JPH02190182A - Ｌ―トリプトファン生産性微生物およびｌ―トリプトファンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＬ−トリプトファン生産性微生物およびこれを
用いたＬ−）リブトファンの製造法に関し、特にフォス
フォリボシル−５−ピロフォスフェートシンセターゼを
コードする遺伝子が増幅されたＬ−１−リプトラアン生
産性微生物およびこれを用いたＬ−トリプトファンの製
造法に関する。

〔従来の技術〕

Ｌ−トリプトファンの生化学的合成法としては従来より
種々の方法が提案されており、それに用いる微生物につ
いても培地中のＬ−トリプトファンの蓄積濃度の増大、
生産性の向上のため、優れた野生株の分離を初め、人工
的突然変異処理や遺伝子工学等の手法を用いた各種の改
良がなされている。

Ｌ−トリプトファンの生化学的合成法における生産菌の
主な改良を挙げると、生合成されたし−トリプトファン
自身による抑制や生合成経路におけるフィードバック阻
害機構を解除する為、人工的突然変異処理による３−メ
チルトリプトファンや５−フルオロトリプトファン等の
トリプトファンアナログ体に対する耐性の付与、あるい
は、遺伝子工学的手法を用いたＴｒＰ＾、　ＴｒｐＢ　
、　ＴｒｐＣ、ＴｒｐＤ　。

ＴｒｐＥ　、　ＴｒｐＦからなる一群のＬ−トリプトフ
ァン合成酵素群をコードする遺伝子（トリプトファンオ
ペロン）の増幅、さらにはＬ−トリプトファンの生合成
経路の最後に重要な役割を果たすし一セリンの菌体内生
合成能を強化する為に３−フォスフォグリセレートデヒ
ドロゲナーゼ等のし一セリン合成酵素群をコードする遺
伝子の増幅等が知られている。しかしながら、これらの
改良された菌株を用いても、従来のＬ−トリプトファン
の工業的醗酵生産においては必ずしも充分な高生産性が
得られているとは言い難い。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は高い生産性を有するＬ−トリプトファン
の工業的醗酵生産法を開発せんとするものであり、また
、その為に用いられる優れた微生物およびその取得法を
提供せんとするものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明によれば、フォスフォリボシル−５−ピロフォス
フェートシンセターゼをコードする遺伝子が増幅された
Ｌ　−１−ＩＪブトファン生産性微生物、特に、トリプ
トファンアナログ耐性を有Ｌ−トリプトファンオペロン
および３−フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ（
Ｌ−）リブトファン合成酵素群およびセリン合成酵素群
）をコードする遺伝子が増幅されたバチルス属の細菌、
その代表的なものとして具体的には、バチルスＳＤ−１
０３６（微工研寄託菌寄第１０４７７号）またはバチル
スＳＤ１０３７　（微工研寄託菌寄第１０４７８号）が
提供され、更には、当該微生物を培地に培養して培養物
中にＬ−トリプトファンを生成蓄積せしめ、これを取得
することを特徴とするＬ−１−リプトファンの製造法、
特に、培地中にアントラニル酸またはその塩の存在下に
培養することを特徴とする方法が提供される。

以下に、本発明について更に詳しく説明する。

Ｌ−トリプトファンの生合成経路は、先ずグルコースよ
りいくつかの中間体を経てコリスミン酸に至り、これよ
りアントラニル酸、Ｎ−５−フォスフォリボシルアント
ラニル酸、１−（ｏ−カルボキシフェニルアミノ−１−
デオキシリブロース−５″−リン酸、インドール−３−
グリセロール−リン酸を順次経てＬ−トリプトファンと
なると言われている。これらの反応経路には１または複
数の酵素が関与し、また、途中、例えばアントラニル酸
からＮ−５−フォスフォリボシルアントラニル酸への段
階では５−フォスホーα−Ｄ−リボース１−二リン酸（
ＰＲＰＰ）が、インドール−３グリセロール−リン酸か
らＬ−）リブトファンへの段階ではＬ−セリンがそれぞ
れ基質として作用している。これら一連の反応は互いに
微妙にバランスしており、Ｌ−トリプトファンを製造す
る反応に対していずれが主たる影響を持つかを見極める
ことは非常に難しい。特に、人工的突然変異処理や遺伝
子工学等の手法を用いて微生物の元の性質を変えてしま
った場合には尚更である。

本発明者等は、従来トリプトファンオペロンやセリン合
成遺伝子が増幅されているにも関わらず、それによって
期待されるＬ−ｔ−リプトファンの高い生産性は必ずし
も充分には得られていない原因の１つとして、上記５−
フォスホーα−Ｄ−リボース１−二リン酸に重要な鍵が
あるのではないかと考えた。

ところで、この５−フォスホーα−Ｄ−リボース１−二
リン酸を外部から補給することは、菌体中への取り込み
に難があると同時にこの物質が高価であるため経済的に
も無理がある。同様にこの物質生産の酵素であるフォス
フォリボシル−５−ビロフオスフエートシンセターゼの
外部からの補給についても反応中の分解および経済性を
考えた場合、実用的ではない。

