JPH02196961A

JPH02196961A - リンパ球の機能検査法

Info

Publication number: JPH02196961A
Application number: JP1680789A
Authority: JP
Inventors: Yasukazu Omoto; 安一大本; Keiko Mizuno; 水野　啓子; Yoshikatsu Hirai; 嘉勝平井
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1989-01-25
Filing date: 1989-01-25
Publication date: 1990-08-03

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】り泉上の皿回Ａ１本発明は新しいリンパ球の機能検査法に関する。

炙−米一五一旦一■ 免疫応答は、大きく２つに分けることができる。

抗体生産による体液性免疫と、直接免疫担当細胞の関与
する細胞性免疫とである。しかし抗体産生も細胞によっ
て行なわれ、免疫系はすべて細胞、特にリンパ系細胞の
機能の反映といえる。免疫担当細胞の量的、質的（機能
的）な変化は、免疫不全症や事故免疫疾患をはじめ、多
くの病気の発生につながっている。どのように異常が存
在するかを検索するために、従来から種々の抗原に対す
る抗体価の測定や、精製ツベルクリン（ｐｕｒｉｆｉｅ
ｄｌ）ｒｏｔｅｉｎ　ｄｅｒｉＶａｔｉＶｅ　ｏｆ　ｔ
ｕｂｅｒｃｕｌｉｎ）ヤシニトロクロルベンゼン（ＤＮ
ＣＢ）に対する遅延型皮膚反応が、用いられてきたが、
近年、リンパ球の細胞表面マーカーによる数の同定、そ
して各々の機能のｉｎ　ＶｉｔｒＯでの解析が研究至だ
けでなく臨床検査室のレベルにおいても広く行なわれる
ようになった。

近年、遺伝子工学の目覚ましい発展によって組換えＤＮ
Ａ技術を用いて、多くの体液性因子（リンフォカイン等
）の遺伝子の構造が解明されている。現在ＩＬ−１α、
ＩＬ−１β、ＩＬ−２，１ｍ−３、Ｉ　Ｌ−４、ＩＬ−
５、ＩＬ−６、ＧＭ−Ｃ３ＦＳＭ−Ｃ３Ｆ、Ｇ−Ｃ８Ｆ
、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、
Ｉ　ＦＮ−γ等種々のものが報告されており、生体内で
は之等の体液性因子によって免疫系が維持されている。

之等の物質を測定することは、生体の免疫系を考える上
で重要でおるが、血液中の体液性因子の含量は少なく、
通常それらの測定は困難である。また、血中濃度を測定
することも大切であるが、−歩踏込んで血液の体液性因
子の産生量／反応性を知ることも大切である。

まず、リンパ球測定法として１９６０年にノウエル（Ｎ
ＯＷｅｌｌ）により見出されたツルインゲン豆から抽出
、精製されたＰ　ＨＡ　（’ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌ
ｕｔｉｎｉｎ）に対するリンパ球の芽球化現象がヒトに
おける細胞性免疫機能研究の端緒となった。その後、リ
ンパ球の芽球化はＰＨＡのほかにアメリカヤマゴボウ由
来のＰＷＭ　（ｐｏｋｅｗｅｅｄ　ｍｉｔｏｇｉｎ）、
ナタマメ由来のＣｏｎＡ　（ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ
　Ａ）等でも引起こされることが明らかとなり、之等の
物質はマイトゲン（ｍｉｔｏｇｅｎ　、有糸分裂物質）
と呼ばれている。

ＰＩＣＡ及びＣＯｎＡは主としてＴ細胞を、ＰＷＭは■
細胞及びＢ細胞の両細胞を芽球化に導くとされている。

ヒトのリンパ球機能を検討する多くのｉｎ　ＶｉｔｒＯ
試験の中でも、上記マイトゲンを利用したリンパ球芽球
化試験は最も簡単で、再現性が高く、しかも定量性があ
るので、これまでで最も広く行なわれてきた方法の一つ
である。

このリンパ球機能検査法の一般的方法としては、血液か
らレクチンと反応する赤血球を除き、リンパ球にして各
々マイトゲンと反応させて細胞の幼若化をみているが、
この方法は尚測定系を簡略化すべき余地がある。即ち、
この方法では被処理対蒙と゛するリンパ球自体の採取、
調製に無菌処理を含む繁雑な操作が必要となる不利があ
る。

■が解゛しようとする４　点本発明の目的は、細胞の、幼若化を指標とすることなく
、リンホカインの産生量を指標として、より簡略化され
た測定系にてリンパ球機能検査を行ない得、従来のリン
パ球検査法の欠点を解消された新しい検査法を提供する
ことにある。

口　１、を　′するための本発明によれば、仝血を用い、該全血中のリンパ球のリ
ンフォカイン産生を誘導させ、該リンフォカインの産生
量を測定することを特徴とするリンパ球の機能検査法が
提供される。

本発明のリンパ球機能検査法は、上記の通り仝血をその
まま利用するものであり、該仝血より末梢リンパ球を分
画する必要がなく、それに伴われる処理時間、操作が不
要であることは勿論のこと、該分画によるリンパ球の活
性低下の問題点もない。

