JPH0220226A - ナガイモの不定胚培養法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明はヤマノイモ科植物ナガイモ（［）ｉｏｓｃｏｒ
ｅａｏｐｐｏｓｉｔａ　Ｔｈｕｎｂ、）の組織培養によ
る新規な不定胚の誘導、増殖、発生、発芽法に関する。

〈従来の技術及び問題点〉 一般に植物細胞、組織、器官培養の技術を作物育種に利
用しようとする場合、不定胚発生（ｓｏｍａｔｉｃ　　
ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ）を確立することが非常に
重要である。不定胚発生とは、生殖細胞以外の体細胞の
１つが受精卵と同様の性質を獲得し、通常の胚発生（種
子形成）と非常に良く似た経路をたどって個体へと発生
する過程を指す。

不定胚を構成する個々の細胞は単一の細胞に由来し、秩
序だった細胞分裂によって増殖したものであることから
遺伝的に均一であり、不定芽より再分化させた個体によ
く見られるようなキメラにはなりにくいことが知られて
いる。

さらに、不定胚の性質を持つ細胞は発生初期の未分化な
状態にあることから、非常に高い増殖能を持つと同時に
非常に高い形態形成能を保持しているものと考えられて
いる。従って、不定胚培養の技術はプロトプラスト培養
・形質転換あるいは各種薬剤、ストレス耐性変異の誘導
、選抜のようなより高度の組織培養による作物盲進技術
にとって不可欠な基本技術であり、さらに大量増殖ある
いは擬似種子の生産といった技術に直接利用可能な技術
である。

植物組織培養による不定胚培養法は比較的多くの植物、
作物柱について知られている。

しかし、ヤマノイモ科植物についてはデイオスコレア・
デルトイデア［（Ｄ、　ｄｅｌｔｏｉｄｅａンエイ・ビ
イ・シンク、バイオロシア・プランタルム（Ｓｉｎｇｈ
、Ｊ、Ｐ、　Ｉ　９７８）、　Ｂｉｏｌｏｇｉａ　Ｐｌ
ａｎｔａｒｕｍ２０：４３６−４３９．１９７８）］及
びデイオスコレア・フロリブンダ［（Ｄ、　Ｎｏｒｉｂ
ｕｎｄａ；ビイ・ブイ・アミラド、ハン）・ブック・オ
ブ・プラント・セル・カルヂャ−（Ａｍｍｉｒａｔｏ、
　Ｉ　９７８　）Ｈａｎｄｂｏｏｋｏｆ　Ｐｌａｎｔ　
Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ）Ｖｏｌ、　３　、　ｐｐ、
　４３７３５４　　Ｍａｃｍｉｌａｎ、　Ｎｅｗ　Ｙｏ
ｒｋ、１９７８　）］の２種で知られているのみであっ
た。デイオスコレア・デルトイデアについては担板体（
芋）組織より誘導したカルス上に不定胚の形成が認めら
れたが、不定胚組織の継代・維持・増殖法及び発生・発
芽法（個体再生法）については何ら記載がない。デイオ
スコレア・フロリブンダについては種子からの不定胚誘
導、液体培養による不定胚の増殖及び発芽・個体再生に
ついての詳細な記載があるが、この不定胚組織は長期間
の継代・維持が不可能であった。

我国及びアジア各国で重要な作物であるナガイモ［デイ
オスコレア・オポジタ（Ｄ　、　ｏｐｐｏｓｉｔａ）］
での不定胚培養はこれまで全く成功例がなく、通常種子
繁殖を行わず、事実上交雑育種が不可能な本作物の品種
改良にとって大きな障害となっていた。

〈課題解決の手段〉 本発明者はナガイモにおいても植物体各組織からの不定
胚誘導が可能であることを見出し、鋭意検討の結果、よ
り効率的な培養法を確立し、本発明を完成するに至った
。

すなわち、本発明はヤマノイモ科植物ナガイモの植物体
組織をオーキシン添加培地で培養することを特徴とする
ヤマノイモ科植物ナガイモ不定胚組織を誘導方法を提供
するものである。また、本発明は、この方法で誘導した
ナガイモ不定胚をオーキノン添加液体培地で旋回培養す
ることを特徴とするヤマノイモ科植物ナガイモ不定胚の
増殖方法も提供するものである。さらに、本発明は該不
定胚カルスをホルモン無添加培地で培養することを特徴
とするヤマノイモ科植物ナガイモ不定胚の発生方法を提
供するものである。さらにまた、本発明は該発生したナ
ガイモ不定胚をザイトカイニン添加培地で培養すること
を特徴とするヤマノイモ科植物ナガイモ不定胚の発芽方
法も提供するものである。

