JPH02187662A - 予めブロックされた固体支持体上でのイムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はりガントに対するアッセイ及びそれに使用され
る物質に関し、更に詳細には、非特異的試薬で予め被覆
された固体支持体上でのリガンドの直接的な捕獲を含ん
でいるアッセイに関する。

（従来の技術） 迅速さ及び感度の良さの両方を備えた種々のアッセイシ
ステムが液体中のリガンドの濃度を検出するため又は定
量するために開発されてきた。慣用的イムノアッセイは
りガントが特異的抗リガンドに結合することに依存して
おり、そしてそれらは高い特異性及び優れた感度を提供
できるので、大変有用であった。これらのアッセイは上
記の試薬の一つが標識された状態で使用され、その標識
された試薬はしばしばトレーサーと呼ばれている。

標識のための種々の手段が開発されてきた。ラジオイム
ノアッセイ（ＲＩ　Ａ）法は標識として放射性同位体を
使用し、高い感度および優れた再現性を提供し、そして
多数のサンプルを短時間で処理するための自動化が容易
である。蛍光イムノアッセイ（Ｆ　Ｉ　Ａ）は標識とし
て蛍光色素を使用し、染料を適当な波長の励起照射で励
起すること及びそれからの蛍光を検出することによって
標識の直接的検出を提供する。

酵素もイムノアッセイにおいて標識として使用されてい
る。酵素イムノアッセイ（Ｅ　Ｉ　Ａ）において、酵素
標識試薬は安価に調製でき且つ大変安定なので長期間の
保存に耐えることができ、しかもラジオイムノアッセイ
の感度に劣らない感度を有し、且つ視覚的にもしくはス
ペクトロフォトメーターのような比較的簡易な装置で測
定できるような外観的な結果を与えるようなアッセイが
提供される。

慣用的ＥＩＡにおいて、酵素は特異的に結合している抗
原−抗体対の一方の成分と共有結合しており、そして生
じた酵素結合物は基質と反応して測定される色を生成す
る。しばしば、抗体のような非結合成分を固体支持体上
に固定し、そして特異的結合反応によって抗原を捕獲す
る働きをする。

そのような慣用的ＥＩＡの典型例はシュウルス（Ｓｃｈ
ｕｕｒｓ）らの米国特許第３，６５４，０９０号がある
。

ブチャー（Ｂｕｃｈｅｒ）らの米国特許第４，５８８，
６８０号明細書には、インフルエンザＡ１Ｂ及びＣを含
む種々のウィルスのＭ蛋白質についてのアッセイが開示
されている。このアッセイはＭ蛋白質を放出させるため
にウィルスの破裂させ、そしてそれを重合体支持体に直
接的に吸着させることを含んでいる。

ＰＣＴ公開された出願ＷＯ８６１０２７３３号は抗原性
糖蛋白質ｇＡ／Ｂ、ｇＣ及びｇＤが重合体支持体に直接
的に吸収されるか又は支持体上の特異的モノクロナール
抗体に捕獲されるような単純ヘルペスウィルス（ＨＳ　
Ｖ）についてのアッセイを開示している。

サンコッリ（ＳａｎｋｐＨｉ）らの１ｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１
０７．１９１（＋９１１７）は固体支持体を特異的抗１
ｇＧ抗体で予め処理するようなエストラジオールについ
てのイムノアッセイを開示している。この抗体は特異的
抗エストラジオール抗体を捕獲し、次にそれがエストラ
ジオールを捕獲し、そして改善された再現性を有するア
ッセイを提供する。

アームストロング（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ）らの米国特許
第４．４９７．８９９号明細書は抗原が例えばビーズ、
試験管、ストリップ、ディスクもしくはマイクロタイタ
ープレートのような固体支持体上に直接的に吸収される
ようなりラミシア（Ｃｂｌａｍｙｄｉａ）抗原について
のアッセイを開示している。そして吸収された抗原はど
のような慣用的ＥＩＡ、ＲＩＡ又はＦＩＡ法によっても
アッセイされる。

固体相イムノアッセイにおいて、サンプル中のアッセイ
すべき物質、特に分子量の大きな分子については固体支
持体に非特異的に付着する傾向がある。アッセイ感度の
低下もしくは再現性が無い主な原因は抗リガンドによっ
て満たされていない固体支持体の結合部位上に標識され
た抗リガンド一 結合物（トレーサー）が直接的に非特異的吸収（ａｂｓ
ｏｒｐｔｉｏｎ）されるからである。この問題は、抗リ
ガンドの適応後、塞がっていない結合部位を標識された
結合物と反応しない蛋白質でブロックすることによって
従来は処理されていた。コール（Ｃｏｌｅ）らの米国特
許第４，４０７，９４３号明細書は多孔性の膜をゼイン
のような水不溶性蛋白質で被覆すること、抗原もしくは
抗体をゼイン層に付着すること、及び外来の蛋白質の非
特異的結合を防ぐために免疫化学的に中性蛋白質を抗原
上に固定することを開示している。

（発明が解決しようとする課題） この慣用的事後ブロックはアッセイ感度を改善するけれ
ども、リガンドの結合の前に固体表面に抗リガンド及び
ブロック蛋白質を順番に適用することは煩わしく、時間
の浪費であり且つ高価な抗リガンドの浪費となる。従っ
て、固体相イムノアッセイ法における更なる改善、特に
非特異的結合の回避についての改卿が必要である。

（課題を解決するための手段） 液体中に存在すると推定されるリガンドを測定するため
の方法は、その液体を不活性蛋白質が固定されている固
体支持体及び標識を含んでいる前記リガンドについての
トレーサーに接触させ、それによって前記リガンドが固
体支持体上に捕獲されそしてトレーサーに結合すること
を含んでいる。

本開示において、不活性蛋白質という用語はアッセイの
その他のどの成分に対しても免疫学的に非反応性である
が、本発明のアッセイの一部ではない他の物質に対して
は免疫学的に十分反応性であることを意味している。結
合後、支持体は液体から分離され、そして液体中のりガ
ントの存在をしめずために支持体上の標識を検出する。

