JPH02208568A - ハプトグロビン定量試薬キット及びそれを用いるハプトグロビン定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は臨床検査領域の／％ブトグロビンの定量方法及
びそれに用いる定量試薬キットに関し、更に詳しくは、
テトラメチルベンジジンを酸化発色剤とする所謂カラー
法によるｌＸブトグロビンの定量に関する。

〔従来の技術〕

健康人血中には通常約２０〜約２００ｍｇ／ｄＮのハプ
トグロビン（以下Ｈｐと略記する）が存在し、２〜４日
の血中半減期で代謝回転している。

Ｈｐはヘモグロビン（以下Ｈｂと略記する）と特異的に
結合し一、　Ｈｐ　　Ｈｂ複合体を形成する。溶血によ
り生じたＨｂは血中のＨｐと複合体を形成し、肝臓に運
ばれ代謝されるが、Ｈｂ、ＱがＨｐとの結合量を上回っ
た時には、余剰のＨｂは遊離の状態で血液中に存在し、
Ｈｂ白血症Ｈｂ尿症を引き起こす。Ｈｂ白血症Ｈｂ尿症
には大量輸血や利尿剤の投与による治療方法の他にＨｐ
を投与する治療方法（ハプトグロビン療法）がある。ハ
プトグロビン療法は遊ｆｉＨｂを腎臓から排泄させるこ
となく、遊ｉ！１ｔＨｂをＨｐと結合させ、肝臓で代謝
させようとするものである。

近年、外科手術に際し、人工心肺を用いた体外循環法が
急速に普及し、体外循環により生ずる溶血の結果、発症
する術後腎不全の予防の為に７１ブトグロビン療法が採
用されつつある。ハプトグロビン療法では患者血中のＨ
ｐ濃度及びＨｂ濃度を知ることが極めて重要である。現
在、Ｈｐの血中濃度はａ）セルロースアセテート膜電気
泳動法、ｂ）−光放射状免疫拡散法（Ｍａｎｃｉｎｉ法
）、Ｃ）レーザーネフエロメーター法、ｄ）スペクトル
迅速定量法、ｅ）ラテックス凝集法、等の方法によって
ＪＰＪ定が可能である（大城孟著「臨床／Ｘブトグロビ
ン」永井書店１９８７年刊）。

しかしながら、これらの方法はＣ）の方法以外は、短期
間に迅速、正確に大量の検体を処理するには不向きであ
り、またＣ）は高価な機器の購入が必要であり、広く普
及させることは困難であると思われる。又ｂ）のマンシ
ー二法は正確な定量方法であるが、上記の不便に加えて
、Ｈｐ固有の３種の遺伝型に鑑み、測定値にそれぞれの
型別係数を乗じて定量値とする不便がある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者は他の者と共同して、ヘモグロビンのペルオキ
シダーゼ様作用を利用して、元来無色の３．３’　、５
．５’　−テトラメチルベンジジン（以下ＴＭＢと略記
する）を過酸化ストロンチウムを介して酸化して発色さ
せるＨｂの比色定量方法を考案し特許出願に及んだ（特
願昭６３−２７６３８７号、以下単に先願という）。

この方法は、血漿、血清及び尿などのＨｂ定量に用いら
れ、定量試薬キットは、（イ）難溶性のＴ　Ｍ　Ｂをク
エン酸の添加により可溶化した水溶液、及び（ロ）過酸
化ストロンチウムを含む水溶液よりなる。そして定量は
、（イ）及び（ロ）の水溶液を用時混合し、混合液に微
量の検体を加え、特定温度（１０〜３７℃）において特
定時間（１〜６０分間）インキュベートし反応発色させ
る。発色は３６５〜３７５ｎｍ又は６４５〜６５５ｒ＋
ｎ＋の特定波長における吸光度を常法により、自己ブラ
ンクを対照として測定する。なお要すれば、反応系に約
１％濃度の過酸化水素を添加して発色を助長することが
できる。同様の操作により検体の代りに、Ｈｂ不含の自
己ブランクに一連の濃度にＨｂを加えた標準被験液を用
い、Ｈｂを定量し検量線（直線となる）を作成し、これ
により検体中のＨｂａ度を求める。比色定量には自動分
析器の使用が可能であって、簡単に短時間に大量の検体
を処理することができる。

