JPH02203783A - 抗原性を有する非感染性エイズウイルス産生クローン化ヒトｔ細胞 - Google Patents
抗原性を有する非感染性エイズウイルス産生クローン化ヒトｔ細胞Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
意！上生科反立災
本発明は抗原性を有する非感染性エイズウィルス及びそ
れを産生ずるクローン化ヒトＴ細胞（Ｈ６細胞）に関す
るものである．抗原性を有する非感染性エイズウィルス
は，エイズウィルスに対する抗体を安全かつ有効に製造
するために使用することができ，更には，抗原−抗体反
応を利用したエイズの検査における抗原として安全に使
用することができる。したがって２本発明の非感染性エ
イズウィルス及びそれを産生するクローン化ヒトＴ細胞
は、医薬の分野、特にエイズの治療及び予防、更にはエ
イズ感染の有無の診断に有用である。
れを産生ずるクローン化ヒトＴ細胞（Ｈ６細胞）に関す
るものである．抗原性を有する非感染性エイズウィルス
は，エイズウィルスに対する抗体を安全かつ有効に製造
するために使用することができ，更には，抗原−抗体反
応を利用したエイズの検査における抗原として安全に使
用することができる。したがって２本発明の非感染性エ
イズウィルス及びそれを産生するクローン化ヒトＴ細胞
は、医薬の分野、特にエイズの治療及び予防、更にはエ
イズ感染の有無の診断に有用である。
また、上記Ｈ６細胞は非感染性であるために。
エイズの予防剤又は治療剤探索のためのスクリーニング
システムにおいて、安全かつ有効に用いることもできる
。
システムにおいて、安全かつ有効に用いることもできる
。
従来左挟米
ヒトレトロウィルス（ＨＩＶ）の感染による後天性免疫
不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療のためには、ｉ在。
不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療のためには、ｉ在。
インターロイキン、インターフェロン、アジドチミジン
（ＡＺＴ）等が用いられているが、それらの評価も定ま
っておらず、充分な有効性の得られるものはほとんどな
いのが現状である。
（ＡＺＴ）等が用いられているが、それらの評価も定ま
っておらず、充分な有効性の得られるものはほとんどな
いのが現状である。
したがって、これらを用いる方法とは別に、エイズの予
防・治療における有望な方法としてワクチン療法も期待
される。しかしながら、そのためにはエイズウィルスに
対する抗体を産生させるために必要な安全性の高い抗原
が必須であり、このような抗原を量産する方法として、
現在、感染性ウィルスと同様の抗原性を有する非感染性
ウィルス粒子を産生ずる形質変換細胞を用いる試みがな
されている０例えばヒトＴ細胞のＭＴ−４細胞由来の形
質変換細胞が報告されている（生田等、 Ｊｐｍ、 Ｊ
。
防・治療における有望な方法としてワクチン療法も期待
される。しかしながら、そのためにはエイズウィルスに
対する抗体を産生させるために必要な安全性の高い抗原
が必須であり、このような抗原を量産する方法として、
現在、感染性ウィルスと同様の抗原性を有する非感染性
ウィルス粒子を産生ずる形質変換細胞を用いる試みがな
されている０例えばヒトＴ細胞のＭＴ−４細胞由来の形
質変換細胞が報告されている（生田等、 Ｊｐｍ、 Ｊ
。
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、 （Ｇａｎｎ）、 ７９．４１
８−４２３ ； Ａｐｒｉｌ。
８−４２３ ； Ａｐｒｉｌ。
１９８８）、 Ｌかし、 ＮＴ−４細胞は１本来、成人
白血病（ＡＴＬ）の原因ウィルスであるＨＴＬＶ−１に
感染している細胞であり、それ自体病原性である。更に
、 ＭＴ−４由来の形質変換細胞は、非感染性ウィルス
粒子を産生するものの、エイズウィルス感染細胞の特徴
である巨細胞形成能（正常なＴ細胞と細胞融合を起こし
、多核細胞を形成し、細胞死に至らしめる）を有するた
め、ワクチンの材料として適当ではない。
白血病（ＡＴＬ）の原因ウィルスであるＨＴＬＶ−１に
感染している細胞であり、それ自体病原性である。更に
、 ＭＴ−４由来の形質変換細胞は、非感染性ウィルス
粒子を産生するものの、エイズウィルス感染細胞の特徴
である巨細胞形成能（正常なＴ細胞と細胞融合を起こし
、多核細胞を形成し、細胞死に至らしめる）を有するた
め、ワクチンの材料として適当ではない。
また、エイズウィルスに対する抗体を産生させる別の方
法として、エイズウィルス由来の特定の蛋白質断片のみ
を、一般に広く用いられている遺伝子工学的手法を用い
て量産させて、抗原として用いる方法も試みられている
。しかし、この場合。
法として、エイズウィルス由来の特定の蛋白質断片のみ
を、一般に広く用いられている遺伝子工学的手法を用い
て量産させて、抗原として用いる方法も試みられている
。しかし、この場合。
ウィルス粒子をそのまま抗原として用いる場合よりも、
抗原性が弱く、エイズウィルスに対する抗体の力価が低
いことが、免疫学的基礎知識から考えられる。またエイ
ズウィルス粒子をそのまま抗原として用いる場合は、特
定の蛋白質断片に対する抗体だけでなく、ウィルス由来
の複数種の抗原に対する複数種の抗体も産生されること
になり。
抗原性が弱く、エイズウィルスに対する抗体の力価が低
いことが、免疫学的基礎知識から考えられる。またエイ
ズウィルス粒子をそのまま抗原として用いる場合は、特
定の蛋白質断片に対する抗体だけでなく、ウィルス由来
の複数種の抗原に対する複数種の抗体も産生されること
になり。
ワクチンとしての効力は強くなると考えられる。
また、エイズの症例の多数が、汚染された血液の輸血に
より生じていることが報告されているため、血液供与者
の血清を免疫学的に検査し、血液がエイズウィルスに感
染しているか否かを調べている。現在、酵素結合イムノ
アトソルベントアッセイ（εＬＩＳＡ）、イムノブロッ
ティング（ＩＩＩｌｍｕｎ。
より生じていることが報告されているため、血液供与者
の血清を免疫学的に検査し、血液がエイズウィルスに感
染しているか否かを調べている。現在、酵素結合イムノ
アトソルベントアッセイ（εＬＩＳＡ）、イムノブロッ
ティング（ＩＩＩｌｍｕｎ。
ｂｌｏｔｔｉｎｇ）法及び凝集法がスクリーニング試験
として使用されている。しかしながら、これらの方法で
は、純粋なウィルス粒子、または感染した細胞から単離
されたタンパク質が、エイズウィルスに対する血清抗体
を検出するため、抗原として使用されているが、これら
のウィルス抗原の製造には、大量（週あたり数百リット
ル）の感染性ウィルス及び組織培養体の処理が必要であ
り、これらの試薬を製造する作業者は、感染した材料に
持続して晒されることを避けられず、エイズにかかると
いう潜在的な危険に常に陥っている。
として使用されている。しかしながら、これらの方法で
は、純粋なウィルス粒子、または感染した細胞から単離
されたタンパク質が、エイズウィルスに対する血清抗体
を検出するため、抗原として使用されているが、これら
のウィルス抗原の製造には、大量（週あたり数百リット
ル）の感染性ウィルス及び組織培養体の処理が必要であ
り、これらの試薬を製造する作業者は、感染した材料に
持続して晒されることを避けられず、エイズにかかると
いう潜在的な危険に常に陥っている。
また、エイズの診断においては、上記のスクリーング試
験において陽性となっても必ずしもエイズ感染者とは断
定し難いため、確定診断を行う必要があると言われてい
る６確定診断法としては。
験において陽性となっても必ずしもエイズ感染者とは断
定し難いため、確定診断を行う必要があると言われてい
る６確定診断法としては。
現在１間接蛍光抗体法が考えられている０間接蛍光抗体
法とは、エイズウィルス感染細胞と患者血清とを反応さ
せた後、蛍光標識した第２抗体を更に反応させ、患者血
清中にウィルス抗体があった時、ウィルス感染細胞が蛍
光を発するのを観察する方法である。この方法では、エ
イズウィルス感染細胞を用いるため、検査者の感染の危
険性を考えるとルーチンの検査法にはならず、一部の特
殊な研究機関で行われているのが現状である。そこで、
安全性の高い１間接蛍光抗体法を用いた確定診断の開発
が望まれている。
法とは、エイズウィルス感染細胞と患者血清とを反応さ
せた後、蛍光標識した第２抗体を更に反応させ、患者血