そこで上記フォスフォリボシル−５−ピロフォスフェー
トシンセターゼをコードする遺伝子の増幅等の菌体自体
の改良が必要となるが、従来、この５−フォスホーα−
Ｄ−リボースｌ−ニリン酸あるいはフォスフォリボシル
−５−ピロフォスフェートシンセターゼに着目したと思
われるＬ−トリプトファンの製造法における生産菌の改
良については、殆ど知られておらず、僅かに、５−フォ
スホーα−Ｄ−リボース１−二リン酸が核酸代謝の中間
代謝物であることと関係があると推定される核酸塩基要
求性変異株を用いる方法や核酸アナログ耐性変異株を用
いる方法が知られているに過ぎず、しかも、これらの方
法では工業的に充分満足する生産性は得られていない。

本発明者は組み替えＤＮＡによりフォスフォリボシル−
５−ピロフォスフェートシンセターゼをコードする遺伝
子が増幅されたＬ−）リプトラアン生産性微生物を得る
ことに成功すると共にかかる微生物の使用により従来よ
りＬ−トリプトファンが高い生産性で得られることを見
出した。

Ｌ−トリプトファンは微生物の増殖に必須であり、その
合成系は微生物に普遍的に存在するから、本発明は広範
囲の微生物に応用することができる。

すなわち、本発明にいう微生物としては、例えば、バチ
ルス・ズプチルス、バチルス・アミロリクイファシェン
ス、バチルス・アミロリティカス、バチルス・アルカロ
フィラス、バチルス・コアギユランス、バチルス・ライ
ケニホルミス、バチルス・ナラトウ、バチルス・ステア
ロサーモフィラス等のバチルス属の細菌：大腸菌等のエ
シェリヒア属の細菌；コリネバクテリウム・グルタミカ
ム、コリネバクテリウム・リリューム等のコリネバクテ
リウム属の細菌；ブレビバクテリウム・フラバム、ブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のブレビバク
テリウム属の細菌；アースロバフタ−・シトレウス等の
アースロバフタ−属の細菌；ミクロコツカス・ルテウス
、ミクロコツカス・パリアンス等のミクロコツカス属の
細菌；キャンディダ属の酵母、ピプトポラス属、レンチ
ネラス属の真菌類などがある。これらの微生物として、
野生株の他に、種々の変異株特に、Ｌ−トリプトファン
アナログ耐性株、およびそれらを親株として遺伝子組換
えによってＬ〜トリプトファン合成系酵素やＬ−セリン
の生産能が高められている菌株が用いられる。

フォスフォリボシル−５−ピロフォスフェートシンセタ
ーゼをコードする遺伝子はそれ自体公知であり、広範な
微生物に存在する。大腸菌由来の該遺伝子はすでにクロ
ーン化されており（Ｂ、ＩＩｏνｅ−Ｊｅｎｓｅｎ、　
Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、　２０１．２６９（１
９８５）　、また、バチルス・ズブチカス由来の該遺伝
子もすでにクローン化されている（Ｄ、Ｎｉ１ｓｓｏｎ
及びＢ、１Ｉｏｖｅ−Ｊｅｎｓｅｎ、　Ｇｅｎｅ、　５
３．２４７（１９Ｂ？）　、従って、本発明において使
用するフォスフォリボニル−５−ピロフォスフェートシ
ンセターゼをコードする遺伝子は、これら公知の方法に
従って手入することができる。さらに、これらの公知の
方法を、該遺伝子を含有する他の微生物に適用すること
により、種々の由来の遺伝子を得ることができる。

次に、フォスフォリボシル−５−ピロフォスフェートシ
ンセターゼをコードする遺伝子の単離方法をバチルス属
微生物を例にとって具体的に説明する。まず、目的とす
る遺伝子を有している株より、染色体ＤＮＡを例えば、
斉藤と三浦の方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、
＾ｃｔａ、、　７２．６１９（１９６３））等に従って
抽出し、これを適当な制限酵素で切断する。

ついで、制限酵素で切断した大腸菌細胞内で増殖しうる
プラスミドベクターにＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて接
続し、得られた組換えＤＮＡを用いて、大腸菌の５゛−
フォスホーα−Ｄ−リボースｌ−ニリン酸合成能が高温
（４２°Ｃ）で欠損した変異株であるｐｒｓ変異株（Ｇ
ｅｎｅ、　５３．２４７（１９Ｂ？））を形質転換せし
め、５−フォスホーα−Ｄ−リボース１−二リン酸合成
能を獲得するに至ったことにより、高温で増殖するよう
になった菌株を単離し、これによりフォスフォリボシル
−５−ピロフォスフェートシンセターゼをコードする遺
伝子を分離できる。バチルス・ズブチルスのフォスフナ
リボシル５−ピロフォスフェートシンセターゼをコード
する遺伝子については、Ｄａｎ　Ｎｉ１ｓｓｏｎと［３
ｊａｒｎｅＨｏνｅ−Ｊｅｎｓｅｎにより単離されてい
るので、これを利用することも可能である（Ｇｅｎｅ、
　５３．２４７（１９Ｂ？））。