本発明による不定胚培養法は数々の理想的な特徴を有し
、単子葉植物の不定胚培養法として非常に希少なもので
あり、双子葉植物ニンジンと並び植物生理・形態形成の
研究開発に最適な実験系となり得るものである。

また、液体懸副培養により高増殖性で均一な不定胚組織
の継代・維持を可能としたことにより、組織培養による
様々な植物育種法が応用可能となる。即ち、この液体培
養組織は発生のごく初期の段階にあり微小な細胞集塊と
して増殖し、しかも不定胚形成能を消失したカルス細胞
（ｎｏｎｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　　ｃａｌｌｕｓ）、
死んだ細胞の破片あるいは繊維質の混入が非常に少ない
ことから、突然変異体の誘発・選抜あるいはプロトプラ
スト単離の材料として理想的な状態にある。

さらに、この細胞集塊としての増殖から、高速かつ均一
な不定胚発生へと切り換えることが可能であり、大量増
殖あるいは擬似種子生産の材料としても適切な状態にあ
る。

本発明はナガイモでの不定胚培養法として初めてのもの
であり、さらにヤマノイモ科植物としても初めての継代
・維持が可能な新規不定胚培養法である。

本発明が適用されるヤマノイモ科植物ナガイモとして、
ながいも、いちょういも、つくねいも。

あるいはやまといも等の品種群が挙げられる。また、別
種であるが近縁野生種ジネンジョ（旦工ｊＢｐｏｎｉｃ
ａ）についても基本的に適用可能であり、本発明におい
ては、便宜上、ジネンジョも「ナガイモ」なる用語中に
包含させる。

本発明の方法は、（１）不定胚の誘導、液体懸濁培養に
よる（２）不定胚の増殖、（３）不定胚の発生、及び（
４）不定胚の発芽の４段階の手順より構成される。以下
、順を追って詳細に説明する。

（１）　　不定胚の誘導 ナガイモ植物体組織を寒天培地上で培養することにより
不定胚を誘導する。材料とする植物体組織として茎節（
腋芽を含む茎の切片）、茎の切片、葉柄の切片あるいは
葉の切片等が使用可能である。

不定誘導培地として、ＭＳ［ムラシゲ−スクーグ（Ｍｕ
ｒａｓｈｉｇｅ　　＆　　Ｓ　ｋｏｏｇ　Ｉ　９６２　
）コあるいはＬＳ［リンスマイヤー−スクーグＣＬ　ｉ
ｎｓｍａｉｅｒ　　＆Ｓｋｏｏｇｌ　９６４）］等の既
知の植物組織培養用培地が使用可能であり、通常０．８
〜１．２％濃度の寒天及び３〜９％濃度のショ糖を添加
したものを用いる。不定胚形成を促進する要因として最
も重要なものは植物生長ホルモン、オーキシンの添加で
あり、通常２．４−Ｄ、２，４．５−Ｔ、ピクロラムあ
るいはグイカンパ等活性の高いものが用いられる。

最適添加濃度範囲は２，４．−Ｄの場合、０．３〜３．
０ｍｇ／（１、ピクロラムの場合、５，０〜３０Ｈ／σ
である。また、２，４．５−Ｔ、グイカンパは１　、０
　ｍｇ／ρ以上の添加が好ましい。ＩＡＡ、　　ＩＢＡ
あるいはＮＡＡ等のオーキシンは活性が低いので、前記
のオーキシンを用いることが好ましい。

なお、各オーキシンの略号は次のものを意味する。

２．４−Ｄ：　　２，４−ジクロロフェノキシ酢酸２．
４．５−Ｔ：　２．４．５−トリクロロフェノキシ酢酸
ピクロラム：４−アミノ−３５，６−）ジクロロピコリ
ン酸 グイカンパニ３，６−ジクロロ−２−メトキシ安息香酸
１’ＡＡ：　　　　インドール酢酸 ＩＢＡ：　　　　インドール酪酸 ＮＡＡ　：　　　　ナフタリン酢酸 培養容器は通常平型のプラスチックシャーレを用いるが
、試験管、三角フラスコあるいは広口瓶等も使用可能で
ある。

