度のＧＰＣを含むに一８ｏＮ保存液に浸せ
きした。各角膜を標準的なアイバンク保存容器に入れて
保存した。

対照に一３ｏｆｆ液中の角膜は４℃で冷却したが、ＧＰ
Ｃを含む試験に一８ｏｎ液中の角膜は約−２０℃で冷凍
した。冷凍は６週間続け、その後に透明な保存容器を通
しての角膜の検査は一２０℃の温度において保存液が凍
結することを示した。角膜の加温は貯蔵室を冷凍庫から
取り出し、それらを室温に２時間放置することによって
実施した。

ＧＰＣを含む冷凍に一５ｏｎ保存液中に入れた角膜は透
明であったが、対照の角膜は透明性を失ったことが認め
られた。透明性は１〜５のスケールで評価し、１は透明
、２は痕跡程度のくもりあり、３は軽度のくもり、４は
中等度のくもり、５は重度なくもりとした。室温におけ
る２時間後に、全ての角膜を新しいに一８ｏ、Ｑ保存液
と共に貯蔵室におだやかに移し入れた。次に角膜を標準
的なルーチンの固定法、包理法及び染色法を用いて、光
学顕微鏡及び透過電子顕微鏡によって調べた。

光学顕微鏡と透過顕微鏡によると、試験角膜と対照角膜
との間に差はなく、このことは試験角膜が対照に比べて
保存が改良されることを示唆する。

試験角膜が室温において５時間透明であったが、特別な
顕微鏡分析と酸化還元蛍光分析とを実施した。鏡検のた
めに、ゲルタールアルデヒド固定液中に固定した後にも
、試験角膜が透明であり、対照角膜が透明性を失ったこ
とは容易に明らかになった。結果は次の第１表に示す。

へ　苫 拠″′″　（へ）ゞ　いゝ　０ゝ 例３ 上記例をウサギ４匹（角膜４対、８個）を用いてくり返
した。この場合にも、試験溶液（３０ｍＭＧＰＣ含有Ｋ
　−８ｏρ）で処理した角膜は対照よりも低温（−１０
℃）であった。この温度において３週間凍結が生じなか
ったが、４週間目に４角膜の中の２個を含む保存液は低
温（−１０℃）において凍結した。これらの角膜は１週
間毎の検査を妨げられたので、過冷却した保存液の物理
的な妨害が保存液の結晶化を生じたと考えられる。試験
的なＧＰＣ含有に一８ｏΩの凝固点降下が凝固点降下の
みに関する公知の化学的理論によって完全には解明され
ないことに留意すべきである。ＧＰＣはこの異常な観察
の原因であると考えられる。４週間後に、角膜を冷凍庫
から取出し、１時間室温に放置した。室温に１時間放置
した後、試験角膜と対照角膜の両方を新鮮な標準に一３
ｏＮ保存液含有貯蔵室に移し入れた。上記例２に述べた
同じスケールを用いて、透明性に関して評価した。結果
を次の表に示す。

寸 誕　の　１　喰 亥 試験角膜４における若干のストローマくもり（Ｓｔｒｏ
ｍａｌ　ｈａｚｅ）　　（最小）を例外として、試験溶
液からの角膜に角膜くもりが認められた場合には、透明
性の損失は上皮（移植後にホストによって取り替えられ
る角膜の一部）に限定されるように思われる。

例４ に−８ｏ１保存液の凍結を防止するために一４℃〜−８
℃の循環範囲に温度を調節した以外は、対照サンプルと
試験サンプルの両方に対して例３の方法をくり返した。

さらに、角膜を加温する前に１か月間冷凍条件下に保存
した。対照溶液と試験溶液の両方に対して室温にまで加
温した後に角膜の顕微鏡写真を作成した。これらの顕微
鏡写真を対照については第１図として、試験溶液につい
ては第２図として示す。