清中にウィルス抗体があった時、ウィルス感染細胞が蛍
光を発するのを観察する方法である。この方法では、エ
イズウィルス感染細胞を用いるため、検査者の感染の危
険性を考えるとルーチンの検査法にはならず、一部の特
殊な研究機関で行われているのが現状である。そこで、
安全性の高い１間接蛍光抗体法を用いた確定診断の開発
が望まれている。
以上述べた従来の技術の問題点を解決するために、非感
染性であるがエイズウィルスとしての抗原性を有するウ
ィルス粒子を産生じ、しかも巨細胞形成能を有しない細
胞の製造法の開発が望まれている。
染性であるがエイズウィルスとしての抗原性を有するウ
ィルス粒子を産生じ、しかも巨細胞形成能を有しない細
胞の製造法の開発が望まれている。
明が解決しようとする課題
本発明は、エイズのワクチン療法又はエイズの診断等に
必要な安全性の高いエイズウィルス抗原を有効に製造す
る技術を開発することを目的とするものである。
必要な安全性の高いエイズウィルス抗原を有効に製造す
る技術を開発することを目的とするものである。
課題を解決するための手
本発明者らは、上記のような状況下において。
ヒトＴ細胞（Ｈ９細胞； Ｐｏｐｏｖｉｃ Ｍ、、 Ｓ
ａｒｎｇａｄｈａｒａｎ。
ａｒｎｇａｄｈａｒａｎ。
Ｍ、Ｇ、、 Ｒｅａｄ、 Ｅ、、 ＆ Ｇａ１ｌｏ Ｒ
，Ｃ，、５ｃｉｅｎｃｅ、 ２２４゜４９７−５００．
（１９８４））にエイズウィルスを感染させ培養した
のち、クローニングすることにより、抗原性を有する非
感染性のエイズウィルスを産生し。
，Ｃ，、５ｃｉｅｎｃｅ、 ２２４゜４９７−５００．
（１９８４））にエイズウィルスを感染させ培養した
のち、クローニングすることにより、抗原性を有する非
感染性のエイズウィルスを産生し。
かつ、巨細胞形成能を有しない新規な形質変換ヒトＴ細
胞（Ｈ６細胞）を得ることにより本発明を完成したもの
である。
胞（Ｈ６細胞）を得ることにより本発明を完成したもの
である。
本発明のＨ６細胞及びこれが産生ずるエイズウィルスは
、抗原性、非感染性、巨細胞形成能欠失等の優れた性質
を有するために、ワクチンを製造するための安全性の高
い抗原として、エイズの検査用の抗原として、更にエイ
ズ予防剤又は治療剤の探索のための安全なスクリーニン
グ等に利用することができる。また、 ＨＩＭのノザン
ブロットハイプリダイゼイション分析及びサザンブロッ
トハイプリダイゼイション分析を行う際に、プローブ試
薬として、Ｈ６細胞に組み込まれたプロウィルスＤＮＡ
断片を使用することができる。
、抗原性、非感染性、巨細胞形成能欠失等の優れた性質
を有するために、ワクチンを製造するための安全性の高
い抗原として、エイズの検査用の抗原として、更にエイ
ズ予防剤又は治療剤の探索のための安全なスクリーニン
グ等に利用することができる。また、 ＨＩＭのノザン
ブロットハイプリダイゼイション分析及びサザンブロッ
トハイプリダイゼイション分析を行う際に、プローブ試
薬として、Ｈ６細胞に組み込まれたプロウィルスＤＮＡ
断片を使用することができる。
次に１本発明の種々の態様と利点を１本発明の下記の詳
細な説明と図において１発明の具体的な実施例とその説
明によって更に詳細に説明する。
細な説明と図において１発明の具体的な実施例とその説
明によって更に詳細に説明する。
但し、下記の実施例は１本発明の実施の態様の単なる例
示であって１本発明がこれらに限定されないことはもと
よりである。
示であって１本発明がこれらに限定されないことはもと
よりである。
なお、Ｈ６細胞は常にウィルスを産生ずる状態にあるた
め、明細書中に記載されるＨ６細胞という語は、適宜、
Ｈ６細胞とその産生ずるウィルスの混合物をも意味する
。
め、明細書中に記載されるＨ６細胞という語は、適宜、
Ｈ６細胞とその産生ずるウィルスの混合物をも意味する
。
第１図は、Ｈ６細胞（ａ）が巨細胞形成能を持たず、Ｍ
ＩＯ細胞（ｂ）、 ＨＩＶ感染感染側９細胞）及び旧Ｖ
感染に０ＬＴ−４細胞（ｄ）が巨細胞形成能を持ってい
ることを示した図である。栃倉ら（Ｔｏｃｈｉｋｕｒａ
、 Ｔ、 ｅｔａｌ、、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、 ２６４
．５４２−５４６． （１９８８））の方法に従い、各
細胞とＭＯＬＴ−４細胞を１対１の割合で共培養し、各
時間での相対的細胞生存率を下記の式より求めた。
ＩＯ細胞（ｂ）、 ＨＩＶ感染感染側９細胞）及び旧Ｖ
感染に０ＬＴ−４細胞（ｄ）が巨細胞形成能を持ってい
ることを示した図である。栃倉ら（Ｔｏｃｈｉｋｕｒａ
、 Ｔ、 ｅｔａｌ、、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、 ２６４
．５４２−５４６． （１９８８））の方法に従い、各
細胞とＭＯＬＴ−４細胞を１対１の割合で共培養し、各
時間での相対的細胞生存率を下記の式より求めた。
（相対的細胞生存率）＝（共培養した時の細胞数）／（
（各細胞単独で培養した時の細胞数）＋（ＩＩＯＬＴ−
４細胞単独で培養した時の細胞数））÷２第２図は、Ｍ
ＩＯ細胞（ａ、ｂ）、 ）（６細胞（ｃ、ｄ）、及び？
ｌ０ＬＴ−４７）ＩＩＶ細胞（ＨＩＭ感＠ＭＯＬＴ−４
細胞）（ｅ、ｆ）ノウイルス由来蛋白の特性を示す図で
ある。各細胞を″Ｓメチオニン標識し、抗ＨＩＶ抗体陽
性血清（十；ｂ＋ｄ、ｆ）又は抗旧Ｖ抗体陰性血清（；
ａ、ｃ、ｅ）を用い。
（各細胞単独で培養した時の細胞数）＋（ＩＩＯＬＴ−
４細胞単独で培養した時の細胞数））÷２第２図は、Ｍ
ＩＯ細胞（ａ、ｂ）、 ）（６細胞（ｃ、ｄ）、及び？
ｌ０ＬＴ−４７）ＩＩＶ細胞（ＨＩＭ感＠ＭＯＬＴ−４
細胞）（ｅ、ｆ）ノウイルス由来蛋白の特性を示す図で
ある。各細胞を″Ｓメチオニン標識し、抗ＨＩＶ抗体陽
性血清（十；ｂ＋ｄ、ｆ）又は抗旧Ｖ抗体陰性血清（；
ａ、ｃ、ｅ）を用い。
免疫沈降させたものである。右側の数は、キロダルトン
（Ｋ）で示した標準マーカーの分子量を示し。
（Ｋ）で示した標準マーカーの分子量を示し。
記載された条件下で電気泳動にかけたときのマーカーの
位置を示す、左側のｇｐ１６０． ｇｐ１２０． ｐ５
５゜ｐ３８． ｐ２４はウィルス由来の蛋白の標準品の
名前を示し、矢印でその位置を示す。
位置を示す、左側のｇｐ１６０． ｇｐ１２０． ｐ５
５゜ｐ３８． ｐ２４はウィルス由来の蛋白の標準品の
名前を示し、矢印でその位置を示す。
第３図は、Ｈ６細胞（ａ）、 ＭＩＯ細胞（ｂ）及びＭ
１２細胞（Ｃ）の総ＲＮＡを用いた時のノザンプロット
ハイプリダイゼイション解析の結果を示す。プローブと
してプラスミドｐＮＫ５．２（Ｙｏｓｈｉｙａｍａ、
Ｈ，ｅｔ ａｌ、。
１２細胞（Ｃ）の総ＲＮＡを用いた時のノザンプロット
ハイプリダイゼイション解析の結果を示す。プローブと
してプラスミドｐＮＫ５．２（Ｙｏｓｈｉｙａｍａ、
Ｈ，ｅｔ ａｌ、。
Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 Ｍｅｄ、、 ４．３８５−３９
６． （１９８７））のＳａｃ Ｉ断片を用いた。 ２
８Ｓ、 １８ＳはリボゾーマルＲＮＡを示し。
６． （１９８７））のＳａｃ Ｉ断片を用いた。 ２
８Ｓ、 １８ＳはリボゾーマルＲＮＡを示し。
矢印にてそれらの泳動位置を示す。
第４図は、Ｈ６細胞（ａ）、 ＭＩＯ細胞（ｂ）及びＭ
１２細胞（Ｃ）のＤＮＡをＳａｃ Ｉ （１）、 シσ
ＩＩ （２）又はＥｃｏＲＩ（３）で消化し、サザンブ
ロットハイプリダイゼイション解析を行った時の結果を
示す、プローブとしてプラスミドｐＮＫ５．２のＳａｃ
Ｉ断片を用いた。数字はキロベースベア（Ｋｂｐ）で
示した標準マーカーの分子量（λＤＮＡ旧ｎｄｍ断片）
を示し、矢印にてそれらの泳動位置を示す。
１２細胞（Ｃ）のＤＮＡをＳａｃ Ｉ （１）、 シσ
ＩＩ （２）又はＥｃｏＲＩ（３）で消化し、サザンブ
ロットハイプリダイゼイション解析を行った時の結果を
示す、プローブとしてプラスミドｐＮＫ５．２のＳａｃ
Ｉ断片を用いた。数字はキロベースベア（Ｋｂｐ）で
示した標準マーカーの分子量（λＤＮＡ旧ｎｄｍ断片）
を示し、矢印にてそれらの泳動位置を示す。
第５図は、Ｈ６細胞（１）またはＭＩＯ細胞（２）から
合成されたウィルス粒子の構造（写真中矢印）の電子顕
微鏡写真を示す。
合成されたウィルス粒子の構造（写真中矢印）の電子顕
微鏡写真を示す。
第６図は、Ｈ６細胞とエイズ患者血清とを反応させた時
の間接蛍光抗体法による蛍光写真（ａ）と位相差写真（