培養条件として、温度は２３〜３０℃、照明は２０００
〜５，０００ルツクスの照度で１２〜２４時間の日長が
適している。

以上のような条件で約２ケ月間培養を続けると、組織の
一部にカルス形成が観察される。フェノール性物質の生
成、蓄積から、カルスは褐色を帯び、非常に生長が遅い
。このため、２〜３ケ月の間隔で、カルス形成が見られ
た組織を同一組成の培地に植継ぐ。不定胚形成は早い場
合には継代２回目（培養３〜４ケ月後）に、通常、継代
３回目（培養５〜６ケ月後）に観察される。不定胚組織
は白〜黄色を帯び、非常に滑らかな表面構造を保ってい
るこ七から、周囲のカルス組織と容易に区別することが
できる。不定胚組織は、同一の培地上で継代培養を行う
ことも可能であるが、生長は非常に遅く、容易にカルス
化して形態形成能を消失しやすい。

（２）不定胚の増殖 不定胚組織の均一かつ高速な増殖を実現するために液体
懸濁培養を行う。寒天培地上で誘導した前記の不定胚組
織を約１ｍｍ角の大きさに切り取り、数個を液体培地に
植込む。

培地は寒天を除く以外、誘導培地と同一組成のものが使
用可能である。ここでもオーキシンの添加が重要であり
、２．４−Ｄの場合０３〜３０ｍｇ／ρの濃度が適して
いる。培養容器は通常１２５ｘＱ容三角フラスコに液体
培地３０〜３５πＱを分注したものが適しており、約１
５　Ｏｒｐｍのスピードで旋回培養を行う。

以」二のような条件で培養を続けた場合、当初４週間程
度までの間、形態形成能を失ったカルス（ｎｏｎｅｍｂ
ｒｙｏｇｅｎｉｃ　　ｃａｌｌｕｓ）の非常にゆっくり
とした増殖が観察される。このカルスは液胞の発達した
、細胞質に乏しい大型の細胞から構成されており、倒立
顕微鏡下で無色半透明の組織として識別される。さらに
培養を続けることにより、通常、液体培養開始後４〜６
週間で別のタイプの非常に高い増殖能を持つ組織が誘導
される。この組織は細胞質に富む小型の細胞から構成さ
れており、倒立顕微鏡下で黄褐色の細胞集塊として識別
される。

形状は不定で、大きさにも直径０１〜２　、０　ｍｍと
大きな幅が見られる。この細胞集塊は不定胚形成能を持
つカルス（ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　　ｃａｌｌｕｓ；
以下不定胚カルスと略記する）であり、不定胚発生を開
始する前の段階、即ち前胚（ｐｒｏ−ｅｍｂｒｙｏ）の
状態にある。

この不定胚カルスをピペット等で単離し、同一組成の液
体培地に植継ぐことにより非常に高速に増殖する不定胚
液体懸濁培養（ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　　５ｕｓｐｅ
ｎｓｉｏｎ　　ｃｕｌｔｕｒｅ）が確立される。

継代の際、置床量を小さく、培養密度を低く保つことが
重要であり、このことにより不定胚形成能を失ったカル
スの生長、増殖を抑制しく一般にｎｏｎｅｍｂｒｙｏｇ
ｅｎｉｃ　　ｃａｌｌｕｓの増殖にはある程度以」二の
培養密度が必要）、このような細胞の混入の少ない均一
な不定胚カルスの増殖が可能となる。

置床量は培地３０ｍ（ｌ当り最低で直径０　、１　ｍｍ
の不定胚カルス１個でも増殖可能であり、均一な増殖の
ためにはｌｘ（以下が好ましい。

置床量が圧縮細胞体積（ｐａｃｋｅｄ　　ｃｅｌｌ　　
ｖｏｌｕｍｅ）でｌＯμσ以下の場合、増殖率は７日間
で数１０倍で、２〜３週間毎の継代が必要である。５０
〜２００μρの置床量の場合、増殖率は２〜３倍で１〜
２週間毎の継代が必要である。