フォスフォリボシル−５−ピロフォスフェートシンセタ
ーゼをコードする遺伝子をＬ−１−リプトファン生産菌
、例えば細菌に導入・増幅する方法としては、細菌細胞
内で増殖しうるプラスミドベクターに導入遺伝子を組換
えて保持させる方法（プラスミド法）と、細菌染色体と
導入遺伝子の相同性を利用して染色体中に組み込ませる
方法（インテグレーション法）がある。プラスミドベク
ターを利用する場合は、まず、細菌細胞内で増殖しえる
プラスミドベクターを適当な制限酵素で切断する。つい
でこの切断された制限酵素切断点にフォスフォリボシル
−５−ピロフォスフェートシンセターゼをコードする遺
伝子を含むＤＮＡを接続し、得られた組換えＤＮＡを用
いてバチルス属細菌を形質転換せしめ、フォスフナリボ
シル５−ピロフォスフェートシンセターゼをコードする
遺伝子を保有するに至った菌株を単離し、これによりプ
ラスミドベクターに該遺伝子が結合した組換えＤＮＡが
取得できる。プラスミドベクターとしては宿主菌細胞内
で増殖しえれば何でもよく、例えばｐＵＢｌｌｏ、　ｐ
ｃ１９４．ρＥ１９４．　ｐＴＰ４．　ｐＴＰ５などの
ようなスタフィロコッカス・オウレウス菌由来のプラス
ミドやｐＬｓｌｌ、　ｐＬｓ１２．　ｐＬｓ１３．　ｐ
Ｌｓ１４．　ｐＬｓ１５のようなりリブティックな枯草
菌プラスミドに薬剤耐性マーカーを付与したプラスミド
ベクター等が利用できる。フォスフォリボシル−５−ピ
ロフォスフェートシンセターゼをコードする遺伝子を含
むＤＮＡの末端はベクターの末端と相補的になるように
制限酵素で切断されているか、またはそれぞれの両端に
相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを接続せ
しめであるか、それともそれぞれの両端が平滑末端にな
っているがいずれでもよい。ベクターとフォスフォリボ
シル−５−ピロフォスフェートシンセターゼをコードす
る遺伝子を含むＤＮＡの接続は、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ
を用いたライゲーション反応で行う。

形質転換は、使用する宿主に依存して、公知の方法によ
り行うことができる。例えばバチルス属細菌の形質転換
法は、Ｃ，１１，Ｄｕｎｃａｎ等のいわゆるコンピテン
トセル法（Ｇｅｎｅ、　ＬＬ１５３（１９７７））やＳ
、ＣｈａｎｇとＳ、Ｎ、Ｃｏｈｅｎのいわゆるプロトプ
ラスト法（Ｍｏｌｅｃ、Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、　１
６８．１１Ｈ１９７９））があるが、いずれでもよい。

フォスフォリボシル−５−ピロフォスフェートシンセタ
ーゼをコードする遺伝子がプラスミドベクターに結合し
た組換えＤＮＡを保有する形質転換株は受容菌として、
フォスフォリボシル−５＝ピロフオスフエートシンセタ
ーゼをコードする遺伝子゛の変異したバチルス・ズブチ
ルスを用いれば容易に得られるが、変異株を使用しない
場合はライゲーション反応の前にベクターをアルカリフ
ォスファターゼで処理すれば形質転換株の有するプラス
ミドを例えばＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　
Ｐ１３８＋　Ｔ。

Ｍａｎｉａｔｉｓら編集、コールドスプリングハーバ−
研究所１９８２年発行、に記載の方法で分析することに
より効率良く単離できる。別の効率的な方法としては、
先にクローン化したフォスフォリボシル−５−ピロフォ
スフェートシンセターゼをコードする遺伝子を含むＤＮ
Ａの該遺伝子以外のＤＮＡ部分にバチルス属細菌中で発
現可能な薬剤耐性マーカー等のマーカー遺伝子を−たん
組換え、その後プラスミドベクターに組換える方法があ
る。この場合、フォスフォリボシル−５−ピロフォスフ
ェートシンセターゼをコードする遺伝子がプラスミドベ
クターに結合した組換えＤＮＡを保有する形質転換体を
薬剤耐性の形質で選択することが可能となる。薬剤耐性
マーカー遺伝子としては、例えばｐＵＢ１１０由来のカ
ナマイシン耐性遺伝子、ｐＴＰ４＋ｐｃ１９４又ハｐｃ
２２１由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子、ｐＥ１
９４由来のエリスロマイシン耐性遺転子、ｐｓＡＯ５０
１由来のストレプトマイシン耐性遺伝子等がある。これ
らの耐性遺伝子と制限酵素を適宜選ぶことができる。上
記のようにして得られた、フォスフォリボシル−５−ピ
ロフォスフェートシンセターゼをコードする遺伝子がバ
チルス属細菌細胞内で増殖するプラスミドベクターに連
結された組換えＤＮＡをバチルス属細菌から選ばれる宿
主菌に導入する形質転換法は先に述べたコンピテントセ
ル法やプロトプラスト法があるがいずれでもよく、形質
転換体の選択はベクターに付与されている薬剤耐性マー
カーを利用すれば効率的である。

