JPH02188532A - リポソームワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 り東上の■貝盆！ 本発明は、リポソームワクチン、より詳しくは癌細胞表
面に顕在する抗原提示糖蛋白質を特定のリポソームに再
構成させてなるリポソームワクチンに関する。

ｉ区反丘点ヱ五Ｊ旦荒 １９６０年中期に英国のパンガム（Ｂａｎｇｈａｍ）が
天然物由来のリン脂質を水中に再分散させたとき、細胞
の形質膜と同じ基本構造の二分子膜が形成され、これが
細胞のバルク構造と同じ閉鎖型小胞形態を有することを
見出して以来、該小胞は脂質（ｌｉｐｉｄ　）からなる
小胞（ｓｏｍｅ　）という意味からリポソーム（ｌ　ｉ
　ｐｏｓｏｍｅ　）と呼ばれ、膜モデルとして乃至はマ
イクロカプセルとして、膜の流動性やバリヤー能（膜透
過障壁）等の細胞膜構造特性の研究材料や、また凝集、
融合等の細胞の動物機能研究等に広く利用され盛んな研
究が展開されてきている。

上記リポソームは、両親媒性脂質分子の非共有結合性集
合体であり、このことがら脂溶性（疎水性）分子の膜内
への侵入、イオン吸着、温度変化に伴う脂質膜のゲル−
液晶相転位、内外水相間の浸透圧バランスの崩れ等の物
理化学的摂動を起こすことはもとより、脂質分子の化学
的・酵素的分解、不飽和脂質の過酸化等による膜構造の
不安定化を起こし、それと共に水の膜外流出、膜内流入
や、膜内に存在させてカプセル化された水溶性薬剤、特
に低分子薬剤の漏出をも起こし得、之等の点より、例え
ば組織指向性薬物運搬体、人工赤血球、細胞修飾剤、酵
素固定化基材、人工細胞等として医薬品分野を初めとす
る各種の分野で積極的利用が大いに期待されてきた。し
かるに、従来のリポソームは、この水溶性物質のカプセ
ル化効率、保持能力等の低さ、即ちリポソーム膜のバリ
ヤー能の低さを致命的欠点としていた（例えばＪ。

ｓｕｎａｍｏｔｏ　ａｎｄに、Ｉｗａｍｏｔｏ、　ＣＲ
ＣＣｒ１ｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ。

２．２，１１７　（１９８６）参照〕。

上記従来のリポソームの欠点は、リポソーム膜中に膜蛋
白質等を組込むことにより解消されると考えられるが、
これはリポソーム膜中での膜蛋白質の保持、安定性の面
で必ずしも満足できるものではなかった〔例えばＳ、Ｌ
、Ｃ００ｋ、　Ｓ、Ｒ，ＢＯｕｍａ。

Ｗ、Ｈ，Ｈｕｅｓｔｉｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
、　　１９．４６０１（１９８０）参照〕。

本発明者らも従来より上記リポソームの構造強化と分子
認識機能発現とを同時に達成し得る技術を提供すること
を目的として鋭意研究を重ねてきたが、その過程で天然
にあける境界脂質の一種と考えられているスフィンゴミ
エリンの部分構造アナログとして、アシル鎖中にアミド
結合を有する１、２−ジミリストイルアミド−１，２−
デオキシホスファチジルコリン（以下ｒＤＤＰｃＪとい
う）を設計合成し、これがアミド結合に由来する二分子
膜中での水素結合帯形成によって極めて安定な二分子膜
を形成することを見出し、この知見に係わる発明を完成
し特許出願した〔特開昭６１−２６７５０９＠公報〕。

上記出願に係わるスフィンゴミエリン含有リポソームは
、生体投与時でもその安定性は、通常のホスファチジル
コリンリポソームよりも優れており、更にＤＤＰＣは天
然のスフィンゴミエリンよりも構造的に単純で、また二
分子膜中での水素結合帯の形成により、ホスファチジル
コリンと混合するのみで脂質分子膜の構造安定性を向上
できるものであり、人工細胞等の用途としてより有効な
ものと考えられた〔例えばＭ、ＧＯｌＯ，）１．Ａｒａ
ｋａＷａ。

■、Ｓａｔ、、　　Ｈ，にｏｎｄｏ、　　Ｊ、Ｓｕｎａ
ｍｏｔｏ、　　Ｃｈｅｍ、Ｃｅｔｔ、。

１旦、１９３５　（１９８７）参照）。

本発明者らは、上記出願に係わるリポソームの応用面の
研究を更に引き続き重ねた結果、従来より細胞間の情報
伝達に極めて重要な役割を演じており、特に癌の免疫療
法において古くから注目されてはいるが、いまだ有効な
抗原として確立されていない癌細胞表面の抗原提示糖蛋
白質（ＴｔｌｍＯｒＳｕｒｆａｃｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ　
Ｐｒｅｓｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ、以下ｒＴｓＡＰＪと
略記する）に着目し、これを上記リポソームに再構成し
た結果、得られるリポソームはワクチンとして非常に有
効であり、その適用によって癌の新しい治療法が確立で
きることを見出し、ここに本発明を完成するに至った。

