JPH022104B2 - - Google Patents

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JPH022104B2
JPH022104B2 JP1488879A JP1488879A JPH022104B2 JP H022104 B2 JPH022104 B2 JP H022104B2 JP 1488879 A JP1488879 A JP 1488879A JP 1488879 A JP1488879 A JP 1488879A JP H022104 B2 JPH022104 B2 JP H022104B2
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JIUSU SAIENTEIFUITSUKU Inc
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Description

【発明の詳现な説明】 最近、腫瘍組織均質䜓の现胞ゟル蛋癜䞭の゚ス
トロゲン受容䜓ER特性の分析が、乳癌が進
んでいる患者を遞び出し、可胜なホルモン療法を
ずるために有効な手段であるこずが蚌明されおい
る。䟋えば、N.Engl.J.Med、2911252−1253
1974を参照しお頂きたい。゚ストロゲン受容
䜓分析で遞ばれた患者は、単に臚床基準によ぀お
遞ばれた患者では単に20から30の反応である
のに察し、32から60の客芳的鎮静率を瀺すこ
ずが報告されおいる。䟋えば、Cancer、39
2934−29471977Cancer 23145−1511969
及JAMA、1721271−12831960を倫々参照
されたい。 しかしながら、゚ストロゲン受容䜓に察し陜性
ずみなされた腫瘍をも぀た患者に斌お、高い反応
率を埗るこずが出来ないこず、及び顕著な゚スト
ロゲン受容䜓のない乳癌患者の玄10が皮々の゚
ンドクリン療法にうたく反応しおいるずいう事実
より、朜圚的なホルモン受容䜓乳癌を怜出し、識
別するために、珟状の方法を曎に改善するずいう
こずが必芁であるこずを瀺しおいる。 珟圚の生化孊的分析方法は、組織均質䜓の现胞
ゟルフラクシペン䞭の蛋癜質の゚ストラゞオヌル
結合胜力を枬定する。埓぀おその結果は、分析に
䟛された組織䞭の癌のかたたりの事実䞊の倧きさ
や、现胞ゟル䞭に抜出しうる癌受容䜓蛋癜質の比
率や、その他非癌組織成分から抜出しうる蛋癜質
に圱響される。結果ずしお、これらの芁因の倉化
によ぀お、最終的な゚ストロゲン受容䜓倀のばら
぀きが倧きくなり、その結果、癌现胞数の真実の
生理孊的状態が䞍正確ずな぀おいる。 䞊述のように、゚ストロゲン受容䜓分析によ぀
お遞ばれた患者は、32から60の明癜な鎮静率
を瀺しおいるが、このこずは、この方法によ぀お
遞ばれた患者の68から40は、ただホルモン療
法がうたくい぀おないずいうこずを意味する。患
者遞抜法を改善するために、朜圚的なホルモン反
応乳癌の識別のための第の印ずしお、腫瘍现胞
ゟル䞭のプロゲステロン受容䜓の分析が採甚され
おいる。 プロゲステロン受容䜓は、乳癌の30−60に斌
お報告されおいる正垞及ネオプラステむツク組
織に斌けるプロゲステロン受容䜓に぀いお、W.
L.McQuire、J.P.Ruynaud、E.E.Baulieu、P171、
New York、Ravin Press、1977。又明らかに
゚ストロゲン受容䜓に察し陜性である腫瘍に぀い
おのみ起るEuropean Journal of Cancer
131205、1977。初期のデヌタぱストロゲン
受容䜓もプロゲステロン受容䜓も同じ腫瘍䞭に芋
出されるずいうこずは、ホルモン反応ず䞀局密接
に関連しおいるこずが考えられるこずを瀺しおい
るようだ。あるペヌロツパシリヌズでは、そうい
うクレヌムは支持しなか぀たにも拘わらず、この
ような初期的な生化孊的分析の基瀎の䞊で、プロ
ゲステロン受容䜓は、今埌の研究でそのような決
定の芖野を確立する必芁があるのだが、ホルモン
反応乳癌に察する第二のしるしづけ道具ずなるで
あろう。 プロゲステロン受容䜓の流行の生化孊的分析
は、゚ストロゲン受容䜓に぀いおすでに議論され
たのず同じような困難さをも぀。それ故、゚スト
ロゲン受容䜓に぀いおず同じように、癌现胞集団
に察するプロゲステロン受容䜓陜性现胞の割合を
枬定できる、単玔でも぀ず正確な现胞化孊的技術
が必芁ずされおいる。 曎に、他のタむプの癌も又ホルモン療法に敏感
であるし、又䞀般に、悪性の組織に斌るホルモン
受容䜓の怜出ず同定を容易にするような重芁な怜
出剀が必芁ずされおいる。 本発明の目的ずねらいは、ホルモン療法に察す
る患者の遞択に察する二者択䞀又は補足的予蚀ず
しお、各癌现胞の゚ストロゲンずしお又プロゲス
テロンや他のホルモン結合の研究ず同定に有効な
方法ず盎接の现胞化孊剀を開発するこずである。 基瀎的には、本発明は、組織のかたたり䞭のあ
るタむプの乳癌の存圚をも芖芚的な方法で遞択的
に指摘するこずのできる著しく䟿利な胜力をも
ち、又、問題の患者に適切なホルモン医療の投薬
の䞊で、鎮静するような、ある皮のホルモン−蛋
癜−染料耇合剀の発芋ず開発を含んでいる。事
実、凍結片䞭で分離されテストされた人間の乳癌
现胞䞭の゚ストロゲンそしお又プロゲステロン受
容䜓を怜出する本発明により、ある化孊的トレヌ
サヌが提出されおいる。曎に、本発明は、皮々の
他のタむプの悪性物䞭の盞圓する受容䜓现胞の怜
出に際し、他のホルモン剀の利甚を含んでいる。
本発明は、生きおいる癌腫の鎮静をなすために適
圓なタむプの療法の決定に倧きな進歩をなすこず
を玄束する。 本発明の実斜䟋は、゚ストロゲン受容䜓に関し
お最初に瀺したのず同様に、次のように手短かに
芁玄できる 初期又は転移した乳癌腫を含むか又は含むず思
われる組織片を倖科手術により患者から取り陀
き、凍結する。その組織片を次に、玄14Όの厚さ
に切り、顕埮鏡のスラむドにすえ぀け、曎に、玄
時間玄℃から℃たで冷蔵庫で也燥させ
る。それから、リン酞塩−緩衡化された塩溶液
たずえば0.01Mリン酞塩を含む0.85NaCl溶液、
PH7.4で手短かにすすいで再氎和した埌、この
組織暙本を䟋えば、螢光゚ストラゞオヌル耇合剀
埌に詳述するで被芆し、曎に宀枩玄16℃か
ら22℃で玄時間湿気のある宀で倍逊する。 この被芆した耇合䜓を、その組織暙本から取り
陀き、その现片をリン酞塩緩衡した塩で再び静か
にすすぎ、そしお、玄時間、塩䞭に浞挬する。
この堎合、新鮮な掗浄液で䞀床亀換するのが有利
である。次いで、リン酞塩−緩衡したグリセリ
ン、PH7.2−7.8及びスラむドカバヌスリツプでカ
バヌしたあず、螢光顕埮鏡でテストする。 螢光゚ストラゞオヌルでのこのような凊理埌、
固た぀おいない凍぀た现片䞭の乳癌现胞は、螢光
顕埮鏡でテストするず、すぐに぀の䞻な範疇に
分離される。即ち本来的な现胞質螢光である矎し
い緑色を瀺す癌现胞ず螢光せず又はしおも極少で
ある郚分ずである。 こういう凊理埌の现胞の螢光の存圚は、組織に
より、耇合䜓の゚ストラゞオヌル残基の衚面的な
結合の結果であるず解釈され、又その䞭に゚スト
ロゲン受容䜓の存圚を瀺す蚌拠ずしお受けずめら
れる。 现胞の゚ストロゲン受容䜓の特別の着色の陜性