その標識は放射性活性原子、蛍光染料又は抗リガンドに
結合されたもしくは抗リガンドに結合されたリポソーム
中に取り込まれている酵素でも良い。

本発明の好ましいアッセイは、標識が抗原に対して特異
的な抗体に結合している酵素であり、及びその酵素標識
を糟色の基質が有色の生成物に変換される反応によ１て
検出するようなウィルス抗原についての膜流れ一通過（
ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）Ｅ　Ｉ　Ａである。

本発明の別のアッセイ形態はウィルス抗原についての２
酵素アツセイである。支持体上の抗原に結合した特異的
抗体に結合している加水分解酵素はブロックされた阻害
剤からブロック基を除去して阻害剤を放出する。その阻
害剤はエステラーゼによるエステル基質の有色生成物へ
の加水分解を阻害し、それによって発色すべき色の欠如
が液体中の抗原の存在を示す指標となる。

本発明の他の態様は本発明の方法のアッセイを実施する
際に有用な物質のキットである。

従って、本発明は固体支持体の実質的に全ての結合部位
が不活性蛋白質で満たされているウィルス抗原のアッセ
イを提供する。不活性蛋白質を含んでいる支持体上への
抗原の捕獲は特異的な捕獲抗体なしに行われ、そしてそ
れによって時間浪費及び特異的な捕獲抗体作製のための
大きな労力を必要とする工程を導けることができる。不
活性蛋白質は、トレーサーを含む他の蛋白質の実質的に
全ての非特異的結合を阻害する（さもなくば、それはア
ッセイ感度を低下させる）。不活性蛋白質は容易に入手
でき且つ安価であるので、本発明はかなりの費用を節約
できる簡易なアッセイ法を提供する。

ここで、図面について簡単に説明する。

第１〜３図は、Ｒ８Ｖ１インフルエンザＡ及びＨ５Ｖの
それぞれについて本発明の方法によって行われたアッセ
イの結果が示されている。

本発明は多くの異なった形態の実施態様によって実現さ
れるが、本開示は本発明の原理の例示として考えるべき
であり本発明をここに説明され述べられた実施態様に限
定する意図ではないという理解の下に、本発明の好まし
い実施態様の詳細をここに述べる。本発明の範囲は特許
請求の範囲及びその均等物で判断されるべきである。

本発明の一つの態様は、支持体上の実質的に全ての結合
部位が不活性蛋白質の被覆によって予めブロックされて
いもような液体サンプル中のリガンドの固体相イムノア
ッセイについての方法である。出願人はアッセイすべき
サンプル中のりガントは、他の蛋白質の全ての非特異的
吸収（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）をブロックするための不
活性蛋白質の能力が減らされることなく、サンプル中の
その濃度に量的に比例して被覆された支持体上に非免疫
学的に捕獲されることを発見した。本発明のイムノアッ
セイはサンプル中のリガンドの存在を検出するため又は
その濃度を測定するために形成され、そして″測定″と
いう用語は定性的又は定量的リガンドアッセイのどちら
かを意味していることを意図している。

リガンドはどのような起源であっても良く、抗原、抗体
又はバズテンであっても良い。例えば、リガンドは体液
中に存在する抗原、又は体液から単離されたもの及びそ
れが異なった液体中例えば緩衝液に入れられていても良
い。その他の場合には、リガンドは体液以外の起源、例
えば微生物の培養液又はその細趨抽出液であっても良い
。好ましいリガンドは抗原であり、最も好ましくは、体
液中に存在するウィルス抗原であり、例えば、アデノウ
ィルス、パラインフルエンザ３ウイルス、及び更に好ま
しくは単純ヘルペスウィルス、Ｈ８ｖ１呼吸シンシチア
ルウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａ
ｌ　ｖｉｒｕｓ）、Ｒ３Ｖ、及びインフルエンザＡ、フ
ルＡ（Ｆｌｕ　Ａ）がある。これ以降、本発明をウィル
ス抗原に関連して述べる。

次にアッセイ成分の詳細について述べると、固体支持体
は等分野では知られているようにアッセイの他の成分も
しくは工程に影響を与えないどのような支持体であって
も良い。使用できる固体支持体の例はガラス及び例えば
ポリエチレン、ポリフッ化ビニリデン及びポリスチレン
等の重合体物質である。そのような支持体はどのような
形状にでも、例えばシート状、チューブ状、マイクロタ
イタープレートウェル、又は最も好ましくは膜に製造で
きる。好ましい膜はナイロン又はニトロセルロースであ
る。特に好ましい膜はポール・コープ（Ｐａｌｌ　Ｃｏ
ｒｐ、）　（−２−５−り、グＬ／　７　：ｌＩ−ヘ）
からイムノダイン（１ｍｍｕｎｏｄｙｎｅ）及びバイオ
ダイン（Ｂｉｏｄｙｎｅ）Ａ　％　Ｂ及びＣの登録商標
名で商業的に入手できる修飾されたナイロン膜である。

どのような不活性蛋白質でも、後で起こる抗原とトレー
サーの間の結合を妨害せず且つアッセイ媒体中の他の蛋
白質と非特異的に実質的に結合しない膜上に被覆するこ
とができる。当業者には他のものも使用できることは明
らかであろうが、適当な不活性蛋白質の非制限的例示に
はカゼインおよびアルブミンがある。不活性蛋白質の膜
への被覆はどのよう適当な方法によっても実行できるか
、好ましくは膜を蛋白質溶液中でインキュベーションし
、それによって蛋白質か膜表面の音自体マトリックスに
物理的に吸収（ａｂｓｏｒｂ）されることである。

不活性蛋白質の被覆を有している膜をウィルス抗原を含
んでいると推定されるサンプルに暴露する。好ましくは
、被覆された膜を一過性（ｔｒａｎｓｉｅｎ＋）の流れ
通過（ｆｌｏｙ−ＬｈｒｏＢｈ）フォーマット中でサン
プルと約１〜約１５分、好ましくは約５分間、約０〜５
０°Ｃ１好末しくは周囲温度でインキュベーションする
。この方法によって、サンプル中の抗原はサンプル中の
その濃度に比例して被覆された膜に吸収される。更に、
ウィルス抗原は、そのサンプルが体液である場合のよう
に大過剰の外来蛋白質を含んでいるサンプルであっても
、優先的に吸収されることが分かった。