ｂ）を示す。
の間接蛍光抗体法による蛍光写真（ａ）と位相差写真（
ｂ）を示す。
下記の実施例１は２本発明によるＨ６細胞及びこれが産
生ずるエイズウィルスの製造の工程を例示する。更に詳
細には、ヒトＴ細胞（Ｈ９）にエイズウィルス（ＩＩＴ
ＬＶＩＢ）を持続感染したのち、当該技術分野の通常の
方法でクローニングして、抗原性を有し非感染性でかつ
巨細胞形成能を有しないエイズウィルス感染ヒトＴ細胞
（Ｈ６）及びこれが産生ずるエイズウィルスを製造する
工程、製造するために用いられた各種試験（非感染性、
抗原性及び巨細胞形成能等）、及びその結果を示してい
る。
生ずるエイズウィルスの製造の工程を例示する。更に詳
細には、ヒトＴ細胞（Ｈ９）にエイズウィルス（ＩＩＴ
ＬＶＩＢ）を持続感染したのち、当該技術分野の通常の
方法でクローニングして、抗原性を有し非感染性でかつ
巨細胞形成能を有しないエイズウィルス感染ヒトＴ細胞
（Ｈ６）及びこれが産生ずるエイズウィルスを製造する
工程、製造するために用いられた各種試験（非感染性、
抗原性及び巨細胞形成能等）、及びその結果を示してい
る。
したがって、実施例１は、製造法を例示するにとどまら
ず、同時に、目的物たるＨ６細胞等の利用の態様をも例
示するものである。
ず、同時に、目的物たるＨ６細胞等の利用の態様をも例
示するものである。
実施例２は、Ｈ６細胞又はＨ６細胞産生ウィルスを含有
するワクチンの製造法に関するものである。
するワクチンの製造法に関するものである。
実施例３は、エイズ感染者の確定診断用としてのＨ６細
胞の細胞抗原としての利用に関する。
胞の細胞抗原としての利用に関する。
実施例４は、エイズ感染者のスクリーニング診断に用い
る免疫学的測定法のＥＬＩＳＡ、イムノブロッティング
及び凝集法のキットにおける。ウィルス抗原としての利
用に関する。
る免疫学的測定法のＥＬＩＳＡ、イムノブロッティング
及び凝集法のキットにおける。ウィルス抗原としての利
用に関する。
実施例５は、 ＨＩＶのノザンブロットハイプリダイゼ
イション分析及びサザンブロットハイプリダイゼイショ
ン分析を行う際に、プローブ試薬として利用する方法に
関する。
イション分析及びサザンブロットハイプリダイゼイショ
ン分析を行う際に、プローブ試薬として利用する方法に
関する。
実施例６は、Ｈ６細胞の抗エイズウイルス治療薬のスク
リーニングシステムにおける利用に関する。
リーニングシステムにおける利用に関する。
実施例１
エイズウィルス（ｌ（ＩＶ）持続感染細胞であるＭＯＬ
Ｔ−４／ＨＩＶ の培養上清をウィルス液としＦ
ＩＴＩＪＩＢ ＭＯＬＴ−４及びＨ９細胞にＯ，０ＯＩＰＦＵ／ｃｅｌ
ｌのｍ、ｏ、ｉ、で。
Ｔ−４／ＨＩＶ の培養上清をウィルス液としＦ
ＩＴＩＪＩＢ ＭＯＬＴ−４及びＨ９細胞にＯ，０ＯＩＰＦＵ／ｃｅｌ
ｌのｍ、ｏ、ｉ、で。
原因ら（Ｈａｒａｄａ、 Ｓ、 ｅｔ ａｌ、、 ５ｃ
ｉｅｎｃｅ、 ２２９．５６３−５６６、 （１９８５
））の方法に従い感染させた。これらの細胞を１０％牛
脂仔血清添加ＲＰＭ１１６４０を培養液とし。
ｉｅｎｃｅ、 ２２９．５６３−５６６、 （１９８５
））の方法に従い感染させた。これらの細胞を１０％牛
脂仔血清添加ＲＰＭ１１６４０を培養液とし。
５％Ｃｏ、、 ３７℃の条件下で４〜５週間培養し旧Ｖ
持続感染細胞の懸濁液を作製した。９６穴培養プレート
に０．６ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように細胞懸濁液を
加え。
持続感染細胞の懸濁液を作製した。９６穴培養プレート
に０．６ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように細胞懸濁液を
加え。
各ｖｉｅｌｌについて細胞増殖の程度を観察しながら適
時継代した。クローニングされた各細胞について。
時継代した。クローニングされた各細胞について。
８１Ｍ感染細胞であるか否かをＨＩＶｖＬｊＫの発現の
有無を指標として間接蛍光抗体法により調べた。すなわ
ち、各クローン化細胞を顕微鏡用スライドグラスの上に
広げ風乾後、冷メタノールで固定し。
有無を指標として間接蛍光抗体法により調べた。すなわ
ち、各クローン化細胞を顕微鏡用スライドグラスの上に
広げ風乾後、冷メタノールで固定し。
次抗体として１０００倍希釈したエイズ患者血清、二次
抗体としてＦＩＴＣ結合抗ヒトＴｇＧ抗体（カベル社製
）を用いて染色した。
抗体としてＦＩＴＣ結合抗ヒトＴｇＧ抗体（カベル社製
）を用いて染色した。
５００個以上の細胞を蛍光顕微鏡下にて判定し。
陽性率を算定した０次に各クローン化細胞が感染性ウィ
ルス粒子を産生じているか否かについて調べた。すなわ
ち、各クローン化細胞培養上清を。
ルス粒子を産生じているか否かについて調べた。すなわ
ち、各クローン化細胞培養上清を。
ニトロセルロースフィルター（０，２２μｍ、ミリボア
社製）を通した後に、 ＭＴ−４及びＭＯＬＴ−４細胞
に接種し、２０日以上培養した後１間接蛍光抗体法によ
り感染の有無を調べた。以上の方法により得られたクロ
ーン化細胞を分類すると１表１に示したように、３群に
分けられた。すなわち、１群は旧■抗原の発現があり、
かつ感染性ウィルス粒子を産生じている。−殻内なエイ
ズウィルス感染細胞である０ｍ群は、 ＨＩＶ抗原の発
現もなく、更に感染性ウィルス粒子を産生じていない細
胞であり、エイズウィルス非感染の正常細胞である８■
群は。
社製）を通した後に、 ＭＴ−４及びＭＯＬＴ−４細胞
に接種し、２０日以上培養した後１間接蛍光抗体法によ
り感染の有無を調べた。以上の方法により得られたクロ
ーン化細胞を分類すると１表１に示したように、３群に
分けられた。すなわち、１群は旧■抗原の発現があり、
かつ感染性ウィルス粒子を産生じている。−殻内なエイ
ズウィルス感染細胞である０ｍ群は、 ＨＩＶ抗原の発
現もなく、更に感染性ウィルス粒子を産生じていない細
胞であり、エイズウィルス非感染の正常細胞である８■
群は。
ＨＩＶ抗原の発現があるが、感染性ウィルス粒子を産生
じていない細胞であり、■群の細胞の中に本発明のＨ６
細胞が含まれている。すなわち、 ８９由来のクローン
化細胞より、上記の方法で本発明のＨ６ｇｆｉ胞を得た
。
じていない細胞であり、■群の細胞の中に本発明のＨ６
細胞が含まれている。すなわち、 ８９由来のクローン
化細胞より、上記の方法で本発明のＨ６ｇｆｉ胞を得た
。
（以下余白）
表１．１ＩＩＶ持続感染クローン化ｊＩＩＩ胞の分類Ｈ
ＩＶ抗原 分類 の発現 感染性粒子 の産生 （ＩＩも八たり０−ン化藷のり ／（全りトン化細胞のｉ） Ｈ９ＭＯＬＴ−４ １群 十 ＋ １４／
１７ ６２／６７■群 ＋
１ハフ １７６７■群 −２７１７４７
６７ このことは、抗原として用いるためのエイズウィルス由
来の蛋白を細胞より抽出する場合に。
ＩＶ抗原 分類 の発現 感染性粒子 の産生 （ＩＩも八たり０−ン化藷のり ／（全りトン化細胞のｉ） Ｈ９ＭＯＬＴ−４ １群 十 ＋ １４／
１７ ６２／６７■群 ＋
１ハフ １７６７■群 −２７１７４７
６７ このことは、抗原として用いるためのエイズウィルス由
来の蛋白を細胞より抽出する場合に。
Ｈ６細胞を用いれば、それらの抗原が効率よく量産でき
ることを意味している。
ることを意味している。
表２ ８ＩＶ発現の定量
また、Ｈ６細胞（３Ｘ１０’ｃｅｌｌｓ／Ｕ１Ｑ）を３
日間培養したのち、培養上清及び細胞中に各々存在する
ｐ２４の量（Ｈｒｖの遺伝子［１がコードしている分子
量２４キロダルトンの蛋白）を、 ＨＩＶ抗原・ＥＩＡ
ｒアボットｊのキットで測定した。その結果２表２に
示されるように、Ｈ６細胞の培養上清中にはＭ１２細胞
（表１の【群に属するクローン化細胞で。
日間培養したのち、培養上清及び細胞中に各々存在する
ｐ２４の量（Ｈｒｖの遺伝子［１がコードしている分子
量２４キロダルトンの蛋白）を、 ＨＩＶ抗原・ＥＩＡ
ｒアボットｊのキットで測定した。その結果２表２に
示されるように、Ｈ６細胞の培養上清中にはＭ１２細胞
（表１の【群に属するクローン化細胞で。
ＭＯＬＴ−４由来の旧Ｖ感染細胞でポジティブコントロ
ールとして用いた）と同程度の９２４の存在が認められ
た。このことから１本発明のＨ６細胞が、非感染性のウ
ィルスを産生していることが確認された。また、Ｈ６細
胞中にはＭ１２細胞の１２倍の９２４の存在が認められ
た。
ールとして用いた）と同程度の９２４の存在が認められ
