JPH02207099A - ＰＴＨｒＰ関連ペプチド、その製造法及び用途 - Google Patents
ＰＴＨｒＰ関連ペプチド、その製造法及び用途Info
- Publication number
- JPH02207099A JPH02207099A JP1028023A JP2802389A JPH02207099A JP H02207099 A JPH02207099 A JP H02207099A JP 1028023 A JP1028023 A JP 1028023A JP 2802389 A JP2802389 A JP 2802389A JP H02207099 A JPH02207099 A JP H02207099A
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- pthrp
- polypeptide
- human
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
この発明は、新規なＰＴＨｒＰ関連ペプチド、その製造
法及びそのカルシウム代謝治療薬としての用途に関する
。この発明のアンタゴニストは、高カルシウム血症の治
療に用いられる。
法及びそのカルシウム代謝治療薬としての用途に関する
。この発明のアンタゴニストは、高カルシウム血症の治
療に用いられる。
［従来の技術］
血液中のカルシウム代謝調節因子として代表的なものに
は副甲状腺ホルモン（ＰａｒａｔｈｙｒｏｉｄＨｏｒ＋
ｗｏｎｅ、 ＰＴＨＩ 、カルシトニン、ビタミンＤ等
があるが、癌が引き起こす高カルシウム血症の原因物質
としては、上記のいずれでもないことが指摘されていた
。
は副甲状腺ホルモン（ＰａｒａｔｈｙｒｏｉｄＨｏｒ＋
ｗｏｎｅ、 ＰＴＨＩ 、カルシトニン、ビタミンＤ等
があるが、癌が引き起こす高カルシウム血症の原因物質
としては、上記のいずれでもないことが指摘されていた
。
１９８７年になりＭｏ５ｅｌｅｙらにより高カルシウム
血症を呈したヒト扁平上皮癌より、ＰＴＨと同じ活性を
示すタンパク質が単離され、これは副甲状腺ホルモン関
連タンパク質（ＰａｒａｔｈｙｒｏｉｄＨｏｒｍｏｎｅ
ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ、 ＰＴＨｒＰ
）と命名された。また、癌患者における高カルシウム血
症の原因物質がこのＰＴＨｒＰであることも判明した。
血症を呈したヒト扁平上皮癌より、ＰＴＨと同じ活性を
示すタンパク質が単離され、これは副甲状腺ホルモン関
連タンパク質（ＰａｒａｔｈｙｒｏｉｄＨｏｒｍｏｎｅ
ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ、 ＰＴＨｒＰ
）と命名された。また、癌患者における高カルシウム血
症の原因物質がこのＰＴＨｒＰであることも判明した。
さらに、 ５ｕｖａらにより、ＰＴＨｒＰのアミノ酸配
列及びｃＤＮＡ塩基配列が決定されるに至り、ＰＴｌｌ
ｒＰは１４１アミノ酸より成るものであることがわかっ
た。 ５ｕｖａらは、得られたｃＤＮＡより補乳類の細
胞系でＰＴＨｒＰを発現させ、ＰＴＨ活性換算４８μｇ
／ｌの発現を確認している。
列及びｃＤＮＡ塩基配列が決定されるに至り、ＰＴｌｌ
ｒＰは１４１アミノ酸より成るものであることがわかっ
た。 ５ｕｖａらは、得られたｃＤＮＡより補乳類の細
胞系でＰＴＨｒＰを発現させ、ＰＴＨ活性換算４８μｇ
／ｌの発現を確認している。
Ｒｏｄａｎらは既にヒトＰＴＨｒＰの１−３４ｔ！目の
ペプチドフラグメントを化学的に合成し、ラット骨肉腫
由来の細胞株ＲＯＳｌ？／２．８におけるアゾニレ−ト
シクラーゼの活性の増加に関してヒトＰＴＨｆｌ−３４
１と同様の活性を持つことを確認している。
ペプチドフラグメントを化学的に合成し、ラット骨肉腫
由来の細胞株ＲＯＳｌ？／２．８におけるアゾニレ−ト
シクラーゼの活性の増加に関してヒトＰＴＨｆｌ−３４
１と同様の活性を持つことを確認している。
癌患者における高カルシウム血症は、癌患者全体の約ｌ
Ｏ％に発症するとされ、血中のカルシウム濃度の上昇に
より疼痛等様々な障害を引き起こすものである。
Ｏ％に発症するとされ、血中のカルシウム濃度の上昇に
より疼痛等様々な障害を引き起こすものである。
現在、この高カルシウム血症の治療薬として、カルシト
ニン関連ペプチドがあるが、その効果は一過性のもので
あり有効率も低い、これは、カルシトニンは破骨細胞の
レセプターに結合し。
ニン関連ペプチドがあるが、その効果は一過性のもので
あり有効率も低い、これは、カルシトニンは破骨細胞の
レセプターに結合し。
骨吸収の抑制作用を示すが、高カルシウム血症の原因物
質であるＰＴＩ（ｒＰの活性を抑えるわけではないため
であり、従って、その効果にも限界がある。
質であるＰＴＩ（ｒＰの活性を抑えるわけではないため
であり、従って、その効果にも限界がある。
［発明が解決しようとする問題点］
従って、この発明の目的は、ＰＴＨｒＰに対するアンタ
ゴニストとして作用し、 ＰＴＨｒＰにより引き起こさ
れる高カルシウム血症を治療することができる新規なＰ
Ｔ）ＩｒＰ関連ペプチド及びその製法を提供することで
ある。
ゴニストとして作用し、 ＰＴＨｒＰにより引き起こさ
れる高カルシウム血症を治療することができる新規なＰ
Ｔ）ＩｒＰ関連ペプチド及びその製法を提供することで
ある。
［問題点を解決するための手段Ｊ
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ヒトＰＴＨｒＰ活性
を有さないが、ヒトＰＴＨｒＰが結合する骨細胞上のレ
セプターに結合し、それによってヒトＰＴＨｒＰ活性を
拮抗する活性を有する新規なポリペプチドを得ることに
成功し、この発明を完成した。
を有さないが、ヒトＰＴＨｒＰが結合する骨細胞上のレ
セプターに結合し、それによってヒトＰＴＨｒＰ活性を
拮抗する活性を有する新規なポリペプチドを得ることに
成功し、この発明を完成した。
すなわち、この発明は、ヒトＰＴＩ（ｒＰ活性を有さす
、ヒトＰＴ）ｌｒＰ又はヒトＰＴＩｌｒＰ活性を有する
ポリペプチドの生理学的作用に拮抗する活性を有するポ
リペプチドを提供する。
、ヒトＰＴ）ｌｒＰ又はヒトＰＴＩｌｒＰ活性を有する
ポリペプチドの生理学的作用に拮抗する活性を有するポ
リペプチドを提供する。
また、この発明は、上記ポリペプチドを有効成分とする
、ヒトＰＴＨｒＰに対するカルシウム代謝治療薬を提供
する。
、ヒトＰＴＨｒＰに対するカルシウム代謝治療薬を提供
する。
さらにまた、この発明は、上記本発明のポリペプチドを
コードする領域を含み、大腸菌中で該ポリペプチドを発
