JPH02195880A - 組換えヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は組換えヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子
、特に複合型′！Ｉ！ＩＩＪｌの非還元末端にα（１−
３）結合ガラクトースを有する組換えヒト組織型プラス
ミノーゲン活性化因子に関するものである。

［従来の技術］ ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子（以下ヒトｔ−
ＰＡと呼ぶ）は、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼに
次ぐ新しい血栓溶解剤として注目を受けている生理活性
物質である。しかもこの物質はウロキナーゼと違って全
身の線溶能を光道することなく血栓部に対して特異的に
作用するという特性を有しているので、新しいタイプの
血栓溶解剤として注目されている。

ヒトｔ−ＰＡはヒトの正常組織、たとえば血管、子宮な
どに存在することが知られており、またヒトメラノーマ
細胞やヒト正常結局細胞等がヒトｔ−ＰＡを産生するこ
とも確認されている。さらに遺伝子組換え技術を応用す
ることによって、ヒトメラノーマ細胞（特公昭６２−１
６９３１）やヒト正常子宮組織（特開昭６１−１４９０
９４）等からヒト化−ＰＡをコードするｍＲＮＡを分離
し、これを用いて作成したｃＤＮＡをベクターに組込ん
で発現ベクターを得、更にこれを大腸菌やＣＨＯ細胞等
に導入してヒトｔ−ＰＡを産生したということも報告さ
れている。

天然に存在するヒトｔ−ＰＡ或は上記ＣＨＯ細胞の如き
真核細胞を宿主とする遺伝子組換え技術によって得られ
るヒトｔ−ＰＡはｍＭｉを有する環タンパクであるが、
この糖鎖に基づく特有の機能については、従来、はとん
ど何も分かつていなかった。

一方、ヒトメラノーマ細胞に由来するヒトｔ−ＰＡの解
析により、該ｔ−ＰＡの糖鎖に関する部分的構造及びそ
の結合位置も明らかにされている［Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂ
ｉｏｃｈｅａ＋、、１７０．６９−７５　　（＋９８７
）コ。しかしながら、ヒトｔ−ＰＡにおけるこれらの糖
鎖構造が生理学的性質にどの様な影響をもたらすのかと
いったことについては今だ如何なる情報も得られていな
い。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明は上記の様な事情に着目してなされたものであっ
て、特定された糖鎖構造を有することによって特異な生
理学的性質を期待することのできるヒトｔ−ＰＡを創製
することを目的とするものである。

［課題を解決する為の手段］ 本発明者らは、従来のヒトｔ−ＰＡとは生理学的性質に
おいて相違する組換えヒトｔ−ＰＡを見出すべく種々検
討した。その結果複合型糖鎖の非還元末端にα（１−３
）結合ガラクトースを有する組換えヒトｔ−ＰＡを作り
出すことに成功し、本発明に到達した。すなわち本発明
の組換えヒトｔ−ＰＡは、複合型＄３鎖の非還元末端に
α（１−３）結合ガラクトースを有する組換えヒトｔ−
ＰＡである。

［作用］ 本発明に係る組換えヒトｔ−ＰＡは環タンパクであって
、タンパク部分を構成するポリペプチドにおけるアミノ
酸配列中の２箇所又は３箇所に糖鎖が結合している。

ポリペプチド鎖が５３０個のアミノ酸配列からなる組換
えヒトｔ−ＰＡにあっては、ポリペプチドの第１２０番
目、第１８７番目及び第４５１番目の３箇所の各アスパ
ラギンにｍ鎖を結合したものと、第１２０番目及び第４
５１番目の２箇所の各アスパラギンにＭ鎖を結合したも
のがある。

またポリペプチド鎖が５２７個のアミノ酸配列からなる
組換えヒトｔ−ＰＡにあっては、ポリペプチドの第１１
７番目、第１８４番目及び第４４８番目の３箇所の各ア
スパラギンにＷｉ鎖を結合したものと、第１１７番目及
び第４４８番目の２箇所の各アスパラギンに糖鎖を結合
したものがある。尚上記におけるアミノ酸の配列順序は
Ｎ末端側から数えたものである。

以下、５３０個のアミノ酸配列からなるポリペプチドの
場合を代表的に取挙げて説明する。

該ポリペプチドの１２０番目のアスパラギンに結合する
１１鎮はハイ・マンノース型であり、１８７番目と４５
１番目のアスパラギンに結合する’ＨＲｍＢは複合型で
ある。そして本発明に係る組換えヒトｔ−ＰＡは、上記
複合型糖鎖の非還元末端にα（１−３）結合ガラクトー
スを有する点に特徴を有するものである。