トレーサーは抗原に特異的で標識が結合している抗体か
らなる。その標識はどのような慣用的マーカーであって
も良く、それは被覆された支持体上に捕獲された抗原に
トレーサーが結合して後に、検出できる信号を生じる。

従って、標識は抗体に結合した放射性活性原子もしくは
蛍光染料であっても良い。標識が放射線活性要素である
場合、その信号は放射性活性カウントである。標識が蛍
光染料である場合、その信号は適当な波長の励起光を染
料に適用して後に検出される蛍光エミッションである。

典型的放射性標識は、例えば、１２７■、及び典型的な
蛍光体は、例えば、フルオレセインイソチオシアネート
（Ｆ　Ｉ　ＴＣ）である。放射線活性及び蛍光標識の抗
体への結合は慣用的であり、そしてイムノアッセイにお
ける放射線及び蛍光原識の使用及び調製についての更に
詳細は当業者が本発明を完全に理解するためには必要が
無い。

本発明の好ましいトレーサーは酵素が結合している抗体
である。抗体に結合でき且つ有色の生成物に変換され得
る基質が存在する酵素はどのようなものでも使用できる
。適当な酵素類は、例えば、サイクラーゼ、インメラー
ゼ、及びペルオキシダーゼである。好ましいペルオキシ
ダーゼは西洋ワサビのベルオキシダーゼである。好まし
い酵素は、例えば、ペプチダーゼ、エステラーゼ、ボス
７アターゼ及びグリコシダーゼのような加水分解酵素で
ある。最も好ましいトレーサーは抗体に結合したカルボ
キシエステラーゼもしくはアルカリホスファターゼを含
んでいる。抗体への酵素の結合は良く知られており、そ
して当業者には十分理解されている。

別法として、放射線活性原子、蛍光染料又は酵素はリポ
ソーム中に取り込まれていても良い。イムノアッセイに
おいてトレーサーとして使用するための標識のリポソー
ム中への取り込み及び抗体へのリポソームの結合は上記
と同様に全く慣用的である。

勿論、基質の選択はトレーサーの酵素成分に依存してお
り、そして各種類の酵素について種々の基質が良く知ら
れている。好ましい基質は膜上に不溶性の沈澱物を形成
するものである。酵素がペルオキシダーゼである場合、
好ましい基質はジアミノベンジジンである。加水分解酵
素について好ましい基質はインドリル誘導体である。例
えば、酵素がアルカリホスファターゼである場合、好ま
しい基質は３−インドリルホスフェートである。

酵素がエステラーゼである場合、好ましい基質は３−イ
ンドリル酢酸及びブチレートである。これらの基質はこ
の分野では良く知られている。

本発明の好ましいアッセイ方法によれは、不活性蛋白質
で被覆され及び捕獲されたウィルス抗原を保持している
膜を、上記に述べたように、液体中でトレーサー溶液と
インキュベーションして抗原とトレーサーの抗体成分と
の免疫学的結合を誘導する。そして、膜上に結合した抗
原−抗体両分を有している膜を適当な方法で、好ましく
は液体を膜通過させることによってアッセイ媒体の液体
相から分離する。膜を通過する液体の流れは重力によっ
ても良く、又は好ましくは膜の下に置かれた吸収物質に
よって誘導される毛管作用によって強化されても良い。

次に、膜を酵素基質が溶解された水、塩類溶液もしくは
緩衝液のような第２の液体中に浸ける。結合画分中の酵
素は基質を色に関連した信号によって検出可能な生成物
に変換する。従って、検出される信号は色の発色もしく
は消失、又はある色から他の色への変化、又は基質が生
成物に変換される速度の変化、例えば、基質の色が一定
の時間の量変化しないで留どまっていることを観察する
ことなどである。基質は酵素標識によって切断されて有
色の生成物を与えるまでは無色であることが好ましい。

色形成の程度は抗原濃度に比例し、濃度は予め定められ
た量の抗原を有している液体サンプルをアッセイするこ
と及びそれらの色の強度を比較することによって測定さ
れる。測定は装置によって、好ましくは肉眼によって行
うことができる。

本発明の別の方法は抗原が吸収されている被覆された支
持体上で実施される２酵素アツセイである。本アッセイ
法のこの実施態様はにおいては、標識はブロック基をブ
ロックされた阻害剤から除去する第１の酵素であると考
えられる。適当な第１の酵素は一般的には加水分解酵素
、例えば、ホスファターゼ、ペプチダーゼ、エステラー
ゼ及びグリコシダーゼ等である。制限的ではない、適当
な第１の酵素の例示としてはトリプシン、トロンビン、
ホ乳類肝臓エステラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ
、β−ガラクトシダーゼ、又は最も好ましくはアルカリ
ホスファターゼかある。

ブロックされた阻害剤は第１の酵素によって第２の酵素
の阻害剤に変換されるどのような物質であっても良い。

好ましいブロックされた阻害剤は２つの成分、阻害剤お
よびブロック基を有しており、そしてそのブロック基が
第１の酵素によって除去されそして阻害剤がアッセイ媒
体中に遊離されるまで第２の酵素に対して非反応性であ
る。従つて、ブロックされた阻害剤の成分の選択は使用
される第１及び第２の酵素に依存している。ブロック基
は第１の酵素によって実質的に選択的に切断される結合
によって阻害剤に共有結合しているものでなければなら
ず、且つ阻害剤成分は第１の酵素には実質的に影響を及
ぼさないで第２の酵素活性を阻害しなければならない。

