JPH02187657A - キャピラリ分離分析用試薬混合装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は化学分析方法に関するものであり、さらに具体
的には、試料の成分をキャピラリに通して差動的動電学
的（ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ）移動により分離す
る分析装置に関する。本発明の主な目的は分離した後の
試料を別の液体と混合して分離した試料の成分の同定と
定量化を助けることである。

具体例では、蛍光検出に先立って分離したタンパク質成
分に蛍光性を付する（ラベリングする）試薬を分離後に
添加している。

〔従来技術およびその問題点〕

複合有機構造の化学分析のおかげで、生物工学（バイオ
テクノロジ）は注目すべき進歩を遂げた。

生物工学では天然の資源にたよっていたのでは不足して
しまうような生命を維持する薬やその他の製品を製造す
る技術を提供してきた。さらに、全く新しい薬が開発さ
乳、これまで処置できなかった病気を見つけ治すことが
できる。生物工学では、世界の増大する人口を養い、飢
護の傾向がある国々の能力をたかめてその国の自給をう
ながすような農業用の新製品を約束している。

一般に、生物学的試料の化学分析では試料を成分（ｃｏ
ｍｐｏｎｅｎ　ｔ）に分離して同定、及び定量化を行う
。キャピラリ・ゾーン電気泳動（ＣＺＥ）は、様々の異
った成分を各々異なった速度でキャピラリの中を移動さ
せ、各々の成分を別々の区域（ゾーン）へ分ける諸方法
の中の一つである。区別されたゾーン・キャピラリの内
側で、あるいはキャピラリの外側で、キャピラリから各
成分が順次比て来るようにすることにより、調べること
ができる。

キャピラリ・ゾーン電気泳動では、試料が長いキャピラ
リの供給口から導入され、出口の方へ移動する。キャピ
ラリの供給口と出口にある電位の違う電極によって電気
力が生じ、試料の成分をキャピラリの出口の方へ移動さ
せる。この動きには２つの別々の成分があり、一つは電
気浸透性の流れ（フロー）によるものであり、もう−っ
は電気泳動性の移動（マイグレーション）によるもので
ある。

電気浸透性の流れはキャピラリの中を満たしている電解
質溶液からの陰イオンを優先的に吸着することによりキ
ャピラリの表面に電荷が蓄積するために生じる。この陰
イオンの負の電荷は、可動性の正の電荷の電解質イオン
から成る薄い層を引きつけ、その層の内面に蓄積する。

電極によりキャピラリの両端部の間に印加された縦方向
に伸びる電界はこれら正のイオンを引きつけ、その結果
これらのイオンはキャピラリの出口にある負の電極の方
へ移動する。これらの正のイオンは水で水和され、粘着
性によりこの内壁の近くにない他の水和分子も引きつけ
、中性または負の正味電荷を有する分子さえも引きつけ
る。その結果、試料とそれを含有する電解質溶液から成
る大きな流れがキャピラリの出口へと移動することにな
る。従って、電気浸透性の流れは中性及び負の帯電した
分子及び正の帯電した分子も負の電極の方へ移動すると
いうメカニズムを提供する。主にキャピラリ・ゾーン電
気泳動のキャピラリは２００μｍ未満、好ましくは１０
０μｍ未満の口径を有するので、外側の分子は内側の分
子と充分に相互作用し、毛管の横断面を見るとかなり均
一な電気浸透性の流れを生じている。

この電気浸透性の流水の上に重ねられているのが、電気
泳動性移動と一般に呼ばれる電界に反応した帯電粒子の
周知の動きである。電解質溶液は電界が毛管の中を通っ
て電極の間に伸びるための媒体として働いている。正の
帯電分子は電気浸透性の流れによる平均流速より速く負
の電極の方へ移動する。負の帯電分子は負の電極に押し
返されるが、この反発作用は電気浸透性流によってむし
ろ相殺されてしまう。従って、負の帯電試料分子も負の
電極の方へと性の帯電分子よりは遅い速度ではあるが進
んでいく。□中性分子は電気浸透性流による中程度の速
度で負の電極へと移動する。