（３）不定胚の発生 不定胚カルスを同調的に大量発生させ、成熟した胚を得
る。液体培地中での発生及び寒天培地上での発生いずれ
とも可能である。

液体培地を使用する場合、小量の不定胚カルス（５０〜
１００μのを２．４−Ｄを含まないホルモンフリー液体
培地中に植継ぎ、（２）と同様の条件で旋回培養を行う
。１〜２週間毎に培地を４〜８回更新し、組織の生長に
応じて複数のフラスコに分割するのが望ましい。培地中
に植物生長ホルモンを含まないことから、この過程でも
不定胚形成能を失ったカルスの生長、増殖はほとんど見
られない。培養約２週間で不定胚発生が認められ、約４
週間で直径０　、５　ｍｍ以下の非常に小さな球状胚（
ｇｌｏｂｕｌａｒ　ｅｍｂｒｙｏ）が観察される。球状
胚以降の発生は双子葉植物に見られるような心臓型胚（
ｈｅａｒｔｅｍｂｒｙｏ）　、魚雷型胚（ｔｏｒｐｅｄ
ｏ　　ｅｍｂｒｙｏ）といった明確な形態形成の過程は
見られないが、培養約８週間でほぼ胚発生を終了し、成
熟した不定胚（発芽直前の不定胚）が得られる。不定胚
カルス１００μρより培養を開始した場合、Ｉ　Ｏ，０
００〜２０゜０００個の不定胚が得られる。

寒天培地上での静置培養により発生も可能であるがホル
モンフリー培地を使用した場合、発生に要する期間は約
４週間と若干短縮されるが、得られる不定胚数は１，０
００個以下と効率が悪く発生の過程も同調しにくいとい
った欠点がある。

（４）不定胚の発芽 発生を終了し、成熟した不定胚を発芽させ、正常な個体
へと再生させる。実際には発生と発芽の間に明確な区別
があるわけではなく、両者は連続的な形態形成の過程で
ある。

ホルモンフリー培地を用いて培養を続けるが通常植物生
長ホルモンサイトカイニンを添加することにより発芽が
促進される。

サイトカイニンとしては、通常ＢＡ（６−ベンジルアデ
ニン）、ＮＡＡ等が用いられ、液体培地でＢＡ（６−ベ
ンジルアデニン）を０．３〜５．０π９／σ、寒天培地
でＢＡ及びＮＡＡを０．３〜３．０ｍ９／（ｌを添加す
るのが好ましい。

培養時間は液体培地では通常３〜６週間、寒天培地では
４〜８ケ月程度である。しかし、ザイトカイニン添加培
地で長期間培養を続けるとカルス化が著しくなり、最終
的な個体再生率が低くなるため、培養は１ケ月程度に留
め、以後、再びホルモンフリー培地を用いて培養するの
が望ましい。

液体培地を用いた場合、成熟した不定胚の約半数が発芽
を開始し、茎頂と根との両極性の伸長が見られる。寒天
培地を用いた場合には根の伸長はやや遅れ、一般に茎葉
の再生・展開の方が先行する傾向にある。

再生した個体は形態的に正常であり、充分に茎葉を展開
し発根したものをバーミキュライト等に移植し、外環境
に馴化させ栽培することが可能である。さらに茎節を採
取して、多芽形成による増殖（特開昭６１−５８９３４
号）あるいはムカゴ形成等、既に完成された培養技術の
材料として用いることも可能である。

〈実施例〉 以下、実施例を挙げ、本発明を更に詳細に説明する。

実施例Ｉ　茎節及び茎切片からの不定胚誘導青森県産ナ
ガイモのウィルスフリー母株より茎節（腋芽を含む茎の
切片、長さ約１０ｍｍ）及び茎切片（約１０ｍｍ）を採
取し、以下の条件に従って培養を行った。培地は寒天０
．８％及びショ糖３％を含み、ｐＨ５、８に調整したＭ
Ｓ改変培地（ＭＳ無機塩類−１−Ｂ５ビタミン類）を直
径１００ｍｍのプラスチックシャーレに４０〜５０ｚｆ
２分注したものを用いた。培地添加オーキシンとして２
．４−Ｄを０．０３、Ｉ　Ｏ１３，０及び１０ｍｇ／Ｑ
の５段階濃度に添加したものを、明所（３０００ルツク
ス、１６時間照明）での培養及び暗所での培養の２区に
分割した。各試験区に茎節の場合、シャーレ当り６個、
茎切片の場合、シャーレ当り９個を置床し、全試験区３
反復（シャーレ３枚）として２８℃で培養を行った。培
養２ケ月後及び４ケ月後の２回、同一組成の培地に植継
ぎ、培−〇ケ月後に不定胚形成の有無を調査した。