従って、第２の酵素及びその基質の性質はブロックされ
た阻害剤及び阻害剤の説明の前に述べるべきであろう。

２酵素アツセイの第２の酵素は一般的には基質を色に関
連した信号により検出可能な生成物に変換する加水分解
酵素である。第２の酵素はブロックされた阻害剤に対し
て実質的に非反応性であることが好ましい。適当な加水
分解酵素は、例えば、ホスファターゼ、トリプシン、キ
モトリプシン及びペプシンのようなペプチダーゼ、又は
好ましくはアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）及
びブチルコリンエステラーゼのようなエステラーゼがあ
る。最も好ましい第２の酵素は、好ましい基質かインド
リルエステルであるブタもしくはウサギ肝臓エステラー
ゼ（ＲＬ　Ｅ）のようなカルボキシエステラーゼである
。

上記に述べたように、トレーサーの第１の酵素成分はブ
ロック基をブロックされた阻害剤から切断して、第２の
酵素の阻害剤を提供する。適当な阻害剤及びブロックさ
れた酵素阻害剤は下記の一般式Ｉ： （式中、Ｂ基の性質は、後で述べるようにこの化合物が
阻害剤であるかブロックされた阻害剤であるかを決定す
る。）で示される。

一般式■において、Ｒ１はＨ１炭素原子数１〜６個の分
岐した若しくは直鎖の低級アルキル、ニトロ、アルコキ
シ、ハロゲンおよびその類似体であり、ｘｔま０、ＳＳ
’ＮＲ２であり、但しＲ２はＨまたは炭素原子数１〜６
個の低級アルキルであり：ｎは１〜６であり；ＡはＦま
たはＣＦ３であり；およびＢはＨ１リン酸もしくはリン
酸塩、グリコシル基、アミノ酸のカルボキシル基を介し
てＸに共有結合しているリジンもしくはアルギニン残基
のようなアミノ酸基、アセチルもしくはブチリル基のよ
うな炭素原子数２〜４個のアシル基、または下記の一般
式■： いる。ＢがＨ以外の他の基である場合、一般式■はブロ
ックされた酵素阻害剤を表している。Ｂがリン酸もしく
はその塩である場合、Ｂは下記の般式■： （式中、Ｒ３は（ＣＨ２）４ＮＨ２、 ＼ Ｈ２ またはベンジルであり；Ｒ６はＨ１分岐したもしくは直
鎖の炭素原子数１〜４個の低級アルキルもしくはヒドロ
キシ−低級アルキル、ＣＨ２Ｃ００Ｈまたは（ＣＨ２）
　２Ｃ００Ｈであり；Ｒ５は炭素原子数１〜４個の分岐
したもしくは直鎖の低級アルキルもしくは低級アルコキ
シ、フェニール、またはベンジルオキシであり；および
ｑは０〜１０である）で表されるペプチドである。

ＢがＨの場合、一般式■は酵素阻害剤を表して（式中、
ＰはＸと結合し、ｎは上記に述べたようである）である
ことを意味している。

一般式Ｉに示された阻害剤およびブロックされた阻害剤
は当業者の通常の知識の範囲内で一般的化学反応を組み
合わせて合成することができる。

適当な、−鍛型方法を下記の実施例に示した。次に示し
た有効な酵素阻害剤の表は例示のためにのみ示されたも
のである。

１、１，１．１−トリフルオロ−３−（４−ヒドロキシ
フェニル）プロパノン ＮＭＲデータ；（ＣＤＣｌ２）　−３，９１（ｓ、　２
Ｈ）、　５．２１（ｂｓ、　ＩＨ）、　６．９０（ｄ、
　２Ｈ）、　７．１０（、ｄ、　２■）Ｋｉ（Ｍ）およ
びエステラーゼ；　２．Ｏｘ　１０−’ＬＥ ２、１，１．１トリフルオロ−３−（３−ヒドロキシフ
ェニル）−２−プロパノン ＮＭＲデータ；（ＣＤＣ１３）　−４，０［１（ｓ、　
２Ｈ）、　４．８０（ｂｓ、　　Ｉｎ）、　　６．８０
（ｍ、　　３Ｂ）、　　７．３０（ｍ、　　ＩＨ）Ｋｉ
（Ｍ）およびエステラーゼ、＞１０−’、　ＰＬＬ ３、１，１．ｌトリフルオロ−４−（４−ヒドロキシフ
ェニル）−２−ブタノン ＮＭＲデータ；（ＣＤＣｌ２）　−２，９５（ｍ、　４
Ｈ）、　４．９０（ｂｓ、　１Ｂ）、　６．９２（ｄｄ
、　４Ｈ）Ｊ□４．６０ＨｘＫｉ（Ｍ）およびエステラ
ーゼ；　２．ＯＸ　１０−’ＬＥ ４、１，１．１−トリフルオロ−４−（３−ヒドロキシ
フェニル）−２−ブタノン ＮＭＲデータ；（ＣＤＣｌ２）　−２，９４（ｔ、　２
■）、　３．０５（１，２Ｈ）、　５．７０（ｂｓ、　
Ｉｎ）、　６．８０（ｎ＋、　３１１）、　７．１５（
ｍ、　Ｉｎ） Ｋｉ（Ｍ）およびエステラーゼ；　１．ＯＸ　１０−’
ＬＥ ５、１，１．ｌトリフルオロ−５−（４−ヒドロキシフ
ェニル）−２−ペンタノン ＮＭＲデータ；（ＣＤＣ１３）　−１，９１（＋、　２
ｆｌ）、　２．５９（ｔ、　２１１）、　２．６８（ｔ
、　２Ｈ）、　５．２３（ｂｓ、　Ｉｎ）、　６．９５
（ｄ、　２１１）、　７．１０（ｄ、　２Ｈ）Ｋｉ（Ｍ
）およびエステラーゼ；　１．ＯＸ　１０−’ＬＥ ６、１，１．１トリフルオロ−５−（３−ヒドロキシフ
ェニル）−２−ペンタノン ＮＭＲデータ；（ＣＤＣｌ２）　−１，９５（ｐ、　２
Ｈ）、　２．７０（ｔ、　２Ｈ）、　２．９５（ｔ、　
Ｈｌ）、　５．４０（ｂｓ、　１［Ｉ）、　６．７０（
ｍ、　３Ｂ）、　７．３０（ｍ、　ｌ［ｌ）Ｋｉ（Ｍ）
およびエステラーゼｉ　１．７Ｘ　１０−７ＬＥ ７．１，１．１−１−リフルオロ−６−（トヒドロキシ
フェニル）−２−ヘキサノン ＮＭＲデータ；（ＣＤＣ１３）　−１，６３（ｍ、　４
ｔｌ）、　Ｃ５９（ｑ、　２［１）、　２．７０（ｑ、
　２＋１）、　５．５５（ｂｓ、　ＩＨ）、　６．７７
（ｄ、　２Ｈ）、　７．０２（ｄ、　２Ｈ）Ｋｉ（Ｍ）
およびエステラーゼ；　２．ＯＸ　１０−’ＲＬＥ ８　、１，１，１，２．２−ペンタフルオロ−５−（４
−ヒドロキンフェニル）−３−ペンタノン ＮＭＲデータ；（ＣＤＣ１３）　−２，９４（ｍ、　２
Ｈ）、　３．０４（ｍ、　２Ｈ）、　４．７５（ｂｓ、
　ＩＨ）、　６．Ｈ（ｄ、　２Ｈ）、　７．１（１（ｍ
、　２Ｈ） Ｋｉ（Ｍ）およびエステラーゼ：　８．ＯＸ　１０−’
ＬＥ 上記表中、ＰＬＥはブタ肝臓エステラーゼ（Ｅ　、Ｃ。