更に、本発明方法ではサンプル量も１００μＱ程度で充
分であり、これは従来のこの種検査法に用いられるサン
プル四が通常１０ｒｔＪ程度であることと比べて１／１
００と非常に少量である。

また、本発明方法の利用によれば、例えば抗ガン剤等の
薬物を投与された患者において、該薬物が患者の生体内
でリンパ球にどのように働いて、該リンパ球のリンホカ
イン産生成いは抑制にどのように影響するかを把握する
こともでき、これによって、該患者に最適な投与薬物の
選択を行なうことが可能である。更に本発明方法は、リ
ンホカインの産生成いは抑制を促す薬剤等の研究、開発
にも有用である。

以下、本発明方法につき詳述すれば、本発明方法の好ま
しい一実施態様においては、サンプルとしての血液を採
取し、この仝血を適当な培地と共にプレートに加え、適
当な刺激剤（インデューサー等）を追加した後、培養し
、培養上清を取り、そのリンホカイン生産量を測定する
ことにより実施できる。

上記において血液サンプルの採取は常法に従い、例えば
ヘパリン採血、クエン酸採血等により実施できる。仝血
＠養用培地としては、例えばＰＢＳ、ハンクス液、Ｄ−
ＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０等の通常の培地をいずれも
利用できる。該培地に対する血液サンプル量は、通常培
地１．０−当り約０．１鵬程度とするのが適当である。

用いられるインデューサーは、測定すべきリンフォカイ
ン、例えばＩＬ−１等の産生を刺激促進できるものであ
ればいずれでもよく、通常ＬＰＳ、ＰＨＡ。

ＱｏｎＡＳＰＷＭ等のレクチンやリンフォカイン（ＩＦ
Ｎ−γ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β等）、ウィルス等を使
用でき、之等の内では特にＬＰＳが好適であり、その使
用量は一般にサンプル血液と等量程度とするのがよい。

また培養は通常３７℃付近の温度条件下に１９〜４８時
間程度、好ましくは３７℃下に２４時間前債を要して実
施される。

上記培養後の培養上清のリンホカイン産生量の測定は、
該リンフォカインの種類に応じて各種の通常の免疫測定
法、代表的には高感度エンザイムイムノアッセイ系等で
行ない得る。待にＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２〜
ＩＬ−６、ＧＭ−Ｃ３Ｆ。

Ｍ−Ｃ３ＦＳＧ−Ｃ３Ｆ、■ＮＦ−α、ＴＮＦ−β、Ｉ
ＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ等の測定は、ＥＬＩ
ＳＡ法（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ！、、　１ユ。

１５２７−１５３０　（１９８７））によるのが適当で
ある。

かくして、本発明によれば血液サンプルの上記各種のリ
ンフォカイン産生量を指標として、単一工程で、同時に
多数の血液サンプルを、少量のサンプル量で、容易且つ
簡便に、しかも無菌操作を要することなく検定できる。

及−里一五一四一１本発明方法の実施によれば、例えば病態時のリンフォカ
インの産生量変化をモニターして病態を把握することが
でき、健康人のリンフォカイン産生量変化をモニターし
て健康状態を把握することもできる。また制ガン剤等の
薬物に対する感受性は個人によって異なるが、本発明方
法によってこれを事前に調査したり、２等薬物のリンフ
ォカインに対する影響を調べ、各種薬物のスクリーニン
グを行なったり、免疫システムの研究解明等を行なうこ
ともできる。

！−−度一一圀以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる
。

実施例　１同一人からヘパリン採血又はクエン酸採血した仝血をサ
ンプルとして、その０．１ｍｆ２をＲＰＭＩ−１６４０
の１．０ＩＩｌｉ２と混合し、混合物を所定時間放置し
た後、２４ウエルプレートに加え、インデューサーとし
てＬＰＳ（デイフコ社製）の０、　’１１１１１２を各
ウェルに加えるか又は加えることなく、３７℃で２４時
間培養した。

次いで各ウェルの培養上清を取り、高感度イムノアッセ
イＣＥＬＩＳＡ法、ＥＵｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、
　。

１７．１５２７−１５３０（１９８７））により、該上
清中のＩＬ−１α及びＩＬ−１β量を測定した。

放置時間（分）及びＬＰＳの添加の有無（図中＋−で表
示）の変化により、それぞれ測定されたＩＬ−１α及び
ＩＬ−１β量（ｐ９／戒）を第１図（ヘパリン採血され
た血液サンプルの場合）及び第２図（クエン酸採血され
た血液サンプルの場合）に示す。

２等各図より、同一人からの各採血法による血液サンプ
ルは、ＬＰＳ刺激によりほぼ同程度（クエン酸採血の場
合の方がやや高いが）のＩＬ−１産生が認められること
が判る。またＬＰＳ無刺激ではＩＬ−１産生量は検出感
度以下である。