た。このことから１本発明のＨ６細胞が、非感染性のウ
ィルスを産生していることが確認された。また、Ｈ６細
胞中にはＭ１２細胞の１２倍の９２４の存在が認められ
た。
９．７０
１．４３
０．４０
０．４２
ａ ： ＣＩ＝ｃｕｔ ｏｆｆ １ｎｄｅｘ ； １１
ｉ性＞１．０ （）ＩＩＶ抗Ｘ −ＥＴＡ「アボット」
による）、上滑は１００倍希釈、細胞は１０００倍希釈
して測定した。
ｉ性＞１．０ （）ＩＩＶ抗Ｘ −ＥＴＡ「アボット」
による）、上滑は１００倍希釈、細胞は１０００倍希釈
して測定した。
Ｈ６，１胞の 胞形成能
一般に、エイズウィルス感染細胞は正常なＴａ１ｌ胞と
細胞融合を起こし多核細胞を形成し、正常なＴＭｉ胞を
も巻き込み細胞死に至らしめるという巨細胞形成能（シ
ンジチア形成能）を持っている。それ故にエイズウィル
ス感染者は、急激な免疫能低下に陥るため、死亡率が高
いのである。
細胞融合を起こし多核細胞を形成し、正常なＴＭｉ胞を
も巻き込み細胞死に至らしめるという巨細胞形成能（シ
ンジチア形成能）を持っている。それ故にエイズウィル
ス感染者は、急激な免疫能低下に陥るため、死亡率が高
いのである。
非感染性ウィルス粒子を産生ずる細胞であってもその細
胞自身に巨細胞形成能があっては、エイズのワクチン療
法又はエイズの診断に必要な安全性の高い抗原を有効に
製造する目的には合わない。
胞自身に巨細胞形成能があっては、エイズのワクチン療
法又はエイズの診断に必要な安全性の高い抗原を有効に
製造する目的には合わない。
そこでＨ６細胞の巨細胞形成能について栃倉ら（Ｔｏｃ
ｈｉｋｕｒａ、 Ｔ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ、 １６４．５４２−５４６、 （１９８８））ら
の方法により評価した。すなわち。
ｈｉｋｕｒａ、 Ｔ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ、 １６４．５４２−５４６、 （１９８８））ら
の方法により評価した。すなわち。
Ｈ６細胞とＭＯＬＴ−４細胞とをｌ；１の割合で共培養
し、経時的に細胞数を測定した。すなわち、巨細胞形成
能がある場合には、細胞融合の結果細胞数の減少が起こ
るのである。実験では、ポジティブコントロールとして
、 ＦＩＩＶ感染Ｈ９細胞、■ＩＴ／感梁ＭＯＬＴ−４
細胞及び表１で１群に属するＭＯＬＴ−４由来のクロー
ン化細胞（ＭＩＯ細胞という）についても同様の実験を
行った。その結果図１に示すように。
し、経時的に細胞数を測定した。すなわち、巨細胞形成
能がある場合には、細胞融合の結果細胞数の減少が起こ
るのである。実験では、ポジティブコントロールとして
、 ＦＩＩＶ感染Ｈ９細胞、■ＩＴ／感梁ＭＯＬＴ−４
細胞及び表１で１群に属するＭＯＬＴ−４由来のクロー
ン化細胞（ＭＩＯ細胞という）についても同様の実験を
行った。その結果図１に示すように。
Ｈ６細胞（ａ）の場合、共培養後２４時間たっても全く
細胞数に変化はなく、一方、ポジティブコントロールに
用いた３種の細胞（ｂ、ｃ、ｄ）は、劇的な細胞数の減
少が見られた。二のことは、Ｈ６細胞には巨細胞形成能
がないことを示している０Ｍｌ０細胞には巨細胞形成能
があり１表１の１群に属する細胞であっても安全性に問
題があることを示している。したがって、この事実は８
６＃［＋胞が驚くべきことに非常に安全性の高い細胞で
あることを示している。
細胞数に変化はなく、一方、ポジティブコントロールに
用いた３種の細胞（ｂ、ｃ、ｄ）は、劇的な細胞数の減
少が見られた。二のことは、Ｈ６細胞には巨細胞形成能
がないことを示している０Ｍｌ０細胞には巨細胞形成能
があり１表１の１群に属する細胞であっても安全性に問
題があることを示している。したがって、この事実は８
６＃［＋胞が驚くべきことに非常に安全性の高い細胞で
あることを示している。
上記の試験結果より、Ｈ６細胞は抗原性を有する非感染
性ウィルス粒子を産生ずるが、従来報告されているＭＩ
Ｏタイプの細胞とは異なり、巨細胞形成能を欠失したも
のであることが明らかである。
性ウィルス粒子を産生ずるが、従来報告されているＭＩ
Ｏタイプの細胞とは異なり、巨細胞形成能を欠失したも
のであることが明らかである。
Ｈ６胞の産生ずるウィルスの逆 写 素話Ｈ６細胞の培
養上清３Ｉａｉ！を１００．００Ｏｒｐｍ（ＢｅｃｋＩ
Ｉｌａｎ。
養上清３Ｉａｉ！を１００．００Ｏｒｐｍ（ＢｅｃｋＩ
Ｉｌａｎ。
ＴＬ−１００遠心ｔａ）で３０分間超遠心分離し、ウィ
ルス粒子をベレットに回収した。ペレットは０．１％Ｎ
Ｐ４０液で可溶化し、テンプレートｌブライマーにｏｌ
ｉｇｏ ｄＴ−ｐｏｌｙ Ａ（ＰＬ社製）を用い、Ｍｇ
”存在下にアイソトープ標識したチミジン（ＮＥＮ社製
）の酸不溶性分画への取り込みを測定し、逆転写酵素活
性を原因ら（Ｈａｒａｄａ、 Ｓ、 ｅｔ ａｌ、、
５ｃｉｅｎｃｅ、 ２２９゜５６３−５６６、 （１９
８５））の方法に従い求めた。しかしながら９表３に示
されるようにＨ６細胞の培養土清の逆転写酵素活性の値
はＨ９（ＨＩＶ非感染のヒトＴ細胞でネガティブコント
ロールとして用いた）と同程度であり、酵素活性はなか
った。
ルス粒子をベレットに回収した。ペレットは０．１％Ｎ
Ｐ４０液で可溶化し、テンプレートｌブライマーにｏｌ
ｉｇｏ ｄＴ−ｐｏｌｙ Ａ（ＰＬ社製）を用い、Ｍｇ
”存在下にアイソトープ標識したチミジン（ＮＥＮ社製
）の酸不溶性分画への取り込みを測定し、逆転写酵素活
性を原因ら（Ｈａｒａｄａ、 Ｓ、 ｅｔ ａｌ、、
５ｃｉｅｎｃｅ、 ２２９゜５６３−５６６、 （１９
８５））の方法に従い求めた。しかしながら９表３に示
されるようにＨ６細胞の培養土清の逆転写酵素活性の値
はＨ９（ＨＩＶ非感染のヒトＴ細胞でネガティブコント
ロールとして用いた）と同程度であり、酵素活性はなか
った。
表３ 逆転写酵素活性
３０．７１８
１．１０６
ｂ ： ３．０Ｘ１０’ｃｅｌｌｓ／−で培養開始後３
日目の上清３ＩＩ１ｇ中の活性 Ｈ６の 生 るウィルス の Ｈ６細胞の産生ずるウィルス粒子の性質を評価する目的
で）ＩＩＶの遺伝子Ｌ！ｆｉｌ 耐及びｅｎｖのコード
としている。 １７，２４，３４，６６．４１，１２０
，１６０．キロダルトンの蛋白の産生を調べた。すなわ
ち、細胞１×１０″ｃｅｌｌｓ／ｍｇと１００ μＣｉ
のｓｓＳメチオニン（ＮＥＮ社製）を、メチオニンを含
まないＲＰｌ’１ｌ１６４０培養液中で６時間培養し、
標識した後、ウィルス及び細胞を０．１％ＮＰ４０にて
可溶化した。これらのサンプルを抗ＨＩＶ抗体陽性及び
抗ＨＩＶ抗体陰性ヒト血清と反応させた後、プロティン
Ａセファロース（ファルマシア社製）で免疫沈降させ、
Ｌａｅｍｍｌｉ、 Ｎａｔｕｒｅ。
日目の上清３ＩＩ１ｇ中の活性 Ｈ６の 生 るウィルス の Ｈ６細胞の産生ずるウィルス粒子の性質を評価する目的
で）ＩＩＶの遺伝子Ｌ！ｆｉｌ 耐及びｅｎｖのコード
としている。 １７，２４，３４，６６．４１，１２０
，１６０．キロダルトンの蛋白の産生を調べた。すなわ
ち、細胞１×１０″ｃｅｌｌｓ／ｍｇと１００ μＣｉ
のｓｓＳメチオニン（ＮＥＮ社製）を、メチオニンを含
まないＲＰｌ’１ｌ１６４０培養液中で６時間培養し、
標識した後、ウィルス及び細胞を０．１％ＮＰ４０にて
可溶化した。これらのサンプルを抗ＨＩＶ抗体陽性及び
抗ＨＩＶ抗体陰性ヒト血清と反応させた後、プロティン
Ａセファロース（ファルマシア社製）で免疫沈降させ、
Ｌａｅｍｍｌｉ、 Ｎａｔｕｒｅ。
２２７、６８０−６８５（１９７０）の方法に従い、ソ
ディウムドデシルサルフエイトー１２％ポリアクリルア
ミド電気泳動を行い、″Ｓメチオニン標識蛋白の泳動位
置をサリチル酸ナトリウムを用いたフルオログラフィー
法によりＸ線フィルムに暴露した。その結果の一例、す
なわち、 ｇｐ１２０の蛋白に着目して解析を行った一
例を図２に示し、各蛋白に着目して解析した結果をまと
めたものを表４に示した０表４に示されるように、抗Ｈ
Ｖ抗体陽性血を用いた時、Ｈ６細胞では、 ｐ１７．
ｐ２４．ｇｐ４１．ｇｐ１２０が認められたが、 ｇｐ
１６０及び耐遺伝子産物である逆転写酵素のｐ３４．ｐ
６６は認められなかった。また、ポジティブコントロー
ルとして用いたＭＯＬＴ−４細胞にＨＩＶを感染させた
細胞ではいずれの蛋白も認められた。また、抗ＨＩＶ抗
体陽性のヒト血清では全くバンドが認められないことよ
り、この実験にて認められた蛋白は、 ）ＩＩＶ由来の
蛋白を調べていることを保証するものである。