本発明者は、Ｈｂの定量方法である上記の所謂カラー法
に用いられる（イ）及び（ロ）の水溶液の混液が、Ｈｐ
とも弱いながら反応性を示し、発色はＨｂと同様に３６
５〜３７５ｒｖ又は６４５〜６５５　ｒｖに特異吸収を
有することを見出した。即ちＨｐはペルオキシダーゼ様
活性を有し、その活性は５０〜２００μｇの範囲におい
てＨｂのそれの１／４５〜１１５２．５であることが実
験の上で明らかとなった。

これを実験により示すと、Ｈｐ及びＨｂ不含の血漿に種
々の終濃度にＨｐを添加し、上記カラー法によりそのペ
ルオキシダーゼ様活性を０Ｄ３７゜値で示すと第１表の
通りとなる。

第　　１　　表 発色反応時間１２分 同様に）Ｉｂのペルオキシダーゼ様活性を第２表に示す
。

第　　２　　表 発色反応時間１０分 第１及び２表のＯＤ　　　の値は何れもそれぞれＨｐ及
び）ｌｂｂ加量に対し、直線関係となり定量可能性を示
す。

第１及び第２表のＯＤ　　　／Ｈｐ（μｇ）／作用時間
（分）の値からＨｐとＨｂとのペルオキシダーゼ様活性
の比較ができる。例えばＨｐ　：　Ｈｂ−１，５６／’
１２ｍ１ｎ　：８４／１０ｉＩｎ　＝１／４５、同様に
してＨｐ：Ｈｂ−１，９２５／１２：５８．６／１０−
１１５２．５゜ カくシてＨｐのこのペルオキシダーゼ様活性を利用して
、Ｈｂ不含の溶血していない血漿又は血清などに含まれ
るＨｐの定量が、前記Ｈｂ定全工法準拠するカラー法に
より可能である。

一方、Ｈｂを含む溶血した血漿などについては、Ｈｐの
ペルオキシダーゼ様活性が前記のように、Ｈｂのそれよ
りも非常に弱いので、Ｈｂの定量には対象中のＨｐの存
在は大きな影響はないように考えられるが、実際には大
きく影響することが見出された。

即ち、Ｈｂ及びＨｐ不含の血漿にＨｂ及びＨｐを一定量
添加して、カラー法によりＯＤ　　　を測定すると非合
理的な過大な結果を与える。

この関係を第３表及び第１図に示す。

第　　３　　表 第３表よりＨｂ　　１μｇ当りのＯＤ　　　を示すと第
４表となる。

第　　４　　表 第３．４表及び第１図より、Ｈｂの共存はＨｐそのもの
のペルオキシダーゼ様活性を遥かに越えた活性を与え、
しかもＨｐの添加回答々につきＯＤ値の直線性を乱すこ
とがないことが分る。この意外な結果を基礎として、Ｈ
ｂを検体中に共存させることにより、検体中のＨｐを増
幅されたＯＤりＣ已又１Ｌ山別司１Ｕガ 値により微量定量することが可能となることが理解され
よう。

かくして、先願のＨｂのカラ一定量法の手法は、Ｈｂ不
含の検体の場合、発色反応に際し比較的に多量に採取す
ることにより、又Ｈｂを含む検体の場合はＨｂ定量法に
おけると同様に比較的少量を採取することにより、その
まま適用できることが見出された。

以上の知見を基に、本発明は、血漿、血清などに含まれ
るハプトグロビンの微量定量を可能とし、しかも自動分
析器の使用に適う定量用試薬キット及びそれを用いるハ
プトグロビンの定量方法を提供する。本発明によりＨｐ
の遺伝型を無視し、多数の検体を迅速、安価にかつ正確
にハプトグロビンが定量できる。