分離（セパレーション）キャピラリの中をかなり長い間
移動した後に試料を構成する各種の成分は種特異性（ｓ
ｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）電荷の機能として起
こる差動速度により帯（バンド）またはゾーンに分離す
る。適当に選ばれて配置された検出器により上記ゾーン
はその前を通過するときに検出される。成分は検出時刻
によって同定され、対応する検出ピークの高さ及び／ま
たは面積によって定量化される。別個の固定法及び／ま
たは定量化の方法のために別々の容器に前記バンドを集
める場合もある。

キャピラリ分離方法でタンパク質を検出するために数種
類の検出器が使用されている。紫外線吸収検出器が最も
一般的である。その他の電磁吸収検出器も使用できる。

さらに、化学ルミネセンス検出器、屈折率検出器、伝導
率検出器も使用されてきた。以上の方法は全てキャピラ
リ・ゾーン電気泳動タンパク質分析における多数のピー
クを検出するのに必要とされる感度に欠けている。全試
料の量は限られているので高い感度が要求され、検出器
は全試料のうちのほんの少しから成っている成分を検出
できなければならない。試料の量が限定されているのは
、試料は電解質に溶解されなければならないし、試料の
濃度は分離された成分ゾーンのゆがみを生じる電界の変
動を避けるように充分低くなければならないからである
。

試料の量はさらにキャピラリの口径や試料の初期の量を
かなり少な目に限定する必要性などによって限定される
。試料の初期の量によってゾーンの最小の幅が定められ
、従って、充填された試料の成分を分析する系の能力も
定められる。

検出器は各試料ゾーンの少量の成分を検出できなければ
ならない。紫外線検出装置は低濃度及び照明路の長さが
非常に短いという欠点があり、主として信号対ノイズの
比が悪い。他の検出方法も同様に限定がある。従って、
キャピラリ・ゾーン電気泳動はタンパク質成分の分離に
は効果的であるが、分離された成分を同定し定量化する
ための充分感度のよい検出器を見出すのには限度がある
。

蛍光検出が一種の二者択一の成分分離法である液体クロ
マトグラフィ（ＬＣ）と組合わせて使用されてきた。液
体クロマトグラフィでは、液体旬動相が可動相と固定相
との間で成分を分配するのに必要な各速度で各成分を毛
管の中を通って導いていく。従って、ゾーンが分配比の
機能として形成されている。このゾーンに光が照射され
、得られた蛍光が検出される。小数のタンパク質は本来
備わっている蛍光を使って充分検出される。しがし、タ
ンパク質の蛍光を増強するために標識付は試薬を使用で
きる。蛍光検出を利用する主な利点は、少量の試料に必
要とされる感度の増大が非常に強い照射を使用すること
によって達成されることにある。従って、標識付は試薬
を使う蛍光検出は試料の成分を同定し定量化する能力を
増大することができる。

残念ながら、液体クロマトグラフィはタンパク質の高分
解能の分離（ｈｉｇｈ　ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　５ｅｐ
ａｒａｔｉｏｎ）に余り適していない。分配比は成分ご
とに違うが、どんな成分の分子も一定の時刻に可動相と
固定相に分けられ、相互に異った速度で移動していく。

キャピラリの全長にわたって効果を平均化しているにも
かかわらず、充分なゾーンの拡大が分配によって生じ、
タンパク質成分の高分解能分離を防げる。ゾーン拡大の
唯一の原因は縦方向の拡散にあるので、キャピラリ・ゾ
ーン電気泳動は液体クロマトグラフィよりもゾーン幅限
定分析が約１０倍も改良されている。

様々な理由により、タンパク質の蛍光検出は、キュピラ
リ・ゾーン電気泳動と共に利用されていない。液体クロ
マトグラフィのようにタンパク質に本来備わっている蛍
光を利用することは一般的に考えられない。蛍光標識付
は薬剤はいくつかの理由でキャピラリ・ゾーン電気泳動
と両立しない。