陰性のブロツキングを、也いた凍結した现片のプ
レむンキナベヌシペンによ぀おテストした。この
テストは、たずえば螢光染料成分を欠くが同様の
゚ストラゞオヌル化合物䞭で、ふ぀うに緩衡され
た子牛の血枅アルブミン“BSA”溶液䞭で、
それぞれ螢光゚ストラゞオヌル耇合䜓の匷床な皀
釈ずする時間前に実斜した。これら现片は、曎
に䞊述の劂く培逊し、掗浄し、テストした。 完党に特異性のあるブロツキングを埗るために
は、螢光゚ストラゞオヌル耇合䜓を皀釈するか又
はステロむド蛋癜質の比を䜎くしお、甚い、着
色䞭の゚ストラゞオヌル残基の濃床がステロむ
ド蛋癜質の比が20−25であるブロツキング溶液
䞭ではその1/10を越えないようにするこずが必芁
であるこずがわか぀た。ブロツキング剀ずしお非
耇合の17β−゚ストラゞオヌル又は17β−゚スト
ラゞオヌル−−CMOを䜿甚する詊みは、蛋癜
質キダリアヌ存圚なしに、玄PH7.4の氎溶液䞭で
のこれらの化孊物質の溶解床は、ER陜性癌现胞
の結合偎を満足するのに充分でなか぀たので、成
功しなか぀た。 螢光゚ストラゞオヌル耇合䜓は、盲腞炎の組織
片、扁桃腺、結腞及胃の癌腫は、陰性の察照䟋ず
しお同じように準備したが、着色しなか぀た。 プロゲステロン受容䜓を含む现胞に関しお、同
様の凊理方法が甚いられる。螢光顕埮鏡甚にこの
組織片を着色しお準備する技術は、この堎合には
螢光プロゲステロン耇合䜓が现胞化孊剀ずしお甚
いられる以倖ぱストロゲン受容䜓に察する堎合
ず同じである。 先に述べたように、本発明は、人間の乳房組織
の凍結片ぞの゚ストロゲンず又プロゲステロンの
結合胜力を蚌明するための新しい现胞化孊剀ず方
法を玄束する。この方法は、本質的にはホルモン
゚ストラゞオヌル又はプロゲステロンステロむド
化合物ず螢光染料化合物ずで、ダブルラベルされ
た蛋癜質キダリアヌから成る新芏な受容䜓のトレ
ヌサヌの調補に成功したこずによる。 この蛋癜質キダリアヌは、そのアミノ酞残基ず
共有結合しお、ステロむドを氎溶液䞭に運び、现
胞化孊的取扱いをする充分な高い濃床ずなすので
このキダリアヌはこのトレヌサヌの必須の成分で
あるず思われる。 他のホルモンステロむド成分も、蛋癜以倖の
倚官胜の芪氎性キダリアヌず同じくその化合に利
甚される。 ステロむドホルモンが、ペプチドキダリアヌず
぀ながるずき、その倩然の分子配眮に斌るホルモ
ンの特異性が維持されるならば、その生理的官胜
基をそのたたにしおさらしおおくこずが、䞍可欠
である。17β−゚ストラゞオヌルの堎合、の䜍
眮の化孊的手による子牛の血枅アルブミンずの結
合は、すでに、免疫孊的特異性の保持に成功しお
いる䟋えば、Steroids、18593−6031971
Steroids、19357−3751972。同じようなアプ
ロヌチがここで甚いた耇合䜓を調補するのに採甚
されおいるが、ある皮の手順が、高分子染料蛋
癜質比及びステロむド蛋癜質比を達成するため
に修正されおいる。平均しお、本発明の奜たしい
䟋では、玄11モルの螢光染料ず24モルのホルモン
がモルの蛋癜質䟋えば“BSA”に有効にく
぀぀く。 螢光プロゲステロン耇合䜓の化孊的合成は、こ
れから曎に詳现に述べるように、䟋えば子牛の血
枅アルブミンフルオロクロヌム染料耇合䜓に、䟋
えばステロむドホルモンのの䜍眮又は11の䜍眮
のいずれかずいうようにプロゲステロン分子を同
様にく぀぀けるこずによ぀お、達成するこずがで
きる。 ゚ストロゲンの具䜓䟋 17β−゚ストラゞオヌル−−−カルボキ
シメチルオキシムの合成 ロングり゚ルずりむンタヌステむナヌ、、
Biol.Chem.133219−2291940に述べられお
いるように、17β−゚ストラゞオヌル・ゞアセテ
むト10を氷酢酞34.5mlに溶解し、氎
6.9mlず氷酢酞51ml䞭にクロミりムトリオ
キサむド8.5をずかした溶液これに加えた。
混合物を、宀枩で24時間撹拌し、氎で500mlに垌
釈し、各々500mlの゚ヌテルを䜿぀お回抜出し
た。倧郚分の酢酞は、かすかなピンク色が氎局に
珟れるたで飜和したNaHCO3溶液で掗うこずに
より、䜵甚された゚ヌテル抜出物より陀去した。
゚ヌテル局を曎に、のNa2CO3ず飜和
NaHCO3溶液の混合溶液によ぀お培底的
に掗い、぀いで、氎で掗い、それから也燥するた
で蒞発させた。残りを酢酞゚チル−石油゚ヌテル
b.p.60−100℃の混合物200mlに溶
解し、22×4.5cmのシリカゲルカラム䞭を通した。
カラムは次にの酢酞゚チル−ヘキサンの
混合物で掗い、それから200mlの留分を集めた。 この分析は、黄色がか぀た、明らかに過酞化さ
れた副産物倚分ケト酞ずその誘導䜓の溶離に
先立぀お埗られる留分䞭の−ケト−17β−゚ス
トラゞオヌル・ゞアセテむトの溶離に最高の結果
を瀺した。 溶出溶剀の蒞発埌、粗−ケト−17β−゚スト
ラゞオヌル・ゞアセテヌト留分は、たずめお無氎
゚タノヌルから再結晶し、2.5の針状結晶m.
p.箄173℃を埗た。 −ケト−17β−゚ストラゞオヌルを調補する
ために、−ケト−17β−゚ストラゞオヌル・ゞ
アセテむト2.5を、窒玠ガス䞋で24時間宀
枩で、メチルアルコヌル䞭75mlの20KOHで加
氎分解した。黄色がか぀た溶液が埗られ、氎で玄
400mlに垌釈し、塩酞でPHたで酞性にし、各々
500mlの゚ヌテルで回抜出した。゚ヌテル抜出
物を合せお、NaHCO3で飜和したNa2CO3で
掗い、それから氎で掗぀た。也燥するたで蒞発さ
せた埌、粗生成物を無氎゚タノヌルで床再結晶
させるず、結晶板m.p.箄280℃生成量1.5
が埗られた。 アヌランゞダヌ等により、Methods in
Immunology and Immunochemistry、Ed
Welliams CA、Clase MW.Academic Press、
New York、Vol.1、144−159、1967䞭で述
べた䞀般的な方法は、17β−゚ストラゞオヌル−
−−カルボキシメチルオキシムを調補す
るために次に甚いられた。−ケト−17β−゚ス
トラゞオヌル1.5を゚タノヌル75ml及
び2NKOH6.8mlに溶解し、次でカルボキシメ
トキシルアミン・ヘミハむドロクロラむド94
1.5を加えた。混合物を時間還流した
埌、アルコヌルを蒞発させた。残りを溶解させる
ために氎150mlを加えた埌に、その溶液をPH
8.5に調敎し、非溶解物を陀くために過し、
各々30mlの酢酞゚チルで床抜出した。HClでPH
に酞性化した埌、癜い沈柱物が生成した。埌者
を、過で集め、37℃のむンキナベヌタヌで也燥
し、アセトンで床再結晶させるず、1.4の針
状結晶m.p.196−199℃が生成した。17β−゚
ストラゞオヌル−−−カルボキシメチル
オキシムずその先駆物質の同定は、融点ずシルカ
ゲルプレヌトで薄局クロコトグラフむヌ溶媒
系酢酞゚チル−ヘキサン゚タノヌル酢
酞の比が7213.54.510で実斜した。文献
䟋えばSteroids、18593−6031971及19
357−3751972に報告されおいるように、その
倀はこれらの化孊物質に予想したものに盞圓する
こずがわか぀た。 フルオレツセン む゜シアネヌトFITC−
子牛血枅アルブミンBSA化合物FITC−
BSAの調補。Am.J.Path.、341081−1097
1958の䞀般的な方法を高いFITC−BSA比を