以上本発明を先願を引用して説明したが、本発明の趣旨
は、過酸化ストロンチウムの代りに過酸化水素を用いる
ことによっても満足される。即ち過酸化水素水溶液は酸
化助剤のみならず主たる酸化剤としても用いることがで
きる。このことは過酸化水素溶液とＴＭＢ水溶液とを試
薬とする同一の反応機構によるＨｂの定量方法が既に知
られていることから明かである（Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ。

第１３巻、第１２号、第１２６４〜１２６５頁、１９８
５、山田輝雄、中甫、「血漿ヘモグロビン」）。

本発明のＨｂ定量用試薬キットは、 （イ）試薬１：ＴＭＢまたはその水可溶化誘導体を含む
水溶液、および （ロ）試薬■：過酸化ストロンチウムまたは過酸化水素
を含む水溶液、 より本質的になる。キットは更に （ハ）ヒトヘモグロビン標準液 （ニ）ヒトハプトグロビン標準液 （ホ）ヒトヘモグロビン及びヒトノλプトグロビン不含
の標準液 の少なくとも１つを含むことができる。

試薬Ｉにおいて、ＴＭＢは水に難溶であるが、本発明の
Ｈｐ￥量法において必要なＴＭＢの量は実際上のＨｐを
含む微量のペルオキシダーゼ様活性物質に対応する０、
２〜０．３ｒｍｇ／ｍりであるので、ＴＭＢの溶解度以
下である。しかし保存温度によってはその析出をみるこ
とがある。従ってＴＭＢを水可溶化することが好ましい
。本発明では、水溶性のＴＭＢ・２塩酸塩をＴＭＢとし
て略当量の０．２５〜０．５ｍｇ／ｍＮを用いる。

水可溶化の手段としては上記塩酸塩を用いる以外に、本
発明が根拠とするＨｐなどのペルオキシダーゼ様活性に
基づく発色反応を阻害しない限りいかなる方法を用いて
もよいが、本発明者はＴＭＢがクエン酸水溶液に可溶な
ことに着目し、ＴＭＢ　２０〜３　Ｃｌｎｇ／　１００
ｍＩＩクエン酸１５０〜２５０ｍｇ／　１００ｒｒｌの
割合に含む水溶液が上記手段に適い、しかも比較的に安
定であり、かつ安全で定量機器の腐食をおこさないため
適当であることを認めた。この場合ＴＭＢがクエン酸の
塩として存在すると思われるが、例えばこのようなＴＭ
Ｂをも水可溶化ＴＭＢ誘導体と定義することとする。

上記の水溶液は何れも好ましくは所定量の精製水に所定
量溶解した後、フィルター（好ましくは０．４５μｍ孔
径）で濾過して調製する。

試薬Ｈの水溶液はＴＭＢを酸化するに十分な過酸化スト
ロンチウムを含み、例えば過酸化ストロンチウム６０〜
９０ｍｇを水（好ましくは精製水）１００ｍｊ７に溶解
した後にフィルター（好ましくは０．４５μｍ孔径）で
濾過して得られる。

試薬Ｈに用いることができる過酸化水素溶液は、濃度１
〜４％を有するか、又は用時この濃度に稀釈できる比較
的安定な高濃度の溶液である。

（ハ）のヒトＨｂ標準液は、シアンメト国際標準法によ
り正確に定量した一定濃度を有し、Ｈｂ含有検体、なら
びにＨｂ含有標準被験液の調製に用いる。

（ニ）のＨｐ標準液は、マンシー二法により正確に定量
した一定濃度を有し、（ホ）のＨｐ及びＨｂ不含の標準
液及び前記Ｈｂ含有標準被験液に添加して一連のＨｐ濃
度の標準被験液を作成し、これを用いて検量線を作成す
る。

（ホ）のＨｐ及びＨｂ不含の標準液は、溶血していない
健康人血漿を、抗ハプトグロビン抗体をカップリングさ
せたアフィニティークロマトグラフィーで処理すること
により調製できる。なお人の尿を検体とする場合は、健
康人の尿をそのまま標準液とすることができる。健康人
、の尿にはＨｐは殆んど検出されない。