例えば、タンパク質成分を前もって分離標識付けすると
同じ種類の分子が異った電荷を有するようになる。従っ
て、一つの成分が多数のピークに分離し、検出が全く読
み取れなくなる。さらに、各ピークがほんのわずかな各
試料成分だけを示すのであるから、感度の問題も悪化し
ている。

分離後の標識付けでは、分離の後、検出の前に蛍光標識
付は試薬を添加することになる。分離後の混合について
は、Ｖａｎ　Ｖｌｉｅｔ　　ｒレーザーによって生じた
蛍光を利用する開口管形液体クロマトグラフィ用カラム
後の反応検出」、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィ
（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｙ
）　、３６３巻、１８７−１９８頁、１９８６年版の記
事に記載されている。この記事には分離キャピラリの水
流に試薬を導入するためにＹ形連結器を使用することが
書かれている。Ｙ形連結器を使用する場合の問題は流れ
が斜角に合流すると必然的に乱れることである。この乱
流が試料の流れを撹拌し成分ゾーンの幅を非常に拡大す
る。このゾーンの拡大は低分解能系では許されても、高
度分解能キャピラリ・ゾーン電気泳動系では許されない
。

分離後の混合については、Ｗｅｂｅｒ他著、「キャピラ
リ液体クロマトグラフィを使ったペルオキシオキサレー
ト・化学ルミネセンス検出」、アナリティカル・ケミス
トリイ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
、５９巻、１４５２−１４５７頁、１９８７年にも記載
されている。

この記事には、混合（ミキシング）キャピラリの内側ま
でシリカ粒子の詰った液体クロマトグラフィから出た分
離された試料成分を運ぶためにテフロン製の管を使用す
ることが記載されている。テフロン製の管と混合キャピ
ラリの間にある環状のすき間は直径の小さい（０，２ｍ
ｍ）テフロン製の管から直径（０，６３ｍ）の混合キャ
ピラリへ移動する試料と同時に化学ルミネセンス試薬を
導入するのに使用される。　（ただし、化学ルミネセン
スはタンパク質成分の検出に使用出来ない。）試薬の流
れは試料を閉じ込めて鞘状に包み込むような流れとなる
ように速いので、乱流を最小限定にくいとめる。しかし
、この鞘状の流れに関する問題は混合がゆっくりと起こ
ることである。化学ルミネセンス試薬と試料成分を充分
混合するためには、かなり長い時間が必要であるし、ま
たその混合する量も大きくなるので、その間にゾーンが
拡大してゆくが、分解能に特に重大な損害はない。しか
し、このゾーンの拡大はすでに開示された比較的低分解
能の液体クロマトグラフィ系では許されるが、高分解能
のキャピラリ・ゾーン電気泳動系ではその利点を否定す
ることになる。

従って、高分解システムに分離後に蛍光標識付けをする
ことに対する障害となっているものは、急速だが乱流の
少なくて容量も少なくてすむ試薬と試料の混合の達成で
ある。しかし、キャピラリ・ゾーン電気泳動及び他の動
電学的分離方法には別の障害があり、それは蛍光標識付
は試薬や他の流体を分離後に導入することである。流体
を導入するには一般に入口が必要であるし、試料の通路
を限定するキャピラリ壁の中で他の物質と同質でないこ
とが必要である。キャピラリ・ゾーン電気泳動分離シス
テムにおいては、上記の同質でないことにより電気浸透
性及び他の動電性効果を防げる電界の変動が生じる。少
なくとも上記電界の変動はゾーンを拡大するが、部分的
に、あるいは完全に試料成分の動電性の動きを損うこと
にさえなる。