ディウムドデシルサルフエイトー１２％ポリアクリルア
ミド電気泳動を行い、″Ｓメチオニン標識蛋白の泳動位
置をサリチル酸ナトリウムを用いたフルオログラフィー
法によりＸ線フィルムに暴露した。その結果の一例、す
なわち、 ｇｐ１２０の蛋白に着目して解析を行った一
例を図２に示し、各蛋白に着目して解析した結果をまと
めたものを表４に示した０表４に示されるように、抗Ｈ
Ｖ抗体陽性血を用いた時、Ｈ６細胞では、 ｐ１７．
ｐ２４．ｇｐ４１．ｇｐ１２０が認められたが、 ｇｐ
１６０及び耐遺伝子産物である逆転写酵素のｐ３４．ｐ
６６は認められなかった。また、ポジティブコントロー
ルとして用いたＭＯＬＴ−４細胞にＨＩＶを感染させた
細胞ではいずれの蛋白も認められた。また、抗ＨＩＶ抗
体陽性のヒト血清では全くバンドが認められないことよ
り、この実験にて認められた蛋白は、 ）ＩＩＶ由来の
蛋白を調べていることを保証するものである。
以上のことは、Ｈ６の産生する非感染性ウィルス粒子は
、ｐ６６及びｐ３４以外の主なウィルス蛋白を本質的に
産生ずるが、逆転写酵素活性を持たないものであること
を示している。また９図２に相当する実験を他種の抗Ｈ
Ｉ抗体陽性血清を用いて行っても全く同じ結果を与える
ことにより、Ｈ６の産生ずる非感染性ウィルス粒子は、
複数のエイズ患者の血清と反応することを示しており、
抗原性において感染性ウィルスと差異はあまりないもの
と考えられる。この点に関しては、実施例３にて更に確
認される。
、ｐ６６及びｐ３４以外の主なウィルス蛋白を本質的に
産生ずるが、逆転写酵素活性を持たないものであること
を示している。また９図２に相当する実験を他種の抗Ｈ
Ｉ抗体陽性血清を用いて行っても全く同じ結果を与える
ことにより、Ｈ６の産生ずる非感染性ウィルス粒子は、
複数のエイズ患者の血清と反応することを示しており、
抗原性において感染性ウィルスと差異はあまりないもの
と考えられる。この点に関しては、実施例３にて更に確
認される。
表４ ＨＩＶ抗原の測定結果
Ｈａ 十 十 −−十 （十）
’（−）ｂａ：（＋）は存在は認められるが異常である
ことを示す。
’（−）ｂａ：（＋）は存在は認められるが異常である
ことを示す。
ｂ：＜−＞は存在は認められるが非常に微量であること
を示す。
を示す。
Ｈ６胞 の旧ＶのＲＮＡ びプロウィルスＤＮＡのト
仮 Ｈ６細胞より総ＲＮＡを抽出し、 ｐＮＫ５．２ Ｓａ
ｃ ｒ断片をプローブとしてノザンブロットハイプリダ
イゼイションにより評価した。すなわち、ＨＢ細胞より
抽出した総ＲＮＡ ｌＯＩＩｇをｇｌｙｏｘａｌにより
変性後。
仮 Ｈ６細胞より総ＲＮＡを抽出し、 ｐＮＫ５．２ Ｓａ
ｃ ｒ断片をプローブとしてノザンブロットハイプリダ
イゼイションにより評価した。すなわち、ＨＢ細胞より
抽出した総ＲＮＡ ｌＯＩＩｇをｇｌｙｏｘａｌにより
変性後。
１％アガロースゲル電気泳動後、ニトロセルロース膜（
ＢＡ８５．ＳａＳ社）に転写し、ニックトランスレーシ
ョン法（アマジャム社ニックトランスレーションキット
Ｎ５０００を使用）により” ” Ｐ−ｄＣＴＰにより
放射標識したプローブ（２Ｘ１０°ｄ、ｐ、ｍ、／Ｉ１
ｇＤＮＡ）と５０％ホルムアミド、 ５ Ｘ５ＳＣ（
ｌ Ｘ５ＳＣ： ０．１５Ｍ ＮａＣ１゜０．０１５Ｍ
ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）、 ５ＸＤ
ｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ５ｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉ Ｘ Ｄ
ｅｎｈａｒｄｔ’ ｓ ５ｏｌｕｔｉｏｎ ： ０．０
２％ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ、 ０．
０２％Ｆｉｃｏｌ１４００．０．０２％ｐｏｌｙｖｉｎ
ｙｌ−ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ−４０）、 ２００ｔ１
ｇ／ｍｇサケ精巣ＤＮＡ、 ０．２％５ＤＳｐ＆中４２
℃１６時間反応後、 ２ｘｓＳＣ，０，２％ＳＤＳ及
び０．ｌＸ５ＳＣ，０，２％ＳＤＳ、 ５０℃で洗浄後
、フジフィルム社レントゲンフィルム（ＦＲ）に−８０
℃、１２時間露光した。
ＢＡ８５．ＳａＳ社）に転写し、ニックトランスレーシ
ョン法（アマジャム社ニックトランスレーションキット
Ｎ５０００を使用）により” ” Ｐ−ｄＣＴＰにより
放射標識したプローブ（２Ｘ１０°ｄ、ｐ、ｍ、／Ｉ１
ｇＤＮＡ）と５０％ホルムアミド、 ５ Ｘ５ＳＣ（
ｌ Ｘ５ＳＣ： ０．１５Ｍ ＮａＣ１゜０．０１５Ｍ
ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）、 ５ＸＤ
ｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ５ｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉ Ｘ Ｄ
ｅｎｈａｒｄｔ’ ｓ ５ｏｌｕｔｉｏｎ ： ０．０
２％ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ、 ０．
０２％Ｆｉｃｏｌ１４００．０．０２％ｐｏｌｙｖｉｎ
ｙｌ−ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ−４０）、 ２００ｔ１
ｇ／ｍｇサケ精巣ＤＮＡ、 ０．２％５ＤＳｐ＆中４２
℃１６時間反応後、 ２ｘｓＳＣ，０，２％ＳＤＳ及
び０．ｌＸ５ＳＣ，０，２％ＳＤＳ、 ５０℃で洗浄後
、フジフィルム社レントゲンフィルム（ＦＲ）に−８０
℃、１２時間露光した。
その結果１図３に示したように、Ｈ６細胞（ａ）の場合
、３５Ｓ及び２６Ｓにバンドが認められ、各々ＨＩＶの
全長ｍＲＮＡ及びそのサブゲノミックｍＲＮＡに相当す
る。さらにこのサイズが、 Ｍ２２＃Ｉ胞（Ｃ）由来の
ものと変わらないことから、Ｈ６細胞は旧■の全長ＲＮ
Ａを含み、更に正常なスプライシングがなされているこ
とを示している。
、３５Ｓ及び２６Ｓにバンドが認められ、各々ＨＩＶの
全長ｍＲＮＡ及びそのサブゲノミックｍＲＮＡに相当す
る。さらにこのサイズが、 Ｍ２２＃Ｉ胞（Ｃ）由来の
ものと変わらないことから、Ｈ６細胞は旧■の全長ＲＮ
Ａを含み、更に正常なスプライシングがなされているこ
とを示している。
次に、Ｈ６細胞中のプロウィルスＤＮＡの存在をＨ６細
胞のＤＮＡサザンブロットハイプリダイゼイションによ
り評価した。すなわち、Ｈ６細胞より抽出したＤＮＡ５
ＩＩｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ及び５ａｃｌ。
胞のＤＮＡサザンブロットハイプリダイゼイションによ
り評価した。すなわち、Ｈ６細胞より抽出したＤＮＡ５
ＩＩｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ及び５ａｃｌ。
８ｇ５４ ＩＩ （東洋紡社製）で切断後、０．７％ア
ガロースゲル電気泳動後１ニトロセルロース膜に転写し
た。
ガロースゲル電気泳動後１ニトロセルロース膜に転写し
た。
次にこれを” ” Ｐ−ｄＣＴＰで放射標識したプロー
ブ（２Ｘ ｌｏ”ｄ、ｐ、ｍ、／ｕｇＤＮＡ）と５ＸＳ
ＳＣ，５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’５ｓｏｌｕｔｉｏｎ、
２００．ｇ／ｍｇサケ精巣ＤＮＡ、 ０．２％ＳＤＳ液
中６５℃１６時間反応した０反応終了後フィルターを２
ＸＳＳＣ，０，２％ＳＤＳ液中３０分、 ０．ｌＸ５Ｓ
Ｃ，０，２％ＳＤＳ液中、５０℃で２時間洗浄後レント
ゲンフィルム（フジフィルム社ＦＲ）に−８０℃、２時
間露光した。
ブ（２Ｘ ｌｏ”ｄ、ｐ、ｍ、／ｕｇＤＮＡ）と５ＸＳ
ＳＣ，５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’５ｓｏｌｕｔｉｏｎ、
２００．ｇ／ｍｇサケ精巣ＤＮＡ、 ０．２％ＳＤＳ液
中６５℃１６時間反応した０反応終了後フィルターを２
ＸＳＳＣ，０，２％ＳＤＳ液中３０分、 ０．ｌＸ５Ｓ
Ｃ，０，２％ＳＤＳ液中、５０℃で２時間洗浄後レント
ゲンフィルム（フジフィルム社ＦＲ）に−８０℃、２時
間露光した。
ＨＩＶのプロウィルスＤＮＡが組み込まれたＤＮＡを制