本発明のキットを用い、血漿又は血清などの検体中のＨ
ｐの定量法は、試薬ｌ及び試薬■を混合し、混合液にＨ
ｐを含有する検体を加え、反応発色させ、比色定量する
ことからなる。

便宜上、検量線を描くための標準被験液について方法を
説明する。試薬■及び■を略等量（０，５〜２ｍＮ）混
合する。混合液に加えるＨｂ不含の標準被験液は、Ｈｐ
の最高濃度を約１０００ｍｇ／ｄΩより約３００ｍｇ／
ｄｌとする一連の濃度に調整し、各々５０〜１０００μ
ｇを試薬混合液に加えることにより、最低２０μｇ１最
高１０００μｇのＨｐを反応させる。

一方、Ｈｂ含存標準被験液は、Ｈｂを任意の濃度に調整
してよいが、１００〜６００■／ｄＲとするのが好まし
く、Ｈｐａ度は最高４００１１ｇ／ｄＪｌ）程度とする
一連の濃度に調整し、各々５〜１０μｇ試薬混合液に加
え、１μｇ以上のＨｐを反応させる。

反応は、各標準被験液につき共通した条件下で行ない、
反応温度は１０〜３７℃、反応時間は１〜６０１ｎより
一定に選ばれる。なお反応を促進するため１〜４％過酸
化水素溶液１ｍｇ以下を反応系に加えることができる。

反応完結後、発色を３６５〜３７５ｎｉ又は６４５〜６
５５ｎ■より選んだ特定波長における吸光度を自己ブラ
ンクを対照として常法により測定する。測定値より検量
線を作成する。

同様な反応を溶血していない健康人の血漿などの検体、
それにＨｂ標準被験液と同じ量の）ｆｂを加えた検体、
及びＨｂ標準被験液と同じ量のＨｂ量とした溶血血漿な
どの検体につき、標準被験液に対応して行ない、発色を
測定してそれぞれの検量線に基づきｕｐを定量する。

なお、検量線の直線性より、使用波長は、溶血していな
い健康人の血漿などヘモグロビン不含の検体をそのまま
定量する場合は、３６５〜３７５ｎｍ、所定量のＨｂを
共存させて定量する場合は、６４５〜６５５　ｎｉ＋よ
り選ぶことが好ましい。

またＨｂの共存によりＨｐの定量性を増幅するに当り、
溶血した血漿のように既にＨｂを含んでいる検体の場合
、Ｈｂ標準被験液に含まれるＨｂ濃度は、検体に含まれ
るＨｂの水準より高い濃度にＨｂ所定量を設定しておく
ことが望ましい。検体中の既存のＨｂはカラー法または
シアンメト国際標準法により定量しておき、不足分を加
えた検体を用いることにより本方法を都合よ〈実施する
ことができる。

以下に参考例及び実施例を挙げて、本発明を更に詳細に
説明する。これらの例において使用された試薬は次の通
りである。

試薬１：参考例及び実施例１〜５においては、クエン酸
１９２ｍｇ／　１００ｍｊ７　Ｓ７Ｍ８２６ｍｇ／　Ｉ
　Ｑ　Ｑ　ｍｌの濃度に含む水溶液。

実施例６においては、ＴＭＢ・２塩酸 塩４０ｍｇ／１００ｍｇの濃度に含む水溶液。

試薬■：過酸化ストロンチウム７７ｏｇ／１００ｍｇの
濃度に含む水溶液。

参考例 第２表及び第３表（従って第１図）に示されるデータは
次のようにして得られた。

１）Ｈｐ−０μｇ Ｈｂ及びＨｐ不含の血漿にシアンメト国際標準法により
正確に定量したＨｂを添加し、これを希釈して０，２０
，４０，６０．８０，１００ａ＋ｇ／ｄｐの濃度のＨｂ
標準血漿を調整した。