結局のところ、キャピラリ・ゾーン電気泳動は、複合タ
ンパク質の分析に必要とされる分解能は提供するものの
、それに適合する充分な感度を有する検出技術がなかっ
たのである。蛍光検出では望ましいレベルの感度を提供
するが、必要とされる標識付けがこれまでのキャピラリ
・ゾーン電気泳動環境では行えなかった。キャピラリ・
ゾーン電気泳動の分解能力と蛍光標識付はタンパク質で
得られる検出感度を結合したシステムが必要とされてい
た。

〔解決しようとする問題点および解決手段〕基本的に本
発明は分離後の試料の流れの中に混合流体を導入できる
方法を提供する。この流体導入を可能にする接合部の結
合構造及び寸法は動電効果がなるべく損なわれないよう
に選ばれる。事実、試料と混合流体の拡散混合を容易に
すると同時にゾーンの拡大（ｂｒｏａｄｅｎｉｎｇ）を
最小に保つために電界が使われる。従って、本発明はキ
ャピラリ・ゾーン電気泳動分離の分解能と蛍光検出の検
出感度とを効果的に結合したものを提供する。

好ましくは、動電性分離キャピラリの放出流端部を混合
キャピラリに差し込み、重なり合う領域ができるように
する。分離キャピラリの外面と内面の間にある環状のす
き間は蛍光標識付は試薬または他の検出流体を導入する
ポートとなる。分離キャピラリ及び混合キャピラリに関
して電界が正の電極から分離キャピラリの穴を通って環
状のギャップの半径を横切って、次に混合キャピラリの
穴を通って負の電極へ伸びるように電極を並べる。

環状のギャップは電界がギャップによって実質的に損わ
れないように半径を充分小さくする。従って、分離キャ
ピラリの流れの中の帯電した分子は電界に沿って環状の
ギャップを横切り、混合流体の流れを横切って導かれる
。従って、電界は放出流と混合流体の拡散混合を容易に
する作用をする。

故に混合が急速に行われ、乱流を最小限におさえ、ゾー
ンを有意に拡大することなく検出を増大する。

充分に急速に拡散混合するのに必要とされる分離キャピ
ラリ及び混合キャピラリの直径はアインシュタインによ
る拡散の方程式、Ｔ＝　（２Ｄｔ）　””により実際に
限定される。混合キャピラリの混合セクションの内径は
２００μｍ以下にし、分離キャピラリの最高の内径は１
００μｍ以下にすべきであり、その結果、混合時間は各
々約１秒間に限定される。

上記両キャピラリの内径は比較的類似しているのが好ま
しい。この場合、重なり合う領域の分離キャピラリの壁
は対応して薄くする必要がある。このように薄い壁はキ
ャピラリを化学的にエツチングして所望の程度に薄くす
ることができる。

ここで第一に重要なことは、混合流体が蛍光標識付は試
薬であるということである。本発明では、この蛍光試薬
を試料の流れと素早く混合でき、ピークの幅の拡大を最
小に抑えることができる。分離キャピラリの直径が非常
に狭いことにより試料づ狐 の量が少ない点は楼力な照射を行っ−で蛍光を補うこと
ができる。従って、分解と感度との相反する問題は極め
て大幅に解決された。本発明の利舎は以下図面を参照し
て行われる説明から明ら力弓こされる。

〔実施例〕

キャピラリ・ゾーン電気泳動システム１００は、高電圧
源１０２、第一電圧電極１０４、電解質溶液ｉ０８の入
った第一電解液貯蔵器ｌＯ６、分離（セパレーション）
キャビ９１月１０、混合］゛字管１２、混合（ミキシン
グ）キャビ９１月１４、蛍光検出器１１６、電解液１０
８の入った第二電解液貯蔵器１１８、接地電極１２０か
ら成る。電解液１０８は分離キャピラリ１１０及び混合
キャビ９１月１４をほとんど満たし、電極１０４と１２
０の間に電界を形成するための媒体として働く。上記電
解液１０Ｂは分析する生物学的試料の溶媒担体としても
使用される。試料貯蔵器１２２には第二高電圧電極１２
４が差し込まれていて、この中に試料溶液１２６を入れ
る。試薬貯蔵器１２８には試薬１３０が入っていて、こ
れは混合キャピラリ１１４で分離キャビ５１月１０の流
れと混合するために試薬キャビ１月３２に沿って混合１
字管１１２へ送られる。試薬の流れは試薬１２８に印加
された圧力によって制御されている。