第１図の左上部には、白色の強膜リムを有する対照角膜
含有アイバンク貯蔵室を示す。この角膜は内皮凹面が上
方になるように置かれる。下方の支持ポストの透明性の
減小から明らかなように、角膜透明度の低下を示す。こ
の図面の右上部の顕微鏡写真は角膜上皮と前方ストロー
マの光学顕微鏡写真である。上皮は浮腫性である。上皮
面は不均一である。表在扁平上皮細胞は散漫に分離して
いる。細胞外空間と中間細胞層での細胞膨潤が増加する
。基底層は細胞変性の証拠を示す。下部のストローマ線
維は緻密である。第１図の下部はデスメー膜と下部の内
皮との透過顕微鏡写真である。

内皮細胞層は浮腫性である。核は強度に変形している。

細胞質は大きな基礎液胞を有し、細胞質が減小している
。内皮細胞の基底細胞縁とデスメー膜との間には大きな
細胞間隙が存在する。

第２図の左上部には、白色強膜リムを有する試験角膜含
有アイバンク貯蔵室を示す。この場合にも、角膜は内皮
凹面が上になるように置かれている。この角膜では、角
膜透明度が維持され、このことは下部の貯蔵室支持ポス
トの透明性から明らかである。図面の右上部の顕微鏡写
真は角膜上皮と前方ストローマの光学顕微鏡写真である
。上皮面は一般に均一である。表在上皮の扁平上皮細胞
は完全である。中間上皮細胞層には、細胞膨潤によって
認められるように、中間上皮細胞層には比較的軽度な浮
腫が存在する。基底層は完全である。

下部ストローマ線維は緻密である。第２図の下部はデス
メー膜と下部の内皮の透過顕微鏡写真である。内皮細胞
は細胞内液胞を殆んど有さず、細胞質損失が最小である
。

例５ ウサギ４匹（角膜４対、８個）を用いて、上記例３をく
り返した。この場合にも試験溶液（３０ｍＭＧＰＣ含有
に一８ｏＲ）処理角膜は一４℃〜−８℃の範囲内の低温
であった。試験角膜と対照角膜の両方は同じ温度であっ
た。この温度において保存液凍結は２週間生じないこと
が観察された。角膜組織の摘出時に、角膜と同じ条件下
で冷却した肝臓と腎臓の一方からサンプルを摘出した。

各動物から２つのサンプルを採取し、１つを対照用に他
方を試験用に用いた。２週間後に、角膜を冷凍庫から取
出し、室温に１時間放置した。室温に１時間放置した後
に、試験角膜と対照角膜の両方を新鮮な標準に一８ｏρ
保存液含有貯蔵室に移し入れた。角膜の透明度を上記例
２で述べた同じスケールを用いて評価した。この結果は
例２で報告した結果に相似した。顕微鏡写真を作成し、
角膜を光学顕微鏡用と透過顕微鏡用に角膜を固定した。

結果は上記例４において対照角膜と試験角膜に対して得
られ、それぞれ第１図と第２図に示した結果と同じであ
った。

肝臓と腎臓の組織の顕微鏡写真を作成した。これらの顕
微鏡写真は第３図及び第４図として示すが、第３図は先
行技術の極低温保護剤（対照）を用いて冷却し加温した
ウサギ肝臓（上部）と腎臓（下部）の切片の光学顕微鏡
写真の組合せであり、第４図は本発明の極低温保護剤（
試験）を用いて冷却し加温したウサギ肝臓（上部）と腎
臓（下部）の切片の顕微鏡写真の組合せである。光学顕
微鏡写真から明らかであるように、胚組織の場合には、
対照サンプルに比べて試験サンプルでは明らかに液胞が
少なく、一般に細胞損傷が少ない。腎組織の場合には、
対照サンプルに比べて試験サンプルでは一般に細管の破
壊が少なく、液胞が少なく、細胞損傷が少ない。結論と
して、角膜、肝臓及び腎臓組織を含めた試験サンプルと
対照サンプルとの間には明白な差があり、対照の非ＧＰ
Ｃ処理群の場合には明白により病的な状態が存在した。

