JPH02200177A - 動物細胞培養用組成物、培養方法および生理活性物質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、動物細胞を培養するための組成物、動物細胞
の培養方法および生理活性物質の製造法に関する。

（従来の技術） 動物細胞を大量に効率よく培養する技術は、モノクロー
ナル抗体をはじめ有用な生理活性物質の生産に応用され
ているが、従来用いられてきた培地には１０％程度の血
清が含有されていた。

（発明が解決しようとする課題） しかしながら血清は高価であり、またロフト差があるた
め、細胞を大量に培養するには問題がある。さらに血清
には異種蛋白質が多く含まれるため、培養後に目的の有
用物質を回収精裂する際にも不都合が生ずる。そのため
種々の無血清培地が開発されてきたが、細胞の増殖性、
生存性および生理活性物質生産性の面で血清含有培地に
比べて十分なものとは言えない。またアルブミン等の血
清成分の添加が不可欠である場合も多（、血清含有培地
の持つ価格、精製面等の欠点は完全にはな（なっていな
い。いずれにしても従来知られている培地は、細胞培養
によって有用物質を大量に効率よく得るためには必ずし
も十分満足できるものではなかった。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、細胞の生存性を高め、かつ生理活性物質
の生産性を高める物質の検索を進めた結果、ガラクチト
ール、Ｄ−クルジトール、■）−マンニトール、１．５
−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール、１．５−７ンヒドロ
ーＤ−マンニトール等の糖アルコールまたは糖アルコー
ル無水物を含有した動物細胞培養用組成物で動物細胞を
培養すると、細胞の生存性が高まり、かつ生理活性物質
の生産性が高まることを見出し２、さらに研究した結果
、本発明を完成した。

本発明は、 物。

（２）糖アルコールまたは糖アルコール無水物を含有す
る培地で動物細胞を培養することを特徴とする動物細胞
の培養方法。

（３）糖アルコールまたは糖アルコール無水物を含有す
る培地で生理活性物質を産生ずる動物細胞を培養し、培
養物中にこれを生成蓄積せしめ、採取することを特徴と
する生理活性物質の製造法。

である。

本発明の組成物は、基礎培地および糖アルコールまたは
糖アルコール無水物からなる。該基礎培地としては、動
物細胞の培養に用いられるものであればいずれのもので
も良い。例えば、市販されている各種基礎培地（イーグ
ルＭＥＭ。

イーグルＢＭＥ、ダルベツコ変法・イーグル培地、イス
コツ培地、Ｌ−１５培地、マノコイ５ａ培地、メディウ
ム１９９、ハムＦＩＯ、ハムＦ１２、ＲＰＭ１１６４０
等）あるいはこれらを混合した培地が挙げられる。さら
にこれらの培地に細胞の増殖に必要な因子（インシュリ
ン、トランスフェリン、ステロイドホルモン、　上皮［
ｉ１増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、エタノールアミン
、２−メルカプトエタノール、亜セレン酸ナトリウム等
）を必要に応じて添加した培地が挙げられる。さらにこ
れらの培地に通常の使用量あるいはそれ以下の量の血清
またはアルブミンを添加した培地でも良い。また市販の
無血清培地〔例えばＨＢ−１０２（ハナ・メディア社製
）、ＨＬ−１（ペントレット社製）、ＡＳＦ培地（味の
素社製）、ｅ−ＲＤＦ（極東製薬社製）等〕を該基礎培
地として用いることもできる。

エリトリトール、アラビトール、アドニトール、キシリ
トール、クルジトール、マンニトール、イジト−ル、ガ
ラクチトール、タリトール、アノトール等の抛アルコー
ルまたはそれらの無水物であり、その基礎培地中での濃
度は好ましくは１０〜１００００　ｆｉｇ／ｍ１．特に
好ましくは１００〜５０００μｇ／ｍｌである。糖アル
コールまたは糖アルコール無水物は、あらかじめ組成物
中に混合されていても良いし、使用する際に混入しても
良い。