３．１．１．１）；ＲＬＥはウサギ肝臓エステラーゼ（
’Ｅ、Ｃ，３，１、’１．１）である。

本発明の他の態様は本発明の方法に従ってリガンドにつ
いてアッセイを行うための物質のパッケージまたは試薬
キットである。キットは固体支持体、好ましくは不活性
蛋白質で被覆された膜、抗リガンド、抗リガンドに結合
した酵素、及び酵素に対する基質を含んでいる。キット
は第２酵素、及び第２酵素に対するブロックされた阻害
剤、リガンドについての標準、例えば予め定められた濃
度の１もしくは１以上のサンプルを含んでいても良く、
またはアッセイの実施に有用な他の試薬、酵素基質又は
他の標識されているもしくは標識されていない特異的リ
ガンド、抗リガンド又はそれらの複合物を含んでいても
良い。生理食塩水または緩衝液のような溶液を含んでい
ても良い。キットの構成要素は、毛管作用によってアッ
セイ液体の膜の通過を容易にするための吸収紙のような
膜の下に置く物質を収納する、好ましくはプラスチック
のハウジング内に組み入れられても良い。

実施例における共通の方法 鍛型分析技術−７ラッシュ（Ｉｌａｓｌ＋）シリカゲル
クロマトグラフィーをＩＣＮシリカゲル３２〜６３メツ
シユで３〜７　ｐｓｉ、で行った。分析ＴＬＣはＥＭサ
イエンティフィク社製のアルミニウム板上の０．２５ｍ
ｍ、５Ｘ２０ｃｍのシリカゲルプレートで行った。調製
ＴＬＣはＥＭサイエンティフィク社製のガラス板上の２
．０ｍｍ、　２０　Ｘ　２０ｃｍのシリカゲルプレート
で行った。融点はトーツス・ホーバー（Ｔｈｏｍａｓ　
Ｈｏｏｖｅｒ）キャピラリー融点装置で行った、そ゛し
て補正はしなかった。ＮＭＲスペクトルはＩＢＭ　　Ｗ
Ｐ−’２００ＳＹ７．ペクトロフォトメーターに記録し
、そして化学シフトはトリフチルシランに対する相対ｐ
ｐｍで記載した。ＨＰＬＣはＵＶ検出を有するウォター
ズ５１０．２ポンプシステムでブラウンレー（Ｂｒｏｗ
ｎｌｅｅ）ＡＸ３００　７Ｘ２５０ｍｍカラム上の２つ
の溶媒系の一つを用いて行った；　（システムＡ）では
最初に３０ｍＭ　　ＮＨ，ＯＡｃ、ｐＨ６，５で５分間
保持し、次に３０分間で２　、０　Ｍ　　Ｎ　Ｈａ　Ｏ
Ａ　ｃへの直線勾配を行い、更に５分間１．ＯＭ　　Ｎ
Ｈ４０Ａｃで保持した；システムＢ）では３０ｍＭＮＨ
，ＯＡｃ、ｐＨ６，５のインクラチック（ｉｓｏｃｒａ
ｔｉｃ）緩衝系を４０分間使用した。流速は１．０ｍ０
７分であった。ガスクロマトグラフィーはＪ＆Ｗサイエ
ンティフィク社から購入できる３０Ｍ　　ＤＢ−１メガ
ポレ（Ｍｅｇａｂｏｒｅ）カラムを使用してＦＩＤおよ
び自動インジェクターを装備したＨ、Ｐ、５８４０Ａガ
スクロマトグラフィーで行った。ＧＣ条件は下記のよう
であった；１００℃で３分間保持し、次に１０°Ｃ／分
の勾配で２５０°Ｃにして、更に１６．０ｍ１１／分の
流速で２５０℃で３分間保持した。

阻害定数をｐＨ８，０の５０　ｍ　Ｍ　）リス中で測定
した。酵素および阻害剤を周囲温度で２０分間インキュ
ベーションした。そして、酵素に対する基質を添加して
、加水分解の速度をスペクトロフォトメーターで測定し
た。ＰＬＥおよびＲＬＥに対する基質は０−ニトロフェ
ニル−ブチレート、およびＡＣｈＥに対してはアセチル
チオコリンおよびエルマン（Ｅｌ１ｍａｎ’　ｓ）試薬
であった。