また複合型１１釦は、一般にβ（１−４）結合マンノー
スを介して２〜４木に分岐したパイ・アンテナ型、トリ
・アンテナ型、テトラ・アンテナ型等の類型に分類する
ことができるが、本発明の組換えヒトｔ−ＰＡは、上記
したβ（１−４）結合マンノース１個当たり、α（１−
３）結合ガラクトースを少なくとも１個、具体的には１
個、２個、３個または４個有している。本発明の組換え
ヒトｔ−ＰＡはこの様なα（１−３）結合ガラクトース
を含有する組換えヒト−ＰＡを代表的成分として含有す
るものである。

本発明の組換えヒトｔ−ＰＡは複合型糖鎖の非還元末端
にα（１−３）結合ガラクトースが結合した糖鎖をもつ
組換えヒトｔ−ＰＡを少なくとも約５０モル％含有する
。

また本発明の組換えヒトｔ−ＰＡは複合型糖鎖の非還元
末端にα（２−３）結合Ｎ−アセチルノイラミン酸およ
び／またはα（２−６）結合Ｎ−アセチルノイラミン酸
が存在する。α（２−３）結合Ｎ−アセチルノイラミン
酸が存在するｔ−ＰＡと、α（２−６）結合Ｎ−アセチ
ルノイラミン酸が存在するｔ−ＰＡの割合は１０／９０
〜９０／１０（モル比）である。

本発明の組換えヒトｔ−ＰＡは組換えＤＮＡ技術により
産生ずることができるものであり、以下本発明において
採用される組換えＤＮＡ技術を説明する。

本発明に係る組換えヒトｔ−ＰＡをコードするＤＮＡ配
列はヒト子宮の正常組織中に存在するヒトｔ−ＰＡをコ
ードするｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ配列中に存在する。該
ｃＤＮＡは５′非非翻訳列、シグナルペプチドをコード
する配列、ヒト子宮正常組織のｔ−ＰＡをコードする配
列及び３゜非翻訳配列から構成されている。該ｃＤＮＡ
配列の作成法については特開昭６１−１４９０９４号公
報の記載に従えば良い。

本発明に係る組換えヒトｔ−ＰＡをコードするＤＮＡ配
列を含む発現ベクターは、上記ｔ−ＰＡをコードするｃ
ＤＮＡ配列の他に、哺乳動物細胞内において該ｔ−ＰＡ
をコードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列を発現させるのに必要
な制御因子［例えば、プロモーター、ポリ（Ａ）付加シ
グナル等］、上記哺乳動物細胞及び細菌細胞内で複製す
るのに必要な遺伝子及び該発現ベクターで形質転換また
は形質導入された上記哺乳動物細胞及び細菌細胞を同定
するのに有用な形質に対する遺伝子等から構成されてい
る。

該発現ベクターをさらに具体的に説明すると、プロモー
ターとしては、例えばマウスのメタロチオネイン遺伝子
、サルウィルス４０　（ＳＶ４０）のポリ（Ａ）付加シ
グナル及びｐＢＲ３２２から成るＤＮＡ配列の一部又は
全部を含むものが挙げられる。尚プロモーター配列とし
てはマウスのメタロチオネイン遺伝子以外に乳癌ウィル
スのＬＴＲ，ＳＶ４０の初期遺伝子等を使用することが
できる。

形質転換体または形質導入体の同定に有用な形質を担う
遺伝子としては、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）、
ネオマイシン耐性遺伝子等を利用できる。ＢＰＶのＥ２
遺伝子は宿主細胞を接触阻害による増殖停止がなくなる
ように形質転換するが、本発明の発現ベクターにおいて
はＥ２遺伝子を欠失したＢＰＶのＤＮＡ配列を利用でき
る。さらにＢＰＶの後期遺伝子の除去によって発現ベク
ターを小さくすれば、宿主細胞内において該発現ベクタ
ーをより安定に存在させることが可能である。

本発明の上記組換えヒトｔ−ＰＡを得るに当たって使用
される宿主細胞としては、マウスの上皮様細胞、例えば
Ｃ１２７細胞が示され、この細胞が上記発現ベクターに
よって形質転換または形質導入される。

本発明の組換えヒトｔ−ＰＡを製造するに当たっては、
上記形質転換または形質導入された宿主細胞を栄養培地
で培養し、該培養物から組換えヒトｔ−ＰＡを採取し、
更にこれを精製する。培養に使用する培地としては、例
えばイーグル最少必須培地、ダルベツコ変法イーグル培
地、１９９培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、ハムＦ１２
培地、イスコツ培地等が挙げられる。そして宿主細胞の
増殖期においてはこれらの培地中に、これら培地の５〜
２０％（Ｖ／Ｖ）に相当するウシ胎児血清、新生仔ウシ
血清等を加えて該細胞を培養する。培養条件としては、
培養温度を３０〜４０℃、培地のｐ）ｌを６．５〜７．
５の範囲に保持する。