試料の溶液１２６は分離キャビ５１月１０の入口端部１
３４を試料溶液１２６に差し込んで該キャピラリ１１０
に導入される。電圧源１０２によって電圧を加えて高電
圧電極１２４から分離キャビ５１月１０及び混合キャビ
９１月１４を通って接地電極１２０まで電界を形成する
。電界液は電気浸透流によって接地電極１２０の方へ引
きつけられるにつれて、試料溶液１２６は分離キャピラ
リｌｌＯの入口端部１３４へ引きつけられる。試料溶液
１２６の適正な量、すなわち約２ナノリツトルを導入す
るのに必要な時間が経ったら電圧源１０２の電源を切る
。

次に分離キャピラリ１１０の入口端部１３４を第一電界
液貯蔵器１０６に差し込み、第一図に示されるように配
置する。再び電圧源１０２に電源を入れると、得られた
電界が電気浸透の流れをひき起こす。

この流れにさらに分子帯電の大きさや符号によって左右
される相対的電気泳動性移動速度が加えられる。その結
果、各試料成分は特有の速度で分離キャピラリ１１０の
中を移動する。差動速度によって試料成分は分離キャピ
ラリ１１０を出て混合キャピラリ１１４へ入り、蛍光検
出器１１６のそばを連続的に通過する。

蛍光検出器１１６では、よく焦点を集めた高強度の紫外
線、例えば、水銀キセノンアーク灯またはレーザーなど
を使って混合キャピラリ１１４内の標識付け（ラベリン
グ）のなされた試料成分に光を照射する。検出器１１６
には得られた蛍光強度を光電流に変える光電子増倍管が
内蔵されていて、第２図に示されるように強度対時間出
力を得るために使われる。ピークは様々な試料成分、例
えば鯨の骨格筋ミオグロビン（ＷＳＭ）　、炭酸脱水酵
素（ＣＡＲ）　、β−ラクトグロフ゛リンＢ　（ＢＬＢ
）　、β−ラクトグロブリンＡ　（ＢＬ＾）などに対応
する。

特定の条件１葬ＳＭとＣＡＨは０．０１％（重量／容量
）。

ＲＬ八とＢＬＢは０．００５％（重量／容量）。オペレ
ーション及び試薬用電界液緩衝液は、０．０５Ｍのホウ
酸塩−０，０５Ｍの塩化カリウムｐ）＋９．５．５ｍｇ
のＯフタルジアルデヒド タノール 液で４　ｍｆｌに希釈。試料の導入は３０ｋＶで２秒間
。運転電圧は３０ｋＶ，以上である。

ＷＳＭとＣＡＨのピーク及びＢＬＡ　とＢＬＢのピーク
を分解するために必要な分解能は口径の小さい分離キャ
ピラリを使って部分的に得られる。口径が１００μｍの
以下の場合は電気浸透性の流れがキャピラリの横断面に
均一に作用し、従来見られたシンの拡大を防ぐ。電極１
０４と電極１２０との間の電気抵抗が大きくならないよ
うに口径は１００μｍ以下が好ましい。抵抗が大きくな
ると一定の与えられた電流を得るために電圧をさらに上
げることになる。電解液が沸騰するのを避けるために電
流を限定する必要がある。電圧が高くなると移動からさ
らに速くなる。移動が速くなるにつれて、ピーク分離に
妥協することなく、拡散（これは、時間に関係している
。）によるゾーンの拡大が抑えられる。