バチルス属細菌細胞内にフォスフォリボシル−５−ピロ
フォスフエトシンセターゼをコードする遺伝子を導入す
る方法としては、バチルス属細菌細胞内で増殖しうるプ
ラスミドベクターをベクターとする他に、バチルス属細
菌に溶原化しうるファージベクターを用いる方法もある
。

さらには、バチルス属細菌細胞内で増殖できないプラス
ミド（例えば大腸菌プラスミド）と、フォスフォリボシ
ル−５−ピロフォスフェートシンセターゼをコードする
遺伝子との組換えＤＮＡで形質転換を行ない、宿主細菌
染色体中に組換えＤＮＡをインテグレーションさせる方
法がある。

この方法は、トリプトファンオペロンやａｅｒＡ遺伝子
がプラスミドベクターにより増幅されている宿主細菌の
場合のフォスフォリボシル−５−ピロフォスフェートシ
ンセターゼをコードする遺伝子増幅法として有効である
。この場合、バチルス属細菌細胞内で増殖できないプラ
スミドにバチルス属細菌中で発現する薬剤耐性マーカー
が付与されておれば、宿主細菌染色体中にインテグレー
ションされた形質転換体を効率よく選択することができ
る。バチルス属細菌細胞内で増殖せず、かつバチルス属
細菌中で発現する薬剤耐性マーカーが付与されているプ
ラスミドに、フォスフォリボシル−５−ピロフォスフェ
ートシンセターゼをコードする遺伝子を組換える方法の
一例として大腸菌プラスミドベクターを利用する場合を
以下に述べる。

まず大腸菌プラスミドベクターを適当な制限酵素で切断
する。ついでこの切断された制限酵素切断点にフォスフ
ォリボシル−５−ピロフォスフェートシンセターゼをコ
ードする遺伝子を含むＤＮＡを接続し、得られた組換え
ＤＮＡを用いて、大腸菌のフォスフォリボシル−５−ピ
ロフォスフェートシンセターゼをコードする遺伝子欠損
株に形質転換せしめ、相補されることにより野生型大腸
菌に復帰した菌株を単離し、これにより大腸菌プラスミ
ドベクターに該遺伝子が結合した組換えＤＮＡが取得で
きる。大腸菌プラスミドベクターは、バチルス属細菌細
胞内で発現するマーカー遺伝子が付与されていることが
望ましく、マーカー遺伝子としては、例えばｐＵＢ１１
０由来のカナマイシン耐性遺伝子、ρＴＰ４．　ｐｃ１
９４又はＰＣ２２１由来のクロラムフェニコール耐性遺
伝子、ｐＨ１９４由来のエリスロマイシン耐性遺伝子、
ｐｓＡ０５０１由来のストレプトマイシン耐性遺伝子等
がある。これらマーカー遺伝子の大腸菌プラスミドベク
ターへの付与は組換えＤＮＡ技術の常法に従えばよい、
大腸菌プラスミドベクターとしては、バチルス属細菌内
で増殖しなければ何でもよく、例えばｐＢＲ３２２゜Ｃ
ｏ１ＥＬ、　ｐＵｃｌＢ、　ｐＵｃｌｌＢ、　ｐＨ５Ｇ
２９Ｂ、　ｐＨ５Ｇ３９６等がある。

フォスフォリボシル−５−ピロフォスフェートシンセタ
ーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡの末端はベクター
の末端と相補的になるように制限酵素で切断されている
か、またはそれぞれの両端に相補的な塩基配列を有する
オリゴヌクレオチドを接続せしめであるか、それともそ
れぞれの両端が平滑末端になっているかいずれでもよい
。ベクターとフォスフォリボシル−５−ピロフォスフェ
ートシンセターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡの接
続は、Ｔ４０ＮＡリガーゼを用いたライゲーション反応
で行なう。

大腸菌の形質転換法はカルシウム法（Ｊ、Ｂａ１ｔｅｒ
ｉｏ１．　＋１１ｉ　１０７２（１９７４））のような
公知の方法を用いることができる。

フォスフォリボシル−５−ピロフォスフェートシンセタ
ーゼをコードする遺伝子がプラスミドベクターに結合し
た組換えＤＮＡを保有する形質転換株は受容菌としてフ
ォスフォリボシル−５−ピロフォスフェートシンセター
ゼ合成能が変異した大腸菌（例えば温度感受性フォスフ
ォリボシル５−ピロフォスフェートシンセターゼ変異株
）ヲ用いれば容易に得られるが、変異株が無い場合でも
ライゲーション反応の前にベクターをアルカリフォスフ
ァターゼで処理すれば形質転換株の有するプラスミドを
例えばＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ＋　Ｐ１３
Ｂ（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓら編集、コールドスプリング
ハーバ−研究所１９８２年発行）に記載の方法で分析す
ることにより効率良く単離できる。