接種細胞濃度は５Ｘ１０’　〜ｌＸ１０’ｌｌｌ胞／ｍ
ｌ（培地）であり、増殖に要する日数は３〜６日である
。他方組換えヒトｔ−ＰＡの生産工程における培養日数
については特に制限はない。

尚上記培養の実施に当たっては、培地中の溶存酸素を０
．２〜１．２ｍｇ／ｌの範囲にコントロールするのが良
く、これによって本発明の組換えヒト七−ＰＡを効果的
に産生せしめることができる。

上記形質転換体細胞の培養においては、細胞が増殖する
際に付着できる細胞付着担体を培養系中に含有せしめる
ことが望ましいが、ホローファイバー型の培養装置中で
該細胞を培養すれば、格別の細胞付着担体を使用しなく
とも細胞培養を効率良く進行させることが可能である。

本発明において使用できる細胞付着担体としてはプラス
チック類のもの以外に架橋デキストランより成る微粒子
担体やそれらの表面をコラーゲン被覆などによる加工処
理に付した微粒子担体、セルロースを主体とする微粒子
担体等の微粒子担体及び多孔性セラミックス等がある。

培養が終了すると、目的の組換えヒトｔ−ＰＡを採取す
るが、この方法・手段は常法に従えば良い、すなわち培
養に伴なって培地に分泌されるヒトｔ−ＰＡを培地と共
に回収し、精製工程に付す。

精製工程で使用する緩衝液としては、グリシン緩衝液、
酢酸塩緩衝液、酒石酸塩Ｎ？ｆｉ液、燐酸塩ｉ衝液等が
挙げられる。またアルキルエーテル系或はポリエチレン
グリコール系の非イオン性界面活性剤０．０１〜０．１
％（Ｖ／Ｖ）を上記緩衝液と組合わせて用いることもで
きる。又上記緩衝液と共存せしめる塩類としては塩化ナ
トリウム、塩化カリウム等が挙げられる。

精製方法としては、公知のイオン交換クロマトグラフィ
ー法やゲル濾過法の他、リガンドとして色素、レクチン
類、疎水性基、アミノ酸、基質アナログ、金属キレート
、抗ｔ−ＰＡ抗体等を有する樹脂を用いたアフイニテイ
・クロマトグラフィー法が挙げられるが、これら方法の
２つないし３つの方法を組合せることにより、高純度の
組換えヒトｔ−ＰＡを高収率で得ることができる。

本発明の組換えヒトｔ−ＰＡの一例についてその生理学
的性質および物理化学的性質を説明すれば下記の通りで
ある。

（１）作用 プラスミノーゲンに作用してプラスミンを生成する。

（２）合成基質に対する特異性 Ｈ−Ｄ−１１ｓ−Ｐｒｏ−＾ｒｇ−ｐＮ＾にａ＋＝１．
９　ｍＭ、　Ｋｃａｔ　ａ＋１２５ｅｃ−’＜Ｇｌｕ−
Ｇｌｙ−＾ｒｇ−ｐＮＡ にｍ＝９．９　ｍＭ、　Ｋｃａｔ　−８，９５ｅｃ−’
＜　Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−＾ｒｇ−ｐＮ＾ Ｋｍ＝３．１　ｍＭ、　Ｋｃａｔ　＝４．２５ｅｃ−’
（３）至１ａｐＨ ８〜９付近 （４）安定ｐＨ域 ｐＨ２〜１０ （５）ヒト自然抗体との反応性 ここに言うヒトの自然抗体とは、ヒト血漿中に存在して
、α（１−３）結合ガラクトースに対して特異的に反応
する自然抗体である［Ｊ、ＥｘｐＭｅｄ、、１６２．５
７３−５８２（１９８５）参照］　（以下この自然抗体
を抗Ｇａｌ抗体と呼ぶ）。

本発明の組換えヒトｔ−ＰＡは抗Ｇａｌ抗体と反応する
が、このことは、該反応がＧａｌ　α　（１−３）Ｇａ
ｌの存在によって阻害されることから明らかである（実
施例４参照）、この反応は他のオリゴ糖の存在によって
はほとんど阻害を受けない。

一方、ＣＨＯ細胞を宿主ｆｉｌ胞とする組換えヒトｔ−
ＰＡは抗Ｇａｌ抗体とは反応しない。

［実施例］ 実施例１ ベクターの構築 本発明に係る組換えヒトｔ−ＰＡをマウスＣ１２７細胞
中で発現させるのに好適な発現ベクターを以下に述べる
方法で構築した。酵素反応条件は各酵素の供給者が推薦
する条件とし、ＤＮＡ断片は常法に従ってゲル電気泳動
法により分離し、ゲルから回収して用いた。