現することができる発現ベクターで大腸菌を形質転換し
、該形質転換された大Ｉｌ！菌を培養し、その培養物か
ら上記ポリペプチドを回収することを含む、本発明のポ
リペプチドの製造法を提供する。
コードする領域を含み、大腸菌中で該ポリペプチドを発
現することができる発現ベクターで大腸菌を形質転換し
、該形質転換された大Ｉｌ！菌を培養し、その培養物か
ら上記ポリペプチドを回収することを含む、本発明のポ
リペプチドの製造法を提供する。
［発明の効果］
本発明により、Ｐ、患者における、ヒトＰＴｔ（ｒＰに
より引き起こされる高カルシウム血症を抑える効果の高
い新規なポリペプチドが提供された。このポリペプチド
は、従来の抗ＰＴＨアンクゴニストである［Ｔｙｒ”Ｉ
ｂ−ＰＴＨ（７−３４１に比較して有意に強（ヒトＰＴ
）ｌ活性を阻害する。
より引き起こされる高カルシウム血症を抑える効果の高
い新規なポリペプチドが提供された。このポリペプチド
は、従来の抗ＰＴＨアンクゴニストである［Ｔｙｒ”Ｉ
ｂ−ＰＴＨ（７−３４１に比較して有意に強（ヒトＰＴ
）ｌ活性を阻害する。
また、本発明の製造法によると、従来の５ｕｖａらによ
る咄乳動物細胞を用いた系に比較して５００倍以上の大
量のポリペプチドを発現させることができる。
る咄乳動物細胞を用いた系に比較して５００倍以上の大
量のポリペプチドを発現させることができる。
［発明の詳細な説明］
上述のように１本発明のポリペプチドは、ヒトＰＴ）ｌ
ｒＰ活性を有さす、ヒトＰＴＩ（ｒＰ又はヒトＰＴＨｒ
Ｐ活性を有するポリペプチドの生理学的作用に拮抗する
ものである０本願発明者らは、鋭意研究の結果、ヒトＰ
ＴＨｒＰは、そのＮ末端側から数えて第１番目ないし第
６番目（以下、特に断りがない限りアミノ酸の位置はＮ
末端から数えて示す）のアミノ酸配列であるＡｌａ Ｖ
ａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｉｎが欠落すると、
そのＰＴＨｒＰ活性を喪失すること。
ｒＰ活性を有さす、ヒトＰＴＩ（ｒＰ又はヒトＰＴＨｒ
Ｐ活性を有するポリペプチドの生理学的作用に拮抗する
ものである０本願発明者らは、鋭意研究の結果、ヒトＰ
ＴＨｒＰは、そのＮ末端側から数えて第１番目ないし第
６番目（以下、特に断りがない限りアミノ酸の位置はＮ
末端から数えて示す）のアミノ酸配列であるＡｌａ Ｖ
ａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｉｎが欠落すると、
そのＰＴＨｒＰ活性を喪失すること。
及び第７番目ないし第３４番目のアミノ酸配列であるＬ
ｅｕ １．ｅｕ旧ｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｓｅｒ Ｉｌｅ ＧｌｎＡｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａ
ｒｇ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｈｉ
ｓ Ｌｅｕｌｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ ｌｉｅ Ｈｉｓ
Ｔｈｒ Ａｌａが存在すればヒトＰＴＨｒＰが結合する
骨細胞上のレセプターに結合してヒトＰＴＨｒＰの生理
学的活性を阻害することができることを見出した。
ｅｕ １．ｅｕ旧ｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｓｅｒ Ｉｌｅ ＧｌｎＡｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａ
ｒｇ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｈｉ
ｓ Ｌｅｕｌｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ ｌｉｅ Ｈｉｓ
Ｔｈｒ Ａｌａが存在すればヒトＰＴＨｒＰが結合する
骨細胞上のレセプターに結合してヒトＰＴＨｒＰの生理
学的活性を阻害することができることを見出した。
従って１本発明の好ましい態様においては。
本発明のポリペプチドは、ヒトＰＴＨｒＰの第１番目な
いし第６番目のアミノ酸配列を含まず、第７番目ないし
第３４番目のアミノ酸配列を含むものである。このポリ
ペプチドは、さらなるアミノ酸配列を含んでいてもよく
１例えばヒトＰＴＨｒＰの第３５番目以降のアミノ酸配
列を含んでいてもよい、さらに、後述の実施例で示すよ
うに、宿主となる大腸菌中での発現を促進するため、Ｎ
末端に種々の大腸菌由来のタンパク質又はポリペプチド
を結合したものであってもよい、もっとも、ヒトＰＴＨ
ｒＰの第７６目ないし第３４番目のアミノ酸配列を有す
るポリペプチドは、抗ＰＴＨｒＰアンタゴニストとして
の活性を有するので、このアミノ酸配列のみから成って
いてもよい。
いし第６番目のアミノ酸配列を含まず、第７番目ないし
第３４番目のアミノ酸配列を含むものである。このポリ
ペプチドは、さらなるアミノ酸配列を含んでいてもよく
１例えばヒトＰＴＨｒＰの第３５番目以降のアミノ酸配
列を含んでいてもよい、さらに、後述の実施例で示すよ
うに、宿主となる大腸菌中での発現を促進するため、Ｎ
末端に種々の大腸菌由来のタンパク質又はポリペプチド
を結合したものであってもよい、もっとも、ヒトＰＴＨ
ｒＰの第７６目ないし第３４番目のアミノ酸配列を有す
るポリペプチドは、抗ＰＴＨｒＰアンタゴニストとして
の活性を有するので、このアミノ酸配列のみから成って
いてもよい。
なお、一般に、ポリペプチドの生理活性は。
そのポリペプチドを構成するアミノ酸のうち少数のアミ
ノ酸が置換し、欠落し又は付加された場合であっても維
持されることがあることは当業者によってよく認識され
ているところである。従って、上記ヒトＰＴＨｒＰの第
７番目ないし第３４番目のアミノ酸配列の一部のアミノ
酸が置換され、欠失し又はこれに少数のアミノ酸が付加
されたものであって、ヒトＰＴＨｒＰ活性を有さず、抗
ヒトＰＴＨｒＰアンタゴニスト活性を有するポリペプチ
ドも本発明のポリペプチドに含まれ、特に請求項２２截
のアミノ酸配列を有するものと解釈するものとする。ま
た、特にヒトＰＴＨｒＰの第３番目ないし第１５番目の
アミノ酸配列を欠失したもの及びＣ末端から数えて第２
５番目よりもＣ末端側のアミノ酸を順次欠失したポリペ
プチドは本発明の目的を達成するものであることが確か
められている。さらに、アミノ酸が非天然の修飾アミノ
酸に置換されたものであって、ヒトＰＴ）ＩｒＰ活性を
有さす、抗ヒトＰＴ）ＩｒＰアンタゴニスト活性を有す
るポリペプチドも本発明のポリペプチドに含まれる。