甚いる以倖は、同様にしお甚いた。詳现には、
BSAシグマケミカル瀟補のもので結晶化
しお凍結也燥したものを10mlの0.5Mのカルボ
ネヌト−ビカルボネヌト緩衡液PH9.5に溶解
した。セラむト10物シグマケミカル瀟補
䞊のFITCをこの溶液に加え、宀枩で
時間撹拌した。遠心分離によりセラむトを陀去
埌、FITC−BSA耇合䜓を、あらかじめ0.05Mリ
ン酞塩緩衡液PH7.8で平衡にしたセフアデツ
クス−25カラムを通し、次いでゆるく結合した
FITCを完党に陀去するため同じ緩衡液で48時間
透析した。その蛋癜質量は、ビナヌレツト反応で
決定した。フルオレツセン蛋癜質の平均分子量
比は、495nでの0.1N NaOH䞭での玔粋FITC
の吞収から11.2±0.5であるず蚈算された。 17β−゚ストラゞオヌル−−CMO−BSA−
FITC耇合䜓フルオレツセン・゚ストラゞオヌ
ル耇合䜓の調補。䞊述のようにしお埗られた、
蛋癜質200mg、−゚チル−−−ゞメチ
ルアミノプロピルカルボゞむミド・ハむドロク
ロラむド200mg及びゞオキサンmlに溶解し
た17β−゚ストラゞオヌル−−−カルボキ
シメチルオキシム200mgを含むリン酞塩緩
衡液に含たれるFITC−BSA耇合䜓の䞀郚、ml
の氎、0.05Mリン酞塩緩衡液の適量からなり、PH
7.8で党量21mlにしたものを宀枩で20時間撹拌し
た。この過皋で、゚ストラゞオヌルは、“BSA”
蛋癜質䞭のε−アミノ基ず、ステロむドのオキシ
ム誘導䜓のカルボキシル基の間のペチタむド結合
の生成によりBSAに結合した。 次いでこの耇合䜓をたず氎で培底的に透析し、
次で、48時間リン酞塩で緩衡化した塩溶液
PBSPH7.4で透析し、次に遠心分離28000
×、15分した。この䞊柄液を集めアゞ化ナト
リりムを防腐剀ずしお最終濃床mgmlになるよ
うに加えた。 この溶液は䜿甚前にPBSで所望の濃床たで曎
に皀釈した。 詊隓すべき乳癌組織暙本を䞊述のように凍結し
た现片ずしお調補しおもよい。それらを、固定さ
れない状態に保たねばならない。䟋えば、もし゚
ストロゲン受容䜓ER陜性癌现胞を含む組織
片が、冷アセトン−20℃、3.7の緩衡液化し
たホルムアルデヒド又はグルタヌルアルデヒ
ド䞭で固定されれば、现胞の゚ストラゲン結合胜
力が完党になくなるずいうこずにもなりうる。 曎に、现胞゚ストロゲン受容䜓に斌ける保存効
果を調べるために、ER陜性腫瘍からず぀た別々
の組織片を各々℃から℃のPBS䞭に保存し、
䞀方は−20℃で凍結した。凍結片は、24時間間隔
で、このかたたりからカツトし、゚ストロゲン受
容䜓の怜出のために着色した。組織のかたたりが
凍結せずに2゜−℃間で保存された時、24時間以
内では癌现胞の゚ストロゲン結合胜力には明らか
な枛少はないが、72時間ではかなりの枛少がみら
れ、ER陜性の癌现胞の割合が明らかに䜎くな぀
た。 −20℃で凍結した組織のかたたりは、现胞化孊
的研究には䞍適圓であるこずが分぀た凍結及び
解凍をくりかえすず、明らかに組織片から゚スト
ロゲン受容䜓蛋癜質を分離するからである。 本発明の実斜に圓぀お、組織片を䞊述のこずを
心にずめお調補し研究しなければならない。 かくしお、现胞の゚ストロゲン受容䜓はアセト
ン及びアルデヒド定着液に、短期間さらしただけ
でも、生き残れないこずが明らかである。埓぀
お、固定されない凍結片のみが、この技術に掚奚
できる。螢光゚ストラゞオヌル耇合䜓ずのむンキ
ナベヌシペンに先立ち、時間の間冷蔵庫内でス
ラむド䞊の现片を也燥するこずは、固定されない
湿぀た凍結片を扱うこずは、非垞に技術的にむづ
かしいので、蚱容しうる劥協案である。 いうたでもなく、现胞化孊怜査のために、材料
を入手する最良の時期は、日垞の蚺断すべき凍結
片が調補された時である。现胞母集団の同定のた
めに近接した連続片を、ヘマトキシリンず゚オシ
ン法で着色するこずができる。しかしながら、暙
本を移送しなければならない堎合には、組織塊は
2゜−℃で保たれ、24時間以内に凊理するこずが
望たしい。凍結ず解凍をくりかえるず、゚ストロ
ゲン受容䜓の掻性が枛少する。貯蔵期間がのびる
に埓぀お生じる死埌倉化も、同様な逆効果をもた
らす。 臚床の生物質のこの现胞化孊法の適応は、すべ
お異なる患者からず぀た17䟋の初期の浞透管癌
腫、䟋の腋䞋のリンパ腺に移転した乳癌、䟋
の繊維癌、10䟋の良性の「fibrocystic
mastopathy」 及び䟋の女性の乳腺腫を含んだ胞の損傷の研究
により䟋蚌された。 これらの組織暙本の通垞の着色法ずしお、䞊述
のようにしお埗た透析した螢光゚ストラゞオヌル
耇合䜓を、最埌濃床がml圓り0.5ÎŒM±10の
FITCず圓量になるようにPBSPH7.4で皀釈し
た。この皀釈液は、暙準物質ずしお、耇合しおい
ないオキシムず玔粋なFITCの0.1N−NaOH溶液
を甚いた堎合に、340nず495nでのそれぞれ
の吞収0.1N NaOH䞭によ぀お瀺されるよう
に17β−゚ストラゞオヌル−−CMOFITC分
子量比は2.2±10を瀺す。 これらの溶液䞭には、遊離のホルモンや螢光染
料は薄局クロマトグラフむヌでは怜出されなか぀
た。 このように研究された19䟋の乳癌の䞭、䟋の
癌腫぀は初期の他は準静的のみが现胞質䞭
では螢光゚ストラゞオヌル耇合䜓が粗く重い沈柱
物を生じ、现胞栞䞭では比范的少いずいう特城を
も぀匷力にER陜性な癌现胞の殆んど同質の母集
団より成り立぀おいた。附随したリンパ球、倚圢
態栞癜血球、組織球、原圢質现胞、血管及介圚す
るち密な繊維状の結合組織は、どんな特異な螢光
をも瀺さなか぀た。 残り15の乳癌腫14䟋は初期で䟋は準静的
は、螢光の皋床が倉化し、完党に陰性の现胞から
匷い陜性の现胞たでばら぀き、同じ腫瘍の個々の
现胞間ず同じく異る腫瘍間でも異぀たホルモン結
合胜力を瀺す癌现胞より成぀おいた。癌现胞栞
は、着色される堎合も着色されない堎合も现胞質
より、明暗床は䜎い。䟋の初期癌のみが、殆ん
ど非着色癌现胞より構成されおいるずいうこずが
芋出され、ER陰性腫瘍ずみなすこずができた。
しかしながら、これら埌者の堎合でも、結果的に
は泚意深く調べおみるず、分離したER陜性癌现
胞が少量珟れる。 乳腺及び小葉の良性の䞊皮现胞は又、均質でな
い゚ストロゲン結合胜力を瀺した。これらの非ネ
オプラスチツク现胞䞭の螢光沈柱物の濃床は、倧
抵のER陜性癌现胞䞭で芳察されるよりもはるか
に䜎く、䞊皮现胞の倧郚分は、ER陰性であり、
ERサむトを殆んども぀おいないので、この方法
では怜出するこずができなか぀た。瞮䞊皮现胞及
びその近くの繊維結合組織では、殆んどが党く゚
ストロゲン結合胜力は芳察されなか぀た。この状
態は、ER陜性癌现胞でかこたれた範囲でさえも
党く倉らなか぀た。䞀定の゚ストロゲン結合を瀺
す良性の䞊皮现胞は、個々の腫瘍間の螢光濃床を
類別する時に、組織片䞭の“匱陜性”のコントロ
ヌルずしお䜿うのが䟿利である。 繊維腺腫及び乳腺腫の結果は、いずれの障害も
ゆ぀くりず増加する゚ストロゲン結合胜力をも぀
た现胞増殖管の䞊皮现胞を含むようにみえる点、
及びこれらの条件のいずれにも、现胞増殖管をず
りかこんで明確に䟋蚌できる゚ストロゲン受容䜓
を有する基質现胞がある点で䌌おいた。 0.5ÎŒM FITCmlず圓量の濃床に皀釈した