（１）ｐＣＡＴＸ、ｐＣＡＴＸ　（Ｅ２−）ｐＣＡＴＸ
　（Ｅ”−）ｄＬの構築 ｐＣＡＴ（特開昭６ｌ−１４９０９４）の７ウスのメタ
ロチオネイン−１（ＭＭＴ−１）プロモーターの上流に
あるｍｌからＡｍｐ’遺伝子の上流にあるＥｃｏＲＩま
での約２０１０塩基を欠失させて、その間にＸｈｏＩ確
認部位を導入したρＣＡＴＸ、Ｅ”遺伝子と後期遺伝子
の片方［ＰＣＡＴＸ　（Ｅ”−）］および両方［ｐＣＡ
ＴＸ（Ｅ２−）ｄＬ］を欠失したプラスミドの構築を行
なった。

（ａ）　　ｐ　Ｍ　Ｌ　−Ｂ　Ｐ　Ｖ　Ｘ　ｆ）構築第
１図に示すようにして、ｐＭＬ ［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｅｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、、７９
．７１４７−７１５１　（１９８２）］　とＢＰＶ−１
の各ＤＮＡがＸｈｏｒリンカ−を介して繋がったｐＭＬ
−ＢＰＶＸを構築した。

（ｂ）　　ｐ　Ｘ　Ｔ　Ｐ　Ａ　−Ｂ　Ｐ　ノ構築第２
図に従ッテ、ｐｃＡＴのＭＭＴ−Ｉプロモーター上流に
ある工ヱエ１部位を７４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端
とした（Ｃ） （ｄ） （ｅ） 部位から、ＢＰＶのＨｉ　ｎ　ｄ　Ｉ１１部位までの約
５．４　ＫｂがＸｈｏ　Ｉリンカ−を介してｐＢＲ３２
２のＰ　ｖ　ｕ　ＩＩとＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＨに繋がった
ｐＸＴＰＡ−ＢＰを構築した。

ｐＭＬ−ｄ　ＢＰＶＸ　（Ｅ’−）　の構築ＢＰＶのＥ
２遺伝子を欠失したベクターを構築するために、先ず￥
Ｓ３図に示すよう＆ｌｌ：ｐＭＬ−ＢＰＶＸをｍＩおよ
びＮｃｏＩで切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末
端として再び結合させることによってｐＭＬ−ｄＢＰＶ
Ｘ　（Ｅ’−）’ａ：構築した。

ｐＣＡＴｄＬの構築 ＢＰＶの後期発現遺伝子の一部を欠失 させるためにｐ　ＣＡＴをＢａｍＨＴとＸｂａ　Ｉで切
断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端としてから、
再び結合させることによってｐＣＡＴｄＬを構築した（
第４図）。

ｐＣＡＴＸ、ｐＣＡＴＸ　（Ｅ２−）。

ｐＣＡＴＸ　（Ｅ’−）ｄ　Ｌの構築 第５図に従って、各プラスミドを構築した。

（２）　　ｐＮＡＴ−Ｎｅｏ、　　ｐＣＡＴ　　（Ｅ”
）−Ｎｅｏ、ｐＣＡＴ　（Ｅ”）ｄＬ−Ｎｅｏの構築ま
ずｐＣＡＴＸ、ｐＣＡＴＸ　（Ｅ”）およびｐＣＡＴＸ
　（Ｅ”）ｄＬ（７）ｐＭＬ領域（７）　Ａ　ｍ　ｐ　
ｒ遺伝子を原核細胞及び動物細胞で機能するＫｍ／Ｇ４
１８耐性機構をもつ遺伝子に変換するためのｐＣＡＴ−
Ｎｅｏ、ｐＣＡＴ−Ｎｅｏ　（Ｅ”）。

ｐＣＡＴ−Ｎａｏ　（Ｅ”）ｄＬを構築した。

（ａ）ｐＰｓｎｅｏの構築 第６図に示したように、ｐＳＶ２− ｎ　ｅ　ｏ　［Ｊ、Ｍｏ１．＾ｐｐ１．Ｇｅｎｅｔ、、
Ｉ　、３２７−３４１（１９８２）］のＳＶ４０の初期
遺伝子のプロモーターとポリ（Ａ）付加シグナルの間に
Ｔｎ５由来のＫ　ｒｎ　’遺伝子が挿入された領域を含
むＰ　ｖ　ｕ　ＩＩ　−Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ断片をｐＢＲ
３２２のＥｃｏＲＩ部位をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平
滑末端とされた（ｂ） （ｃ） 部位とＢａｍＨ１部位の間に挿入した ｐＰｓｎｅｏを構築した。ＥｃｏＲ１認識部位は復活す
る。

ｐｓｎｅｏの構築 第７図に従って、ｐＰｓｎｅｏの ＥｃｏＲ１部位を切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平
滑末端として、その間に ５ａｌｌリンカ−（ＧＧＴＣＧＣＣ）を挿入しｐＳｎｅ
ｏを構築した。