口径の小さい分離キャピラリ１工０を使用すると試料の
量が少なくなるので検出される物質もがなり少なくなる
。具体例では、試料のタンパク質が電解溶液に希釈され
るので、第２図の各ピークは試料のタンパク質のほんの
わずかな含有量を示している。同じ試料の検出方法とし
て紫外線吸収方法を使用した場合には、該成分のピーク
はノイズによる他のピークと明確に区別できなか１．た
。似たような問題は蛍光検出器でタンパク質の本来備わ
っている蛍光を頼りにしなければならない場合にも起こ
るであろう。上述のように、分離前の試料に蛍光標識付
けをすることは実行できる方法ではない。従って、本発
明は分離後に蛍光標識付＆ｊをするための新しい連結（
ジャンクション。合流部）を提供する。これは試料成分
の同定と定量化のだめの充分に強い成分ピーク信号を得
ることができると同時にり−ンの拡大を最小に抑えるよ
うにンｊわれる。

分離後の標識付けは第３Ａ図に示されるジャンクション
；３３６を使って灯われる。ステンレス銅混合′ｒ字管
１１２は２個のインラインのボート３３８と３４０及び
直交するボート３４２を有する。分離キャピラリ１１０
は第一［」環Ｄｅｒｒｕｌｅ）　３４４に支えられ、イ
ンラインボート３３８を通って長く伸び、混合キャビ５
１月１４は第一１Ｚｉｉ環３４０によって支えられ、第
のインラインボー４３４０を通って伸びている。

試薬キャビラ呵月３２は短い直交したボート３４２に入
り、第二のＤ環で確保される。融解（ｆｕｓｅｄ）シリ
カ試薬ｔヤビリリ１３２の内径が２００μｍ、外径３２
５μｍ、、長さか７０　ｎｎである。次に、本発明にお
いて１、試料の流れを長手方向にとり、分離キャピラリ
月０か混合キャビ５１月１４の方へ伸びて両者が長手方
向に図示の領域３５０を限定すべく重なり合い、好まし
くは同一の中心を持つようにする。

重複領域３５０は分離キャピラリ１１０　＠出口部分（
クション）３５１　と混合キャピラリ１１４の入口部分
３５３から成る。

第３Ｂ図に示されるように、重複領域３５０には中間の
環状のギヤラフ３５２があり、これは第３Ａ図に示され
るように分離キャビ５１月１０の放流端部３５６の近く
にある混合キャピラリ１１４の中の試薬キャツ ピ号り１１４と混合部分３５４との間で流体を接触させ
る。これによって試料部分の分離後に蛍光試薬１３０を
分離キャピラリの流れを混合させる。充分に混合した後
、例えば試料の照射及び蛍光検出などの検出が混合部分
３５４の下流にある検出窓３５８を通して行われる。

実施態様について第４図にさらに詳細に示す。

分離キャピラリは直径２５μｍの中心電気泳動性キャピ
ラリの穴４６０と直径が２５μｍから１２０μｍへと放
射状に拡がる融解シリカ壁２６２から成る。分離キャピ
ラリの壁４６２はポリイミドプラスチック保護塗膜４６
４で覆われているが、分離キャピラリ１１０のむき出し
の部分４６６では覆われていない。

むき出しの部分４６６では、融解シリカ壁４６２は直径
４０μｍへと先細りになっていくが、これは分離キャピ
ラリの出口の部分３５１の一定の直径と同じである。混
合キャピラリの内径は次に５０μｍになる。

分離キャピラリ１１０は第４図に示される寸法を有しプ
ラスチック塗膜４６４が付いている市販のキャピラリを
変形して形成される。先ず、むき出しの部分４６６とな
るべきところにある塗膜をはがし、次に濃沸化水素酸（
４８％）の攪拌した浴の中で出口端部４６８のエツチン
グを行う。エツチングの間、内部の腐食を防（ためエツ
チング溶液の方へ向かって分離キャピラリ１１０の中を
水が流れている。