ノ酸が置換し、欠落し又は付加された場合であっても維
持されることがあることは当業者によってよく認識され
ているところである。従って、上記ヒトＰＴＨｒＰの第
７番目ないし第３４番目のアミノ酸配列の一部のアミノ
酸が置換され、欠失し又はこれに少数のアミノ酸が付加
されたものであって、ヒトＰＴＨｒＰ活性を有さず、抗
ヒトＰＴＨｒＰアンタゴニスト活性を有するポリペプチ
ドも本発明のポリペプチドに含まれ、特に請求項２２截
のアミノ酸配列を有するものと解釈するものとする。ま
た、特にヒトＰＴＨｒＰの第３番目ないし第１５番目の
アミノ酸配列を欠失したもの及びＣ末端から数えて第２
５番目よりもＣ末端側のアミノ酸を順次欠失したポリペ
プチドは本発明の目的を達成するものであることが確か
められている。さらに、アミノ酸が非天然の修飾アミノ
酸に置換されたものであって、ヒトＰＴ）ＩｒＰ活性を
有さす、抗ヒトＰＴ）ＩｒＰアンタゴニスト活性を有す
るポリペプチドも本発明のポリペプチドに含まれる。
本発明のカルシウム代謝治［薬は、上記本発明のポリペ
プチドを有効成分とするものである。
プチドを有効成分とするものである。
本発明のカルシウム代謝治療薬のヒトに対する投与量は
１通常、本発明のポリペプチドの量で３ｘｌＯ−８モル
ないし３ ｘ １０−’モル程度であり、投与経路は静
脈注射又は筋肉内注射が好ましい、また。
１通常、本発明のポリペプチドの量で３ｘｌＯ−８モル
ないし３ ｘ １０−’モル程度であり、投与経路は静
脈注射又は筋肉内注射が好ましい、また。
アンタゴニストの具体的な製剤例として、生理食塩水又
はクエン酸緩衝液中に本発明のポリペプチドをｌ ｘ
１０−’Ｍないしｌ ｘ １０−’Ｍ含むものを挙げる
ことができる。
はクエン酸緩衝液中に本発明のポリペプチドをｌ ｘ
１０−’Ｍないしｌ ｘ １０−’Ｍ含むものを挙げる
ことができる。
本発明のカルシウム代謝治療薬は、カルシウム代謝に異
常のある種々の疾病、例えば高カルシウム血症、骨粗し
よう症のような骨疾患及び慢性腎不全による高カルシウ
ム血症の治療に用いることができる。
常のある種々の疾病、例えば高カルシウム血症、骨粗し
よう症のような骨疾患及び慢性腎不全による高カルシウ
ム血症の治療に用いることができる。
本発明のポリペプチドは化学合成又は遺伝子工学的手法
により製造することができる。アミノ酸の数が４０以下
の場合には化学合成により製造する方法が便利であるが
、アミノ１ｉ１ａが４０を超えると化学合成が困難にな
るので遺伝子工学的手法により合成することが好ましい
。
により製造することができる。アミノ酸の数が４０以下
の場合には化学合成により製造する方法が便利であるが
、アミノ１ｉ１ａが４０を超えると化学合成が困難にな
るので遺伝子工学的手法により合成することが好ましい
。
ポリペプチドの化学的合成法はこの分野において周知で
あり、市販のペプチド合成機を用いて行なうことができ
る０例えばアブライドバイオシステムズ社のモデル４３
０ペプチドシンセサイザーを用いてＦ、。。法により行
なうことができる。
あり、市販のペプチド合成機を用いて行なうことができ
る０例えばアブライドバイオシステムズ社のモデル４３
０ペプチドシンセサイザーを用いてＦ、。。法により行
なうことができる。
遺伝子工学的手法による本発明のポリペプチドの合成は
、ポリペプチドをコードする領域を含み、大腸菌中で該
ポリペプチドを発現することができる発現ベクターで大
腸菌を形質転換し、該形質転換された大腸菌を培養し、
その培養物から上記ポリペプチドを回収することにより
行なうことができる。
、ポリペプチドをコードする領域を含み、大腸菌中で該
ポリペプチドを発現することができる発現ベクターで大
腸菌を形質転換し、該形質転換された大腸菌を培養し、
その培養物から上記ポリペプチドを回収することにより
行なうことができる。
上記発現ベクターにおいて１本発明のポリペプチドをコ
ードする領域は、本発明のポリペプチドをコードするも
のであればいかなる塩基配列を有していてもよいが１発
現がスムーズになるよう大腸菌の使用頻度の高いコドン
を使い、バリンドローム等の配列を避けることが望まし
い、ヒトＰＴＨｒＰの第７番目ないし第３４番目のアミ
ノ酸をコードする塩基配列としては以下の配列が好まし
い。
ードする領域は、本発明のポリペプチドをコードするも
のであればいかなる塩基配列を有していてもよいが１発
現がスムーズになるよう大腸菌の使用頻度の高いコドン
を使い、バリンドローム等の配列を避けることが望まし
い、ヒトＰＴＨｒＰの第７番目ないし第３４番目のアミ
ノ酸をコードする塩基配列としては以下の配列が好まし
い。
ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＡＣＧＡＣＡＡＡ ＧＧＴ ＡＡＡ
ＴＣＴ ＡＴＣＣＡＡ ＧＡＴＣＴＧ ＣＧＴ ＣＧ
ＣＣＧＴ ＴＴＣＴＴＣＣＴＧ ＣＡＣＣＡＣＣＴＧ
ＡＴＣＧＣＴ ＧＡＡ ＡＴＣＣＡＣＡＣＴ ＧＣＡ上
記本発明のポリペプチドコード領域の上流には大腸菌内
での転写効率を高めるプロモーターが存在する。プロモ
ーターは大腸菌由来のものが好ましく、特にトリプトフ
ァンプロモーターが好ましい、プロモーターの直下流に
前記本発明のポリペプチドコード領域が位置していても
よいが、後述の実施例で示すように、大腸菌ｔｒｐＥタ
ンパク質のような、大腸菌由来タンパク質をコードする
領域の下流に上記領域が位置していてもよい、後者の場
合には、本発明のポリペプチドは融合タンパク質の形態
として得られる。
ＴＣＴ ＡＴＣＣＡＡ ＧＡＴＣＴＧ ＣＧＴ ＣＧ
ＣＣＧＴ ＴＴＣＴＴＣＣＴＧ ＣＡＣＣＡＣＣＴＧ
ＡＴＣＧＣＴ ＧＡＡ ＡＴＣＣＡＣＡＣＴ ＧＣＡ上
記本発明のポリペプチドコード領域の上流には大腸菌内
での転写効率を高めるプロモーターが存在する。プロモ
ーターは大腸菌由来のものが好ましく、特にトリプトフ
ァンプロモーターが好ましい、プロモーターの直下流に
前記本発明のポリペプチドコード領域が位置していても
よいが、後述の実施例で示すように、大腸菌ｔｒｐＥタ
ンパク質のような、大腸菌由来タンパク質をコードする
領域の下流に上記領域が位置していてもよい、後者の場
合には、本発明のポリペプチドは融合タンパク質の形態
として得られる。
この発明の発現ベクターは１通常の発現ベクターと同様
、抗生物質耐性のような適当な選択マーカー及び大腸菌
内で複製するための複製開始点を有する。さらに、上記
本発明のポリペプチドコード領域の下流には転写終結コ
ドンが存在する。これらは例えばｐＵｃ９、ｐＢＲ３２
２その他の市販の大腸菌用ベクターのものをそのまま利
用することができる。
、抗生物質耐性のような適当な選択マーカー及び大腸菌