次の実施例は本発明を更に説明するために提供されるが
、いかなる場合も本発明を制限するものと考えるべきで
はない。

実施例１ ジアンモニウム［４−（３−オキソ−４，４，４−）リ
フルオロブチル）フェニルコリン酸の調製 Ａ、エチル２−（４−メトキシベンジル）−３−オキソ
−４゜４．４−トリフルオロブタノエート 還流コンデンサー、滴下漏斗、アルゴン入口、およびマ
グネット撹拌を備えた１リツターの４つ首の丸底フラス
コに水素化ナトリウムの５０％油分散液７．１７　ｇ　
（０，１４９Ｍ）および無水エチルエーテル３００ｍＭ
を入れた。その溶液を撹拌しながら無水エタノール（９
ｍｌ＋）をゆっくりと添加した。水素の発生が停止して
後、エチル４，４゜４−トリフルオロアセトアセテート
２５　ｇ（０，１３６モル）および４−メトキシベンジ
ルクロリド２１゜３ｇ（０，＋３６モル）の混合物を１
時間をかけて添加した。次に、その混合物を一晩還流し
、冷却し、水、ＩＮ塩酸で抽出し、無水ＭｇＳＯ４で乾
燥し、そして溶媒をロータリーエバポレーターで減圧下
で除去した。粗反応混合物３３．５ｇを６０Ｘ３００ｍ
ｍシリカゲルカラムで酢酸エチル／ヘキサン（２５／７
５）の混合物を用いるクロマトグラフィーにかけた。同
じ画分を集めて、所望の（分光分析的に複合体）生成、
物９．４ｇ（２３％）を油状物として得た。Ｎ　Ｍ　Ｒ
（ＣＤＣｌ２）　：　１．２６（ｍ、　３Ｈ）、　３．
７７（ｓ、　３Ｈ）、　４．１２（ｍ、　２Ｈ）、　７
．０１１（＋ｎ。

２■） Ｂ、　１，１．ｌｌ−リフルオロ−４−（４−ヒドロキ
シフェニル）−ブタン−２−オンの調製 還流コンデンサー、アルゴン入口、およびマグネット撹
拌を備えた１００ｍＡの丸底フラスコにエチル２−（４
−メトキシベンジル）−３−オキソ−４，４，４トリフ
ルオロブタノエート（Ｉ）２．０５　ｇ　（６，７ｍｍ
ｏｌ）　、３１％（ｗ／ｖ）ＨＢｒの酢酸溶液２０ｍｆ
ｉ、および水１０ｍＡを入れた。この混合物を一晩１２
０℃で加熱し、減圧下で濃縮し、そしてジクロロメタン
および水で分配した。有機層を水性重亜硫酸塩、及び炭
酸水素ナトリウム塩飽和液で順番に抽出し、そして無水
硫酸マグネシウムで乾燥した。そして溶媒を減圧下で除
去した。粗反応混合物は５０Ｘ３００ｍｍシリカゲルカ
ラムで酢酸エチル／ヘキサン（５０１５０）の混合物を
用いてクロマトグラフィーを行った。同じ画分を集めて
、溶媒を減圧下で除去して生成物６００ｍｇ（４１％）
を透明な油状物として得た。ＮＭＲデータ；（ＣＤＣ１
３）　：　ｇ、９５（ｍ、　４Ｈ）、　５．４０（ｂｓ
、　１Ｂ）。

６．９３（ｄｄ、　４Ｈ）Ｊ＝４．６１ＢＺＣ，ジエチ
ル［４−（３−オキソ−４，４，４−トリフルオロブチ
ル）フェニル］ホスフェートの調製アルゴン入口および
マグネット撹拌を備えたｌＯｍ　Ｑの丸底フラスコに１
．１．１トリフルオロ−４−（４ヒドロキシフエニル）
ブタン−２−オン４００　ｍ　ｇ（１，ｇｍＭ）、ジエ
チルクロロホスフェート４゜Ｏｍ　ｇ　（２，３ｍＭ）
　、無水ピリジン０．１５ｍＱおよびジクロロメタン５
ｍｆｉを入れた。この混合物を一晩周囲温度で撹拌し、
塩酸ピリジニウムを濾過で除去し、０．２ＮＨＣＩで抽
出し、水で抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。

そして溶媒を減圧下で除去して、粗生成物６００ｍｇを
茶色の油状物として得た。酢酸エチル／ヘキサン（５０
１５０）を用いた調製ＴＬＣによって透明な油状物２０
０ｍｇ（３１％）を得た。Ｎ　Ｍ　Ｒ（ＣＤＣｌ２）　
：　　１．５０（ｍ、　６Ｈ）、　３．０（、ｍ、　４
Ｈ）、　４．２０（ｍ、　４Ｈ）、　７．１５（ｓ、　
４Ｈ） Ｄ、ジアンモニウム日−（３−オキソ−４，４，４−ト
リフルオロブチル）フェニル］ホスフェートの調製アル
ゴン入口およびマグネット撹拌を備えた２５ｍＱの一つ
首丸底フラスコにジクロロメタン５．０ｍ１１ジエチル
［４−（３−オキソ−４，４，４−１−リフルオロブチ
ル）フェニル］ホスフェート（Ｉ［［）１４０ｍｇ（０
，４ｍＭ）およびブロモトリメチルシラン２−Ｏｍｌを
入れた。この混合物を３時間周囲温度で撹拌して後、メ
タノール１０ｍ１ｌを添加して、そして揮発性物質を減
圧下で除去した。残渣を水に溶解し、そしてｐＨを７．
０に１．ＯＮ水酸化ナトリウムで調整した。その水性溶
液をジエチルエーテルで抽出し、そして凍結乾燥して白
い固体１９０ｍｇを得た。この物質を１０ｍ１ｌの水に
溶解し、そしてアニオン交換ＨＰＬＣによって精製した
。勾配条件は：最初に２０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐｉ
（６，５で５分間保持し：次に２０分間以上で１．０Ｍ
酢酸アンモニウム濃度まで直線的に上げ；そして１．０
Ｍ酢酸アンモニウム中に１５分間保持した。流速２．５
ｍ１ｌ／分で、生成物は約３２分に溶出した。カラム容
量は２０ｍｇであった。数回のＨＰＬＣ操作からの生成
物をプールし、凍結椰燥して５０ｍｇ（３−７％）の生
成物を得た。融点ｍｐは２３５−２４０°Ｃ１ＮＭＲ（
Ｄ２０）：　１．９０（ｍ、２１１）、２．５６（ｍ、
２Ｈ）、４．６５（ｓ。