試薬Ｉ及び試薬■の等全混合により調製した発色試薬２
ｒｒｌに各々の濃度のＨｂ金含有漿５μｇを添加混合し
、３７℃で正確に１０分間インキュベートした後、自己
ブランクを対照として分光光度計で３７０　ｔｖの吸光
度を測定し、検量線を作成した。

結果を第２表に示し、また第３表第１図に組入れである
。

２）Ｈｐ−５μｇ Ｈｂ標準血漿にＨｐ　１００ｍｇ／　ｄｊ？を更に含ま
しめる以外上記１）を繰り返゛した。

結果は第３表及び第１図に組入れである。

３）　　Ｈｐ−１０μｇ Ｈｐを２００　ＩＩｇ／’ｄ　１）とした以外は上記２
）を繰り返した。

結果は第３表及び第１図に組入れである。

４）Ｈｐ−１５μｇ Ｈｐを３００ｍｇ／ｄＮとした以外は、上記２）を繰り
返した。

結果は第３表及び第１図に組入れである。

５）Ｈｐ−２０μｇ Ｈｐを４００ｆｆ＋ｇ／ｄｆｆとした以外は上記２）を
繰り返した。

結果は第３表及び第１図に組入れである。

６）Ｈｐ−２５μｇ Ｈｐを５００ｍｇ／ｄｊＪとした以外は上記２）を繰り
返した。

結果は第３表及び第１図に組入れである。

実施例　Ｉ Ｈｂ及びＨｐ不含の血漿にマンシー二法により正確に定
量したＨｐを添加し、これを希釈して０゜５０．１００
，１５０，２００，２５０，３００ｍｇ／ｄ、１７の濃
度のＨｐ標準血漿を調整した。試薬Ｉ及び試薬■の等量
混合により調製した発色試薬２ｍＭに各々の濃度のＨｐ
含有血漿１００μｇを添加混合し、３７℃で正確に１２
分間インキュベートした後、ブランクを対照として分光
光度計で３７０　ｒ＋ａ＋の吸光度を測定し、検量線を
作成した。

溶血していない検体１００μｇを用いて同様の操作を行
ない３７０　ｎｍの吸光度をＪｌｌｌ定し、検量線から
検体中のＨｐａ度を求めた。

標章血漿についての結果は第１表に示し、検量線は第２
図に示す。

実施例　２ 実施例１を繰り返した。但しＨｐ標準血漿のＨｐ濃度を
０．２００，４００，６００，８００゜１０００ｍｇ／
ｄＩＩとし、インキュベーションの時間を正確に６分間
とした。

検量線を第３図に示す。

実施例　３ Ｈｂ及びＨｐ不含の血漿に、シアンメト国際標準法によ
り正確に定量したＨｂを添加して、最終Ｈｂａ度を２０
０ｍｇ／ｄΩとし、次いでマンシーニ法により正確に定
量したＨｐを添加し、最終Ｈｐ　／ａ度を各々０，５０
，１００，１５０゜２００．２５０，３００口ｇ／ｄｆ
Ｉの標準血漿を調製した。

試薬Ｉ及び試薬■の等量混合により調整した発色゛試薬
２ｍｆｌに各々の濃度の標準血漿５μｇを添加混合し、
３７℃で正確に８分間インキュベートした後、自己ブラ
ンクを対照として分光光度計で６５０　ｒ＋ｍの吸光度
を測定し、検量線を作成した。

溶血した血漿中のＨｂをカラ一定量法またはシアンメト
標準国際法で定量し、不足分のＨｂを加えてその濃度を
標準血漿°中の濃度と同じく２００ｍｇ　／　ｄ　りと
し、これの５μｇを用い、同様の発色反応に付して吸光
度を７１−１定し、検量線からＨｐａ度を求めた。