内で複製するための複製開始点を有する。さらに、上記
本発明のポリペプチドコード領域の下流には転写終結コ
ドンが存在する。これらは例えばｐＵｃ９、ｐＢＲ３２
２その他の市販の大腸菌用ベクターのものをそのまま利
用することができる。
上記発現ベクターは、上記した本発明のポリペプチドコ
ード領域を例＾ばホスホアミダイド法等の公知の方法に
より合成し、これを大腸菌用の市販のベクター又は大腸
菌内で発現する公知の発現ベクターにクローニングする
ことにより作製することができる。後述の実施例では、
大腸菌トリプトファンプロモーターを有し、大腸菌中で
ＴｒｐＥ及びＴＧＦ−ａを発現するｐＡＴ−ＴｒｐＥＴ
ＧＦ ａ（特願昭６３−２８９０８号゛記載）に部分的
ＰＴＨｒＰコード領域をクローニングした。
ード領域を例＾ばホスホアミダイド法等の公知の方法に
より合成し、これを大腸菌用の市販のベクター又は大腸
菌内で発現する公知の発現ベクターにクローニングする
ことにより作製することができる。後述の実施例では、
大腸菌トリプトファンプロモーターを有し、大腸菌中で
ＴｒｐＥ及びＴＧＦ−ａを発現するｐＡＴ−ＴｒｐＥＴ
ＧＦ ａ（特願昭６３−２８９０８号゛記載）に部分的
ＰＴＨｒＰコード領域をクローニングした。
上記発現ベクターを用いた形質転換は従来の大腸菌用ベ
クターによる形質転換と全く同様に行なうことができる
。また、大腸菌の培養条件も従来と同様に行なうことが
できる。
クターによる形質転換と全く同様に行なうことができる
。また、大腸菌の培養条件も従来と同様に行なうことが
できる。
上記ベクターで形質転換された大腸菌により産生された
本発明のポリペプチドは、菌体を遠心分離等で集め、周
知のりゾチーム処理及び／又は超音波処理等で菌体を破
壊し、これをゲルろ過クロマトグラフィー等にかけるこ
とにより分離精製することができる１分離精製の具体的
条件は後述の実施例に詳述する。
本発明のポリペプチドは、菌体を遠心分離等で集め、周
知のりゾチーム処理及び／又は超音波処理等で菌体を破
壊し、これをゲルろ過クロマトグラフィー等にかけるこ
とにより分離精製することができる１分離精製の具体的
条件は後述の実施例に詳述する。
［実施例］
以下、この発明を実施例に基づいてより具体的に説明す
るが、この発明は下記実施例に限定されるものではない
。
るが、この発明は下記実施例に限定されるものではない
。
なお、下記実施例において、それぞれの操作は特に断り
がない限り、 Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ、”Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｌｌａｎｕａじ（１９８２１，Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ ＋１ａｒｂｏｒ記載の方法により行なった。
がない限り、 Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ、”Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｌｌａｎｕａじ（１９８２１，Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ ＋１ａｒｂｏｒ記載の方法により行なった。
及Ｉ舅ユ
（１１クローニングベクターの構築
図２．３に示す通り、 ＰＴＨｒＰ遺伝子を（Ａ）と（
Ｂ）に分割し、それぞれ約６０塩基から成るＤＮＡフラ
グメントをホスホアミダイト法により合成した６合成し
たフラグメントを逆相クロマトグラフィーにより精製し
、図４に示した通り前半部（Ａ）についてライゲーショ
ン反応を行ない。
Ｂ）に分割し、それぞれ約６０塩基から成るＤＮＡフラ
グメントをホスホアミダイト法により合成した６合成し
たフラグメントを逆相クロマトグラフィーにより精製し
、図４に示した通り前半部（Ａ）についてライゲーショ
ン反応を行ない。
約２００塩基対から成る（Ａ）の部分的ペプチドに対応
する遺伝子を得た。さらに後半部（Ｂ）についても同様
な操作を行なった。
する遺伝子を得た。さらに後半部（Ｂ）についても同様
な操作を行なった。
得られた遺伝子（Ａ）、（Ｂ）の５°及び３°末端はど
ちらも制限酵素Ｅｃｏ８１部位及びＳａｌ１部位を持ち
、それぞれ独立にＥｃｏＲＩ及びＳａｌ［で消化したク
ローニングベクター＋）［ＩＣ９に挿入した（図５）、
これを用い大腸菌ＪＭ１０７株を形質転換し、 ４０ｕ
ｇ／ｍｌのアンピシリン、Ｉ ＰＴＧ及びＸ−ｇａｌ
存在下、Ｌ培地にて一晩培養し、候補株を得た。
ちらも制限酵素Ｅｃｏ８１部位及びＳａｌ１部位を持ち
、それぞれ独立にＥｃｏＲＩ及びＳａｌ［で消化したク
ローニングベクター＋）［ＩＣ９に挿入した（図５）、
これを用い大腸菌ＪＭ１０７株を形質転換し、 ４０ｕ
ｇ／ｍｌのアンピシリン、Ｉ ＰＴＧ及びＸ−ｇａｌ
存在下、Ｌ培地にて一晩培養し、候補株を得た。
得られた候補株よりプラスミドを抽出した後サンガー法
により挿入遺伝子の塩基配列を調べ、設計した通りの遺
伝子配列を持つことを確認した。この目的とするＰＴＨ
ｒＰ （Ａｌ及びＰＴ）ｌｒＰ （８１を含むクローニ
ングベクターを持つ菌株をそれぞれｐＵｃ−ＰＴＨｒＰ
（＾）及びｐＵｃ−ＰＴｌｌｒＰ （８１と命名した
。
により挿入遺伝子の塩基配列を調べ、設計した通りの遺
伝子配列を持つことを確認した。この目的とするＰＴＨ
ｒＰ （Ａｌ及びＰＴ）ｌｒＰ （８１を含むクローニ
ングベクターを持つ菌株をそれぞれｐＵｃ−ＰＴＨｒＰ
（＾）及びｐＵｃ−ＰＴｌｌｒＰ （８１と命名した
。
（２）部分ペプチド（Ａ）及び（Ｂ）の直接発現ベクタ
ーの構築。
ーの構築。
以下１部分ペプチド（Ａ）の直接発現ベクターの構築に
ついて記載する。
ついて記載する。
ｐＵｃ−ＰＴＩ（ｒＰ （Ａ）遺伝子断片を抽出し、別
途、制限酵素Ｃ１ａ１．５ａＬＩで消化した発現ベクタ
ーｐＡＴ−ＸのラージフラグメントとＴ４リガーゼを用
いて結合した。これを用い、大腸菌１１８１０１株を形
質転換し、４０ｇｇ／ｒａｌのアンピシリン存在下、Ｌ
培地にて一晩ｔ＠養し、候補法を得た。得られた候補法
よりプラスミドを抽出し、制限酵素により目的とする挿
入遺伝子を持つ株を得、これをｐＡｒ−ＰＴＨｒＰ Ｉ
ＡＩ ／ＨＢ １０１株とした。
途、制限酵素Ｃ１ａ１．５ａＬＩで消化した発現ベクタ
ーｐＡＴ−ＸのラージフラグメントとＴ４リガーゼを用
いて結合した。これを用い、大腸菌１１８１０１株を形
質転換し、４０ｇｇ／ｒａｌのアンピシリン存在下、Ｌ
培地にて一晩ｔ＠養し、候補法を得た。得られた候補法
よりプラスミドを抽出し、制限酵素により目的とする挿