Ｄｏｌｌ）、６．８８（ｄｄ、４■）Ｊ□６．８２Ｈｚ
実施例２ 膜フイルタ−スタックは次の構成で組み立てられに二 最上層−３ミクロンのイムノダインイムノアフィニティ
ーメンブレン（ポール（Ｆａｌｌ）、＃ＢＩＡＯＯ３０
ＨＣ５、ニューヨーク、イーストヒルズ）。０．３％カ
ゼインを含むリン酸緩衝生理食塩水に３０分間、周囲温
度で浸漬することによって予め被覆されている。

次の層−不織のレーヨンシート（シュレイチャーアンド
シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｂｕｅ
１１）、＃５−３．ニューハンプシャー、ケエン） 最下層−セルロース吸収パッド（２）（フィルトレージ
ョンサイエンス（Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　５ｃｉｅｎｃ
ｅ）、＃ＥＤ３２０−．２００、ペンシルバニア、ホリ
ースプリングス） 膜層は最上層の上部に形成される受はウェルを有してい
るプラスチックホルダー内に入れられている。このウェ
ル内に受はウェルよりも狭い開口を有しており且つ最上
層膜に対して流れを定める流れ制限挿入物がはめられて
いる。

抗原の保存液は緩衝液（２５０ｍＭトリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン塩酸塩（ＴＲＩＳ塩酸）、１５０
ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣＩ）、１０ｍＭエチレンジ
アミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）、４％（ｖ　／　
ｖ　）ポリオキシエチレンソルビクンモノラウレート（
ツイーン２０）、１％ｎ−アセチルシスティン、０．２
％ナトリウムアザイド（Ｎ　ａ　Ｎｓ）　、ｐＨ８，５
）で呼吸シンシチアルウイルス（Ｒ３Ｖ）（長い株）に
感染したＨＥｐ−２細胞を希釈して調製した。対照用の
抗原は感染していないＨＥｐ−２細胞から同様の方法で
調製した。

この抗原（もしくは対照）のアリコート１５０μ悲を器
具に負荷して、そして流れ制限挿入物を通して最上層の
膜上に流出させた。（液体は支持吸収層の毛管作用によ
って最上層の膜を通って引かれる。）そして流れ制限挿
入物を取り除き、器具に５０ｍＭ１リスＨＣｌ、１５０
ｍＭＮａＣ＋、０．２％ＮａＮ３、ｐＨ７，２０リス緩
衝生理食塩水）からなる溶液に更にウサギＩｇＧ　　１
ｒｒ＋ｇ／ｍρを含んでいる洗浄溶液１５０μａを添加
した。

アルカリホスファターゼと結合した抗−Ｒ３Ｖ抗体２７
μｇ　／　ｍ　Ａを含む溶液を５０　ｍ　Ｍ　）リスＨ
ＣＩ、１００ｍＭＮａＣ＋’、２００ｍＭリン酸ナトリ
ウム、１％カゼイン、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１
ｍＭ塩化亜鉛、及び１ｍＭ２−メルカプトエタノールを
含む緩衝液ｐＨ７，５で調製した。この混合物のアリコ
ート１５０μａを器具に添加して、膜スタックに吸収さ
せた。短いインキュベーション（２分間）の後、器具を
ＴＢＳ（ＩｇＧを含まない）３００μａで洗浄した。

ニトロブルーテトラゾリウム０．３３ｍｇ／ｍｎ　。

１％メタノール、及び０．２％ＮａＮ３を含む溶液１５
０μａを器具に添加した。これに続いて、５０ｍＭ２−
アミノ−２−メチル−１−グロバノールアセテート（Ａ
ＭＰ　　ＨＯＡｃ）　、０．２％ＮａＮ、、１９ｍＭ塩
化マグネシウム、ｐ　Ｈ９，８中にレバミゾール１２ｍ
Ｍを含む溶液１５０μａを添加した。周囲温度で５分間
のインキュベーションの後、色を形成する反応を２００
ｍＭリン酸カリウム、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．２％Ｎａ
Ｎ３を含むｐＨ７，２の溶液１５０μ此の添加によって
停止した。

得られた膜の色強度を反射デンシトメーター（ダレタッ
グ（Ｇｒｅｔａｇ）、型式１８３、ワシントン州シアト
ル）で測定した。一連の希釈物についての実験の結果を
第１図に表した。

実施例３ インフルエンザウィルスＡ型のアッセイインフルエンザ
ウィルスについてのアッセイを下記の例外を除いて実施
例２と同様の方法で行つた： ｌ）抗原保存液をインフルエンザウィルスＡ　（ＷＳＮ
株）に感染したマジンーダービー（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒ
ｂｙ）大腎臓（ＭＤＣＫ）細胞から調製した。

２）最上層は３ミクロンのバイオダインＣ（＃ＢＮＰＣ
Ｈ５、ポール、ニューヨーク州イーストヒルズ）を使用
した。

３）抗原保存液緩衝液をトリス塩酸の代わりに塩化ナト
リウムを含まず、そして１ｍＭエチレンビス（オキシエ
チレンニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）を更に含んでいる
トリス酢酸で調製した。

４）結合希釈物は５０ｍＭトリスの代わりに１゜Ｏｍ　
Ｍ　トリス、及び１００ｍＭＮａＣ１の代わりに１５０
ｍＭＮａＣ＋を含む。

５）レバミゾール濃度は１２ｍＭの代わりに１６ｍＭと
した。

連の抗原希釈物で行われた実験の結果は第２図に表され
る。

実施例４ 単純ヘルペスウィルス（ＨＳ　Ｖ）のアッセイ単純ヘル
ペスウィルス（■及び■型）についてのアッセイを下記
の例外を除いて実施例２と同様に行った： １）抗原保存液をＨ３Ｖタイプ■で感染したベロ（Ｖｅ
ｒｏ）細胞から調製した。