結果を第１表に示す。

進上表　各培養条件下でのナガイモ不定胚形成率（３反
復平均（％）士標準誤差） ２．４−Ｄ濃度　茎節（腋芽を含む　茎切片（腋芽を含
０．３　　　５．６±５．６　　０　　　３．７±３．
７０１．０　　　　０　　　　０　　　７．４±３．７
０３．０　　２２．２±１１．１　　０　　３７．０±
７，４０１ｏ　　　　　　ｏ　　　　　　ｏ−ｏ　　　
　　　（１茎節を培養した場合、腋芽からの茎葉の伸長
、発根あるいはムカゴ形成が起こり不定胚形成はやや低
下する傾向にあった。茎節、茎切片ともに２゜４−Ｄ　
　０．３〜３．Ｏｕ／Ｑの濃度で培養した場合、明所で
のみ不定胚形成が確認された。

実施例２　　Ｆｒ：定胚液体懸濁培養 １−１　　不定胚液体懸濁培養の誘導 実施例１で誘導した不定胚から約１　ｍｍ３の組織を採
取し、以下の条件に従って液体懸濁培養の誘導を行った
。培地はショ糖３％を含み、ｐ）ｌ　５　、８に調整し
たＭＳ改変液体培地（ＭＳ無機塩類＋３５ビタミン類）
を１２５ｍｇ容三角フラスコに３０〜３５ｚ（！分注し
たものを用いた。

培地添加オーキシンとして２．４−Ｄを０１０゜３．１
０及び３．０ｍｇ／Ｑの４段階濃度に添加したものを、
明所（３，０００ルツクス、１６時間照明）での培養及
び暗所での培養の２区に分割した。

全試験区３反復（フラスコ３本）とし、各フラスコに組
織片３〜５個を置床しで、２８℃　１５０ｒｐｍで２ケ
月間旋回培養を行い、不定胚組織の増殖の有無を調査し
た。結果を第２表に示す。

第２表　各培養条件での液体懸濁培養の誘導率（％） ２．４−Ｄ濃度（即／ａ）　　　明所 ０．３　　　　　　　　０ １．０　　　　　　　　３３３ ３．０　　　　　　　　３３３ 暗所 ２．４−Ｄ　　０．３〜３．０ｍ９／Ｑの濃度で不定胚
の液体懸濁培養の誘導が可能であり、フラスコ３本につ
き１本の確立で誘導された。暗所での誘導も可能である
がやや効率が低下する傾向にあった。

２−２　不定胚液体懸濁培養組織の増殖実施例２−１で
誘導した不定胚液体懸濁培養組織を２．４−Ｄ　　１．
０ｍｇ／ρ明所で１ケ月間培養して増殖を行った後、以
下の条件に従って増殖条件の検討を行った。培地はショ
糖３％を含み、ｐＨ５，８に調整したＭＳ改変液体培地
（ＭＳ無機塩類＋３５ビタミン類）を１２５ｚρ容三角
フラスコに３０〜３５１１ａ分注したものを用いた。

培地添加オーキシンとして２　、４．−　Ｄを０、Ｏｌ
ｌ　０３．１０及び３．０ｍｇ／ρの５段階濃度に添加
したものを、明所（３，０００ルツクス、１６時間照明
）での培養及び暗所での培養の２区に分割した。

各フラスコに不定胚組織１００μρを置床して２週間培
養し、コンディショニングを行った後、６週間増殖率を
調査した。調査は１００μｇの組織を１週間培養し体積
を測定した後、新たに１００μσを新しい培地に植継ぐ
方法をとった。