問題７．を　決するための手ｒ 即ち、本発明は癌細胞表面に顕在する抗原提示糖蛋白質
（ＴＳＡＰ＞を、１，２−ジミリストイルアミド−１，
２−デオキシホスファチジルコリン（ＤＤＰＣ）を含む
リポソームに再構成させてなることを特徴とするリポソ
ームワクチンに係わる。

本発明ワクチンは、これを生体に投与することによって
生体を免疫化させ得、かくして生体の癌に対する抵抗性
を強化し、もって癌の新しい予防及び治療法を確立でき
る。即ち、本発明ワクチンで免疫化された生体は癌細胞
の陵内移植試験によっても全く発癌及び癌細胞の増殖を
認めず、優れた免疫効果を奏し得る。

本発明はかかる優れた免疫効果を奏し得るリポソームワ
クチンの製造方法をも提供するものであり、また本発明
ワクチンは癌診断用抗体の調製にも非常に有効である。

以下、本発明リポソームワクチンにつき、これをその製
造法より詳述すれば、該ワクチンはＴＳＡＰを、ＤＤＰ
Ｃを含むリポソームに再構成させることにより製造でき
る。

ここで使用されるＴＳＡＰは、各種の癌細胞より通常の
方法により調製することができる。その起源とする癌細
胞も特に限定されるものではなく、各種動物、ヒトの再
移植性癌細胞、癌患者等から手術等により切除された癌
細胞乃至白血病細胞のいずれでもよい。特に好ましい代
表的癌細胞としては、例えばマウス白血病細胞（Ｂａｌ
ｂ　ＲＶＤ）　　（例えばＨ，Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ、　
Ｈ，５ｈｉｋｕ、に、Ｈｏｒｉｂｅ、　Ｙ、０ｂａｔａ
。

Ｅ、５ｔｏｃｋｅｒｔ、　Ｈ，Ｔ、Ｏｅｔｔｇｅｎ、　
Ｌ、Ｊ、Ｏｌｄ、に、　Ｙａｍａｄａ。

Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１６３．４５２　（１９８６）
参照））を例示できる。２等癌細胞からのＴＳＡＰの調
製は、代表的には通常の細胞膜糖蛋白質の抽出操作に従
うことができる。該抽出操作に利用される溶媒も特に限
定されるものではなく、一般的な各種のもの、例えば水
、メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアル
コール、ブチルアルコール等の低級アルコール類等や之
等とＰＢＳとの混液等を利用できる。また上記抽出操作
は、通常Ｏ〜５０℃の温度条件下に１〜３０分間程度イ
ンキュベートすることにより実施され、この抽出後、遠
心分離等の常法により、上清として所望のＴＳＡＰ抽出
液を得ることができる。該抽出液はまた常法に従い、必
要に応じて適宜減圧濃縮、凍結乾燥、透析等を行なって
更に濃縮精製することもでき、通常２等精製操作の採用
が好ましい。本発明では上記抽出操作及び必要に応じて
更に精製操作を行なって得られるものを利用するが、本
発明のリポソームワクチンの製造におけるＴＳＡＰは、
上記抽出等を行なうことなく、起源癌細胞が有するＴＳ
ＡＰをそのまま、即ち該癌細胞のまま利用できる場合も
ある。

本発明において上記ＴＳＡＰの再構成に用いられるリポ
ソームは、ＤＤＰＣを含むリポソームである限り特に限
定されるものではなく、その代表例としては、本発明者
らの先の出願〔特開昭６１−２６７５０９号公報〕に係
わる方法により得られるものを例示できる。より詳しく
は上記リポソームは、通常のリポソーム形成用リン脂質
と上記ＤＤＰＣとを利用して、それ自体公知の各種方法
、例えば代表的にはポルテックス法（ｖｏｒｔｅｘ　ｉ
　ｎｇｍｅｔｈｏｄ又はＨｙｄｒａｔｉｏｎｍｅｔｈｏ
ｄ）　　（Ｂａｎｇｈａｍ、Ａ、Ｄ、。