この様にして得られたフォスフォリボシル−５ピロフオ
スフエートシンセターゼをコードする遺伝子がバチルス
属細菌中で発現するマーカー遺伝子の付与された大腸菌
プラスミドベクターに組換えられた組換えＤＮＡをバチ
ルス属細菌に導入し、染色体中へインテグレーションさ
せる方法としては、先に述べたコンピテントセル法やプ
ロトプラスト法のいずれでもよく、マーカー遺伝子の形
質によって選択すればよい。

宿主細菌染色体中にフォスフォリボシル−５−ピロフォ
スフェートシンセターゼをコードする遺伝子を含む組換
えＤＮＡをインテグレーションさせる方法の場合、該遺
伝子の増幅は１倍にしかならないという欠点がある。そ
こで、あらかじめプラスミドベクターにバチルス属細菌
細胞中で機能することが自明でありその発現程度が強い
プロモーターを付与しておき、このプロモーター下流近
傍にフォスフォリボシル−５−ピロフォスフェートシン
セターゼをコードする遺伝子が発現可能となる方向で挿
入されることにより、該遺伝子の発現を強くすることが
可能となり、上記欠点を克服することが可能となる。

以上バチルス属細菌を例として、その細胞内にフォスフ
ォリボシル−５−ピロフォスフェートシンセターゼをコ
ードする遺伝子を導入、増幅する方法について、プラス
ミド法とインテグレーション法を詳しく説明したが、他
の微生物の場合においても、フォスフォリボシル−５−
ピロフォスフェートシンセターゼをコードする遺伝子の
単離方法、細胞内への導入、増幅法に基本的な差はない
。

ただし、他の微生物における組換えＤＮＡ技術は、プラ
スミドを利用した場合が一般的である為、プラスミド法
が容易である。

このようにして得られたＬ−トリプトファン生産能を有
する微生物を培養して、Ｌ−１−リプトファンを生成せ
しめる方法は、従来の方法と原則的に違う点はない。即
ち、培地としては、炭素源、窒素源、無機塩を含む通常
のものである。炭素源としては、ブドウ糖、糖蜜、ショ
糖、澱粉、澱粉糖化液、セルロース分解物等の糖類、酢
酸、エチルアルコール、グリセリンなど、窒素源として
は、アンモニア、硫安、温室、硝安、燐安等のアンモニ
ウム塩や尿素、硝酸塩等が適宜使用される。無機塩とし
ては、燐酸、カリウム、マグネシウム、マンガン等の塩
類、例えば燐酸アンモニウム、燐酸カリウム、燐酸ナト
リウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、苛性カリ等
の工業的薬品でよく、他に微量元素として、カルシウム
、亜鉛、はう素、銅、コバルト、モリブデン等の塩類を
添加してもよく、また微量有機栄養素としてビタミン、
アミノ酸、核酸関連物質等は菌の生育上特に必要ではな
いが、これ等を添加したり、肉エキス、酵母エキス、コ
ーンステイープリカー、ペプトン等の有機物を添加して
もよい。

Ｌ−トリプトファンの前駆物質としてアントラニル酸や
インドールを添加する方法はその生合成経路が短縮され
ること及び本発明の改良された菌株の使用にとって特に
効果的な製造法と言えるが、この場合アントラニル酸は
ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等の水溶液
や遊離酸のエタノール又はメタノール溶液として添加す
ればよく、インドールはエタノール又はメタノール溶液
として添加すればよい。培地中のアントラニル酸又はそ
の塩や、インドールの濃度に特に限定はないが、目的の
Ｌ−１リプトフアンの収量、培養条件および経済的観点
から一般的には、０．１〜３０００■／！好ましくは１
００〜１０００■／ｌの濃度とする。

本発明における培養は好気的条件下に、例えば通気撹拌
によって培養することができる。培養条件は特に制限は
ないが、−船釣に言えば温度３０〜４５°Ｃ，ｐＨ６〜
８及び１５時間〜６０時間程度の条件で実施する。

培養物からの目的のＬ−トリプトファンの採取方法は、
慣用方法に従って行うことができる。例えば培養物を遠
心分離し、その上清からイオン交換樹脂処理、活性炭処
理等の操作を適宜組合わせて、Ｌ−トリプトファンを単
離することができる。

以下に本発明のフォスフォリボシル−５−ピロフォスフ
ェートシンセターゼをコードする遺伝子が増幅された微
生物及びこれを用いたＬ−トリプトファンの製造法につ
いて代表的な実施例を示す。

〔実施例〕

バチルス属細菌染色体にフォスフナリボシル５−ピロフ
ォスフェートシンセターゼをコードする遺伝子を組込ん
で該遺伝子を増幅する為にはバチルス属細菌中で増殖で
きないような例えば大腸菌プラスミドベクターにバチル
ス属細菌中で発現するようなマーカー遺伝子を組換えた
プラスミドを用いる。さらにはフォスフォリボシル−５
−ピロフォスフェートシンセターゼをコードする遺伝子
の発現を強化する為に、バチルス属細菌で機能するプロ
モーター配列を該プラスミドに付与することが望ましい
。このようなインテグレーション用発現ベクターの構築
は以下のように行なった。