例６ 生後６か月のニューシーラント白ウサギ５匹（角膜５対
、１０個）を用いて、上記例３をくり返した。

５対の角膜の各々に対して、１つの角膜は対照のに一８
ｏΩ保存液に浸せきし、他方の角膜は３０ｍＭ濃度のＧ
ＰＣ含有に一８ｏΩ保存液中に浸せきした。標準アイバ
ンク貯蔵容器に保存した各角膜を写真撮影し、サンプル
をおだやかに撹拌しながら室温に４時間保持した後、３
対の対照角膜と試験角膜をそれらの保存液から取出し、
液体窒素中で冷凍した。他の２対の対照角膜と試験角膜
は、それらの保存液に入れて、−２０℃に維持した冷凍
庫の温度調整フリーザーコンパートメント内で冷凍した
。液体窒素中で冷凍した角膜の場合には、液体窒素冷却
ステンレス鋼浴中に液体窒素含有ポリアロマ−管に入れ
て５分間保持し、その後これらを対照保存液または試験
保存液中に再浸せきし、４℃の温度で解凍させた。保存
液中で２４時間冷凍させた角膜対の場合には、凍結した
保存液を標準アイバンク室内で解凍させた。液体窒素冷
凍した組織とフリーザー冷凍した組織の両方に対する解
凍プロセスは２４時間にわたって実施し、その後に材料
を２時間にわたって室温にまで緩め、透明度を写真術的
に評価した。

透明度は１〜５スケールに等級化し、１は透明、２は痕
跡程度のくもり、３は軽度なくもり、４は中等度のくも
り、５は重度なくもりであり、盲検において３人の試験
官が判定した。結果は５対全ての角膜に関して例３に匹
敵した。写真撮影後に、全ての角膜を光学顕微鏡検査及
び透過顕微鏡検査用に調製した。冷凍保存液中で凍結し
た角膜は例４及び第１図と第２図に報告した結果に相似
した光学及び電子顕微鏡検査結果を示した。液体窒素処
理角膜対の透過電子顕微鏡検査から得た観察は次に述べ
る： 対照（非処理）サンプル（３角膜）の角膜上皮は破裂し
た表面微小突起と角膜表面からはく離した細胞とを示し
た（第５固在部分）が、試験（ＰＭ処理）サンプル（３
角膜）の角膜上皮は正常な微小突起を有する完全な表面
を示した（第６固在部分）。対照（非処理）サンプルで
は、液胞形成、電子密度低下及び細胞質低下が大ていの
表布細胞と下部の扁平上皮細胞とを特徴づけたが（第５
図の左部分）、試験サンプルでは表布細胞の液胞形成は
最小であった（第６図の左部分）。

一般に、試験サンプルの上皮は上皮が良好に保存されて
いることを示す比較的均一な電子密度を有した（第６図
の左部分）。深部翼状細胞と基底細胞は無傷であり、対
照サンプル（第５図の左部分）と試験サンプル（第６図
の左部分）の両方において正常範囲内であるよう・に思
われた。上皮基底膜は対照サンプル（第５図の左部分）
と試験サンプル（第６図の左部分）において無傷であっ
た。

角膜ストローマは対照サンプル（第５図の左部分）と試
験サンプル（第６図の左部分）の両方において正常範囲
内であるように思われた。

４対照（非処理）サンプルの１つのみが完全な内皮を示
し、対照サンプルの１つは内皮の１００％欠損を実際に
示したが、試験（ＰＭ処理）角膜の内皮は４サンプルの
全てにおいて完全であった。