入遺伝子を持つ株を得、これをｐＡｒ−ＰＴＨｒＰ Ｉ
ＡＩ ／ＨＢ １０１株とした。
部分ペプチド（Ｂ）に付いても同様であり。
得られた株をｐＡＴ−ＰＴＨｒＰ（Ｂｌ／）１８１０１
株とした。
株とした。
（３） 部分ペプチド（Ａ）及び（Ｂ）の融合タンパク
質とした発現ベクターの構築。
質とした発現ベクターの構築。
以下１部分ペプチド（Ａ）について記す。
ｐＵｃ−ＰＴＩＩｒＰ ＩＡＩ／ＪＬ４１０７株より制
限酵素ＥｃｏＲ［。
限酵素ＥｃｏＲ［。
５ａｉｌで消化し、約２００塩基対のＰＴＨｒＰ （Ａ
ｔ遺伝子断片を抽出し、別途、制限酵素ＥｃｏＲＩ 、
５ａｌｌで消化した発現ベクターｐＡＴ−ＴｒｐＥ（Ｇ
Ｆ−ａのラージフラグメントとＴ４ライゲースを用いて
結合した。これを用い大腸菌１１ＢＩＯＩ株を形質転換
し、４０ｇ ｇ／ａ＋１のアンピシリン存在下、Ｌ培地
にて一晩培養し、候補法を得た。得られた候補法よりプ
ラスミドを抽出し、制限酵素により目的とする挿入遺伝
子を持つ株を得、これをｐＡＴ−ＴｒｐＥ−ＰＴＨｒＰ
（８１／ＨＢＩＯＩ株とした。
ｔ遺伝子断片を抽出し、別途、制限酵素ＥｃｏＲＩ 、
５ａｌｌで消化した発現ベクターｐＡＴ−ＴｒｐＥ（Ｇ
Ｆ−ａのラージフラグメントとＴ４ライゲースを用いて
結合した。これを用い大腸菌１１ＢＩＯＩ株を形質転換
し、４０ｇ ｇ／ａ＋１のアンピシリン存在下、Ｌ培地
にて一晩培養し、候補法を得た。得られた候補法よりプ
ラスミドを抽出し、制限酵素により目的とする挿入遺伝
子を持つ株を得、これをｐＡＴ−ＴｒｐＥ−ＰＴＨｒＰ
（８１／ＨＢＩＯＩ株とした。
１４１ ＰＴＨｒＰの直接発現ベクターの構築ｐＵｃ−
ＰＴＨｒＰ ＩＡＩ／Ｊ旧０７株及びｐＵｃ−ＰＴＩｌ
ｒＰ （Ｂｌ／ＪＭ１０７株をそれぞれ制限酵素Ｃ１ａ
１． ＫｐｎＩ及び）［ｐｎｌ、 ５ａｌＩで切断し、
約２００塩基対のＰＴｌｌｒＰ前半部分遺伝子と、約２
１０塩基対の後半部分遺伝子を得た６両者及び制限酵素
Ｃ１ａ１．５ａｌＩで消化した発現ベクターｐＡＴ−Ｘ
のラージフラグメントをＴ４リガーゼを用い結合した（
図６）、これを用い大腸菌１（８１０１株を形質転換し
４０ ｕ ｇ／＋１のアンピシリン存在下、Ｌ培地にて
一晩培養し、候補法を得た。得られた候補法よりプラス
ミドを抽出し、制限酵素による解析の結果、ＰＴ）Ｉｒ
Ｐ ｉｆｉ伝子の挿入をＵ＆ ｍし、この株をｐＡＴ−
ＰＴＨｒＰ／１ｌＢ１０１株とした。
ＰＴＨｒＰ ＩＡＩ／Ｊ旧０７株及びｐＵｃ−ＰＴＩｌ
ｒＰ （Ｂｌ／ＪＭ１０７株をそれぞれ制限酵素Ｃ１ａ
１． ＫｐｎＩ及び）［ｐｎｌ、 ５ａｌＩで切断し、
約２００塩基対のＰＴｌｌｒＰ前半部分遺伝子と、約２
１０塩基対の後半部分遺伝子を得た６両者及び制限酵素
Ｃ１ａ１．５ａｌＩで消化した発現ベクターｐＡＴ−Ｘ
のラージフラグメントをＴ４リガーゼを用い結合した（
図６）、これを用い大腸菌１（８１０１株を形質転換し
４０ ｕ ｇ／＋１のアンピシリン存在下、Ｌ培地にて
一晩培養し、候補法を得た。得られた候補法よりプラス
ミドを抽出し、制限酵素による解析の結果、ＰＴ）Ｉｒ
Ｐ ｉｆｉ伝子の挿入をＵ＆ ｍし、この株をｐＡＴ−
ＰＴＨｒＰ／１ｌＢ１０１株とした。
１５１ ＰＴＩＩｒＰの融合クンバク質の発現ベクター
の構築 ｐＵｃ−ＰＴｔｌｒＰ ＩＡＩ ／ＪＭ１０７株及Ｕ
ｐＵｃ−ＰＴＨｒＰ （Ｂｌ／Ｊｌ１１０７株をそれぞ
れ、制限酵素ＥｃｏＲＩ 、 ＫｐｎＩ及びＫｐｎｌ、
５ａｌｌで切断し、約２００塩基対のＰＴＨｒＰ前半
部分遺伝子と約２１０塩基対の後半部分遺伝子を得た１
両者及び制限酵素Ｃ１ａ１．５ａｌＩで消化した発現ベ
クターｐＡＴ−ＴｒｐＥ−ＴＧＦ−ａのラージフラグメ
ントをＴＲリガーゼを用い結合した。これを用い大腸菌
１１８１０１株を形質転換し、４０ｇｇ／ｍｌのアンピ
シリン存在下、Ｌ培地にて一晩培養し、候補法を得た。
の構築 ｐＵｃ−ＰＴｔｌｒＰ ＩＡＩ ／ＪＭ１０７株及Ｕ
ｐＵｃ−ＰＴＨｒＰ （Ｂｌ／Ｊｌ１１０７株をそれぞ
れ、制限酵素ＥｃｏＲＩ 、 ＫｐｎＩ及びＫｐｎｌ、
５ａｌｌで切断し、約２００塩基対のＰＴＨｒＰ前半
部分遺伝子と約２１０塩基対の後半部分遺伝子を得た１
両者及び制限酵素Ｃ１ａ１．５ａｌＩで消化した発現ベ
クターｐＡＴ−ＴｒｐＥ−ＴＧＦ−ａのラージフラグメ
ントをＴＲリガーゼを用い結合した。これを用い大腸菌
１１８１０１株を形質転換し、４０ｇｇ／ｍｌのアンピ
シリン存在下、Ｌ培地にて一晩培養し、候補法を得た。
得られた候補法よりプラスミドを抽出し、制限酵素によ
る解析の結果、ＰＴ）ＩｒＰ遺伝子の挿入をｌｉ１認し
、この株をｐＡＴ−ＴｒｐＥ−ＰＴＨｒＰ／ＨＢＩＯ１
株とした。
る解析の結果、ＰＴ）ＩｒＰ遺伝子の挿入をｌｉ１認し
、この株をｐＡＴ−ＴｒｐＥ−ＰＴＨｒＰ／ＨＢＩＯ１
株とした。
（６）各種ベクターの発現
構築した発現ベクターを含む上記ｐＡＴ−ＰＴＨｒＰ（
Ａｌ／）１８１０１株、ｐＡＴ−ｐＴＨｒＰ （８１／
１１８１０１株、 ｐＡＴ−ＴｒｐＥ−ＰＴＨｒＰ （
＾）／Ｈ口１０１株、ｐＡＴ−ＴｒｐＥ−ＰＴＨｒＰ
（Ｂｌ ／）１１１１０１株、ｐＡＴ−ＰＴＨｒＰ （
Ａｌ ／ＨＢ ｌ ０１株又はｐＡＴ−ＴｒｐＥ−ＰＴ
ｌｌｒＰ（Ａｌ／１１８１０１株について上記と同様の
条件下で培養を行ない組換えタンパク質の発現を調べた
。
Ａｌ／）１８１０１株、ｐＡＴ−ｐＴＨｒＰ （８１／
１１８１０１株、 ｐＡＴ−ＴｒｐＥ−ＰＴＨｒＰ （
＾）／Ｈ口１０１株、ｐＡＴ−ＴｒｐＥ−ＰＴＨｒＰ
（Ｂｌ ／）１１１１０１株、ｐＡＴ−ＰＴＨｒＰ （
Ａｌ ／ＨＢ ｌ ０１株又はｐＡＴ−ＴｒｐＥ−ＰＴ
ｌｌｒＰ（Ａｌ／１１８１０１株について上記と同様の
条件下で培養を行ない組換えタンパク質の発現を調べた
。
以下、 ｐＡＴ−ＴｒｐＥ−ＰＴＩ（ｒＰ （Ａｌ ／
ＩＩ旧旧株について記載するが、他の株についてもその
処理は実質的に同じである。
ＩＩ旧旧株について記載するが、他の株についてもその
処理は実質的に同じである。
ｐＡＴ−ＴｒｐＥ−ＰＴＨｒＰ ｆＡｌ ／Ｈ旧旧株を
４０ ｕ ｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３２ｍ１のＬ
培地中で一夜培養した後、３．２１２の０．５％カザミ
ノ酸を含むＭ９培地に接種し、３７℃で培養し、 ６０
０ ｎｍにおける吸光度が０．５になるまで培養したと
ころでインドールアクリル酸を最終濃度３０ ｎ＋ｇ／
Ｉ２になるように加え、さらに２０時間培養を継続した
後、遠心分離により６ｇの菌体を集めた。
４０ ｕ ｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３２ｍ１のＬ
培地中で一夜培養した後、３．２１２の０．５％カザミ