FITC−BSA耇合䜓だけをもたた、陰性の非特異
性の着色コントロヌルずしお甚いた。この物質
は、ER陜性癌现胞を着色するのに倱敗した。こ
の现胞化孊技術の特異性は、この耇合䜓が盲腞
炎、扁頭腺及胃腞系統の癌腫を含む、よく知られ
た“非暙的”組織を着色できず、又、この暙的现
胞ER陜性の乳癌现胞の着色は、非螢光の17β
−゚ストラゞオヌル−−CMO−BSAによ぀お
劚げられるずいう事実によ぀お支持できる。特異
着色を完党に劚害するために、玄10倍の非螢光ス
テロむド濃床が必芁である。このこずは、3H−
゚ストラゞオヌルの結合を8S现胞ゟル蛋癜質受
容䜓によ぀お抑えるためには、玄100倍の過剰な
非攟射性゚ストラゞオヌルが必芁であるずいう実
枬による。J.Clin.Enocrinol.Metab.37986−
9891973参照 悪性の転移が起るず、乳癌现胞は、ホルモンの
受容䜓の通垞の母集団のすべお又は䞀郚分を保持
しおおり、ER陜性腫瘍に発展するずいうこずが
䞀般的に芋なされおいる。しかしながら、又、良
性の乳房組織は生化孊的分析により怜出される充
分な゚ストロゲン受容䜓をめ぀たに含たないずい
うこずもよく知られおいる。参照Cancer Res.、
30692−6981970 埓぀お、この“保持”理論では高゚ストロゲン
受容䜓倀が、ER陜性癌のいく぀かで芋出される
ずいうこずを説明するのはむづかしい。本现胞化
孊研究の発芋は、ER陜性癌现胞は保持するのみ
ならず、しばしば珟実問題ずしおの通垞の゚スト
ロゲン結合胜力よりも高いものを芁し、良性の芪
の100倍から1000倍の倧きさにもなりうる、ずい
うこずを瀺す。䞭幎又は高霢の女性患者の乳房組
織では、管及び小葉の裏の䞊皮现胞の少数のみ
が、䜕らかの意味のある゚ストロゲン結合を瀺
す。 本発明の実斜の結果は又、乳癌を単玔にER陜
性又はER陰性腫瘍かで分類するこずができない
ずいうこずを瀺す、なぜならば、乳癌の倧郚分
は、混合割合がいろいろであるが、ER陜性及ER
陰性现胞それぞれが混りあ぀た異る゚ストロゲン
受容力の癌现胞の異皮の母集団から成立぀おいる
からである。倚分垞にどのER陜性腫瘍䞭にもER
陰性现胞を芋出すこずはできるであろうそしおそ
の逆も同様である。それ故、癌现胞母集団䞭の
ER陜性现胞の癟分率によ぀お乳癌を類別するこ
ずがより適圓ず思われる。 明らかに、ホルモン療法の前埌で陀去した腫瘍
で埗られる现胞化孊デヌタを比范研究すれば、癌
现胞生成孊に関する深淵で重芁な疑問点に぀いお
曎に情報が埗られるであろう。䟋えば、内分泌凊
理が、癌现胞母集団のER陜性现胞の癟分率をぞ
らすこずができるならば、䞀般に悪性现胞のホル
モン䟝存床及びホルモン受容床間の関連にず぀お
匷力な蚌拠ずなるだろう。このこずは又、䜕故い
く぀かのER陜性腫瘍は完党に自発的状態に進行
する前にホルモン療法期間䞭郚分的又は短期間の
み鎮静するかを説明するこずができる。参照
Cancer、392934−29471977いわゆる受容䜓
陰性腫瘍たで倖挿されるホルモン䟝存床は連続募
配の抂念も、又、すでに提案されおいる
Cancer、391971−19771977。 本発明を甚いれば、このような研究に圹立぀芳
察が可胜ずなる。䟋えば、本発明によれば実際、
倧抵の乳癌腫は、ER陜性癌现胞を含み、疑わし
い原暙本の悪性床を扱うずきに、乳癌を識別する
のに助けずなるずいうこずが瀺されおいる。 曎に、患者の䜓液䞭を埪環しおいる内生の゚ス
トロゲンは、腫瘍の゚ストロゲン受容サむトを占
め又は飜和しおいお、受容䜓の分析を劚害するず
いうこずが考えられる。 本発明の実斜䟋に぀いお瀺し、そしお䞊述した
ように、個々の癌现胞の間に結合しおいる均質な
゚ストロゲンの欠乏は、腫瘍の真実の゚ストロゲ
ン受容力の枬定の際の䞻な障害であるので、割匕
しお珟れる。 しかしながら、これは、䜍眮的に腫瘍内で生
産され、個々の现胞の䞀様でない飜和を導いおい
るホルモンによる圹割を付けるものでない。 本発明の実斜により埗られる现胞化孊的デヌタ
は又、繊維腺腫及び女性の乳腺腫の胞の組織が、
䞊皮现胞にも基質现胞にも、今怜出されうるずこ
ろの゚ストロゲン受容力を増加させるずいう芳察
を支持する。 お分りのように、本発明は、䟋えば、特別の参
照䟋ずしお17β−゚ストラゞオヌル−−−
カルボキシメチルオキシム子牛の血枅アルブ
ミンフルオレツセン・む゜チオシアネヌト耇合
䜓の利甚に぀いお述べ又䟋蚌する。この耇合剀の
分子構造は次のように図瀺できる。 プロゲストロンの具䜓䟋 䞊述のように、本発明は又、プロゲステロン−
蛋癜質−染料耇合䜓を甚いおも実斜できる。この
具䜓的な方法をここで述べ、図瀺したい。 方法11−䜍のプロゲステロン結合 11α−ハむドロキシプロゲステロン・ヘミサクシ
ネむトの合成 ゚ルランガヌ等免疫孊及免疫化孊の方法、
巻、p.148、C.A.Williams及M.W.Chase著、アカ
デミツクプレス、N.Y.、1967及ブツデむ等J.
Med.Chem.10199、1967によ぀お芁玄された
䞀般的な原理に埓぀お、11α−ハむドロキシプロ
ゲステロン10Sigma Chem.Co.、St.
Louis、MOず無氎コハク酞10の也燥ピ
リゞン100ml溶液を調補し、20時間窒玠ガス
䞋で還流した。冷华した反応混合液を砕氷を含ん
だ冷い塩酞氎溶液3N.500mlに泚ぎ入れ、ク
ロロホルムで抜出した。クロロホルムを蒞発した
埌、残䜙をアセトン−ヘキサン、及びアセトンで
くりかえし再結晶するず、融点が148−152℃の癜
い結晶が4.5埗られた。0.1N−NaOH䞭での
吞収の最倧は243nであ぀た。これらの特城は
11α−ハむドロキシプロゲステロンヘミサクシネ
ヌトに察する文献リンドナヌ等Steroids 19
357−375、1972に曞かれたものず䞀臎しおい
た。 FITC−BSA耇合䜓の調補 䞊述ず同じ方法を再び採甚できる。 11α−ハむドロキシプロゲステロン・ヘミサクシ
ネヌト−BSA−FITC螢光プロゲステロン−11
−耇合䜓の調補 17β−゚ストラゞオヌル−−−カルボキ
シメチルオキシムの代りに、11α−ハむドロキ
シプロゲステロン・ヘミサクシネヌトを甚いる以
倖は、螢光゚ストラゞオヌル耇合䜓の調補に甚い
た䞊述の方法を再び甚いるこずができる。 生じた最終耇合䜓の構造を䞋蚘に瀺す。 この最終の螢光のあるプロゲステロン−11−耇
合䜓に附着したステロむド残基の数は、゚ルラン
ガヌ等による方法J.Biol.Chem.228713、
1957を甚いお、ゞニトロプニヌル化により決
定された。平均しお、11モルの螢光染料ず26のホ
ルモンがモルの子牛の血枅アルブミンに附着す
る。 この技術の特効性は、螢光プロゲステロン耇合
䜓で癌现胞䞭のプロゲステロン受容䜓の着色は、
非螢光11α−ハむドロキシプロゲステロン・ヘミ
サクシネヌト−子牛の血枅アルブミン化合物に斌
る組織片の予めむンキナベヌシペンによ぀おうた
く劚げられるずいう事実及び螢光プロゲステロン
耇合䜓はよく知られた非目的組織、䟋えば、扁頭
腺、虫様突起、リンパ腺組織及胃腞管の癌腫のよ
うなものを着色出来ないずいう事実によ぀お支持
できる。 方法−䜍のプロゲステロン結合 −プロモプロゲステロンの合成 ゟンドハむマヌ等の方法J.Am.Chem.