対照（非処理）角膜には無数の大きい細胞質液胞が存在
した（第５図の右部分）、これに反して、試験サンプル
の内皮は液胞形成を殆んど示さなかった（第６図の右部
分）。対照角膜の場合には、核質（ｎｕｃｌｅｏｐＨａ
ｓｍ）が殆んど完全に消失した核が無数に存在したが（
第５図の右部分）、試験角膜の場合には多くの核が充分
な電子密度を有する核質を示した（第６図の右部分）。

【図面の簡単な説明】

第１図は先行技術の極低温保護剤を用いて冷却し、加温
した角膜についての、図面左上部の角膜のバイオ顕微鏡
写真、図面右手上方コーナーの角膜断面の光学顕微鏡写
真、及び図面下部の角膜の電子顕微鏡写真から成る顕微
鏡写真の組合せであり； 下記の例４で得られた結果を説明する；第２図は本発明
の極低温保護剤を用いて冷却し、加温した角膜の第１図
と同様にして作成し、配置した顕微鏡写真の組合せであ
り、下記の例４で得られた結果を説明する； 第３図は先行技術の極低温保護剤を用いて冷却し加温し
たウサギ肝臓（上部）及び腎臓（下部）実質部切片の光
学顕微鏡写真の組合せであり；第４図は本発明の極低温
保護剤を用いて冷却し加温したウサギ肝臓（上部）及び
腎臓（下部）実質部切片の光学顕微鏡写真の組合せであ
り；第５図は先行技術の方法によって、液体窒素中で冷
凍して解凍した角膜の電子顕微鏡写真の組合せであり； 第６図は本発明の極低温保護剤を用いて、液体窒素中で
冷凍して解凍した角膜の電子顕微鏡写真（外４名） 図面の浄書（内容に変更なし） 第／　図 第２ｒ：！Ｊ 秦３ 堤、乙、　ズ 芽、、乙 尾４ フ １、事件の表示 平成１年特許願第２０２６８６号 ２、発明の名称 組織の極低温保存方法とそのための組成物補正をする者 り［件との関係　　特許出願人 住所 氏　名　　ジャック令ブイ・ブレイナー（外１名） ４、代理人 住所 東京都千代田区大手町二丁目２番１号 新大手町ビル　２０６区 出願人の欄を正確に記載した願書