ノ酸を含むＭ９培地に接種し、３７℃で培養し、 ６０
０ ｎｍにおける吸光度が０．５になるまで培養したと
ころでインドールアクリル酸を最終濃度３０ ｎ＋ｇ／
Ｉ２になるように加え、さらに２０時間培養を継続した
後、遠心分離により６ｇの菌体を集めた。
集めた菌体を２ ｎｇ／ｍｌのリゾチーム、２ａ＋ＭＥ
ＤＴＡ及Ｕ １００ ｍＭ） ’Ｊ ス−ｔ’Ａ酸ｍ１
ｔｌ液（ｐＨ８，ｏｌ ’に含む溶液中に！！濁し、０
℃、３０分間放置した。さらにβ−メルカプトエタノー
ル３５μｌを加λ。
ＤＴＡ及Ｕ １００ ｍＭ） ’Ｊ ス−ｔ’Ａ酸ｍ１
ｔｌ液（ｐＨ８，ｏｌ ’に含む溶液中に！！濁し、０
℃、３０分間放置した。さらにβ−メルカプトエタノー
ル３５μｌを加λ。
超音波処理を行ない菌体を粉砕した。−晩撹拌した後遠
心分離により可溶性画分である上清と不溶性画分である
沈殿に分離し、それぞれ、５ｔａｎｋとＭｕｎｒｅｓの
方法に従い、８Ｍ尿素存在下１５％５Ｏ８−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を行なったところ可溶性及び不溶
性画分にそれぞれ９：１の割合で目的とするＰＴＨｒＰ
（＾）タンパク質の発現を確認した。また、 ＰＴＨ
ｒＰの１〜３４アミノ酸長の合成ペプチドに対するポリ
クローナル抗体を用い発現を調べたところ３０ ｍｇ７
４２以上のＰＴＨｒＰ （Ａｔの発現量が免疫学的活性
として得られた。得られた可溶性画分を凍結濃縮し、セ
ファデックスＧ−７５（ファルマシア社製）ゲルろ過カ
ラムクロマトグラフィーにより分離精製した。ゲルろ過
の具体的条件は溶出液： ２０＋Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐＨ８，０１、カラム：φ２． ｘ １００ ａｍ
、流速２ ｍ１７１５分であった。
心分離により可溶性画分である上清と不溶性画分である
沈殿に分離し、それぞれ、５ｔａｎｋとＭｕｎｒｅｓの
方法に従い、８Ｍ尿素存在下１５％５Ｏ８−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を行なったところ可溶性及び不溶
性画分にそれぞれ９：１の割合で目的とするＰＴＨｒＰ
（＾）タンパク質の発現を確認した。また、 ＰＴＨ
ｒＰの１〜３４アミノ酸長の合成ペプチドに対するポリ
クローナル抗体を用い発現を調べたところ３０ ｍｇ７
４２以上のＰＴＨｒＰ （Ａｔの発現量が免疫学的活性
として得られた。得られた可溶性画分を凍結濃縮し、セ
ファデックスＧ−７５（ファルマシア社製）ゲルろ過カ
ラムクロマトグラフィーにより分離精製した。ゲルろ過
の具体的条件は溶出液： ２０＋Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐＨ８，０１、カラム：φ２． ｘ １００ ａｍ
、流速２ ｍ１７１５分であった。
溶出画分を集め、凍結ａ綿を行ない、臭化シアンにより
ＴｒｐＥ部分を除去、切断した。これは、７０％ギ酸中
にクンバク質濃度が１％になるようにＰＴＨｒＰを加え
、臭化シアンを１００当量加え、３７℃で２４時間放置
することにより行なった。さらに、セファデックスＧ−
５０（ファルマシア社製）を用いゲルろカラムクロマト
グラフィーを行なった。このゲルろ過の具体的条件は、
２０ ｍＭ ＴｒｉｓＨＣＩ （ｐＨ８，０１、カラム
： 中２゜６ ｘ １００ ａｍ、流速２．２ ａｌｌ
／１５分であった。溶出画分を集め、凍結乾燥を行ない
、２０ｍｇのＰＴＨｒＰ （Ａｌクンバク質を得た。こ
のものの純度は逆相カラムクロマトグラフィー及び５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により単一のも
のであることを確認した。
ＴｒｐＥ部分を除去、切断した。これは、７０％ギ酸中
にクンバク質濃度が１％になるようにＰＴＨｒＰを加え
、臭化シアンを１００当量加え、３７℃で２４時間放置
することにより行なった。さらに、セファデックスＧ−
５０（ファルマシア社製）を用いゲルろカラムクロマト
グラフィーを行なった。このゲルろ過の具体的条件は、
２０ ｍＭ ＴｒｉｓＨＣＩ （ｐＨ８，０１、カラム
： 中２゜６ ｘ １００ ａｍ、流速２．２ ａｌｌ
／１５分であった。溶出画分を集め、凍結乾燥を行ない
、２０ｍｇのＰＴＨｒＰ （Ａｌクンバク質を得た。こ
のものの純度は逆相カラムクロマトグラフィー及び５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により単一のも
のであることを確認した。
叉１目１１
アブライドバイオシステムズ社のモデル４３０ペプチド
シンセサイザーを用いてＦ、。。法によりヒトＰＴＨｒ
Ｐ １７−３４１ ＮＨｘを合成した。
シンセサイザーを用いてＦ、。。法によりヒトＰＴＨｒ
Ｐ １７−３４１ ＮＨｘを合成した。
合成したヒトＰＴＨｒＰ （７−３４１ＮＨ＊について
の１ｎｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの効果を試験した
。
の１ｎｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの効果を試験した
。
１ｎｖｉｔｒｏにお（る
方法：
ラット骨肉腫由来細胞株ＲＯＳｌ？／２．８ （受託
番佐超、 ＋Ａｃｔａ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉ
ｃａ−、ｖｏｌ、 １１６． ｐ。
番佐超、 ＋Ａｃｔａ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉ
ｃａ−、ｖｏｌ、 １１６． ｐ。
１１３、 ｆ１９８７１をＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地で２
日間培養した。Ｆ１２培地（Ｔｒｉｓ １０ ｍＭ、
ＢＳＡ ０．１％。
日間培養した。Ｆ１２培地（Ｔｒｉｓ １０ ｍＭ、
ＢＳＡ ０．１％。
１［ＩＭＸ ０．５ ｍｌＪ ？−含ム）テ洗ツタ後、
濃度ヲ変えたヒトＰＴＨｒＰ ｆ７−３４１ ＮＬフラ
グメント及びヒトＰＴＨｒＰ ｆｌ−３４１ＮＨ＊を加
え、３７℃、１０分間インキュベートした。氷上、ＩＮ
ＨＣＩを加λた後、細胞を集め、上清を市販（ヤマサ
社製）のＣＡＭＰ ＲＩＡのキットで濃度を定量した。
濃度ヲ変えたヒトＰＴＨｒＰ ｆ７−３４１ ＮＬフラ
グメント及びヒトＰＴＨｒＰ ｆｌ−３４１ＮＨ＊を加
え、３７℃、１０分間インキュベートした。氷上、ＩＮ
ＨＣＩを加λた後、細胞を集め、上清を市販（ヤマサ
社製）のＣＡＭＰ ＲＩＡのキットで濃度を定量した。