本発明方法で培養される動物細胞は特に限定されず、例
えばヒト、マウス、ラット、サル、ウシ、ハムスター等
の哺乳動物由来の各種リンノく。

〜系細胞、ハイブリドーマ　正常二倍体細胞、株化腫瘍
細胞、その他の細胞が培養できる。例えばＢａ１ｌ　−
１，Ｎａｍａｌｖａ、　Ｊｕｒｋａｔ、　ＮＳ　−Ｌ　
Ｐ　３　Ｕ　１゜Ｈｅ１ａ、　Ｖｅｒｏ、　ＣＨＯ，Ｂ
ＨＫ−２１，Ｌ　９２９等の細胞が挙げられる。

本発明の生理活性物質の製造法に用いられる動物細胞と
しては、たとえばインターフェロンを産生するＮａｍａ
ｌｖａ、インターロイキン−２を産生スるＪｕｒｋａｔ
、モノクローナル抗体を産生ずる各種ハイフリトーマ（
マウス−マウス、マウス−ヒト、ヒト−ヒト等）、組織
プラスミノーゲンアクチベータを産生ずるヒト肺癌細胞
またはメラノーマ細胞等が挙げられる。また種々の有用
物質を産生ずるように遺伝子操作を施した細胞や、ウィ
ルスを感染させてワクチンの製造等に利用するウィルス
感受性の細胞も挙げることができる。

本発明の培養には、通常培養に用いられる容器または装
置が用いられる。例えばマルチウェルプレート、シャー
レ、培養フラスコ、スピンナーフラスコ、ジャーファー
メンタ−ファーメンタ−ローラーボトル、ホローファイ
バーマイクロキャリヤー等が挙げられる。

培養の条件としては、通常培養に用いられる条件で良く
、例えば３７℃にて５％ＣＯ２雰囲気下で良好な結果が
得られる。

培養液から細胞を採取するには、浮遊細胞の場合は、例
えば培養液を直接遠心分離機やろ過機にかけて集める。

接着細胞の場合は、例えば０．２５％トリプシン−０，
０２％ＥＤＴＡ液を添加して細胞を浮遊させた後遠心分
離やろ過により集める。

細胞培養によって生産される生理活性物質はその物質が
培養液中に蓄積される場合、ろ過または遠心分離により
上澄液を得、これから採取される。また細胞内に蓄積さ
れる物質の場合には、ろ過または遠心分離により得た細
胞をホモジナイズ、超音波処理、化学薬品処理等を施し
生産物を抽出した上澄液を得る。上記上澄液から生理活
性物質を分離、精製するには、公知の方法を適宜組み合
わせて行う。例えば硫安沈殿、透析、限外ろ過、電気泳
動、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィ、逆相クロ
マトグラフィ、アフィニティクロマドグラフィ等が適用
される。

（実施例） 実施例１．　　（細胞の生存性に対する効果）イーグル
ＭＥＭに牛胎児血清１％を添加した培地を基礎培地とし
、これに各種濃度の糖アルコールまたは糖アルコール無
水物を添加した培地を２４穴のマルチウェルプレート（
メンタＮｕｎｃｊｏｎ％ｎ＝４）に分注した。これにア
フリカミドリザル腎由来樹立細胞ｖｅｒＯを］　Ｘ　１
０’　／ウェルとなるように接程し、５％ＣＯ２インキ
ュベーター中３７℃で７〜９日間培養した後、生細胞数
を測定した。細胞数の測定は計算盤により、生・死細胞
の判別はトリバンプルー染色により行った。表１に結果
を示した。

数字は基礎培地のみで培養した場合の７日後の生細胞数
を１００とした場合の相対値を７８後／８日後／９日後
と示している。

表１から明らかなように、基礎培地のみで培養した場合
には、８日後、９日後と日数が増えるにｌ〜たがって生
細胞数の顕著な減少が見られる（接触阻害による細胞の
死滅、脱落のため）が、糖アルコールまたは糖アルコー
ル無水物の添加により生細胞数の減少がかなり抑えられ
ている。