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、脂肪酸残基を有さないホスホグリセリドのホスホモ
   ノエステルまたはホスホジエステル異化生成物の化学組
   成を有する極低温保護剤を生物学的細胞材料中に通常存
   在する濃度の少なくとも２倍の濃度で分散させた生物学
   的細胞材料。 ２、極低温保護剤がホスホグリセリドのホスホモノエス
   テル及びホスホジエステル異化生成物から成る群から選
   択した１種類以上の要素の混合物である請求項１記載の
   細胞材料。 ３、そのホストから摘出した請求項１記載の細胞材料。 ４、極低温保護剤が少なくとも１種類のグリセロールホ
   スホリルエステルを含む請求項１記載の細胞材料。 ５、極低温保護剤をグリセロールホスホリルコリン、グ
   リセロールホスホリルエタノールアミン、グリセロール
   ホスホリルセリン、グリセロールホスホリルグリセロー
   ル、グリセロールホスホリルイノシトール、ホスホリル
   グリセロール、ホスホリルコリン、ホスホリルエタノー
   ルアミン及びセリンエタノールアミンホスホリルジエス
   テルから成る群から選択する請求項１記載の細胞材料。 ６、極低温保護剤がグリセロールホスホリルコリンであ
   る請求項４記載の細胞材料。 ７、極低温保護剤がグリセロールホスホリルエタノール
   アミンである請求項４記載の細胞材料。 ８、細胞材料内の極低温保護剤の濃度が細胞材料の全重
   量を基準として少なくとも０．３重量％である請求項１
   記載の細胞材料。 ９、０℃を超えない温度を有する請求項１記載の細胞材
   料。 １０、植物起源である請求項１記載の細胞材料。 １１、動物起源である請求項１記載の細胞材料。 １２、角膜、血液、心血管系組織、呼吸器系組織、消化
   器系組織、尿路組織、神経組織、筋骨格系組織及び胚組
   織から成る群から選択した請求項１１記載の細胞材料。 １３、皮膚である請求項１記載の細胞材料。 １４、角膜である請求項１記載の細胞材料。 １５、血液である請求項１記載の細胞材料。 １６、精液である請求項１記載の細胞材料。 １７、脂肪酸残基を含まないホスホグリセリドのホスホ
   モノエステルまたはホスホジエステル異化生成物の化学
   組成物を有する極低温保護剤を、生物学的細胞材料中に
   通常存在する異化生成物の濃度の少なくとも２倍の濃度
   で前記細胞材料中に拡散させ、細胞材料の温度を貯蔵温
   度に低下させることから成る生物学的材料を保護する方
   法。 １８、極低温保護剤がホスホグリセリドのホスホモノエ
   ステル及びホスホジエステル異化生成物から成る群から
   選択した少なくとも１種類の要素の混合物である請求項
   １７記載の方法。 １９、生物学的細胞材料をそのホストから分離する請求
   項１７記載の方法。 ２０、極低温保護剤が少なくとも１種類のグリセロール
   ホスホリルエステルを含む請求項１７記載の方法。 ２１、貯蔵温度が０℃を超えない請求項２０記載の方法
   。 ２２、極低温保護剤をグリセロールホスホリルコリン、
   グリセロールホスホリルエタノールアミン、グリセロー
   ルホスホリルセリン、グリセロールホスホリルグリセロ
   ール、グリセロールホスホリルイノシトール、ホスホリ
   ルグリセロール、ホスホリルコリン、ホスホリルエタノ
   ールアミン及びセリンエタノールアミンホスホリルジエ
   ステルから成る群から選択する請求項２０記載の方法。 ２３、極低温保護剤がグリセロールホスホリルコリンで
   ある請求項２２記載の方法。 ２４、極低温保護剤がグリセロールホスホリルエタノー
   ルアミンである請求項２２記載の方法。 ２５、溶液中の極低温保護剤の濃度が１〜５００ｍＭの
   範囲内で変化する請求項２０記載の方法。 ２６、貯蔵温度を−４℃未満に低下させる請求項２１記
   載の方法。 ２７、細胞材料が植物である請求項１７記載の方法。 ２８、細胞材料が動物である請求項１７記載の方法。 ２９、脂肪酸残基を含まないホスホグリセリドのホスホ
   モノエステルまたはホスホジエステル異化生成物の化学
   的組成を有する極低温保護剤を１〜５００ｍＭの範囲内
   の濃度で含む水性溶液からなり、生理的ｐＨに維持され
   る極低温保存用溶液。 ３０、極低温保護剤がホスホグリセリドのホスホモノエ
   ステル及びホスホジエステル異化生成物から成る群から
   選択した１種類以上の要素の混合物である請求項２９記
   載の極低温保存用溶液。 ３１、異化生成物の濃度が１０〜５０ｍＭの範囲内であ
   る請求項２９記載の極低温保存用溶液。 ３２、約２００〜約５００ｍｏｓｍ．／ｋｇのオスモル
   濃度を溶液に与えるために充分な量のオスモル濃度調節
   剤を含む請求項３２記載の極低温保存用溶液。 ３３、オスモル濃度調節剤が約３００〜４００ｍｏｓｍ
   ．／ｋｇのオスモル濃度を溶液に与えるために充分な量
   で存在する請求項３２記載の極低温保存用溶液。 ３４、オスモル濃度調節剤がグルコースである請求項３
   ２記載の極低温保存用溶液。 ３５、ｐＨ調節剤を含む請求項２９記載の極低温保存用
   溶液。 ３６、ｐＨ調節剤が６．５〜７．５の範囲内のｐＨを与
   える請求項２９記載の極低温保存用溶液。