検量線を第４図に示す。

実施例　４ 実施例３を繰返した。但し標準血漿のＨｂの最終濃度を
４００１１１ｇ／ｄｊＪとした。

検量線を第４図に示す。

実施例　５ 標準血漿のＨｂ最終濃度を５００ｆｆ＋ｇ／ｄΩとした
以外は、実施例３を繰り返した。

検量線を第４図に示す。

実施例　６ Ｈｂ及びＨｐ不含の血漿にマンシー二法により正確に定
量したＨｐを添加し、これを希釈して、０．１００，２
００，４００，６００，８００゜１０００ｍｇ／ｍΩの
濃度のＨｐ標準血漿を調製した。

試薬ｌ及び試薬■の等量混合により調製した発色試薬２
ｍｇに各々の濃度のＩ（ｐ含有血漿５０μｇを添加、混
合し、３７℃で正確に１０分間インキュベートした後、
自己ブランクを対照とじて分光光度計で３７０ｎｏ＋の
吸光度を測定し、検ｆｆｉ線を作成した。

溶血していない検体５０μｇを用いて同様の操作を行な
い、３７０　ｎｍの吸光度をａｔｊ定し、検量線から検
体中のＨｐ濃度を求めた。

検量線を第５図に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は参考例及び実施例１における血漿中のヘモグロ
ビン濃度に依存する、ハプトグロビンの吸光度の影響を
示す図、第２図及び第３図はそれぞれ実施例１及び２の
ヘモグロビン不含血漿におけるハプトグロビンの検量線
を示す図、第４図はそれぞれ実施例３，４及び５のヘモ
グロビン含有血漿におけるハプトグロビンの検量線を示
す図、第５図は実施例６のヘモグロビン不含血漿におけ
るハプトグロビンの検量線を示す図である。 特許出願人　　株式会社　ミドリ十字 代理人弁理士　　　寺　　嶋　　孝

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（イ）３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジ
   ン又はその水可溶化誘導体を含む水溶液、ならびに（ロ
   ）過酸化ストロンチウム又は過酸化水素を含む水溶液よ
   りなるハプトグロビン定量試薬キット。 ２、（ハ）ヒトヘモグロビン標準液、（ニ）ヒトハプト
   グロビン標準液、（ホ）ハプトグロビン及びヘモグロビ
   ン不含の標準液の少くとも１つを更に含む請求項１記載
   のキット。 ３、（イ）の水溶液が３，３′，５，５′−テトラメチ
   ルベンジジン塩酸塩２５〜５０ｍｇ／１００ｍｌの割合
   である請求項１記載のキット。 ４、（イ）の水溶液が３，３′，５，５′−テトラメチ
   ルベンジジン２０〜３０ｍｇ／１００ｍｌ及びクエン酸
   １５０〜２５０ｍｇ／１００ｍｌの割合である請求項１
   記載のキット。 ５、（ロ）の水溶液が過酸化ストロンチウムを６０〜９
   ０ｍｇ／１００ｍｌの割合で含む請求項１記載のキット
   。 ６、（イ）３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジ
   ン及び又はその水可溶化誘導体を含む水溶液と（ロ）過
   酸化ストロンチウム又は過酸化水素を含む水溶液とを用
   時混合し、混合液にハプトグロビンを含む検体を加え、
   反応発色させ、比色定量することからなるハプトグロビ
   ンの定量方法。 ７、検体がヘモグロビンを含有する請求項６記載の方法
   。 ８、検体がヒトの血漿又は血清である請求項６記載の方
   法。 ９、比色定量を、６４５〜６５５ｎｍ又は ３６５〜３７５ｎｍの波長における吸光度に基づいて行
   なうことからなる請求項６記載の方法。 １０、比色定量を、検体のヘモグロビン濃度と同一であ
   り、かつ一連のハプトグロビン濃度を有する標準被験液
   の測定により得られた検量線に基づいて行なうことから
   なる請求項７記載の方法。 １１、比色定量を、６４５〜６５５ｎｍの波長における
   吸光度に基づいて行なうことからなる請求項７または１
   ０記載の方法。 １２、比色定量を自動分析器を用いることにより行うこ
   とからなる請求項６記載の方法。