ｐＮｅｏの構築 ｐｓｎｅｏのＳａｌ　Ｉ−ＢａｍＨＩ　（約２．５にｂ
）を、ｐＭＬの複製のオリジン（ｏｒｉ）を含むＳａ　
１１−Ｘｈｏｌｌ　（１０７５ｂ）断片に結合してｐＮ
ｅｏを構築した（第７図）。

このプラスミドはｐ　Ｂａ３２２から該プラスミドが動
物細胞中で安定に保持されるのに有害な配列が除去され
たＤＮＡ複製ｏｒｉをもち、さらに大腸菌ではＫｍ耐性
、動物細胞で０４１８抵抗性を示す選択マーカーをもっ
ている。

（ｄ）　　ｐ　ＣＡ　Ｔ　−Ｎ　ａ　ｏ　、　　ｐ　Ｃ
Ａ　Ｔ　　（Ｅ　”）−Ｎｅｏ。ｐＣＡＴ　（Ｅ”）ｄ
Ｌ−Ｎｅｏの構築 第５図に示されるようにして、 ｐＣＡＴＸ、ｐＣＡＴＸ　（Ｅ”）あるいはｐＣＡＴＸ
　（Ｅ’−）ｄＬとｐＮｅｏからｐＣＡＴ−Ｎｅｏ、ｐ
ＣＡＴ　（Ｅ”）　−Ｎｅ゛０およびｐＣＡＴ　（Ｅ”
−）ｄＬ−Ｎｅｏを構築した。なお、Ｋｍ’遺伝子（Ｎ
ｅｏ’とも略称される）の転写の方向は第５図に示すよ
うにいずれでもよい。

（３）マウスＣ１２７細胞の形質転換及び組換えｔ−Ｐ
Ａを産生する形質転換細胞の選択マウスＣ１２７及び細
胞に上記発現ベクターを燐酸カルシウム沈殿法［Ｃｅ１
ｌ、　１１，２２３−２３２　。

（１９７７）］の変法（特開昭６ｌ−１４９０９４）を
用いて導入した０発現ベクターの導入された細胞を、そ
れらが０４１８（ジェネテイシン）耐性に形質転換され
ることを指標として、マウスＣ１２７細胞に対して１０
００　μｇ／ｍｌの０４１８を含有せしめ、さらに１０
％ウシ胎児血清、１０ｍＭグルタミンを含むダルベツコ
変法イーグル培地中で増殖する細胞として選別した。形
質転換体細胞のｔ−ＰＡ産生能は、培養液中の組換えｔ
−ＰＡ含有量をｔ−ＰＡ特異的ＥＬＴ　ＳＡによって検
定することにより判断した。

実施例２ えヒトｔ−ＰＡの生産 マウスＣ１２７細胞を宿主とし、ｐＣＡＴ−ＮｅＯを導
入したｔ−ＰＡ生産性組換え細胞を凍結保存用チューブ
に小分は分注して液体窒素中に保存（セルバンク）し、
これを元種としてｔ−ＰＡ生産培養を行なった。

セルバンクから再生した上記細胞をＴ−２５細胞培養フ
ラスコにて培養を開始し、継代培養をくりかえしながら
順次培養スケールの拡大を行なった後、３ＩＬ容量の卓
上型ファーメンタに移し種培養を行なった。

ファーメンタ培養に際して、細胞の装着面としてマイク
ロキャリアを培地中に添加した。酸素の供給に関しては
、培養液に接触するようにファーメンタ内にセットした
シリコンチューブ内に炭酸ガス及び酸素を富化した空気
を通気して行なった。ファーメンタ内に溶存酸素センサ
ーをセットし、培養液中の溶存酸素濃度（ＤＯ）をモニ
ターし、Ｄｏが０．２〜１．２　ｒａｇ／　ＪＺに保持
されるように通気中の溶存酸素濃度を調節した。

３１客容量ァーメンタで得られた細胞を種として２０Ｉ
１．容量ファーメンタに移した。

２０１容量フアーメンタ内で培養液量２０１で３日間培
養を行ない、細胞密度を十分に増加させた。培養終了後
、生産培地に切り替え生産培養を行なった。２日間の生
産培養の後ヒトｔ−ＰＡの蓄積した培！！液１７．５１
を得た。

生産培養の間は、通気中の酸素濃度を調節して培養液中
のＤＯを０．３〜０．９　ｍｇ／　ＩＬに保持した。

得られた培養液中のヒトｔ−ＰＡ濃度を分析した結果、
平均３０ｍｇ／Ｊ２であった。上記培養液から次のよう
にして、ヒトｔ−ＰＡの精製を行なった。

得られた培養液１７．５１を、疎水性アフィニテイクロ
マトグラフィーにより精製し、粗１−ＰＡ画分を得た０
次いで該ｔ−ＰＡ画分を、抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗
体をアフィゲル１０（バイオラッド社製）に結合させた
カラムを用いるクロマトグラフィーにより、さらに精製
した。