限酵素の５ａｃｌで切断すれば４．５Ｋｂｐ（キロベー
スベア）と３．５ＫｂｐのプロウィルスＤＮＡ断片が切
り出されてくることがＨｎの制限酵素地図（Ｒａｔｎｅ
ｒ、 Ｌ、 ｅｔａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ、 ３１３．
２７７−２８４． （１９８５））から予測出来る。図
４に示したように、Ｈａ細胞（（１）−（ａ））より得
られたＤＮＡをＳａｃ Ｉで切断してサザンブロットハ
イプリダイゼイションを行うと、 ４．５Ｋｂｐと３．
５Ｋｂｐにバンドが認められた。さらに履■切断断片の
大きさはＨ６細胞（（２）−（ａ））、 ＭＩＯ細胞（
（２）−（ｂ））及びＭ１２細胞（（２）−（ｃ））で
変化がなかった。
限酵素の５ａｃｌで切断すれば４．５Ｋｂｐ（キロベー
スベア）と３．５ＫｂｐのプロウィルスＤＮＡ断片が切
り出されてくることがＨｎの制限酵素地図（Ｒａｔｎｅ
ｒ、 Ｌ、 ｅｔａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ、 ３１３．
２７７−２８４． （１９８５））から予測出来る。図
４に示したように、Ｈａ細胞（（１）−（ａ））より得
られたＤＮＡをＳａｃ Ｉで切断してサザンブロットハ
イプリダイゼイションを行うと、 ４．５Ｋｂｐと３．
５Ｋｂｐにバンドが認められた。さらに履■切断断片の
大きさはＨ６細胞（（２）−（ａ））、 ＭＩＯ細胞（
（２）−（ｂ））及びＭ１２細胞（（２）−（ｃ））で
変化がなかった。
二のことは、Ｈ６細胞中のプロウィルスＤＮＡには大き
な領域にわたるＤＮＡの欠落はないことを示している。
な領域にわたるＤＮＡの欠落はないことを示している。
非感染性ウィルスに変異した原因はウィルスゲノム上の
ポイントミューティジョン等を含む、小さな領域の変異
によっていることを示している。また、制限酵素のＥｃ
ｏＲＩで切断すれば、約１．２ＫｂｐのプロウィルスＤ
ＮＡ断片と、約４ ＫｂｐプロウィルスＤＮＡ断片に宿
主のＤＮＡ断片が付いたサイズのＤＮＡ断片２本が切り
出されてくることが、 ）ＩＩＶの制限酵素地図から予
測出来る。図４に示したように。
ポイントミューティジョン等を含む、小さな領域の変異
によっていることを示している。また、制限酵素のＥｃ
ｏＲＩで切断すれば、約１．２ＫｂｐのプロウィルスＤ
ＮＡ断片と、約４ ＫｂｐプロウィルスＤＮＡ断片に宿
主のＤＮＡ断片が付いたサイズのＤＮＡ断片２本が切り
出されてくることが、 ）ＩＩＶの制限酵素地図から予
測出来る。図４に示したように。
Ｈ６細胞（（３）−（ａ））より得られたＤＮＡをＥｃ
ｏＲＩで切断してサザンブロットハイプリダイゼイショ
ンを行うと、 １．２Ｋｂｐと約２０ｋｂ及び約２３Ｋ
ｂｐにバンドが認められ、予測と一致していた。すなわ
ち、約２０Ｋｂｐのバンドは、約４ Ｋｂｐのプロウィ
ルスＤＮＡ断片に約１６Ｋｂｐの宿主のＤＮＡ断片が付
いたバンドであり。
ｏＲＩで切断してサザンブロットハイプリダイゼイショ
ンを行うと、 １．２Ｋｂｐと約２０ｋｂ及び約２３Ｋ
ｂｐにバンドが認められ、予測と一致していた。すなわ
ち、約２０Ｋｂｐのバンドは、約４ Ｋｂｐのプロウィ
ルスＤＮＡ断片に約１６Ｋｂｐの宿主のＤＮＡ断片が付
いたバンドであり。
約２３）［ｂｐのバンドは約４ Ｋｂｐのプロウィルス
断片に約１９ｋｂの宿主ＤＮＡ断片がついたバンドであ
る。また１、２Ｋｂｐと２０Ｋｂｐと２３Ｋｂｐノバン
ド以外に全くハンドが認められないことよりＨ６細胞の
ＤＮＡ上に組み込まれたプロウィルスＤＮＡは単一であ
ることを示している。これとは反対に、Ｍ１２１胞（（
３）−（ｃ））では１．２Ｋｂｐのバンド以外に２本以
上のバンドが検出される。このことは、Ｈ６細胞が単一
のプロウィルスＤＮＡを含むクローン細胞集団であり、
Ｍ１２細胞が複数の細胞のクローンを含む集団である
ことを示してしλる。
断片に約１９ｋｂの宿主ＤＮＡ断片がついたバンドであ
る。また１、２Ｋｂｐと２０Ｋｂｐと２３Ｋｂｐノバン
ド以外に全くハンドが認められないことよりＨ６細胞の
ＤＮＡ上に組み込まれたプロウィルスＤＮＡは単一であ
ることを示している。これとは反対に、Ｍ１２１胞（（
３）−（ｃ））では１．２Ｋｂｐのバンド以外に２本以
上のバンドが検出される。このことは、Ｈ６細胞が単一
のプロウィルスＤＮＡを含むクローン細胞集団であり、
Ｍ１２細胞が複数の細胞のクローンを含む集団である
ことを示してしλる。
これらの結果は、明らかにＨ６細胞中の旧■プロウィル
スの一つのコピーが本質的にウィルスＲＮＡとして発現
されていてしかも、非感染性であるにもかかわらずその
サイズが感染性の旧Ｖと同じであることを意味している
。
スの一つのコピーが本質的にウィルスＲＮＡとして発現
されていてしかも、非感染性であるにもかかわらずその
サイズが感染性の旧Ｖと同じであることを意味している
。
Ｈ６細胞の産生ずる 感染性ウィルス粒子の 態悠塁寒
Ｈ６ｉ胞を６５０Ｘｇの遠心分離により沈殿に回収し、
血清を含まないＲＰＭＴ１６４０の培養液にて穏やかに
洗浄し、０．１とのナトリウムカコジレート緩衝液（ｐ
Ｈ７，２）の存在下で、２．５％グルタルアルデヒド中
で、１〜２時間固定した。４％のショ糖を含有する０、
１Ｍのナトリウムカコジレート緩衡液中にて１回５分間
の洗浄を３回行い、続いて沈殿を１％の四酸化オスミウ
ムで１〜２時間処理した。その後。
血清を含まないＲＰＭＴ１６４０の培養液にて穏やかに
洗浄し、０．１とのナトリウムカコジレート緩衝液（ｐ
Ｈ７，２）の存在下で、２．５％グルタルアルデヒド中
で、１〜２時間固定した。４％のショ糖を含有する０、
１Ｍのナトリウムカコジレート緩衡液中にて１回５分間
の洗浄を３回行い、続いて沈殿を１％の四酸化オスミウ
ムで１〜２時間処理した。その後。
これらをＯ，ＩＮナトリウムカコジレート緩衝液中で３
回洗浄し、そして３０％から１００％のエタノール中で
段階的に脱水し、続いてプロピレンオキサイドを用いて
最終的脱水を行った。その後検体をエポキシ樹脂中に埋
封し、薄い切片を作製した。続いて、酢酸鉛及びウラニ
ルアセテートで染色した後、透過型電子顕微鏡にて観察
した。またコントロールとしてＭＩＯ細胞についても同
様に処理後。
回洗浄し、そして３０％から１００％のエタノール中で
段階的に脱水し、続いてプロピレンオキサイドを用いて
最終的脱水を行った。その後検体をエポキシ樹脂中に埋
封し、薄い切片を作製した。続いて、酢酸鉛及びウラニ
ルアセテートで染色した後、透過型電子顕微鏡にて観察
した。またコントロールとしてＭＩＯ細胞についても同
様に処理後。
観察した。
その結果９図５に示すように、Ｈ６細胞（１）及びＭＩ
Ｏ（２）細胞ともにレトロウィルス様の構造が。
Ｏ（２）細胞ともにレトロウィルス様の構造が。
各々細胞の表面から発芽しているのが見える。しかし驚
くべきことにＨ６細胞由来のウィルス粒子はエイズウィ
ルス粒子の特徴である縮合された棹型ヌクレオイドを示
しているのに対し２Ｍ１０細胞由来のウィルス粒子は、
これらの特徴を全く示さず構造的に異常であった。すな
わちＨ６細胞の産生ずる非感染性のウィルス粒子は構造
的にも感染性エイズウィルスと変わりはなく、形態的観
点から見ても抗原性に差異がないことが予測される。
くべきことにＨ６細胞由来のウィルス粒子はエイズウィ
ルス粒子の特徴である縮合された棹型ヌクレオイドを示
しているのに対し２Ｍ１０細胞由来のウィルス粒子は、
これらの特徴を全く示さず構造的に異常であった。すな
わちＨ６細胞の産生ずる非感染性のウィルス粒子は構造
的にも感染性エイズウィルスと変わりはなく、形態的観
点から見ても抗原性に差異がないことが予測される。
実施例２
組織培養用のＲＰＭ１１６４０液を用いた培養系で。
Ｈ６細胞を増殖させて得た生ワクチンにラクトース５
Ｗ／Ｖ％、サッカロース５ Ｗ／Ｖ％、Ｄ−ソルビトー
ル１．８〜２−／ｖ％２分子量約３５ 、０００の加水
分解ゼラチン２〜；ｌ／Ｖ％を添加し凍結乾燥すること
により生ウイルスワクチンを得る。
Ｗ／Ｖ％、サッカロース５ Ｗ／Ｖ％、Ｄ−ソルビトー
ル１．８〜２−／ｖ％２分子量約３５ 、０００の加水
分解ゼラチン２〜；ｌ／Ｖ％を添加し凍結乾燥すること
により生ウイルスワクチンを得る。
実施例３
エイズウィルス感染者の確定診断用として間接蛍光抗体
法を行う際の安全な細胞抗原としてＨ６細胞を使用する
。一般にエイズウィルスの抗原性は変化しやすいとされ