その結果、ヒトＰＴ＋ｌｒＰ （１−３４１ＮＨ，に対
するヒトＰＴＨｒＰ ｆ７−３４１ＮＩＩｚの拮抗作用
は従来のヒトＰＴＦ（に対するアンタゴニストである［
Ｔｙｒ”］ｂＰＴＨｆ７−３４）に比較し、非常に優れ
ていることが判明した。
するヒトＰＴＨｒＰ ｆ７−３４１ＮＩＩｚの拮抗作用
は従来のヒトＰＴＦ（に対するアンタゴニストである［
Ｔｙｒ”］ｂＰＴＨｆ７−３４）に比較し、非常に優れ
ていることが判明した。
図８は、ＰＴＨｒＰ活性を持ツＰＴＩ（ｒＰ （７−３
４１のＲＯ３１７７２，８細胞に対するアデニレートシ
クラーゼ活性１００とした時の各種ＰＴＨｒＰ合成フラ
グメントの阻害効果を調べた図で、 ＰＴＩＩｒＰ （
７−３４１ＭＨｚが最も強く阻害し、アンタゴニストと
して優れていることを示している。
４１のＲＯ３１７７２，８細胞に対するアデニレートシ
クラーゼ活性１００とした時の各種ＰＴＨｒＰ合成フラ
グメントの阻害効果を調べた図で、 ＰＴＩＩｒＰ （
７−３４１ＭＨｚが最も強く阻害し、アンタゴニストと
して優れていることを示している。
さらに１図９は、 ＰＴＨｒＰ（１−３４１の濃度を高
くできることを示している図で、この結果より、ＰＴＩ
ＩｒＰ ｆ７−３４１ＮＨｚが確かにアンタゴニストと
して作用していることが証明できた。
くできることを示している図で、この結果より、ＰＴＩ
ＩｒＰ ｆ７−３４１ＮＨｚが確かにアンタゴニストと
して作用していることが証明できた。
ｆｌＯ５１７７２，８を上記と同様に培養し、 ＨＢＳ
Ｓで洗浄した後、一定量の［’ ” ’ Ｉ ］ −ｒ
ＰＴ Ｈｒ Ｐ （１−３４１Ｎ ＩＩ ｚと濃度を変
化させたラベルをしていないヒトＰＴＩＩｒＰ （７−
３４１ＮＨｔフラグメントを加え、２時間室温でインキ
ュベートした。 ＩＮ ＮａＯＨで溶出し。
Ｓで洗浄した後、一定量の［’ ” ’ Ｉ ］ −ｒ
ＰＴ Ｈｒ Ｐ （１−３４１Ｎ ＩＩ ｚと濃度を変
化させたラベルをしていないヒトＰＴＩＩｒＰ （７−
３４１ＮＨｔフラグメントを加え、２時間室温でインキ
ュベートした。 ＩＮ ＮａＯＨで溶出し。
γカウンターによりレセプター結合した１１２′目ＰＴ
ＨｒＰ （１−３４１ＮＨ＊ａ１度を測定した。その結
果、ヒトＰＴＨｒＰ （７−３４１ＮＨｓは従来のアン
タゴニストである［Ｔｙｒ”］］ｂＰＴ旧７−３４Ｎｌ
ｌｔに比較し、レセプター結合能が優れていることがわ
かった（図１０１゜ 正ｖｉｖｏ ”Ｃツ慟ｊ ヒト高カルシウム血症を呈した患者より得た２種のＩＩ
Ｉ瘍培養株Ｌｕ６１ （肺扁平上皮Ｐ、）及びＦｕｊｏ
ｋａ （膵癌）を植大、高カルシウム血症を呈したヌー
ドマウスによるモデル実験系を用いて試験を行なった。
ＨｒＰ （１−３４１ＮＨ＊ａ１度を測定した。その結
果、ヒトＰＴＨｒＰ （７−３４１ＮＨｓは従来のアン
タゴニストである［Ｔｙｒ”］］ｂＰＴ旧７−３４Ｎｌ
ｌｔに比較し、レセプター結合能が優れていることがわ
かった（図１０１゜ 正ｖｉｖｏ ”Ｃツ慟ｊ ヒト高カルシウム血症を呈した患者より得た２種のＩＩ
Ｉ瘍培養株Ｌｕ６１ （肺扁平上皮Ｐ、）及びＦｕｊｏ
ｋａ （膵癌）を植大、高カルシウム血症を呈したヌー
ドマウスによるモデル実験系を用いて試験を行なった。
ヒトＰＴｌｌｒＰ （７−３４１Ｎｉｌ！を０．１％
［ｌＳＡ含有クエン酸緩衝液（ｐＨ６，５１１ｍｌに溶
解し、ヌードマウスの尾静脈よりＩＱ ｍｇ／マウスに
成るように投与した。投与期間はＬｕ６１細胞について
は投与３時間後及び５時間後に継続投与し、Ｆｕｊｏｋ
ａ細胞については最初のみとした。
［ｌＳＡ含有クエン酸緩衝液（ｐＨ６，５１１ｍｌに溶
解し、ヌードマウスの尾静脈よりＩＱ ｍｇ／マウスに
成るように投与した。投与期間はＬｕ６１細胞について
は投与３時間後及び５時間後に継続投与し、Ｆｕｊｏｋ
ａ細胞については最初のみとした。
直後及び図１１及び図１２にそれぞれ示す点において採
血し、血清カルシウム濃度を原子吸光により測定した。
血し、血清カルシウム濃度を原子吸光により測定した。
その結果、ヒトＰＴＨｒＰ （７−３４１ＮＨｔは正常
マウスには作用せず、 Ｌｕ６１． Ｆｕｊｏｋａを移
植し、高カルシウム血症を呈したマウスにのみ、３６時
間以上の長期にわたりカルシウム濃度を正常レベルまで
低下した（図１１及び図１２）、１０ｕｇ／マウスはヒ
トに換算すると５００μｇ／ヒトになり、実際の治療薬
としても問題のない量であった。
マウスには作用せず、 Ｌｕ６１． Ｆｕｊｏｋａを移
植し、高カルシウム血症を呈したマウスにのみ、３６時
間以上の長期にわたりカルシウム濃度を正常レベルまで
低下した（図１１及び図１２）、１０ｕｇ／マウスはヒ
トに換算すると５００μｇ／ヒトになり、実際の治療薬
としても問題のない量であった。
以上のように１本発明の治療薬は１回の投与に対して数
十時間以上の持続効果があり、Ｂ！＜はど優れており、
骨疾患及び中枢神経が関与する疾患の治療薬としである
いは臨床診断薬として有用である。
十時間以上の持続効果があり、Ｂ！＜はど優れており、
骨疾患及び中枢神経が関与する疾患の治療薬としである
いは臨床診断薬として有用である。
図１はこの発明の発現ベクターにおける、ＰＴｌｌｒＰ
コード領域付近の制限酵素地図、図２及び図３は、それ
ぞれＰＴ）ＩｒＰ（Ａｔ及びＰＴＨｒＰ （８１をコー
ドする遺伝子の塩基配列を示す図。 図４ないし図７はこの発明の発現ベクターの構築の操作
を説明するための図。 図８はＰＴＨｒＰ活性を持ツＰＴＨｒＰ（７−３４）の
ＲＯＳ１７／２．８細胞に対するアデニレートシクラー
ゼ活性１００とした時の各種ＰＴＨｒＰ合成フラグメン
トの阻害効果を示す図。 図９は種々の濃度のＰＴＨｒＰ （１−３４１に対して
種々の濃度のＰＴＨｒＰ １７−３４１ ＮＨｚを加え
た時のサイクリックＡＭＰの量を示す図。 図１０は、この発明のヒトＰＴｌｌｒＰ （７−３４）
及び従来のアンタゴニストのレセプターに対する特異的
結合能の強さを示す図。 図１１及び図１２は、それぞれ肺扁平上皮癌及び膵癌細
胞をヌードマウスに植えて高カルシウム血症を呈させた
場合における本発明の治療薬の高カルシウム血症治療効
果を示す図である。 ←−Ｃ閃 もり（コ − ロＱ（ （ＪＩＪ関 ＣＪ ｆＪ ＜ ＄５四 〇〇く ≦ｔｌニー＋ （クーコーク し５＝ ←くり ８８之 （←← ←く− ←くり ←く為 Ｑ口Ｑ １ｒ ライゲーション ＰＴＨｒＰ （Ａ） 分画番号２−７ １１００℃ ２分 ↓ 分画番号１．８ アニーリング ↓ ライゲーション １時間 ↓ ｌＯ％ＰＡＧＥ ↓ 抽 出 ↓ エタノール 図 ８乏！ニー！ ８閣？５８じご二 雲上ごビ（ＪＣＪ
（Ｊ 、−＋（ＪＬ５（Ｊ −１ｃｊ（ＪＬＩ