Soc.754712、1953により、プロゲステロン
10ず−プロモサクシンむミドを
時間四塩化炭玠250ml䞭で環流した。その
混合液を過埌、溶媒を蒞発した。残぀たものを
ヘキサンで摩砕するず、融点が玄139−142℃の
−ブロモプロゲステロンが埗られた。アセト
ン−ヘキサンから結晶をくりかえしお、融点が
141−144℃の分析サンプルずした。 プロゲステロン−−カルボキシメチレンチ
オ゚ヌテルの合成 リンドナヌ等の方法Steroids 19357、
1972によ぀お、−ブロモプロゲステロン
2.4ずチオグリコヌル酞0.8を、KOH
を含むメタノヌル100mlに加えた。こ
の混合液を時間環流した。メタノヌルの倧郚分
を蒞発させた埌、残さを氎100mlでずかしお
から、PHになるたでHCl10で酞性にし、
゚ヌテルで抜出した。それから゚ヌテル局を
NaHCO3氎0.1Nで抜出した。HCl10で
アルカリ抜出物を酞性にするず、沈柱が生じるの
で、それを過しお集め、氎掗し、也燥し、酢酞
゚チル−石油゚ヌテルで再結晶させた。最終生成
物0.55は146−149℃の融点をも぀おい
た。 プロゲステロン−−カルボキシメチレン−チ
オ゚ヌテル−BSA−FITC螢光プロゲステロン
−−耇合䜓の調補 ゞメチルホルムアルデヒドml䞭のプロゲ
ステロン−−カルボキシメチレンチオ゚ヌ
テル100mgず、氎10ml䞭の−゚チル−
−−ゞメチル−アミノプロピルカルボゞ
むミド・ハむドロクロラむド100mgの混合液
を、宀枩で20分間撹拌し、リン酞塩緩衡液を甚い
ないで圓量の蛋癜質100mgを含む子牛の血枅アル
ブミン−フルオレツセン・む゜チオシアネヌト
10mlの氎溶液に加えた。それを℃で日間
撹拌した埌、NaHCO30.05M溶液で䞀日透析
し、次に日間、リン酞塩で緩衡化した塩PH
7.4で曎に透析した。この最終耇合䜓を沈柱を
陀くために遠心分離した。この䞊柄液に、防腐剀
ずしおアゞ化ナトリりムをmgmlの濃床になる
ように加えた。 最終的な耇合䜓の構造を次に瀺す。 最終的な螢光プロゲステロン−−耇合䜓に附
着したステロむド残基の数は、゚ルランガヌ等の
方法J.Biol.Chem.228713、1957によるゞニ
トロプニル化により決定した。平均しお11モル
の螢光染料ず26モルのホルモンが子牛の血枅アル
ブミンモルに附着する。 癌现胞プロゲステロン受容䜓を怜出するための
螢光プロゲステロン−−耇合䜓の䜿甚方法は、
螢光゚ストラゞオヌル耇合䜓及び螢光プロゲステ
ロン−11−耇合䜓に぀いお䞊述したのず同じであ
る。 着色の特異性に぀いおは、非螢光プロゲステロ
ン−−BSA耇合䜓又は、非螢光プロゲステロ
ン−11−BSA耇合䜓を甚いる技術により、この
耇合䜓が䞊に述べたように非暙的組織を着色でき
なか぀たこずにより支持される。 ぀は11の䜍眮、もう぀はの䜍眮でのこれ
ら぀の螢光プロゲステロン耇合䜓の調補に成功
したこずは、人間の組織に斌るホルモン受容䜓の
怜出ぞの现胞化孊的な可胜性を瀺す。蛋癜質キダ
リダヌに぀いおいえば、螢光耇合䜓䞭のステロむ
ドホルモンの濃床は、人間の䜓液䞭の生理孊的濃
床の10䞇倍から100䞇倍に達する。この高濃床は、
生理孊的PH範囲の氎溶液䞭にごくわずか溶けおい
るフルオレツセン−ステロむド化合物があ぀たず
しおも、现胞化孊的受容䜓のトレヌサヌずしお、
有効に採甚するこずは出来ないから、必然的であ
る。 これら぀の螢光耇合䜓のうち、11α−ハむド
ロキシプロゲステロン・ヘミサクシネヌト−
BSA−FITC方法は容易に調補でき、又蛋
癜質のかなりの量がプロゲステロン−−カル
ボキシメチレンチオ゚ヌテル−BSA−FITC
方法の調補の際の最終段階で倉性を受ける
ので、収量も高い。しかしながら、䞡方の䌁おは
共に、䟿利なプロゲステロン受容䜓のトレヌサヌ
を調補するのに利甚されうる。これは、リング
の䜍眮もリング11の䜍眮もステロむ
ドホルモン−プロゲステロンの特異な機胜をも぀
基に圱響を䞎えない化孊的な手ずしお利甚できる
ずいう免疫孊的芳枬ず䞀臎しおいる。 この志願者による11䟋の人間の乳癌の研究は、
プロゲステロン受容䜓は、はじめ腫瘍现胞の现胞
栞に䜍眮しおいお、゚ストロゲン受容䜓陜性癌现
胞をも含む癌に斌お起るようにみえるずいうこず
が瀺されるのは興味深い。プロゲステロン受容䜓
及び゚ストロゲン受容䜓のどちらも、垞に互に䌎
぀お生じ、そしお同じ现胞䞭に存圚するかどうか
は、ただ党く確かめられおいない。 ゚ストロゲン受容䜓ずプロゲステロン受容䜓现胞
の同時怜出 本発明の実斜䟋は曎に、゚ストロゲン受容䜓ず
プロゲステロン受容䜓现胞の同時怜出に぀いお次
に解説する。 ここで甚いられる詊薬ずしお、詊薬は、17β
−゚ストラゞオヌル−−CMO−BSA−FITC
を䞊に抂略説明したようにしお調補した。 詊薬は、11α−ハむドロキシプロゲステロ
ン・ヘミサクシネヌト−BSA−テトラメチルロ
ヌダミン・む゜チオシアネヌトである。 この詊薬は、テトラメチルロヌダミン・む゜チ
オシアネヌトをフルオレツセン・む゜チオシアネ
ヌトの代りに甚いる以倖は11α−ハむドロキシプ
ロゲステロン・ヘミサクシネヌト−BSA−FITC
に぀いお䞊に述べたのず同じ方法で調補する。 詊薬ず詊薬は次に、圓モル混合し、生じた
混合液が10-4から10-3Mの結合した゚ストラゞオ
ヌル及びそれずほが同濃床の結合したプロゲステ
ロンを含むものずする。ステロむド ホルモン成
分のフルオロクロヌム染料単䜍に察する平均分子
比は、玄ずの間で、䞀般には玄
である。 着色の方法 次に怜査すべき組織现片を切り、詊薬ず詊薬
の䞊述の混合液で着色する。 このようにしお着色された組織片は、次にセ
ツトのフむルタヌで、぀はフルオレツセン・む
゜チオシアネヌトの刺激動起に察しお遞択性
があり、もう぀は、ロヌダミン・む゜チアネヌ
トの刺激に察し遞択性のあるものを装備した螢光
顕埮鏡で怜査する。このようなフむルタヌを䜿぀
た利点は、゚ストロゲン受容䜓䜍眮は、茝くよう
な緑色を瀺し、䞀方プロゲステロン受容䜓䜍眮
は、明かるいオレンゞ色−赀色の螢光を瀺すずい
うこずである。この技術により、䞊述の混合液を
䜿぀お、゚ストロゲン受容䜓ずプロゲステロン受
容䜓ず䞡方の存圚が同時に怜出できるし、又同䞀
組織暙本で目で芋ながら怜査できる。 結 果 本発明の前蚘の具䜓䟋を䜿぀お、12䟋の乳癌及
び䟋の子宮内膜癌をこの化合された受容䜓分析
方法で怜査した。この研究により、個々のホルモ
ンに察する単䞀癌现胞の結合胜力は、同䞀レベル
ではないかもしれないが、倧抵の゚ストロゲン受
容䜓陜性癌现胞は、実にプロゲステロン受容䜓を
含むずいう芳枬が確かめられた。匱い゚ストロゲ
ン結合を瀺す良性の基質现胞は、女性の乳房の堎
合には、プロゲステロン結合胜力を持぀おいるよ
うにはみえない。䟋の子宮内膜癌は、非垞に匷
い基質のプロゲステロン受容䜓掻性であ぀たが、
基質䞭には、共存した゚ストロゲン結合はなか぀
た。 この結果は曎に、郚耇合分子ずしお結合した
時、螢光ステロむドホルモンは、゚ストロゲン受
容䜓ずは別な受容䜓又乳癌ずは別な組織の怜査及
び同定に䜿甚しうるずいうこずを実蚌しおいる。 螢光プロゲステロン耇合䜓の合成に関する本実
隓は又、本発明の実斜が、他の倩然又は合成のス
テロむド ホルモン䟋えば、テストステロンの
ようなアンドロゲンホルモンや、17α−ハむドロ
キシコルチコステロン即ち、ハむドロコルチゟ
ン、コルチゟヌルのようなアドレコルチ・ホ
ルモンの郚分耇合䜓を䜿うずいうこずを含むこ
ずを明瀺しおいる。テストステロン蛋癜質染料ず
コルチゟヌル−蛋癜質染料の耇合䜓を調補するた
めの実隓手順は、次に瀺す通りである。 螢光テストステロン耇合䜓の調補 方法11の䜍眮のテストステロン結合 11α−ハむドロキシテストステロン−11−ヘミ
サクシネヌトは、䟋えばステラロむド瀟、りむル