第２のクロマトグラフィーにより得たｔ−ＰＡ画分をゲ
ル濾過して、精製ヒトｔ−ＰＡを分離した。

実施例３ 組換えヒトｔ−ＰＡの糖頭構　解 実施例２で得られた組換えヒトｔ−ＰＡの糖鎖構造を解
析した。

組換えヒトｔ−ＰＡの糖鎖を３Ｈラベルするため、培養
液に３ＨラベルしたＮ−アセチルグルコサミンを加えて
実施例２と同様にして培養し、得られた培養液から組換
えヒトｔ−ＰＡを精製して試料とした。

組換えヒトｔ−ＰＡをβ−メルカプトエタノールで還元
してシスティン−システィン結合を切断し、続いてシス
ティン残基をカルボキシメチル化してカルボキシメチル
システィンとした。このカルボキシメチル化したｔ−Ｐ
Ａをトリプシン消化してペプチドに切断後、逆相系高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってペプチド
を分離したところ、’ｆｌｌｋＭを有するペプチドが２
群に分離された（ＧＰＴ、ＧＰＩＩ）。ＧＰＩに属する
糖鎖は複合型１１ｆｆを特異的に切断するペプチドＮ−
グリカナーゼＦによって遊隙され、またＧ　Ｐ　Ｉｆに
属する１１鎖は高マンノース型糖鎖に特異的なエンド−
β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨによって遊離さ
れた。

次いで、ペプチド部から遊離された糖鎖を逆相系ＨＰＬ
Ｃを用いてペプチド部から分離し、回収した。回収した
Ｉｇ鎖の還元末端を水素化ホウ素ナトリウムを用いて還
元し、糖アルコールとした。

ＧＰＩがら得られたＩ３鎖の一部をイオン交換ＨＰＬＣ
により分別回収し、分別回収した各糖鎖についてメチル
化分析を実施した。また、ＧＰＩから得られた糖鎖の別
の一部は、それをノイラミニダーゼ処理後、イオン交換
ＨＰＬＣ及びアミン系ＨＰＬＣにより各糖鎖に完全に分
別回収し、分別回収した各糖鎖についてメチル化分析、
グリコシダーゼを用いる酵素学的分析及びＮＭＲスペク
トルを用いる構造解析を実施した。

その結果第８図に示すα（１−３）結合ガラクトースを
有する１１鎖の存在を確認した。また、アミノ酸シーケ
ンサ−による解析からＧ　Ｐ　ＩＩは第１２０番目のア
スパラギンに結合するＷｉｌｌであること、またＧＰＩ
には第１８７番目と第４５１番目のアスパラギンの両部
位に結合する１１鎖が含まれていることがわかった。こ
のことから第１２０番目のアスパラギンには高マンノー
ス型糖鎖及びハイブリッド型糖が、また第１８７番目と
第４５１番目のアスパラギンには複合型糖鎖が夫々結合
しているとの結論を得た。更に複合型糖鎖の他の非還元
末端にはＮ−アセチルノイラミン酸が結合し、その結合
にはα（２−３）Ｎ−アセチルノイラミン酸およびα（
２−６）Ｎ−アセチルノイラミン酸の両様式の存在が認
められた。

実施例４ １区二免旦尉 ヒト血漿中には、先に述べたように抗Ｇａｌ抗体が存在
する。Ｇａ１ｉｌｉらはこの抗Ｇａｌ抗体が全ての正常
人の血漿中に存在し、その血中含量が全血液中ＩｇＧの
１％にも及ぶと報告した。更に彼らはこの抗Ｇａｌ抗体
をシンソーブ９ｏ免疫吸着剤（Ｃｈｅｍｂｉｏｍｅｄ　
Ｌｔｄ、製、Ｇａｌ　ａｌ−＋３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ
−Ｒ，Ｒは不溶性シリカマトリックス）を用いればヒト
血漿中から特異的に精製し得ることを示した［Ｊ、　Ｅ
ｘｐ、　Ｍｅｄ、、■曙、８９３−７０４　（１９８７
）コ。

そこで木発明者らはＧａ１ｉｌｉらの方法に従ってヒト
血漿から抗Ｇａｌ抗体を精製し、得られた抗Ｇａｌ抗体
と種々のｔ−ＰＡとの反応性を酵素免疫測定法により検
討した。