全試験区３反復（フラスコ３本）とし、２８℃１５０　
ｒｐｍで旋回培養を行った。結果を第３表に示す。

第３表　各培養条件での不定胚組織の増殖率（ｖ／ｖＸ
倍／週、６週間、３反復の平均±標準誤差） ２．４−Ｄ濃度（ｊ！９７の　明所　　暗所０　　　　
　不定胚発生　　不定胚発生０．１　　　　　不定胚発
生　　不定胚発生０．３　　　　２．４９±０．０６　
　２．２２±０．１０１０　　　　２．１６±０．０５
　　１．７７±００９３．０　　　　カルス細胞混入カ
ルス細胞混入２．４−Ｄ　　Ｏ，１πｖ／Ｑ以下では不
定胚組織は発生を開始し、継代、維持ができなくなるこ
と、３０即／ρ以上では、不定胚形成能を失ったカルス
細胞が混入し、増殖条件として適切でないことが確認さ
れた。

２．４−Ｄ　　０．３ｕ／ρ明所での培養で最高の増殖
率（２５倍／週）を示した。

実施例３　不定胚の液体培地中での発生実施例２−２の
４増殖条件（２，４−Ｄ　　０．３及び１．Ｏｕ／Ｑ、
それぞれ明所・暗所）で継代、増殖した不定胚組織をそ
れぞれホルモンフリー液体培地に移植して発生ずる不定
胚数の推定を行った。

培地はショ糖３％を含み、ｐＨ５，８に調整したホルモ
ン無添加のＭＳ改変液体培地（ＭＳ無機塩類＋Ｂ５ビタ
ミン類）を１２５順容三角フラスコに３０〜３５叶分注
したものを用いた。

前記の４増殖条件の不定胚組織１００μρをそれぞれホ
ルモンフリー液体培地で毎週培地を更新して８週間培養
を行い、成熟した不定胚数を測定した。培養はすべて２
８℃、明所（３，０００ルツクス、１６時間照明）でＩ
　５０　ｒｐｍで旋回培養する方法をとった。結果を第
４表に示す。

第４表　各増殖条件下の不定胚組織１００μσから得ら
れる成熟不定胚数 ０３　　　　　明　　　　１２４７１　　±　１７９２
０３　　　　暗　　　　１６５４１　±　７８４１０　
　　　　明　　　　１４５３４　　±　１０５３増殖不
定胚組織１００μｇから発生を開始した場合、１万〜２
万個の成熟した不定胚が得られることが確認された。

増殖条件として暗所で培養した方が最終的に得られる不
定胚数は多くなるが、これは明所での培養と比較して増
殖組織が発生段階としてやや初期の状態にあるためと思
われる。

また、２．４−Ｄ　　０．３Ｍ９／ρに比較して１．０
Ｈ／（ｌの方が不定胚数が多くなるが、これは２４Ｄの
持ち込み効果でホルモンフリー培地中でも若干の増殖が
続くためと考えられる。

実施例４　不定胚の液体培地中での発芽実施例３で確認
された方法のうち、２４−Ｄｏ　、　３　ｍｇ／（１、
明所での増殖組織から得られた成熟不定胚をサイトカイ
ニンＢＡ添加液体培地に移植し発芽条件の検討を行った
。培地はショ糖３％を含み、ｐＨ５、８に調整したＭＳ
改変液体培地（ＭＳ無機塩類＋８５ビタミン類）を１２
５１１Ｑ容フラスコに３０〜３５１分注したものを用い
た。培地添加サイトカイニンとしてＢＡを０．０．ｌ、
０３．１．０．３．０．５．０．７．０及び１０．０即
／ρの８段階濃度に添加したものを、明所（３，０００
ルツクス、１６時間照明）、２８℃で培養した。

各フラスコに不定胚４００〜５００個を移植し、毎週培
地を更新して、４週間後、茎頂部、根との両極性の伸長
を開始したものを発芽した不定胚とみなし、各フラスコ
での不定胚発芽率を調査した。