゜ン、ニナヌハンプシダヌ、から入手するこず
もできるし、ボツシナステロむド、23699−
711、1974に埓぀お合成するこずもできる。 11α−ハむドロキシテストステロン−11−ヘミ
サクシネヌト BSA−FITC螢光テストステロ
ン−11−耇合䜓の調補は、11−ハむドロキシテ
ストステロン−11−ヘミサクシネヌトが、11α−
ハむドロプロゲステロン・ヘミサクシネヌトの代
りに䜿われる以倖は䞊述の螢光プロゲステロン−
11−耇合䜓の調補ず同じ方法で完成された。 生じた最終耇合䜓の構造を、次に瀺す。 方法の䜍眮のテストステロン結合 テストステロン−7α−カルボキシメチル チ
オ゚ヌテルは、り゚むンステむンの方法ステロ
むド、20789−812、1972に埓぀お調補するこ
ずができる。 その埌テストステロン−−カルボキシ゚チ
ルチオ゚ヌテル−BSA−FITC螢光テストス
テロン−−耇合䜓の調補は、ゞメチルホルム
アミドを含む媒䜓䞭で、結合剀ずしお−゚チル
−−−ゞメルアミノプロピルを甚いお完
成する。くわしい方法は、テストステロン−7α
−カルボキシ゚チル チオ゚ヌテルが、この堎
合、プロゲステロン−−カルボキシメチレン
チオ゚ヌテルの代りに甚いられる以倖は、“䜍
眮のプロゲステロン結合”に察する方法ずしお
䞊述した方法になろう。 生じた最終耇合䜓の構造は次に瀺す。 コルゟチゟル−−−カルボキシメチルオ
キシム−BSA−FITC耇合䜓螢光コルチゟル耇
合䜓の調補 コルチゟル−−−カルボキシメチルオ
キシムは、アヌノルドずゞ゚ヌムスの方法ステ
ロむド 18789、1971及び、フアヌミむ等の
改良法ステロむド 26267、1975を甚いお
合成できる。 コルチゟル−−CMO−BSA−FITCの調補
は、コルチゟル−−−カルボキシメチル
オキシムが、17β−゚ストラゞオヌル−−
−カルボキシメチルオキシムの代りに甚いられ
る以倖は、はじめ述べた17β−゚ストラゞオヌル
−−CMO−BSA−FITC耇合䜓ず同じ方法を
甚いお完成する。 最終耇合䜓の構造は次に瀺す。 テストステロン又はコルチゟルを含む最終螢光
耇合䜓に附着したFITC分子の数は、0.1N−
NaOHäž­495nでの耇合䜓の吞収から蚈算でき
る。最終耇合䜓に附着したステロむド残基の数
は、゚ルランガヌ等の方法Clin.Chem.1624、
1970を甚いるゞニトロプニル化又は、トリニ
トロベンれンスルホン酞によるアミノ基の決定方
法Clin.Chem.1624、1970を甚いお決定で
きる。耇合䜓の子牛の血枅アルブミンの各分子
は、高いステロむド染料比ず、溶液䞭の有効結
合ステロむドホルモンの高濃床を確保するため
に、20から30のテストステロン又はコルチゟル残
基及びから11分子のフルオレツセンを担う。 今日たで蓄積された経隓から、凍結組織现片䞭
の受容䜓をさぐり出すため、螢光ステロむドホル
モン耇合䜓を䜿うためには、郚の耇合䜓が、受
容䜓に察する高い芪和力を保持するためステロむ
ド残基の適圓な数を担う筈であるが、キダリアヌ
ナニツトに附着したフルオロクロヌム染料分子の
数はさほど決定的でないずいうこずが分぀おい
る。キダリダヌずしお子牛の血枅アルムミンを䜿
甚する堎合に、フルオロクロヌムずホルモンの比
は䞀般的には玄から、25、最小でも
50の範囲内である。 前立腺組織及造血組織に斌ける螢光テストステ
ロン及螢光コルチゟル耇合䜓の適甚は、すでに述
べたのず同じ䞀般的方法に埓぀お取扱われる。 本発明の他の実斜䟋に぀いお述べる。 しかし、もちろんのこずずしお、(a)䟋えばカル
ボキシル基などを有するペプチド鎖のような、生
成の可胜性のある適圓な芪氎性キダリアヌ成分
(b)、䞊述のキダリアヌ䟋えば、ヘミサクシネヌ
ト又はカルボキシメチレン チオ゚ヌテル誘導䜓
の圢での゚ストロゲンや同じくテストステロンや
コルチカルホルモン誘導䜓等ぞの結合に察し適
圓な化孊的な手をも぀掻性ホルモン剀、そしお
(c)、前述の蛋癜質成分に結合したフルオロクロヌ
ム染料料ずいう本質的な特城をその詊薬がも぀限
り、このような詊薬の方匏を倉えたり、又本発明
の範囲内で、ホルモン−キダリアヌ−フルオロク
ロヌム染料の他の化合物の組合せを利甚するこず
ができるずいうこずは理解できるであろう。 䞊に瀺したような具䜓䟋の皮々の特別の改良は
圓業者によ぀お適宜採甚されるであろう。 䟋えば、ホルモン成分ずそしおフルオロクロヌ
ム染料、即ち、倧倚数のアミノ基を含むこれらの
蛋癜質ず同様の化孊的化合物ず䞡方ず結合する可
胜性をも぀アミノ基を含むならば、他の蛋癜質キ
ダリアヌを遞んでもよい。 そういう亀互の蛋癜質キダリアヌの䟋ずしお次
に名前をあげる。 単玔蛋癜質アルブミン類、グロブリン類、グル
テリン類、プロミラン類、アルブミノむド類、
ヒストン類及びプロタミン類。 耇合䜓蛋癜質栞蛋癜質、糖蛋癜質、ムコ蛋癜
質、リン蛋癜質、色玠蛋癜質、リポ蛋癜質及び
金属蛋癜質、 誘導蛋癜質物理的化孊的方法により倉性した蛋
癜質、プロテオヌス類、ペプトン類、ペプチド
類、぀のアミノ歳のゞケトピペラゞン環状無
氎物。 少くずも぀の第䞀玚アミノ−NH2基を
も぀アミノ酞から誘導したポリペプチド類は、生
じた耇合䜓が充分溶解性があるならば、それ自䜓
蛋癜質の代りに利甚できる。 加えお、二者択䞀的に、䟋えばポリグリコヌル
やポリグリセロヌルのような倚数の氎酞基をも぀
他の氎和性分子がキダリアヌ䟋えば゚ステルや
゚ヌテル鎖を通じおそこで結合するずしお利甚
できる。 今、フルオレツセンそれ自身が遞択利甚される
染料である䞀方、たくさんの他のフルオロクロヌ
ム染料も、(1)ここに述べた甚途に保持されるかな
りは぀きりした螢光特性及び(2)前述のポリ−アミ
ノ−タむプの蛋癜質キダリアヌ物質ず結合する可
胜性ずいう基瀎的な芁求に応じるさえすれば、圩
甚できる。こうしお採甚されおもよいフルオロク
ロヌム染料を䞋蚘に瀺す。 オヌラミン、ロヌダミン、ロヌダミン3G、
アクリグラビン、アクリゞン・オレンゞ、コリホ
スフむン、アクリゞン・む゚ロヌ、フオスフむ
ン、ベンゟフラビン、チオフラビンTCN、ロデ
むンダむン、マグダラレツド、ベルベリン、キナ
クリン、リバノヌル、テトラサむクリン、チアゞ
ンレツド、チアゟヌル む゚ロヌ、コンゎレ
ツド、アシツドフクシン、スルフオロヌダミン
、゚オシン、プリムリン、チオフラビン、
テトラメチルロヌダミン及びゞナフチルアミンス
ルホン酞。 曎に、他の゚ストロゲン化ホルモンが17β−゚
ストラゞオヌルの代りに採甚できる。それは、゚
ストラゞオヌルは、゚ストラゲンのうちの぀
最も重芁な圢であるがにすぎないし、本発明
の実斜に圓぀お、倧切なこずは、疑惑の癌现胞を
受容しやすい゚ストロゲンを採甚するずいうこず
である。他のそのような化合物ずしおは、もちろ
ん、その−−カルボキシメチルオキシム
誘導䜓の圢での17α−゚ストラゞオヌルをはじめ
に挙げるこずができる。 この化合物は、䞊の䟋で、採甚した17β化合物
に準拠するが、ステロむド環の面より䞋の17䜍眮
にホルモンの氎酞基のある化合物である。基本的
には、シクロペンテノプナンスレン栞を含み、
か぀、−−カルボキシメチル オキシム誘導
䜓を生成する胜力をも぀どんな゚ストロゲン化し
たステロむドホルモンでも、本発明の前述の゚ス
トラゞオヌルのずころに採甚しおもよく、それ
は、゚ストリオヌル、゚ストロンや同様の化合物
を含んでいる。 同様に、プロゲステロン、プレグナンゞオヌ
ル、プレグナントリオヌル、及びプレグナノロヌ
ンのような倩然のプロゲツシペンホルモンや、化
合物R5020、ノル゚チンドロン、ノル゚チノドレ
ル等を含む合成のプロゲステロンを含めた他のプ
ロゲステロン ホルモンを䜿うこずができる。こ
れらの化合物は、プロゲステロンに぀いお䞊述し
た同様の方法で、䜍眮又は11䜍眮に化孊的結合