まずマルチクローニングサイｌを有する大腸菌プラスミ
ドベクターｐＨｃ１８０．５　ｎを制限酵素ＥｃｏＲＩ
で３７°Ｃ１６０分間反応後、０．５ユニツトのアルカ
リ性フォスファターゼを加え、５５°Ｃで３０分間イン
キュベーションした。常法に従いフェノール処理、エタ
ノール沈殿処理を行ない、ＥｃｏＲＩ反応液に溶解させ
た。バチルス属細菌中で機能する、５ＰＯ２フアージ由
来のプロモーターＰ２゜１を有する公知のプラスミドｐ
ＰＬ７０Ｂ（Ｇｅｎｅ、　１６．１９９（１９８１））
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃ
ｅｎｔｅｒ、オハイオ・ステート・ユニバージティーか
ら分譲購入できる。）ｌ！４をＥｃｏＲＩで３７°Ｃ１
６０分間反応後、６５°Ｃで２０分間熱処理し、前処理
したｐＵｃｌＢと混合し、ＡＴＰ存在下Ｔ４　ＤＮＡリ
ガーゼを用いて１６°Ｃで２０時間連結反応を行なった
。連結反応を行なったＤＮＡ溶液を用いて、常法により
塩化カルシウムで調整した大腸菌ｔｌＢｌｏ１に形質転
換した。

アンピシリン２５ｐｐｍを含むし寒天培地（ポリペプト
ンｌｏｇ、酵母エキス５ｇ、食塩５ｇ１寒天１５ｇ、水
１２）に塗抹後、３７°Ｃ１晩の培養で１のアンピシリ
ン耐性のコロニーが出現した。

２０コロニーを釣菌し、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ、Ｐ１３８（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓら編集、Ｃｏ
１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ研究所、１９８２年
発行）に従って、保有するプラスミドＤＮＡの大きさ及
び、プロモーターＰ２゜１を含む０．１７メガダルトン
のＤＮＡ断片の存在を調べた。６株の形質転換株がｐＵ
ｃｌＢに０．１７メガダルトンＤＮＡ断片が挿入されて
いた。次にプロモーターＰ！。１の挿入方向を決定する
為に、ダイデオキシ法による塩基配列の決定を行なった
。市販のシークエンスキット（宝酒造製、コード番号６
０１０）を用い、使用方法に従って塩基配列を決定した
ところ、ｐＵｃｌＢのマルチクローニングサイトに向っ
て転写が行なわれる向きでプロモーターＰ２゜、が挿入
されている形質転換株が３株あった。そのうちの１株か
ら取得されたプラスミドをｐＴＰｌ（Ｓ２０１と命名し
た（第１図参照）。

次にｐＴＰＫｓ２０１にバチルス属細菌中で発現するマ
ーカー遺伝子を付与した。まずスタフィロコッカス・オ
ウレウス由来であり、バチルス属細菌中で増殖し、テト
ラサイタリン耐性を示すプラスミドｐＴＰ５　（前述の
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅ
ｎｔｅｒより分譲購入可能）１ｇを制限酵素ｔｌｉｎｄ
ｌ［Ｉで３７°Ｃ１６０分間反応後、５５゛Ｃで３０分
間インキュベーションした。常法に従いフェノール処理
、エタノール沈澱処理を行ない、ＤＮＡポリメラーゼト
反応液に溶解後、ＤＮＡポリメラーゼＩ・にｌｅｎｏｗ
フラグメントを３ユニツト、各ｄＸＴＰ　２ナノモルを
加え、３７°Ｃで３０分間インキュベーションした。

常法に従いエタノール沈澱処理を行ない、ライゲーショ
ン反応液に溶解した。一方ｐＴＥＫｓ２０１は１眉を０
．５〜０．１ユニツトの制限酵素Ｐｖｕ　ＩＩで３７℃
、６０分間反応させ、少量の反応液をアガロース電気泳
動を行なって分析し、部分消化されていることを確認後
、ＩＭ）リス−Ｈ（Ｊ緩衝液（ｐＨ８，０）を１／１０
量加え、０．５ユニツトのアルカリ性フォスファターゼ
を加え、５５°Ｃで３０分間インキュベージジンした。

フェノール処理、エタノール沈澱処理を行ない、ライゲ
ーション反応液に溶解した。このようにして前処理され
たｐＴＰ５とｐＥＦＫｓ２０１を混合し、ＡＴＰ存在下
、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて１６°Ｃで２０時間連
結反応を行なった。連結反応を行なったＤＮＡ溶液を用
いて、常法により塩化カルシウムで調整した大腸菌ＨＢ
ＩＯＩに形質転換を行なった。