・実施例　２同一人からヘパリン採血した仝血０．１ｍｌを、０〜９
時間に亘って４℃又は室温（２３℃）で保存後、ＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地１，０ｍ１２と混合し、２時間以内に
２４ウエルプレートに加えると同時にＬＰＳ（コーニン
グ社製）０．１＋１１ｉ２を各ウェルに加え、３７℃で
２４時間培養した。

次いで各ウェルの培養上清を取り、実施例１と同様にし
て高感度イムノアッセイにより、該上清中のＩＬ−１α
及びＩＬ−１β四を測定した。

上記保存を４℃で行なって得られた結果を、第３図の（
１）［棒グラフ］及び第３図の（２）［最大値を１００
とする百分率（％）で表わされた折れ線グラフ］に示す
。各図において縦軸はＩＬ−’ｌα又はＩＬ−１β量（
１）（７／１１１１２又は％）を、横軸は時間（時間）
を示し、（１）はＩＬ−１βであり、（２）はＩＬ−１
αである。

また室温で保存した時の同結果（但し血液提供者は異な
る）を同様にして第４図の（１）及び（２）に示す。

２等各図より、室温及び４℃のいずれで保存する場合で
も、採血より２時間以内にＬＰＳ刺激を行なえば、最大
産生量の８割以上のＩＬ−１産生を得ることが判る。

実施例　３同一人からヘパリン採血した全血０．１ｍｌを各種培地
１．０鵬と混合し、２時間以内に２４ウエルプレートに
加えると同時にＬＰＳ（コーニング社製）０．１１１１
Ｑを各ウェルに加え、３７℃で２４時間培養した。

次いで各ウェルの培養上清を取り、実施例１と同様にし
て高感度イムノアッセイにより、該上清中のＩＬ−１α
及びＩＬ−１β量を測定した。

用いた培地の変化により、それぞれ測定されたＩＬ−１
α及びＩＬ−１β間（ｐｇ／鵬）を第５図に示す。

第５図より、用いたいずれの培地でもＩＬ−１α（グラ
フ（２））の産生は同程度であるが、ＩＬ−１β（グラ
フ（１））の産生量はＰＢＳ及びハンクス液の利用の場
合に比べてＤ−ＭＥＭ及びＲＰＭＩ−１６４０培地の利
用の場合の方が２〜３倍多いことが判る。

実施例　４実施例３において、ＬＰＳ添加聞及び培養時間を変化さ
せ且つ培地として１０％ＦＣ８を加えたＲＰＭＩ−１６
４０を選択して、同様にしてＩＬ−１α及びＩＬ−１β
量を測定した。

結果を第６図及び第７図に示す。

第６図はＩ［−１α産生量（Ｅ）（］／ｌ１ｆ２）を縦
軸とし、培養時間（時間）を横軸として、各ＬＰＳ添加
量について得られた結果をプロットしたものでおり、第
７図は同様にしてプロットしたＩＬ−１β産生量（１）
（１／ｍ２＞の測定結果である。各図においてグラフ（
１）はＬＰＳ１０μｑ／鵬添加を、（２）は同１μｇ／
脱添加を、（３）は同０．１μｑ／−添加を、（４）は
無添加をそれぞれ示す。

之等の図より、ＬＰＳＩＯμＣｌ／ｗ：１１度の添加の
場合に最大のＩＬ−１産生が認められる。

実施例　５ＲＰＭＩ−１６４０培地を選択して、実施例３と同様に
して所定時間培養を行なった後、同様にしてＩＬ−１α
及びＩＬ−１β四を測定した。

結果を第８図に示す。

第８図はＩＬ−１α産生量（ｆ）（Ｊ／ｌｌｌ１２＞　
　（グラフ（１））又はＩＬ−１β産生量（りＭ鵬）　
（グラフ（２））を縦軸とし、培養時間（時間）を横軸
として、ＩＬ−１産生最の経時変化をプロットしたもの
である。

該図より、Ｌ　Ｐ　Ｓ　１ｉｌｌ激後の培養４〜８時間
時間区中Ａの期間）はＩＬ−１α及びβ共産生期であり
、その後１９〜７２時間目（図中Ｂの期間）ではＩＬ−
１の産生は終了してあり、従ってこの時期がＩＬ−１の
サンプリングに適していることが判る。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は本発明実施例１に従い求めたＩＬ−
１α及びｌ−１β産生量を示すグラフである。第３図及び第４図は本発明実施例２に従い求めたＩＬ−
１α及びＩＬ−１β産生量を示すグラフである。第５図は本発明実施例３により求められたＩＬ−１α及
びＩＬ−１β産生量を示すグラフである。第６図及び第７図は本発明実施例４に従い求めた１ｍ−
１α及びＩＬ−１β産生量を示すグラフである。第８図は本発明実施例５により求められたＩＬ１α及び
ＩＬ−１β産生量を示すグラフである。（以　上）（９８７ｍ１）侍看時間（時間）第図第図 π 図傍１時開（Ｂ＋藺）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）全血を用い、該全血中のリンパ球のリンフォカイ
ン産生を誘導させ、該リンフォカインの産生量を測定す
ることを特徴とするリンパ球の機能検査法。