によ぀おペプタむドキダリアヌに結合される。 このようにしお、癌现胞䞭のホルモン受容䜓を
探り出すために分枝分子耇合䜓を䜿うこの方法
は、螢光顕埮鏡でその盞圓する受容䜓を埗り出し
怜出するのに適圓なプロゲステロン、テストステ
ロンやコルチゟヌル賢蔵皮質ホルモン、ハむド
ロコルチゟルずしおも知られるを含む螢光耇合
䜓を合成するのに適応するこずができるこずが明
らかずなるだろう。 䞊述の実䟋は、䟋えば、䟋の女性ホルモン
゚ストラゞオヌル及プロゲステロン、䟋の男
性ホルモンテストステロン及び䟋の腎臓皮
質ホルモンコルチゟヌルを䜿甚した堎合を含
んでいるが、本発明を、それだけに限定しお解釈
するべきでない。 前文で述べたのは、卵巣、睟䞞及び腎臓の皮質
に斌お倩然に生成した最も重芁なステロむドホル
モンであるが、乳房から遊離されたり又は化孊的
に合成されお、卵巣、睟䞞及腎臓皮質により生成
されたステロむドホルモンにより生じたのず同様
の生理孊的機胜を働かせるこずのできる倚くのホ
ルモン先駆物質、ホルモン代謝物質、及びホルモ
ン類䌌物がある。明らかに、䞊に䟋蚌した゚スト
ラゞオヌル、プロゲステロン、テストステロン及
びコルチゟヌルの代甚に甚いられうる化孊物質の
すべおを正確にリストするこずは䞍可胜なこずで
あるが、本発明が、䟋えば人間の悪性の組織䞭の
察応する受容䜓の怜出反応に適圓である郚耇合
䜓の圢の他の倩然及び合成゚ストロゲン、倩然プ
ロゲステロン及合成のプロゲステむシペン剀、そ
しお倩然及び合成の腎臓皮質ステロむド又はステ
ロむド類䌌䜓のすべおを䜿甚するこずたで最倧限
広い抂念に拡倧するずいうこずをこの道の専門家
であれば、認識できるだろう。参照、䟋えば、
ハロルド゚むハヌパヌ著「生理化孊評論」第11
版、ランゲミデむカル パブリケむシペンズ、ロ
スアルトス、カリフオルニア、1967、の436−
437、及444ペヌゞのかような化合物の䟋瀺 曎に、蛋癜質キダリアヌで぀なげるために甚い
る化孊的な手を、最も重芁な倩然の生理的機胜基
ず、ホルモン分子配眮を保持するためにステロむ
ド分子の−、−、7α−そしお又は11α−䜍
に䜍眮させるこずができる。 しかしながら、この化孊的な手を、これに限定
されるものではないが、分子の9α−、17−、及
び21䜍を含むステロむドホルモンの他の堎合にも
䜍眮するこずができる。 又䞊に述べたように、耇合䜓䞭の蛋癜質分子に
附着した少くずも぀のフルオロクロヌム染料分
子ず少くずも぀のホルモン分子が存圚するこれ
らの耇合䜓を甚いるこずは䟿利である。組織受容
䜓ぞの耇合䜓の芪和力を匷めるために、染料分子
に察するホルモン分子の比は以䞊であるこずが
望たしい。埓぀お、ホルモンに察するフルオロク
ロヌムの分子比は玄から25の限床内で
あるべきであるが玄から10が望たし
い。 䟋えば25000から100000の平均分子量をも぀蛋
癜質キダリアヌに぀いおは、耇合䜓䞭の蛋癜質分
子に察するフルオロクロヌム染料分子及ホルモン
分子の比は、フルオロクロヌムに察しおは玄
から20、ホルモンに察しおは玄10ず
40の間の範囲内で倉えられるのは䟿利なこず
である。 本方法に関するこれらは䞊で特に䟋瀺した以倖
の化孊的結合を、耇合構造にホルモン成分を結合
させるために採甚しおも同じこずであるずいうこ
ずを専門家であれば認識するだろう。䟋えば、カ
ルボキシメチルアミンのずころに、初期のアミン
機胜及びカルボキシ機胜をも぀他の補剀を、その
アミンがむミン構造成分を生成するか又はホルモ
ン実䜓ずの結合を生成し、そしお、カルボキシ基
が染料実䜓ずのカルボキシアミド結合ずしおその
埌の結合に利甚できるならば、採甚できる。そう
いう詊薬は、 HO2CCH2xONH2 ここでは、䟋えば以䞋の小さい敎数である
ような倉化を含む。 曎に、無氎琥珀酞の代りに、11−プロゲステロ
ンヘミサクシネヌト誘導䜓を生成するために、無
氎アゞピン酞、あるいは、偎鎖を眮換した無氎琥
珀酞や無氎アゞピン酞のような他の詊薬を、無氎
フタヌル酞や無氎トリメリツト酞のような無氎芳
銙族酞ず同じ様に採甚できる。チオグリコヌル酞
の代りに、二者択䞀的に、他のメルカプト−カル
ボキシ酞が、−プロゲステロン誘導䜓、䟋えば
β−メルカプトプロピオン酞、メルカプト琥珀
酞、及びチオ安息銙酞のような誘導䜓を生成する
ために、䜿甚される。このように、耇合䜓を぀く
るのに䜿われるホルモン成分は次の構造をも぀こ
ずが機械的な必芁条件であり、 〔hormore〕−−CO2H ここでは、ステロむド栞ぞのカルボキシル基
の結合の為に採甚された詊薬の分子残基である。 曎に、カルボゞむミドは、結合剀の唯䞀の基で
ある。他のクロス−リンキングの化孊的反応が、
適圓な化孊的な手が芪分子に導入されたならば、
キダリアヌずステロむド又は染料ずキダリアヌの
結合に利甚できる。その䟋は䟋えば、 (1) トリヌル−ブチルアミンずむ゜ブチルクロロ
カルボネヌトを甚いる混合アンハむドラむド法
゚ルランガヌ等、J.Biol.Chem.228713、
1958及びJ.Biol.Chem.2341909、1959 (2) シンガヌずシツクにより利甚されたゞむ゜シ
アネヌト法J.Biophys、Bnochem.Cytol.9
519、1961 (3) アレキサンダヌ等によるゞハロゲン化したゞ
ニトロベンれン法Bio chem.J.52177、
1952 を含む。 ホルモンがキダリアヌフルオロクロヌム染料耇
合䜓に附着する前に、フルオロクロヌム染料が最
初にキダリアヌ分子に結合するこずが結合の順序
ずしお重芁なこずであるずいうこずは蚘憶するべ
きである。む゜シアネヌト及びむ゜チオシアネヌ
トがステロむドのフリヌのハむドロキシル基ず別
に瞮合する堎合があるので、特に、フルオロクロ
ヌム染料のむ゜シアネヌト又はむ゜チオシアネヌ
ト類が螢光指瀺薬ずしお甚いられる時には、これ
がステロむドの氎酞基のようなステロむドホルモ
ンの生理的な官胜基の消滅を避けるだろう。もし
埌者の反応が起るならば、受容䜓のトレヌサヌず
しおの最埌の螢光耇合䜓の特異性は圱響されう
る。換蚀すれば、最終の成分耇合䜓は、キダリ
アヌ−ホルモン−染料又は、ホルモン−染料−キ
ダリアヌ耇合䜓の圢よりもむしろホルモン−キダ
リアヌ−染料の圢であるべきである。 埓぀お、゚ストロゲン又はプロゲステロン又は
他のステロむドの域はホルモンの受容䜓胜力をも
぀ず疑われおいる乳癌又は他の癌腫組織サンプル
に斌お、悪性现胞の決定ず同定の改良に、珟圚公
開されおいる方法ず技術によ぀お採甚されうる新
しいクラスの薬剀を、本発明が提䟛するこずは、
先述の議論から分るであろう。 かくしお、蚺療及び蚺断ぞの重芁な貢献ずし
お、ホルモン療法の利甚による鎮静に敏感な悪性
物をも぀乳癌及び他の癌患者の怜出ず同定の際の
助けずしお発展した。 もちろん、特蚱請求の範囲の真意ず目的の範囲
内で、ここで述べた本発明の貢献の特別の実斜ず
利甚は、たぶん、この䞊で䟋瀺したように利甚さ
れた特別の具䜓的なやり方から離れ、倉化するで
あろうこずは、専門家であれば呚知のこずであ
る。 【特蚱請求の範囲】  二぀の圧電振動子ず、 䞊蚘二぀の圧電振動子の間に匵蚭しおある支持
郚材ず、 この支持郚材に装着された重錘ず、 䞊蚘二぀の圧電振動子のそれぞれを発振させる
二぀の発振回路ず、 䞊蚘二぀の発振回路の出力呚波数の差をずる回
路ずを具備し、 䞊蚘出力呚波数の差をずる回路の出力により加
速床を枬定するこずを特城ずする加速床センサ。

Claims (1)

  1. 効な怜出剀。  䞊蚘〔ホルモン〕が17β−゚ストラゞオヌ
    ル、17α−゚ストラゞオヌル、゚ストロン、及゚
    ストリオヌルホルモン類のクラスである゚ストロ
    ゲン ホルモンであるこずを特城ずする特蚱請求
    の範囲第項蚘茉の怜出剀。  䞊蚘〔ホルモン〕が、プロゲステロン、プレ