ＦＪＣＪ（Ｊ＜瓢！ニー！ （り（コ（り 仁乏ｔ もりζコ〉 ヨト３ ｔｌ；ごｂ （コ（ＪＣＪ に≧ｔ （りζコ〉 ミごｂ 旨謔２ 乏に２ （りＣ＋）（り ８Ｈ民δ目５Ｅ３≦５ご；ヰ１よ 翳ぽ占 ヨＥ５４詰 りぽ占 ライゲーション ↓ 形質転換（ＪＭ１０７） 訂 ライゲーション ↓ 形質転換（ＪＭ１０７） 口ぎ ＰＴ）ｌｒＰ刺激汐トｆ活性の阻害２ ライゲーシヨン ↓ 形質転換（Ｃ６００） ６′１ 特具的結合 カルシウム （町ゾｄｉ） カルシウム （町ゾｄｌ）
コード領域付近の制限酵素地図、図２及び図３は、それ
ぞれＰＴ）ＩｒＰ（Ａｔ及びＰＴＨｒＰ （８１をコー
ドする遺伝子の塩基配列を示す図。 図４ないし図７はこの発明の発現ベクターの構築の操作
を説明するための図。 図８はＰＴＨｒＰ活性を持ツＰＴＨｒＰ（７−３４）の
ＲＯＳ１７／２．８細胞に対するアデニレートシクラー
ゼ活性１００とした時の各種ＰＴＨｒＰ合成フラグメン
トの阻害効果を示す図。 図９は種々の濃度のＰＴＨｒＰ （１−３４１に対して
種々の濃度のＰＴＨｒＰ １７−３４１ ＮＨｚを加え
た時のサイクリックＡＭＰの量を示す図。 図１０は、この発明のヒトＰＴｌｌｒＰ （７−３４）
及び従来のアンタゴニストのレセプターに対する特異的
結合能の強さを示す図。 図１１及び図１２は、それぞれ肺扁平上皮癌及び膵癌細
胞をヌードマウスに植えて高カルシウム血症を呈させた
場合における本発明の治療薬の高カルシウム血症治療効
果を示す図である。 ←−Ｃ閃 もり（コ − ロＱ（ （ＪＩＪ関 ＣＪ ｆＪ ＜ ＄５四 〇〇く ≦ｔｌニー＋ （クーコーク し５＝ ←くり ８８之 （←← ←く− ←くり ←く為 Ｑ口Ｑ １ｒ ライゲーション ＰＴＨｒＰ （Ａ） 分画番号２−７ １１００℃ ２分 ↓ 分画番号１．８ アニーリング ↓ ライゲーション １時間 ↓ ｌＯ％ＰＡＧＥ ↓ 抽 出 ↓ エタノール 図 ８乏！ニー！ ８閣？５８じご二 雲上ごビ（ＪＣＪ
（Ｊ 、−＋（ＪＬ５（Ｊ −１ｃｊ（ＪＬＩ
ＦＪＣＪ（Ｊ＜瓢！ニー！ （り（コ（り 仁乏ｔ もりζコ〉 ヨト３ ｔｌ；ごｂ （コ（ＪＣＪ に≧ｔ （りζコ〉 ミごｂ 旨謔２ 乏に２ （りＣ＋）（り ８Ｈ民δ目５Ｅ３≦５ご；ヰ１よ 翳ぽ占 ヨＥ５４詰 りぽ占 ライゲーション ↓ 形質転換（ＪＭ１０７） 訂 ライゲーション ↓ 形質転換（ＪＭ１０７） 口ぎ ＰＴ）ｌｒＰ刺激汐トｆ活性の阻害２ ライゲーシヨン ↓ 形質転換（Ｃ６００） ６′１ 特具的結合 カルシウム （町ゾｄｉ） カルシウム （町ゾｄｌ）
Claims (6)
- （１）ヒトＰＴＨｒＰ活性を有さず、ヒトＰＴＨｒＰ又
はヒトＰＴＨｒＰ活性を有するポリペプチドの生理学的
作用に拮抗する活性を有するポリペプチド。 - （２）前記ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む
請求項１記載のポリペプチド。 【遺伝子配列があります】 - （３）上記アミノ酸配列のＮ末端側にヒトＰＴＨｒＰの
Ｎ末端部分配列である【遺伝子配列があります】を含ま
ない請求項２記載のポリペプチド。 - （４）請求項２記載のアミノ酸配列から成る請求項２記
載のポリペプチド。 - （５）請求項１ないし４のいずれか１項に記載のポリペ
プチドを有効成分とする、ヒトＰＴＨｒＰに対するカル
シウム代謝治療薬。 - （６）請求項１記載のポリペプチドをコードする領域を
含み、大腸菌中で該ポリペプチドを発現することができ
る発現ベクターで大腸菌を形質転換し、該形質転換され
た大腸菌を培養し、その培養物から上記ポリペプチドを
回収することを含む、請求項１記載のポリペプチドの製
造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1028023A JPH02207099A (ja) | 1989-02-07 | 1989-02-07 | ＰＴＨｒＰ関連ペプチド、その製造法及び用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1028023A JPH02207099A (ja) | 1989-02-07 | 1989-02-07 | ＰＴＨｒＰ関連ペプチド、その製造法及び用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02207099A true JPH02207099A (ja) | 1990-08-16 |
Family
ID=12237152
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1028023A Pending JPH02207099A (ja) | 1989-02-07 | 1989-02-07 | ＰＴＨｒＰ関連ペプチド、その製造法及び用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02207099A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996025944A1 (en) * | 1995-02-20 | 1996-08-29 | Yukio Kato | Remedies for arthrosis deformans and inflammatory joint diseases |
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| US6903194B1 (en) | 1996-09-26 | 2005-06-07 | Chungai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody against human parathormone related peptides |
| US7468184B2 (en) | 1997-05-15 | 2008-12-23 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Therapeutic agent for cachexia |
| US8029793B2 (en) | 2000-04-28 | 2011-10-04 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods for inhibiting cell proliferation |
-
1989
- 1989-02-07 JP JP1028023A patent/JPH02207099A/ja active Pending
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