アンピシリン２５ｐｐｎ＋とテトラサイクリン１０ｐｐ
ｍを含むし寒天培地に塗抹後、３７°Ｃ１晩の培養で出
現した数個のコロニーを選び、前述の方法で保有するプ
ラスミドＤＮＡの構造を調べた。

このようにして、ｐＥＰＫｓ２０１にｐＴＰ５由来のテ
トラサイクリン耐性遺伝子を含む１，５メガダルトンの
ＤＮＡが第１図のように挿入されている３、２メガダル
トンのインテグレーション用発現ベクターｐｓＤＭｓ１
０５２が取得された。

（１）で得られたｐｓＤＭｓ１０５２ヘフォスフォリボ
シル−５−ピロフォスフェートシンセターゼをコードす
る遺伝子を組換える場合、プロモーターＰ２゜１の下流
に、フォスフォリボシル−５−ピロフォスフェートシン
セターゼをコードする遺伝子が転写される向きに挿入さ
れなければならない。

プロモーターＰ２゜１の下流にあるマルチクローニング
サイトにフォスフォリボシル−５−ピロフォスフェート
シンセターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡを挿入後
、分析して目的の向きに挿入されているものをスクリー
ニングするのも一法ではあるが、効率的に目的の向きに
挿入された組換えＤＮＡのみを選択する為に、まず、大
腸菌プラスミドｐＨ３Ｇ３９６のマルチクローニングサ
イトへ該遺伝子のリクローニングを行なった。

Ｄａｎ　Ｎｉ１ｓｓｏｎとＢｊａｒｎｅ　Ｈｏｖｅ−Ｊ
ｅｎｓｅｎによってバチルスズブチリスのフォスフォリ
ボシル−５−ピロフォスフェートシンセターゼをコード
する遺伝子がクローニングされており、該遺伝子はｐＤ
Ａ８と命名されたプラスミド上の１．１メガダルトンの
制限酵素Ｐｖｕ　ＩＩ断片に存在している。（Ｇｅｎｅ
、　５３＋２４７　（１９Ｂ？）　）。

まず、ｐＤＡ８１　ｎを制限酵素Ｐｖｕ　ＩＩで３７°
Ｃ１６０分間反応後、６５°Ｃで２０分間熱処理した。

次にｐ）ｌｓＧ３９６　（市販のものを利用）ｌＩ！ｇ
を制限酵素旧ｎｃ１１で３７゛Ｃ１６０分間反応後、６
５°Ｃで２０分間熱処理し、上記のｐＤＡ８の処理液と
混合し、ＡＴＰ存在下Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて１
６℃、２０時間連結反応を行なった。連結反応を行なっ
たＤＮＡ溶液を用いてフォスフォリボシル−５−ピロフ
ォスフェートシンセターゼの温度感受性変異株である大
腸菌ＨＯ６１１（Ｇｅｎｅ、　５３．２４７（１９Ｂ？
））の塩化カルシウム処理菌と混合、常法に従って形質
転換を行なった。クロラムフェニコール１０ｐｐｍを含
むし寒天培地に塗抹し、４２°Ｃで１晩培養すると数百
個のクロラムフェニコール耐性のコロニーが出現した。

このうちの３２株について前述の方法で保有するプラス
ミドＤＮＡの構造を調べた。

調べた全ての形質転換体のプラスミドは第２図に示した
ような向きに挿入されていた。このうちのひとつの組換
えＤＮＡをρ５ＥＹ１２２１と命名した。

（１）で構築されたインテグレーション用発現ベクター
ｐｓＤＭｓ１０５２１　ｎを制限酵素Ｂａｍ１１．　ｌ
と５ａｌＩで３７°Ｃ１６０分間反応、（２）で得られ
たプラスミドｐｓＢＹ１２２１　１８ｇを制限酵素Ｂａ
ｍＨＩとＸｈ。

■で３７°Ｃ１６０分間反応、両反応液を混合した。

常法に従ってエタノール沈澱を行ない、ライゲーション
反応液に溶解させた。ＡＴＰ存在下Ｔ４　ＤＮＡリガー
ゼを用いて１６℃、２０時間連結反応を行った。常法に
従って塩化カルシウムで処理した大腸菌ＨＯ６１１に形
質転換を行なった。

アンピシリン２５ｐｐｍを含むＬ寒天培地に塗抹後、４
２°Ｃで１晩培養すると数十個のアンピシリン耐性のコ
ロニーが出現した。

これら２０株について前述の方法で保有するプラスミド
ＤＮＡの構造を調べた。圃べた全ての形質転換体のプラ
スミドは、第２図に示したような構造をしていた。この
うちのひとつをｐｓＥＹ１４６１１と命名した。

（４）　１プ　フ　ン　　　への ｐｓＥＹ１４６１１のトリプトファン生産菌への導入は
、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇ
ｅｎｅｔ、。