混合キャピラリ月４は内径５０μｍの穴４７０を有する
。シリカ混合キャピラリ１１４の穴４７０を限定する壁
４７２の外径は１２０μｍである。分離キャビラフ月１
０と混合キャピラリ１１４の壁は表面の帯電を連続させ
中間の環状ギャップ３５２を横切る動電性効果を高める
ために同種の材料から成ることが重要である。実際、融
解シリカはその柔軟性、透明性、電気の絶縁性などの利
点を有するが故に３種類のキャピラリ１１０．１１４．
１３２の全てａＸ使われている。ポリイミドプラスナッ
ク塗膜４′７４は外径を１５０μｍに拡げる。検出窓３
５８はポリイミド塗膜４７４を１−２　ｃｍ−＝部焼き
取−２て月ｚ成ｌ！＊する１゜重複領域３５０における
電界により、試寧４１戊分１．′。

試薬液の流れの軌道を放射状（，１″、！切、−４−５
′Ｊ岐づ・高電圧の電極１０４と接地電極１’ｔ’、ｏ
　　（第１図姿照は電界５７６（第５図参照）を形成ｌ
、分１１−苓・ピラリの穴４６０と混合キャピラリの４
７０を通−１５、（、ｊＪ果的に試料分子のための道を
限定する。電界は１１１合部分３５４で放射状に分岐し
、分離−８＋ビ゛戸１の流れ６７８を試薬の流れ６８０
を横切　てＩＪ！！、！ｌ＋状Ｓこ外側へ、次に混合キ
ャピラリの内面−１と導＜　（第６図参照）。分岐する
流れ６７８４オ不必要２（乱流がなくても容易に拡散混
合できる。従って、電界５７６は有意に成分ピークを拡
大せずに拡散混合を助ける。故に、システム１００はタ
ンパク質の高分解分析に適している。

同軸ジャンクション３３６を使用すると０−フタロジア
ルデヒド（ＯＰＡ）試薬を移動する試料成分のゾーンを
過度に拡大しなくてもそれに混合することができる。検
出器１１６は３種類の大きさに渡る線状で、アミノ酸及
びタンパク質の検出限度をフ」ニントグラム（ｆｅｍｔ
ｏｇｒａｍ）　（ア・ントモル（ａｔｔｏｍｏｌｅ）　
）の範囲で示す。分離システム】００に関してさらに詳
細はチャペル・ヒルのノース・カロライナ大学ｊ、コ提
出されたドナル１−Ｊ・ローズジュニア物理学博士論文
「キャピラリ・ゾーン電気泳動における器具の使用、検
出及び表面の不活性化Ｊに記載されており、参考のため
ここに述べる。

本発明では、他にいくつかのジャンクションの種類を提
供する。第ｎ図に示すように、市販の２個のキャピラリ
を使用し、その寸法を直して本発明のジャンクションを
形成できる。例えば、分離キャピラリ７８２の内径は一
定で２５μｍであり、外径も一定で１５０μｍであるが
、一方混合キャビラリ７８４の内径は２００μｍである
。代わりの具体例では、分離キャピラリ７８８の放出流
端部７８６は混合キャピラリ７９０の中にはまるように
一定の外径よりも先が細くしである。（第７Ｂ図）。２
個の内径の先をなくすことにより電界の連続性が増し、
乱流が最小に抑えられる。第７Ｃ図に示されるように分
離キャピラリ７９２の部分から外側の塗膜を取り除くこ
とにより外径が重なる領域で１１０μｍになるので、さ
らに小さい内径、例えば、１６０μｍの混合キャピラリ
７９４を使うことができる。

第７Ｄ図に比較のためさらに好ましい具体例を示すが、
これは最も速く効果的に混合できた。この具体例では内
径の差が最小であり、従って、流れが分散する放射状の
平均距離が最小である。さらに、試薬と試料の流速が非
常によくつり合っていた。