民江辷五迷二旦１ ５６℃、３０分の処理により非動化した正常ヒトブール
血漿（１００＋ａｌ）を、シンソーブ９゜免疫吸着剤（
１０＋ａｌ）を充填したカラムにかけた。０．１５Ｍ　
ＮａＣ１を含む１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７
，２）で洗浄後、０．５Ｍメリビオースを含む同１１衝
液（２０ｉｆ）を用いてカラムに結合した抗Ｇａｌ抗体
を溶出した。ピーク画分１０ｍ１を同緩衝液５１に対し
て４回透析し、その後タンパク濃度を０．５ｍｇ／ｍｌ
に濃縮した。

抗Ｇａｌ抗体と種々のｔ−ＰＡとの　応性本発明の０１
２７細胞由来組換えヒトｔ−ＰＡ（以下本発明のｔ−Ｐ
Ａという）及びＣＨＯ細胞由来組換えヒトｔ−ＰＡ　（
以下ＣＨＯ／ｌ　−ＰＡという）を０．１Ｍ炭酸水素ナ
トリウム水溶液（ｐＨ８，３）を用いて０．３〜３０　
μｇ／ｍｌの濃度に溶解し、これら各ｔ−ＰＡ溶液をＥ
ＩＡプレート（コースタ−社製）の多穴に１００μｌず
つ分注した。恒湿箱中に室温で一晩静置して抗原被覆を
行なった後、０．１５Ｍ　ＮａＣ１および０．０５％ツ
ウィーン２０を含む１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ６，７）を用いて５回ＥＩＡプレートを洗浄した。

次いで１％カゼイン、　０．０５％ＥＤ丁Ａ、　０．０
５％ツクィーン２０および０．４５Ｍ　ＮａＣ１を含む
３０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，７：希釈用緩
衝液）を用いて２００倍希釈した抗Ｇａｌ抗体をプレー
トの穴に１００μｌずつ添加し、３７℃で２時間静置し
た。プレートを洗浄後、希釈用Ｍ衝液を用いて１０万倍
希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（タボ
社製）を全ての穴に１００μｌずつ添加し、３７℃で２
時間静置した。プレート洗浄後、０．３％オルトフェニ
レンジアミンおよび０．０２％過酸化水素水を含むクエ
ン酸ナトリウム綴ａ５液（ｐＨ５，７）を全ての穴に１
００μｌずっ添加し、室温で１５分間静置して酵素反応
を行なわせた。次いで２Ｎ硫酸１００μｌを添加して反
応を止め、酵素反応により発色した反応液の４９０ｎｍ
における吸光度をＥＩＡ用オートリーダーにより測定し
た。その測定の結果は次の第１表に示す通りであった。

第　　１ 表 （被覆抗原量１０μｇ／ｍｌ） 抗Ｇａｌ抗体は本発明のｔ−ＰＡのみと反応し、ＣＨＯ
／１−ＰＡとは反応しなかった。なお、他の被覆抗原濃
度においても同様の結果が得られた。

さらに、希釈用緩衝液を用いてｉｏｏ倍希釈した抗Ｇａ
ｌ抗体溶液と、３ｍＭ濃度のオリゴ環とを等容量ずつ混
合して４℃で１６時間反応させた後、この混合物１００
μｌをあらかじめ本発明のｔ−ＰＡで被覆したプレート
の穴に添加した。

３７℃で２時間静置した後、上記におけるベルオキター
ゼ標識抗１ｇＧ抗体の添加以降と同様の操作を行なった
。

下記第２表に示すように、抗Ｇａｌ抗体と本発明のｔ−
ＰＡとの反応はＧａｌ　ａ　１−３Ｇａｌにより最も強
い阻害を受けることがわかった。尚第２表における反応
性（％）は競合オリゴ環を加えなかったと牲の吸光度を
１００として求めた。

第　２表　ガラクトースを含むオリゴ環との競合反応の
結果 抗Ｇａｌ抗体は本発明のｔ−ＰＡとのみ反応し、しかも
この反応はＧａｌ　ａ　１−３Ｇａｌによフて特異的に
阻害されるという結果は、本発明のｔ−ＰＡの糖鎖中に
はα（１〜・３）結合ガラクトースが存在するという実
施例３に示した糖鎖構造の解析結果との一致を示すもの
である。また、抗Ｇａｌ抗体とＣＨＯ／１−ＰＡとは反
応しないという結果は、このヒトｔ−ＰＡのＷ鎖中には
α（１−３）結合ガラクトースが存在しないことを示し
ている。

実施例５ は、高い比率でα（１−３）結合ガラクトースを含有す
るｔ−ＰＡ分子の存在することが明らかとなったと同時
に、ＣＨＯ／１−ＰＡには、全くα（１−３）結合ガラ
クトースが存在しないことが明らかとなった。