ている。そのため、より多くのエイズ患者の血清と反応
する細胞抗原であることが望ましい、そこで、Ｈ６細胞
をスライドガラスに風乾固定後、冷メタノール中１０分
処理したものを細胞抗原として２６例の患者血清につい
て間接蛍光抗体法を行ったところ１表５に示したように
、２４例の正常人の血清とは全く反応しないのに対して
、全ての患者血清と反応した。写真観察の結果の一例を
図６に示した。
法を行う際の安全な細胞抗原としてＨ６細胞を使用する
。一般にエイズウィルスの抗原性は変化しやすいとされ
ている。そのため、より多くのエイズ患者の血清と反応
する細胞抗原であることが望ましい、そこで、Ｈ６細胞
をスライドガラスに風乾固定後、冷メタノール中１０分
処理したものを細胞抗原として２６例の患者血清につい
て間接蛍光抗体法を行ったところ１表５に示したように
、２４例の正常人の血清とは全く反応しないのに対して
、全ての患者血清と反応した。写真観察の結果の一例を
図６に示した。
表５ ８６細胞を用いた間接蛍光抗体法による確定診断
結果 実施例４ Ｈ６細胞を１０％牛脂仔血清添加ＲＰＭ１１６４０培養
液中で４〜ｓ ｘ ｌＯ’ｃｅｌｌｓ／威で培養し、上
清液から非感染性ウィルス粒子を精製し、抗エイズウイ
ルス抗体検出のためのスクリーニングキット（ＥＬＩＳ
Ａ、イムノブロッティング及び凝集法）に使用するウィ
ルス抗原とする。
結果 実施例４ Ｈ６細胞を１０％牛脂仔血清添加ＲＰＭ１１６４０培養
液中で４〜ｓ ｘ ｌＯ’ｃｅｌｌｓ／威で培養し、上
清液から非感染性ウィルス粒子を精製し、抗エイズウイ
ルス抗体検出のためのスクリーニングキット（ＥＬＩＳ
Ａ、イムノブロッティング及び凝集法）に使用するウィ
ルス抗原とする。
実施例５
ＨＩＭのノザンブロットハイプリダイゼイション分析及
びサザンブロットハイプリダイゼイション分析を行う際
に、プローブ試薬として、Ｈ６細胞に組み込まれたプロ
ウィルスＤＮＡ断片を使用する。
びサザンブロットハイプリダイゼイション分析を行う際
に、プローブ試薬として、Ｈ６細胞に組み込まれたプロ
ウィルスＤＮＡ断片を使用する。
実施例６
スクリーニングしようとするサンプル液及びＩｔｓメチ
オニン存在下でＨ６細胞３×ｌＯ″ｃｅｌｌｓ／戒を２
０時間培養し、ウィルス及び細胞を０．１％ＮＰ４０に
て可溶化し、抗Ｈ１’／抗体陽性ヒト血清と反応させた
後、プロティンＡセファロースで免疫沈降させ、 Ｌａ
ｅｍｍｌｉ等の方法に従い、ソディウムドデシルサルフ
ェイトーポリアクリルアミド電気泳動を行った後、電気
泳動ゲルをＸ線フィルムに暴露すル、 ＨＩＶ由来の蛋
白ｐ １７． ｐ２４．ｇｐ４１４ｐ１２０に相当する
Ｘ線フィルム上のバンドの有無を調べてサンプル液の抗
エイズウイルス活性を調べる。 ＨＩＶ由来の蛋白のい
ずれかに相当するバンドが無くなっていた時は、用いた
サンプル液が抗エイズウイルス活性を示すことが期待出
来る。
オニン存在下でＨ６細胞３×ｌＯ″ｃｅｌｌｓ／戒を２
０時間培養し、ウィルス及び細胞を０．１％ＮＰ４０に
て可溶化し、抗Ｈ１’／抗体陽性ヒト血清と反応させた
後、プロティンＡセファロースで免疫沈降させ、 Ｌａ
ｅｍｍｌｉ等の方法に従い、ソディウムドデシルサルフ
ェイトーポリアクリルアミド電気泳動を行った後、電気
泳動ゲルをＸ線フィルムに暴露すル、 ＨＩＶ由来の蛋
白ｐ １７． ｐ２４．ｇｐ４１４ｐ１２０に相当する
Ｘ線フィルム上のバンドの有無を調べてサンプル液の抗
エイズウイルス活性を調べる。 ＨＩＶ由来の蛋白のい
ずれかに相当するバンドが無くなっていた時は、用いた
サンプル液が抗エイズウイルス活性を示すことが期待出
来る。
また、サンプル液とＨ６細胞３ Ｘ１０’ｃｅｌｌｓ／
ｍＥを３日間培養し、培養上清中のｐ２４の量を旧Ｖ抗
原・ＥＩＡ ｒアボット、」のキットで測定し、サンプ
ル液の抗エイズウイルス活性を調べる。ｐ２４の量が減
っていた時は、用いたサンプルが抗エイズウイルス活性
を示すことが期待出来る。
ｍＥを３日間培養し、培養上清中のｐ２４の量を旧Ｖ抗
原・ＥＩＡ ｒアボット、」のキットで測定し、サンプ
ル液の抗エイズウイルス活性を調べる。ｐ２４の量が減
っていた時は、用いたサンプルが抗エイズウイルス活性
を示すことが期待出来る。
発明の効果
本発明の、抗原性を有する非感染性エイズウィルス遺伝
子を組み込まれたヒトＴ−細胞由来の形質変換細胞（Ｈ
６細胞）は、エイズのワクチン療法及びエイズの診断に
必要な安全性の高い抗原を製造するために有用であり、
更に抗エイズ薬のスクリーニングシステムとしても有用
である。このため１本発明は産業上の利用の効果が極め
て高いものである。
子を組み込まれたヒトＴ−細胞由来の形質変換細胞（Ｈ
６細胞）は、エイズのワクチン療法及びエイズの診断に
必要な安全性の高い抗原を製造するために有用であり、
更に抗エイズ薬のスクリーニングシステムとしても有用
である。このため１本発明は産業上の利用の効果が極め
て高いものである。
第１図は、細胞の巨細胞形成能の試験結果を示した図で
ある。 第２図は、ウィルス由来蛋白の特性を示す図である。右
側の数は、キロダルトン（Ｋ）で示した標準マーカー（
バイオラッド社製）の分子量を表し。 矢印は記載された条件下で電気泳動にかけたときのマー
カーの位置を示す。 第３図は、ノーザンブロットハイプリダイゼイション解
析の結果を示す。 第４図は、サザンブロットハイプリダイゼイション解析
の結果を示す、数字はキロベースペア（Ｋｂｐ）で示し
た標準マーカーの分子量を示し、矢印はそれらの泳動位
置を示す１図中（１）は細胞のＤＮＡをＳａｃ Ｉで切
断し、解析した結果を示す１図中（２）は細胞のＤＮＡ
を里１１で切断し、解析した結果を示す１図中（３）は
細胞のＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し解析した結果を示す
。 第５図は、細胞から合成されたウィルス粒子の構造（写
真中矢印）の電子顕微鏡写真を示す１図中（１）はＨ６
細胞から合成されたウィルス粒子の構造の電子顕微鏡写
真を示し１図中（２）はＭＩＯ細胞から合成されたウィ
ルス粒子の構造の電子顕微鏡写真を示す。 第６図は、）１６７５胞とエイズ患者血清とを反応させ
た時の細胞の構造の顕微鏡写真を示す。 特許出願人 萬有製薬株式会社 第２図 （ａ）（ｂ） （ｃ）配）（す（ｆ ）■ 〜□−
１１ 遺り手＋１１畿〔ぶζ街 第 ｙＴ （ａ）（ｔ’）（ｃ） 第 図 （ａＨｈ）（ｃ） 第 図 Ｃａ）（ｂ）＜ｃ、） 第 １メＩ （ａ）＜ｂ＞（ｃ） 第 図 第 図 第 図 手 続 補 正 書 方 式 事件の表示 平成１年特許願第２４，７０３号 ２゜ 発明の名称 クローン化ヒトＴＭＪ胞 ３゜ 補正をする者 事件との関係
ある。 第２図は、ウィルス由来蛋白の特性を示す図である。右
側の数は、キロダルトン（Ｋ）で示した標準マーカー（
バイオラッド社製）の分子量を表し。 矢印は記載された条件下で電気泳動にかけたときのマー
カーの位置を示す。 第３図は、ノーザンブロットハイプリダイゼイション解
析の結果を示す。 第４図は、サザンブロットハイプリダイゼイション解析
の結果を示す、数字はキロベースペア（Ｋｂｐ）で示し
た標準マーカーの分子量を示し、矢印はそれらの泳動位
置を示す１図中（１）は細胞のＤＮＡをＳａｃ Ｉで切
断し、解析した結果を示す１図中（２）は細胞のＤＮＡ
を里１１で切断し、解析した結果を示す１図中（３）は
細胞のＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し解析した結果を示す
。 第５図は、細胞から合成されたウィルス粒子の構造（写
真中矢印）の電子顕微鏡写真を示す１図中（１）はＨ６
細胞から合成されたウィルス粒子の構造の電子顕微鏡写
真を示し１図中（２）はＭＩＯ細胞から合成されたウィ
ルス粒子の構造の電子顕微鏡写真を示す。 第６図は、）１６７５胞とエイズ患者血清とを反応させ
た時の細胞の構造の顕微鏡写真を示す。 特許出願人 萬有製薬株式会社 第２図 （ａ）（ｂ） （ｃ）配）（す（ｆ ）■ 〜□−
１１ 遺り手＋１１畿〔ぶζ街 第 ｙＴ （ａ）（ｔ’）（ｃ） 第 図 （ａＨｈ）（ｃ） 第 図 Ｃａ）（ｂ）＜ｃ、） 第 １メＩ （ａ）＜ｂ＞（ｃ） 第 図 第 図 第 図 手 続 補 正 書 方 式 事件の表示 平成１年特許願第２４，７０３号 ２゜ 発明の名称 クローン化ヒトＴＭＪ胞 ３゜ 補正をする者 事件との関係
Claims (9)