本発明はまた混合領域について他の配置形態を提供する
。例えば、混合液は同じような内径を有する２個のキャ
ピラリの間のギャップに導入されるが、キャピラリの他
方の端部は重なるよりむしろ隣接している。また別の例
としては、１本のキャピラリで分離領域と混合領域の両
方の役割をさせ、キャピラリの壁に穴を開け、混合液を
この穴から試料の中に導入できる。

標識の選択は分離方法と両立できるかどうかによって限
定される。はとんどの蛍光標識はそれ自体蛍光性があり
、１個以上のピークが検出器の検出結果に見られた。偽
の蛍光性を避けるために、試薬は完全に反応しなければ
ならないか、あるいは過剰の試薬は検出前に取り除かれ
なければならない。以上の二者択一の方法は非常に問題
がある。

Ｏ−フタルジアルデヒドのようにタンパク質分子の第一
級アミン官能基と反応するまで蛍光性を発揮しない蛍光
性標識材は試薬を使うのが好ましい。

−ａに、本発明では分離キャピラリの内径が１００μｍ
未満で、混合キャピラリの内径が２００μｍ未満である
場合が最適条件である。さらに、環状ギャップの横断面
積は分離キャピラリの横断面積の１−４倍である必要が
ある。具体的な実施態様では、分離キャピラリの横断面
積は約５００μＭであり、中間の環状ギャップの横断面
積は約７００μボであるので、比の値は約１．４倍であ
る。

キャピラリ・ゾーン電気泳動に対して他の動電性分離方
法がある。キャピラリ・ボリアクリルアミドゲル電気泳
動ではゲルマトリックスの中を電気泳動移動するのを利
用する。キャピラリ等電焦点法ではキャピラリの全長に
わたって形成されたｐ）ｌの変化度における等電点によ
って試料成分を分配する。等速度泳動（ｉｓｏｔａｃｈ
ｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）は運動性により試料成分を分配す
る。ミセラー動電性毛管クロマトグラフィはクロマトグ
ラフィの形で電気浸透性の流れに従う固定相を利用する
。以上の分離方法は全てキャピラリに沿って移動分離を
起こす電界を必要とする。従って、本発明は上記方法と
結び付いて分離後検出流を添加する方法を提供する。本
発明は電界が分離に必要ない場合でさえも、混合を容易
に行うために電界を利用する他のキャピラリ分離方法に
適用できる。

実施例では、蛍光標識材は試薬を分離後添加して検出の
効果を増す。本発明は他の検出方法を包含するので、他
の方法で使用する検出液も添加できる。例えば、質量分
析器を使って分離された成分を分析する。本発明は分析
された成分を全て質量分析器へ送り込むために検出液、
特に担体液を導入する場合に使用される。記載された具
体例に対して様々の変更が本発明により提供されるが、
本発明の範囲は上記の特許請求の範囲により限定される
。

〔効　果〕

本発明は、以」二のように構成され、作用するものであ
るから、上記の課題を達成することができるという効果
が得られる。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明の実施例に係る。 第１図は、キャピラリ・ゾーン電気泳動システムを示す
図である。 第２図は、ある試料の検出出力を示すグラフである。 第３Ａ図は、第１図の混合ジャンクションの断面図であ
る。 第３Ｂ図は、第３Ａ図の３−３矢視断面図である。 第４図は、分離キャピラリ及び混合キャピラリの端部を
示す断面図である。 第５図は、第３図における電界を示す図であ汐。 第６図は、第５圀と同様、電界を示す図である。 第７Ａ図、第７Ｂ図、第７Ｃ図、第７Ｄ図は、他の実施
例に係る分離２キヤピラリ及び混合キャピラリの端部を
示す断面図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 複数の成分を含む試料を導入して移動させながら各成分
   を分離するキャピラリ分離部を有する試料パスと、該試
   料パスに添って配置され前記混合部において前記成分に
   予め混合された試薬を検出する検出器と、分離後の各成
   分が前記検出器まで移動する前に試薬の混合をおこなう
   混合器とを備えたことを特徴とするゾーン電気泳動分析
   などの、キャピラリ分離分析用試薬混合装置。