５ｔａｎｄ　＋　ｓｈ、　Ｍ、　Ｍ。＆　Ｗａｔｋｉｎ
ｓ、Ｊ、Ｃ，Ｊ、Ｍｏ１．［５ｉｏ１．。

１３．２３８　（１９６５））に従って実施できる。

上記リポソーム形成用脂質としては、より具体的には例
えば、大豆、卵黄等から抽出、精製されたレシチン、ス
フイボミニリン等の膜中で水素結合帯形成を行ない得る
アミド基を有する脂質、極性頭部近くにジペプチド結合
を有する合成脂質（ＤＤＰＣ等）、好ましくは卵黄レシ
チン、シミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ
）等を例示できる。上記に５いて、特に好ましいりボソ
ームは、卵黄レシチンとＤＤＰＣとを併用するか又はＤ
ＤＰＣとＤＭＰＣとを通常約４：６（重量比〉で併用し
て調製される。

上記ＴＳＡＰによるリポソームの再構成は、基本的には
、両者を単に混合することにより、即ち、リポソーム懸
濁液に所定量のＴＳＡＰ水溶液を添加混合することによ
り実施できる。また癌細胞自体を利用する場合は、上記
と同様にリポソーム懸濁液中に癌細胞の適当量を添加し
てインキュベート後、癌細胞を遠心力！ｌｌｔ等の適当
な手段で除去することにより目的とする所望のリポソー
ムを得ることができる。上記におけるリポソームに対す
るＴＳＡＰの添加量は、得られるワクチンの活性発現能
と関連して非常に重要であり、一般には１鵬中のレシチ
ン１０１１１ｇに対して約２００μＱの蛋白質量程度と
するのが好ましい。

かくして得られるリポソームはそのまま本発明リポソー
ムワクチンとして利用できる。勿論必要に応じて、常法
に従い滅菌等の操作を施すこともできる。

本発明リポソームワクチンは、従来公知の他のワクチン
と同様にして、その所定量を動物に投与することにより
、該動物を免疫化することができる。該ワクチンを適用
され得る動物は特に限定はなく、ヒトを初めとする各種
の哺乳動物、その他の動物のいずれでもよい。また２等
動物の本発明ワクチン投与による免疫化も、一般的方法
に従うことができる。本発明ワクチンの投与経路として
は、皮下注射が一般的であるが、特にこれに限定される
ものではない。上記免疫化に当たっての本発明ワクチン
の投与量は、適宜決定できるが、通常投与量はＴＳＡＰ
として０．０１単位／マウス程度の量を目安とすること
ができる。尚、このＴＳＡＰ（７）１単（１：、２Ｘ１
０’　Ｂａ１ｂ　ＲＶＤＩＢ胞から抽出される抗原性蛋
白質量として表わされる。上記免疫化は、またワクチン
を約０．０１〜１０単位／個体となる量で、１〜２週間
に１〜４回程度投与することにより行なわれるのが適当
である。

叉−一厘一一１ 以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる
。

実施例　１　リポソームワクチンの調製１　）ＴＳＡＰ
の抽出 １０匹のＢＡＬＢ／Ｃマウス腹腔内で培養したＲＶＤ　
（白血病細胞〉細胞５〜１０ｘ　１０９ｆｉｎ採取し、
これを１１０００ｒｐで５分間遠心分離し、細胞ペレッ
トを得た。このベレットに同体積の０．８３％ＮＨｉ　
Ｃ９水溶液を加えて混在する赤血球を溶血させ、ｉｏｏ
ｏｒｐｍで５分間遠心分離して除去した。この操作は赤
血球が完全に溶血するまで数回繰返した。

次いで得られた細胞ペレットに２．５％ｎ−ブタノール
−ＰＢＳ溶液を細胞５Ｘ１０７個当たり１ｍ！Ｊ！Ｉ添
加して混合し、至瀧で７分３０秒インキュベートした。

その後、１１０００ｒｐで５分間遠心分離を行ない、更
に得られた上澄を２００Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離し
、その上澄をＴＳＡＰとして得た。

このＴＳＡＰ溶液約１００〜２００鵬を、ＰＬＡＴ限外
濾過機（ミリボア社製）で約５〜１０倍に濃縮し、濃縮
液を２００倍容量のＰＢＳに対して室温で２時間透析し
て、ＴＳＡＰ濃縮液（１３８μ（１）ＴＳＡＰ／１単位
／１−）を得た。