- （１）抗原性を有する非感染性エイズウィルス遺伝子が
組み込まれており、かつ、巨細胞形成能を有しないこと
を特徴とするクローン化ヒトＴ細胞（以下、Ｈ６細胞と
いう）。 - （２）ヒトＴ細胞（Ｈ９細胞）にエイズウィルスを感染
させ培養したのち、クローニングすることを特徴とする
第１請求項記載のＨ６細胞の製造法。 - （３）第１請求項記載のＨ６細胞が産生する抗原性を有
する非感染性エイズウィルス。 - （４）第１請求項記載のＨ６細胞を用いることを特徴と
する、抗原性を有する非感染性エイズウィルスの製造法
。 - （５）第１請求項記載のＨＢ細胞又は第３請求項記載の
非感染性エイズウィルスを含有することを特徴とするエ
イズの予防剤又は治療剤。 - （６）第１請求項記載のＨ６細胞又は第３請求項記載の
非感染性エイズウィルスを含有することを特徴とするエ
イズワクチン。 - （７）第１請求項記載のＨ６細胞又は第３請求項記載の
非感染性エイズウィルスを含有することを特徴とするエ
イズの検査薬。 - （８）第６請求項記載のエイズの検査薬を用いることを
特徴とするエイズの検査方法。 - （９）第１請求項記載のＨ６細胞又は第３請求項記載の
非感染性エイズウィルスを用いることを特徴とするエイ
ズの予防剤又は治療剤のスクリーニング方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1024703A JPH02203783A (ja) | 1989-02-02 | 1989-02-02 | 抗原性を有する非感染性エイズウイルス産生クローン化ヒトｔ細胞 |
| US07/414,368 US5139947A (en) | 1989-02-02 | 1989-09-29 | Antigenic noninfectious hiv-producing cloned t cell |
| EP90101817A EP0381146B1 (en) | 1989-02-02 | 1990-01-30 | Antigenic noninfectious HIV-producing cloned T cell |
| DE69013935T DE69013935D1 (de) | 1989-02-02 | 1990-01-30 | Klonierte T-Zellen, die nichtinfektiöses, antigenes HIV produzieren. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1024703A JPH02203783A (ja) | 1989-02-02 | 1989-02-02 | 抗原性を有する非感染性エイズウイルス産生クローン化ヒトｔ細胞 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02203783A true JPH02203783A (ja) | 1990-08-13 |
Family
ID=12145541
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1024703A Pending JPH02203783A (ja) | 1989-02-02 | 1989-02-02 | 抗原性を有する非感染性エイズウイルス産生クローン化ヒトｔ細胞 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5139947A (ja) |
| EP (1) | EP0381146B1 (ja) |
| JP (1) | JPH02203783A (ja) |
| DE (1) | DE69013935D1 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8923123D0 (en) * | 1989-10-13 | 1989-11-29 | Connaught Lab | A vaccine for human immunodeficiency virus |
| US5861282A (en) * | 1989-10-16 | 1999-01-19 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Non-infectious HIV particles and uses therefor |
| WO1991007425A1 (en) * | 1989-11-20 | 1991-05-30 | Oncogen Limited Partnership | Non-replicating recombinant-made retroviral particles used as antiviral agents and immunogens |
| WO1991019803A1 (en) * | 1990-06-19 | 1991-12-26 | Applied Biotechnology, Incorporated | Self assembled, defective, nonself-propagating viral particles |
| CA2085897A1 (en) * | 1990-06-19 | 1991-12-20 | George Pieczenik | Nonpathogenic variant virus |
| EP0738319A4 (en) * | 1994-01-12 | 2000-03-29 | Genetic Therapy Inc | Purification of retroviral vectors |
| EP1281754A4 (en) * | 2000-05-11 | 2004-06-16 | Takeda Chemical Industries Ltd | HIV PRODUCING CELL LINE AND USES THEREOF |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ219313A (en) * | 1986-02-14 | 1989-01-27 | Us Commerce | Htlv-iii (hiv) virus with modifications to the tat gene |
| EP0242216A1 (en) * | 1986-04-16 | 1987-10-21 | THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary United States Department of Commerce | Non-cytopathic clone of Human T-Cell Lymphotropic Virus type III |
| JPH01120284A (ja) * | 1987-11-05 | 1989-05-12 | Shiro Kato | Ｈｉｖ不完全粒子および該製造方法 |
| IL89567A0 (en) * | 1988-03-28 | 1989-09-10 | Univ Leland Stanford Junior | Mutated hiv envelope protein |
-
1989
- 1989-02-02 JP JP1024703A patent/JPH02203783A/ja active Pending
- 1989-09-29 US US07/414,368 patent/US5139947A/en not_active Expired - Fee Related
-
1990
- 1990-01-30 EP EP90101817A patent/EP0381146B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-30 DE DE69013935T patent/DE69013935D1/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0381146A1 (en) | 1990-08-08 |
| EP0381146B1 (en) | 1994-11-09 |
| US5139947A (en) | 1992-08-18 |
| DE69013935D1 (de) | 1994-12-15 |
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