１６８、１１Ｈ１９７９））に従った。形質転換菌はテ
トラサイクリン２．５　ｐｐｒＲを含むＤＭ−３再生培
地に生えてくる株を選んだ。受容菌であるトリプトファ
ン生産菌としては、バチルスアミロリクイファシェンス
に属する５Ｏ−１０２１（微工研菌寄第９５４９号）と
バチルス・ズブチリスＳＤ−１０２２（微工研菌寄第９
５５０号）を用いた。ＳＤ−１０２１およびＳＤ−１０
２２は、５−フルオロトリプトファン耐性で、トリプト
ファンオペロンが染色体上で２倍に増幅し、５ｅｒＡ遺
伝子が枯草菌プラスミドｐＬｓ１５−Ｅｍ（ｐｓＤＭＯ
Ｏ２３）に組換えられたｐｓＤＭＯＯ３５０を保有する
株である。

３０°Ｃにて３日間培養後に生えてきたテトラサイクリ
ン耐性株のＰＲＰＰシンセターゼの酵素活性測定の結果
を表１に示した。活性測定の方法はＡｎａｌｙｌｉｃａ
Ｉ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋９８．２５４（１９７
９）に従った。いずれの形質転換株の活性も宿主菌の数
倍に増大していた。バチルスＳＤ−１０２１の形質転換
株をバチルスＳＤ−１０３６、バチルスＳＤ−１０２２
の形質転換株をバチルスＳＤ−１０３７と命名し、前者
は微工研菌寄第１０４７７号、後者は微工研菌寄第１０
４１８号として夫々寄託されている。これら形質転換　
株の菌学的性質はフォスフォリボシル−５−ピロフォス
フェートシンセターゼ活性が高い（第１表）ことを除け
ば親株と実質的に同じである。

第一」−一表 トリプトファン生産菌のフォスフナリボシル５−ピロフ
ォスフェートシンセターゼ活性バチルスＳＤ−１０３６
及びバチルスＳＤ−１０２１、並びにバチルスＳＤ−１
０３７及びバチルスＳＤ−１０２２を培養し、Ｌ−トリ
プトファン生産能を調べたところ第２表に示す結果を得
た。

培養はグルコース５％、硫安０．２％、Ｋ、ＨＰＯ４０
，６％、クエン酸ナトリウム・　２１ｈ０　１　ｇ。

ＭｇＳＯ４’　　７Ｈｚ００．０２％、Ｐｅ５ｏ、　・
７Ｈ，Ｏｌｐｐｍ　。

Ｍｎ５Ｏａ　　ｌ　ｐｐＨｌを含む培地（ａｌ１７．０
　）　２１にアントラニル酸８００ｐｐｍを添加し、こ
れに形質転換菌５Ｏ−１０３６及びＳＤ−１０３７、並
びに親株ＳＤ−１０２１及びＳＤ−１０２２をそれぞれ
植菌し、３５°Ｃで５１のジャーファーメンタ−で通気
撹拌培養した。培養中、アントラニル酸濃度が５０ｐｐ
ｍ＋以下まで減少した時点でアントラニル酸濃度が約１
１０００ｐｐになるように適宜追加添加し、また培養途
中グルコースを１００ｇ追加し、更にアンモニア水の添
加により培地のｐＨを７．０±０．４に保ちながら１５
時間培養した。

生成したＬ−トリプトファンの濃度は高速液体クロマト
グラフィーで測定した。

培養成績を第２表に示す。形質転換体のＬ−１−リプト
ファン生産能は親株の１．２５倍に向上した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に供したインテグレーション用発現ベ
クターρＳＤＭＳ１０５２の作製法を模式的に示す。 第２図は、前記ベクター　ｐｓＤＭｓ１０５２にフォス
フォリボシル−５−ピロフォスフェートシンセターゼを
コードする遺伝子が組込まれたプラスミドｐｓＥＹ１４
６１１の作製法を模式的に示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、フォスフォリボシル−５−ピロフォスフェートシン
   セターゼをコードする遺伝子が増幅されたＬ−トリプト
   ファン生産性微生物。 ２、バチルス属の細菌であり、トリプトファンアナログ
   耐性を有しトリプトファンオペロンおよび３−フォスフ
   ォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が
   増幅された特許請求の範囲第１項の微生物。 ３、バチルスＳＤ−１０３６またはバチルスＳＤ−１０
   ３７である特許請求の範囲第１項または第２項の微生物
   。 ４、フォスフォリボシル−５−ピロフォスフェートシン
   セターゼをコードする遺伝子が増幅されたＬ−トリプト
   ファン生産性微生物を培地中で培養して培養物中にＬ−
   トリプトファンを生成蓄積せしめ、これを取得すること
   を特徴とするＬ−トリプトファンの製造法。 ５、培地中アントラニル酸またはその塩の存在下に前記
   微生物を培養することを特徴とする特許請求の範囲第４
   項のＬ−トリプトファンの製造法。 ６、バチルスＳＤ−１０３６またはバチルスＳＤ−１０
   ３７をアントラニル酸またはその塩の存在下に培地中で
   培養して培養物中にＬ−トリプトファンを生成蓄積せし
   め、これを取得することを特徴とするＬ−トリプトファ
   ンの製造法。