２）リポソームの調製 卵黄から文献記載の方法（Ｗ、Ｓ、Ｓｉｎｇｉｅｔｏｎ
、Ｈ，Ｓ。

Ｇｒａｙ、Ｈ，Ｌ、Ｂｒｏｗｎ、Ｊ、Ｌ、Ｗｈｉｔｅ、
　Ｊ、Ａｉ、ＯｉＩ　Ｃｈｅｍ、３ｏｃ、。

４２．５３　＜１９６５））に従い卵黄ホスファチジル
コリン（ＥＵＯＰＣ）を抽出し、アルミナカラムを用い
て精製した。その純度はＴＬＣにより確認した。

また、２，３−ジアミノプロピオン酸から特開昭６１−
２６７５０９＠公報〔砂本順三ら１日本化学会誌、１９
８７　（３）、　ｐ５６９−５７４）記載の方法により
、ＤＤＰＣを合成した。

上記ＥｇｇＰＣの１０．６ｍ（ＩＩとＤＤＰＣの７．　
Ｏｌｎｇとを混合し、ナス型フラスコ中で２１！ＩＩ２
のクロロホルム中に溶解さ、せた。ロータリーエバポレ
ーターを用いてクロロホルムを減圧下に留去し、更に減
圧デシケータ−中で一夜放置した。

次いで得られた溶液をポルテックスミキサー上でＰＢＳ
　（ｐＨ７，３８＞の１１１Ｑに膨潤させ、剥離した。

その後、ＵＲ２００Ｐプローブ型超音波破砕機（トミー
社製）を用いて、窒素ガス気流下に５分間、０℃、２５
Ｗで超音波照射して、所望のリポソーム懸濁液を得た。

３）リポソームワクチンの調製 上記１）で調製したＴＳＡＰ濃縮液１−と上記２）で調
製したリポソーム懸濁液１脱とを混合し、３７℃で２４
時間インキュベートして、本発明のリポソームワクチン
懸濁液を得た。

実施例　２　リポソームワクチンのｗＡ製１）リポソー
ム懸濁液の調製 ＤＭＰＣの３８．ＯＩＩｉｇとＤＤＰＣの２４．０ｍｃ
＋とを用いて、前記実施例１の２）と同様にして溶液を
調製し、これにＰ　Ｂ　Ｓ　２　ｍＱを加えてポルテッ
クスミキサーをかけ、その後、ＵＲ２００Ｐプローブ型
超音波破砕機を用いて、窒素ガス気流下に５分間、３７
℃で超音波照射して、所望のリポソーム懸濁液を得た。

２）リポソームワクチンの調製 上記１）で調製したリポソーム懸濁液１．５ｍｌとＢａ
１ｂ　ＲＶＤｌ、５ｘｌＯ８細胞とを混合し、３７°Ｃ
で１時間インキュベートした後、０．８μｍのフィルタ
ーで細胞とリポソームとを分離して、本発明のリポソー
ムワクチン懸濁液を得た。

このものがＴＳＡＰを含むことは、５ＤＳ−ＰＡＧＥに
より確認された。

実施例　３　リポソームワクチンの効果１６週令のＣＢ
６Ｆ＋雄性マウス（平均体重２０〜２５ｇ＞１群５匹に
、各種濃度（０，０１単位又は０．１単位ＴＳＡＰ）の
実施例１で調製したリポソームワクチン懸濁液を、２週
間間隔で２回皮下に投与して免疫し、最終投与から２週
間後に、供試動物の背部陵内にＲＶＤ細胞２Ｘ１０５個
を移植した。

その後、移植したＲＶＤ細胞のコロニーの直径を経日的
に測定して、リポソームワクチンの効果を判定した。

比較及び対照として、リポソームワクチン懸濁液に代え
て、ＴＳＡＰ及び生理食塩水をそれぞれ同様に投与した
群を設けた。

腫瘍移植１０日目における腫瘍径（ｍｍ）を以下の式に
より求めて効果の判定を行なった。

腫瘍径（ｍｍ）　＝　（短径士長径）／２その結果、生
理食塩水投与対照群では５例中４例において腫瘍直径が
１０ｍｍを越えた。

また丁ＳＡＰ単独投与群では、ＴＳＡＰｏ、１単位投与
群（１単位＝２Ｘ１０Ｂ細胞から抽出した抗原Ｍ）にお
いて５例中２例が、０．０１単位投与群において５例中
３例が、生理食塩水投与対照群と同様に腫瘍径がｌＱｍ
ｍを越えた。

之等に対して、本発明のリポソームワクチン投与群にお
いては、該ワクチン０．０１単位投与群（１単位＝２Ｘ
１０８細胞から抽出した抗原量）において、腫瘍の増殖
は全く認められず、顕著な腫瘍増殖抑制効果を奏するこ
とが確認された。

（以　上）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）癌細胞表面に顕在する抗原提示糖蛋白質を、１，
   ２−ジミリストイルアミド−１，２−デオキシホスファ
   チジルコリンを含むリポソームに再構成させてなること
   を特徴とするリポソームワクチン。