第　　　３　　　表 α（１−３）結合ガラクトースに強い親和性を有するレ
クチオンであるバンディラ豆凝集素Ｉ（ＢＳＬ）をアガ
ロースに共有結合したゲル（ＢＳＬ−ゲル）に本発明の
ｔ−ＰＡ及びＣＨＯ／１−ＰＡを各々０．１　ｕ　ｇ／
ｍｌ　〜１００　ｕ　ｇ／ｍｌの範囲で加え、４℃で１
６時時間上うした後、遠心分離し、上澄液中のｔ−ＰＡ
をＥＬＩＳＡを用いて定量し、α（１−３）結合ガラク
トースを含有するｔ−ＰＡの存在比率を検討した。

その結果、本発明のｔ−ＰＡにおいて約８０％がＢＳＬ
−ゲルに吸着したのに対し、ＣＨＯ／１−ＰＡでは、Ｂ
ＳＬ−ゲルへの吸着が全く詔められなかった。このこと
より、本発明のｔ−ＰＡに実施例６ 匡吏監里二菫上 （１）投与薬剤の調製方法 実験に使用したｔ−ＰＡは本発明のｔ−ＰＡを含有する
製剤、ＣＨＯ／１−ＰＡを含有する製剤の２種である０
両製剤をそれぞれ注射用蒸留水に溶解した後、生理食塩
液で希釈して試料液とした。投与薬剤の濃度は、ともに
ｌｌ１１ｇ／ｌｌ１ｌであった。

（２）投与方法 調製した３０１の薬剤をそれぞれ定速で、チンパンジー
の静脈より６０分を要して点滴で投与した。なお使用し
たチンパンジーは各群２匹であり、体薬期間を１週間と
した交叉試験方法により実施した。

（３）採血方法 採血は、各時点においてチンパンジーの外側前腕皮静脈
より行ない、抗凝固剤としてクエン酸ナトリウムを使用
した。静脈血を遠心分離して、血漿を分離し、薬物濃度
測定開始まで一８０℃で凍結保存した。

（４）濃度測定方法 血漿中のｔ−ＰＡ濃度測定はＥＬＩＳＡにより行なった
。

（５）薬動力学的解析 ＥＬＩＳＡにより得られた各時点における血漿中ｔ　−
Ｐ　Ａｆｉ度の測定結果から、クリアランスを算出した
。クリアランス値を第４表に示す。

第　　　４　　　表 第４表に見られる通り、本発明のｔ−ＰＡのクリアラン
ス値は、ＣＨＯ／１−ＰＡのそれよりも３０％小さかっ
た。従って本発明のｔ−ＰＡの代謝はＣＨＯ／１−ＰＡ
の代謝より緩やかに進行することが判明した。

このように本発明のｔ−ＰＡは、その糖鎖中にα（１−
３）結合ガラクトースを有するため、チンパンジーの体
内に存在する抗Ｇａｌ抗体と結合し５、代謝が緩やかに
なったものと考えられる。

（６）チンパンジ一体内の抗Ｇａｌ抗体量の測定方法 血漿中杭Ｇａｌ抗体量の測定は酵素免疫測定法により行
なった。

（７）血漿中杭Ｇａｌ抗体量の測定結果酵素免疫測定法
により測定した血漿中杭Ｇａｌ抗体量の測定結果を第５
表に示す（２匹の平均値）。

第　５表　　血漿中杭Ｇａｌ抗体量（％）（平均値、ｎ
＝２） 第５表に示すように本発明のｔ−ＰＡを投与していくと
、チンパンジーの血漿中に存在する抗Ｇａｌ抗体量は低
下し、抗Ｇａｌ抗体が本発明のｔ−ＰＡと結合している
ことを示している。一方、ＣＨＯ／１−ＰＡにはこのよ
うな抗Ｇａｌ抗体量の低下は認められなかった。

（８）ヒトにおける血漿中動態 ヒトの血漿中においても、チンパンジーと同じく、抗Ｇ
ａｌ抗体が存在することを確認している。

従ってヒトに対して本発明のｔ−ＰＡ及びＣＨＯ／１−
ＰＡを投与すれば、本発明の七−ＰＡの方がＣＨＯ７／
１−ＰＡに比べて代謝が緩やかになるであろうと推定さ
れる。

［発明の効果］ 本発明のｔ−ＰＡはｍ鎖中にα（１−３）結合ガラクト
ースを含有することにより抗Ｇａｌ抗体と反応する０人
体に投与した場合は、ｔ−ＰＡの半減期が長くなり、血
中濃度が比較的高いレベルで安定し、より強力な血栓溶
解効果が発揮されると期待される。

【図面の簡単な説明】

第１〜７図は発現ベクター構築の手順を示す図である。 第８図は本発明の組換えヒトｔ−ＰＡに結合したα（１
−３）結合ガラクトースを有する糖鎖を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 複合型糖鎖の非還元末端にα（１−３）結合ガラクトー
   スを有する組換えヒト組織型プラスミノーゲン活性化因
   子。