実施例２．（細胞の生存性に対する効果）ｅ−ＲＤＦ（
極東製薬社製）にインシュリン０．２Ｕ／ｍｌ、トラン
スフェリ７３５　ｔｔｇ／ｍ１１　エタノールアミン２
０μＭ、亜セレン酸ナトリウム２．５×１０　Ｍ（４つ
を合わせてＩＴＥＳと称する）を添加した培地を基礎培
地とし、これに各種濃度の糖アルコールまたは糖アルコ
ール無水物を添加した培地ヲシャーレ（ファルコン１０
０８．ｎ＝５）Ｋ分注した。これにモノクローナル抗体
（ＩｇＧ）産生マウス−マウスハイフリトーマＬｕ２４
３　細胞ヲ３ｘＩＱ’／ｍ／！となろように接種し、５
％ＣＯ２インキュベーター中３７℃で３日間培養した後
、生細胞数と総細胞数を測定した。表２に結果を示した
。

数字は基礎培地のみで培養した場合の生細胞数と総細胞
数をそれぞれ１００とした場合の相対値を上／下に示し
た。

表２　糖アルコール、糖アルコール無水物の細胞の生存
性に及ぼす効果 表２から明らかなように、糖アルコールまたは糖アルコ
ール無水物の添加により総細胞数の若干の増加と生細胞
数の顕著な増加が認められた。

実施例３．（抗体産生に対する効果） 実施例２と同様の方法で、Ｌｕ２４３を各種濃度の糖ア
ルコールまたは糖アルコール無水物を添加した基礎培地
で３日間培養し、その上清中の抗体量をα−マウスＩｇ
をコートしたプレートによるＥＬＡ法で測定した。表３
に結果を示した。数字は基礎培地のみで培養した場合の
成績を１００とした場合の相対値で示した。

表３　糖アルコール、糖アルコール無水物の抗体産生に
及ぼす効果 実施例４．（抗体産生に対する効果） 基礎培地に１■／ｍｌの濃度の牛血清アルブミンおよび
各種濃度の糖アルコールまたは糖アルコール無水物を添
加した培地を用いて実施例３と同様の実験を行った。表
４に結果を示した。

表４　糖アルコール、糖アルコール無水物の抗体産生に
及ぼす効果 表３に見られるように、糖アルコールまたは糖アルコー
ル無水物の添加により抗体産生は著しく向上している。

なお基礎培地に牛血清アルブミンを１■／ゴの濃度で添
、加した場合の数字は約２００である。

表４に見られるように、牛血清アルブミンと糖アルコー
ルまたは糖アルコール無水物を両方添加することにより
、それぞれを単独で添加した場合以上の効果を得ること
ができる。

実施例５．（抗体産生に対する効果） Ｌｕ２４３の代わりにモノクローナル抗体（ＩｇＭ）産
生マウス−マウスハイブリドーマ５Ｔ−４３３を用いて
実施例３と同様の実験を行った。表５に結果を示した。

表５　糖アルコール、糖アルコール無水物の抗体産生に
及ぼす効果 本発明の組成物を用いることにより、細胞の生存性およ
び物質生産性の面で、従来の培地で得られた以上の結果
を得ることができる。本発明方法により、生理活性物質
を産生ずる細胞を培養した場合には、物質生産性が高ま
り、かつ生存性が高まる結果として培養を長期にわたり
依持できるので、生理活性物質を効率的に生産すること
ができ、工業生産上有利である。本発明で用いられる糖
アルコールまたは糖アルコール無水物は、安価であり、
かつ均質な低分子化合物であるので、従来の培地に比べ
価格が安（かつ目的とする物質の精製が容易であり、工
業生産上有利である。

表５に見られるように、５Ｔ４３３についても、糖アル
コールまたは糖アルコール無水物の添加により、抗体産
生は著しく向上している。

（発明の効果）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）糖アルコールまたは糖アルコール無水物を含有す
   ることを特徴とする動物細胞培養用組成物。
2. （２）糖アルコールまたは糖アルコール無水物がガラク
   チトール、Ｄ−グルシトール、Ｄ−マンニトール、１，
   ５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールまたは１，５−アン
   ヒドロ−Ｄ−マンニトールである第１項記載の組成物。
3. （３）糖アルコールまたは糖アルコール無水物を含有す
   る培地で動物細胞を培養することを特徴とする動物細胞
   の培養方法。
4. （４）糖アルコールまたは糖アルコール無水物を含有す
   る培地で生理活性物質を産生する動物細胞を培養し、培
   養物中にこれを生成蓄積せしめ、採取することを特徴と
   する生理活性物質の製造法。
5. （５）生理活性物質がモノクローナル抗体である第４項
   記載の製造法。