一連の抗原希釈物について行われた実験の結果を第３図
に表した。

実施例５ Ｒ３Ｖについての２酵素カスケードアツセイを下記の例
外を除いて実施例２と同様の方法で行った： １）ウサギ肝臓カルボキシエステラーゼをイムノダイン
イムノアフィニティー膜上に被覆する。そして、その膜
を前述のようにカゼインでブロックする。

２）アルカリホスファターゼ−抗体結合物の適用及びそ
れに続く洗浄後、５０ｍＭジェタノールアミン中の０．
１５ｍＭのマスクされた阻害剤（４（３−オキソ−４，
４，４−１−リフルオロブチル）フェニルホスフェート
）溶液、ｐＨ９，０を器具に添加する。この溶液を周囲
温度で２０分間インキュベーションする。ＴＢＳ中の０
．５ｍＭ３インドリルブチレート（リサーチオーガニツ
クス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｏｒｇａｎｉｃｓ）、オハイ
オ州クリーブランド）を含む色原体溶液を器具に添加す
る。発色を１　ｍＭ　＋、１．１−　トリフルオロアセ
トフェノン（アルドリッチ（ＡＩｄｒ＋ｃｈ）、ウィス
コンシン州ミルウオキー）の添加によって適当な時間の
経過後に停止する。色強度を前記の実施例で述べたよう
に反射デンシトメーターで測定する。

未知サンプルの色強度を感染していない対照と比較する
。もし、その未知試料の結果が対照よりもかなり淡く表
れた場合（対照の反射濃度の半分以下）、ウィルス物質
の存在を示す陽性の結果であると判断される。

従って、本発明は抗原に対する特異的捕獲用抗体を含ん
でいないウィルス抗原アッセイを提供する。更に、固体
支持体は不活性蛋白質で被覆され、そして抗原はその被
覆された支持体上に直接捕獲される。更に、不活性蛋白
質は、たとえ抗原捕獲の前に予め被覆されても、アッセ
イ感度を低下させるトレーサーのような他の蛋白質の非
特異的結合を実質的に全て防ぐことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、色の反射濃度と感染細胞の量の関係をプロッ
トした図面である。 第２図は、色の反射濃度と感染細胞の量の関係をプロッ
トした図面である。 第３図は、色の反射濃度と感染細胞の量の関係をプロッ
トした図面である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、液体中のウィルス抗原を測定する方法であって、 ａ）ウィルス抗原を含んでいると推定される第１の液体
   を不活性蛋白質で被覆された膜及び酵素を含んでいるト
   レーサーと混合し、それによって前記ウィルス抗原が前
   記被覆された膜に付着しそして前記トレーサーに結合し
   て、前記膜上に前記酵素を含んでいる結合画分が生成さ
   れ； ｂ）前記膜を、前記第１の液体を前記膜を通過させるこ
   とによって前記第１の液体から分離し；ｃ）前記酵素に
   対する基質を含んでいる第２の液体を前記膜を通過させ
   て、前記基質を前記酵素によって前記膜上の有色の生成
   物に変換し；及びｄ）前記ウィルス抗原を前記生成物の
   色に関連した信号によって検出すること； からなる上記方法。 ２、前記不活性蛋白質がカゼイン及びアルブミンからな
   る群から選択される、請求項１記載の方法。 ３、前記トレーサーが前記酵素が結合しており前記抗原
   に対して特異的な抗体を更に含む請求項１記載の方法。 ４、前記トレーサーが前記抗原に対して特異的な抗体及
   び前記酵素が閉じ込められており且つ前記抗体に結合し
   ているリポソームを更に含む、請求項１記載の方法。 ５、液体中の抗原を測定する方法であって、ａ）ウィル
   ス抗原を含んでいると推定される液体を不活性蛋白質で
   被覆された固体支持体及び標識を含んでいるトレーサー
   と混合し、それによって前記ウィルス抗原が前記被覆さ
   れた支持体に付着しそして前記トレーサーに結合して、
   前記支持体上に前記標識を含んでいる結合画分が生成さ
   れ；ｂ）前記支持体を前記液体から分離し；及びｃ）前
   記支持体上の前記標識を検出し、そして前記検出から前
   記ウィルス抗原が前記液体中に存在することを推定する
   こと； からなる上記方法。 ６、前記標識が放射性活性の計数によって検出される放
   射性原子及び染料に励起光を照射しそしてそれから放出
   される蛍光を観察することによって検出される蛍光染料
   からなる群から選択される、請求項５記載の方法。 ７、液体中のウィルス抗原を測定する方法であって、 ａ）ウィルス抗原を含んでいると推定される第１の液体
   を不活性蛋白質で被覆された膜及び第１の加水分解酵素
   と結合している前記抗原に対して特異的な抗体と混合し
   、それによって前記ウィルス抗原が前記被覆された膜に
   付着しそして前記抗体に結合して、前記膜上に前記第１
   の加水分解酵素を含んでいる結合画分が生成され； ｂ）前記膜を、前記第１の液体を前記膜を通過させるこ
   とによって前記第１の液体から分離し；ｃ）前記被覆さ
   れた膜を、ブロックされた阻害剤、前記ブロックされた
   阻害剤に対して実質的に非反応性である第２の加水分解
   酵素及び前記第２の加水分解酵素に対する基質を含んで
   いる第２の液体と接触させ、それによって前記支持体上
   の前記第１の加水分解酵素が前記ブロックされた阻害剤
   を阻害剤に変換し、そしてその阻害剤が前記第２の加水
   分解酵素による前記基質の有色生成物への変換を阻害し
   ；及び ｄ）前記ウィルス抗原を前記生成物の色に関連した信号
   によって検出すること； からなる上記方法。 ８、前記ブロックされた阻害剤がブロックされたフルオ
   ロケトンである、請求項７記載の方法。 ９、不活性蛋白質で被覆された膜、酵素が結合した抗体
   、前記酵素に対する基質、及び前記膜に隣接して配置さ
   れる吸収物質を収納している容器からなるウィルス抗原
   のアッセイを行うための物質のキット。 １０、酵素、酵素基質、ブロックされた阻害剤、緩衝液
   及び塩類液からなる群から選択される少なくとも一つの
   他の試薬を更に含む、請求項９記載のキット。