全試験区３反復（フラスコ３本）として、１５０ｒｐｍ
で旋回培養を行った。結果を第５表に示す。

第５表　各培養条件での不定胚の発芽率ＢＡ濃度 ｊ！ｇ＃！ 不定胚発芽率 （％；平均士標準誤差） ０　　　　　　　　０．０±　０．０ ０．１　　　　　　　　１．９±　０５０．３　　　　
　　　２５．４±　３．５１．０　　　　　　　４３．
１±　３．５３．０　　　　　　　５１．１±ｌ０５７
５．０　　　　　　　　３０．２　±　１１３７．０　
　　　　　　１６．９±　４．８１０．０　　　　　　
　１７．７±１２．３成熟した不定胚の発芽はＢＡによ
り顕著に促進され、３．０ｚｇ／（ｌ添加で約５０％が
発芽を開始することが確認された。

実施例５不定胚の寒天培地上での発生、発芽実施例２−
２の増殖条件のうち、２．４−Ｄ　　０３　Ｍ９／（１
，明所で増殖した不定胚組織を寒天培地上に移植し、発
芽、発生条件の検討を行った。培地は寒天０．８％及び
ショ糖３％を含み、Ｉ）Ｈ５８に調整したＭＳ改変培地
（ＭＳ無機塩類＋８５ビタミン類）を直径１００１１１
２のプラスチックシャーレに４０〜５０πρ分注したも
のを用いた。

培地添加ホルモンとしてＮＡＡ及びＢＡをそれぞれＯｌ
ｏ、３．１．０及び３．Ｏｒｔｔｇ／Ｑの４段階に添加
した計１６区の試験区を設けた。

各試験区（シャーレ１枚）につき直径１ＩＩＩＩＩ＋の
不定胚発芽数を８１個置床し、２８℃、明所（３，００
０ルツクス、１６時間照明）で培養を行った。培養２ケ
月後と４ケ月後の２回、ホルモン無添加の寒天培地に植
継ぎ培養６ケ月後に発芽個体数を調査した。結果を第６
表に示す。

第６表　各培養条件での不定胚発芽数 ＮＡＡ、　　　　　ＢＡＣＭ９／の （所／ｆ２）　　　　ＯＯ，３１，０３，０１，００２
４６ 液体培地中での発生、発芽と比較して効率は非常に低く
なるが、ＢＡの添加により発生・発芽が促進されること
、ＮＡＡ３．０ｆｆ９／Ｑ、添加では抑制されることが
確認された。

〈発明の効果〉 本発明によれば、ヤマノイモ科植物ナガイモの植物体組
織から効率的に不定胚の培養が行え、ナガイモの植物生
理、形態形成の研究開発の最適な実験系が提供でき、さ
らに、組織培養による様々な植物育種法が応用可能とな
る。

特許出願人住友化学工業株式会社 代理人弁理士青　山　葆　ほか１名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヤマノイモ科植物ナガイモの植物体組織をオーキシ
   ン添加培地で培養することを特徴とするヤマノイモ科植
   物ナガイモ不定胚組織の誘導方法。 ２、ナガイモの腋芽、茎の切片、葉柄の切片あるいは葉
   の切片を２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を０．３〜３
   ．０ｍｇ／ｌ濃度に添加した培地上で明所培養すること
   を特徴とする請求項１記載の方法。 ３、請求項１又は２記載の方法で誘導したナガイモ不定
   胚をオーキシン添加液体培地で旋回培養することを特徴
   とするヤマノイモ科植物ナガイモ不定胚の増殖方法。 ４、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸含有液体培地で培
   養し、不定胚カルスを形成させ、該カルスを０．１〜１
   ｍｇ／ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸含有液体培
   地上で、１／３０（ｖ／ｖ）以下の培養密度で継代培養
   することを特徴とする請求項３記載の方法。 ５、請求項３又は４記載の方法で得られたナガイモ不定
   胚カルスをホルモン無添加液体培地で旋回培養するか、
   又は寒天培地で静置培養し、不定胚を発生することを特
   徴とするヤマノイモ科植物ナガイモ不定胚の発生方法。 ６、請求項５記載の方法で発生させたナガイモ不定胚を
   サイトカイニン添加培地で培養し、ナガイモ不定胚を発
   芽させることを特徴とするヤマノイモ科植物ナガイモ不
   定胚の発芽法。 ７、０．３〜５．０ｍｇ／ｌの６−ベンジルアデニンを
   含有する液体培地で旋回培養するか、又は３．０ｍｇ／
   ｌ以下の６−ベンジルアデニン及びナフタリン酢酸を含
   有する寒天培地で培養することを特徴とする請求項６記
   載の方法。