    グナンゞオヌル、プレグナントリオヌル、及プレ
    グネノロンホルモン類及び、化合物R5020、ノル
    ゚シむンドロン、ノル゚シノドレルの合成のプロ
    ゲステむンのクラスのプロゲステロンホルモンか
    ら成るこずを特城ずする特蚱請求の範囲第項蚘
    茉の怜出剀。  䞊蚘〔ホルモン〕が、倩然たたは合成の、ア
    ンドロゲンホルモンであるこずを特城ずする特蚱
    請求の範囲第項蚘茉の怜出剀。  䞊蚘〔ホルモン〕が、倩然たたは合成のアド
    レノコルチカルホルモンであるこずを特城ずする
    特蚱請求の範囲第項蚘茉の怜出剀。  䞊蚘分子比率が玄から25であるこ
    ずを特城ずする特蚱請求の範囲第項〜第項い
    ずれか項に蚘茉の怜出剀。  䞊蚘キダリアヌが、アルブミン類、グロブリ
    ン類、グルテリン類、プロラミン類、アルブミノ
    むド類、ヒストン類及プロタミン類栞蛋癜質、
    糖蛋癜質、ムコ蛋癜質、リン蛋癜質、色玠蛋癜
    質、リポ蛋癜質及び金属蛋癜質プロテオヌス
    類、ペプトン類、ペプチド類、二぀のアミノ酞の
    ゞケトピペラゞン環状無氎物及び、ポリハむド
    ロキシ化合物から成る矀から遞ばれる芪氎性単䜍
    であるこずを特城ずする特蚱請求の範囲第項〜
    第項のいずれか項に蚘茉の怜出剀。  䞊蚘フルオロクロヌムが、オヌラミン、ロ
    ヌダミン、ロヌダミン3G、アクリフラビン、
    アクリゞンオレンゞ、コリフオスフむン、アクリ
    ゞンむ゚ロヌ、フオスフむン、ベンゟフラビン、
    チオフラビンTCN、ロデむンダむン、マグダラ
    レツド、ベルベリン、キナクリン、リバノヌル、
    テトラサむクリン、チアゞンレツド、チアゟヌ
    ルむ゚ロヌ、コンブレツド、アシツドフクシ
    ン、スルホロヌダミン、゚オシン、プリムリ
    ン、チオフラビン、テトラメチルロヌダミン及
    び、ゞナフチルアミンスルホン酞、及びフルオレ
    ツセン から成るクラスの染料であるこずを特城ずする特
    蚱請求の範囲第項〜第項のいずれか項に蚘
    茉の怜出剀。  䞊蚘〔ホルモン〕が、17β−゚ストラゞオヌ
    ルであり、䞊蚘蛋癜質キダリアヌが、牛の血枅ア
    ルブミンであり、䞊蚘フルオロクロヌム染料が、
    フルオレツセンであるこずを特城ずする特蚱請求
    の範囲第項蚘茉の怜出剀。  䞊蚘フルオロクロヌム染料の〔ホルモン〕
    に察する分子比率が、玄から10の間で
    あるこずを特城ずする特蚱請求の範囲第項蚘茉
    の怜出剀。  蛋癜質キダリアヌが、玄25000から100000
    の間の平均分子量をも぀こずを特城ずする特蚱請
    求の範囲第項蚘茉の怜出剀。  フルオロクロヌム染料の蛋癜質に察する分
    子比率が玄から20の間であり、〔ホル
    モン〕の蛋癜に察する分子量比が玄10から
    40の間であり、埓぀お、結合した〔ホルモ
    ン〕成分が、生理的PHの安定した氎溶液䞭で玄
    10-2M以䞋10-5Mたでの濃床をもちうるこずを特
    城ずする特蚱請求の範囲第項蚘茉の怜出剀。  (i) が、カルボキシル基導入詊薬の残基
    である〔ステロむド〕−−CO2H構造をも぀
    ゚ストロゲンホルモン又はプロゲステロンホル
    モン誘導䜓 (ii) カルボキシアミド鎖を通じお、䞊蚘ホルモン
    に結合した蛋癜質又はポリペプチドキダリアヌ (iii) アミノ基を通じお䞊蚘キダリアヌに結合した
    フルオロクロヌム染料ずからなり、か぀䞊蚘フ
    ルオロクロヌム染料のホルモンに察する平均分
    子比率が玄から50の間であり、結合
    したステロむドホルモンが生理的PHの氎溶液䞭
    で玄10-2Mから10-5Mの濃床をも぀分子耇合䜓
    から本質的に成るこずを特城ずする特蚱請求の
    範囲第項蚘茉の怜出剀。  (i) ゚ストロゲンホルモンの−−カ
    ルボキシメチルオキシム誘導䜓 (ii) カルボキシアミド鎖を通じお䞊蚘ホルモンに
    結合した蛋癜質又はポリペプチドキダリアヌ及
    び (iii) アミノ基を通じお䞊蚘キダリアヌに結合した
    フルオロクロヌム染料からなり、か぀䞊蚘ホル
    モンに察する䞊蚘フルオロクロヌム染料の平均
    分子比率が玄ず50の間であり、又、
    氎溶液䞭でのステロむドホルモンの濃床が玄
    10-2Mから10-5Mである分子耇合䜓から本質的
    に成るこずを特城ずする゚ストロゲン受容䜓特
    性をも぀癌組織现胞の怜出に有効な特蚱請求の
    範囲第項蚘茉の怜出剀。  (i) 11α−ハむドロキシプロゲステロン
    ヘミサクシネヌト (ii) カルボキシアミド鎖によ぀お䞊蚘ホルモンに
    結合しおいる蛋癜質又はポリペプチドキダリア
    ヌ、及び (iii) アミノ基によ぀お䞊蚘キダリアヌに結合した
    フルオロクロヌム染料からなり、そしお䞊蚘ホ
    ルモンに察する䞊蚘フルオロクロヌム染料の平
    均分子比率が玄ず50の間であり、又
    少くずも玄10-2Mから10-5Mの結合したステロ
    むドホルモン濃床をも぀溶液を氎媒液䞭に生じ
    るであろうような分子耇合䜓から本質的に成る
    こずを特城ずするプロゲステロン受容䜓特性を
    も぀癌組織现胞の怜出に有効な特蚱請求の範囲
    第項蚘茉の怜出剀。  (i) プロゲステロン−−カルボキシメチ
    レンチオ゚ヌテル (ii) カルボキシアミド鎖によ぀お䞊蚘ホルモンに
    結合した蛋癜質又はポルペプチドキダリアヌ、
    及び (iii) アミノ基によ぀お䞊蚘キダリアヌに結合した
    フルオロクロヌム染料からなり、か぀䞊蚘ホル
    モンに察する䞊蚘フルオロクロヌム染料の平均
    分子比率が玄から50の間であり、結
    合したステロむドホルモンが、生理PHの氎溶液
    䞭で玄10-2Mから10-5Mの濃床をも぀ 分子耇合䜓から本質的に成るこずを特城ずするプ
    ロゲステロン受容䜓特性をも぀癌組織现胞の怜出
    に有効な特蚱請求の範囲第項蚘茉の怜出剀。  癌の疑いのある組織を切陀し、凍結し、截
    片状で也燥し、化孊的に固定されない条件に維持
    しおおき、 (1) その組織片を、ほが生理孊的PH範囲を持぀、
    リン酞塩−緩衡化された実質的に等匵の塩溶液
    䞭で氎和凊理をし、 (2) 匏 〔ホルモン〕−〔〕−〔蛋癜質又はポリペプチ
    ドキダリアヌ〕−〔フルオロクロヌム〕 を有するものであ぀お、 (a) 䞊蚘〔ホルモン〕が共有結合で−−に結
    合したステロむド分子単䜍であり、 (b) 䞊蚘−−が、共有結合した化孊的鎖であ
    り、 (c) 䞊蚘〔キダリアヌ〕が、それぞれ以䞊の
    〔ホルモン〕−−物質および曎に以䞊のフ
    ルオロクロヌム染料物質に共有結合するこず
    のできる倚機胜な芪氎性分子であり、そし
    お、 (d) 䞊蚘〔フルオロクロヌム〕が、䞊蚘キダリ
    アヌに共有結合し又、光照射の䞋で目に芋え
    おは぀きりず芳察できる色を瀺すこずのでき
    る少くずも぀の染料単䜍を瀺し、か぀䞊蚘
    ホルモンに察する䞊蚘フルオロクロヌム染料
    の平均分子比率が玄ず50の間であ
    り、又結合したステロむドホルモンが、生理
    å­Šçš„PHの氎溶液䞭で玄10-2Mから10-5Mの濃
    床をもちうる 分子耇合䜓を䞊蚘のように凊理された組織片に
    コヌテむングするこず (3) その埌䞊蚘組織暙本から䞊蚘分子耇合䜓のコ
    ヌテむングを陀去し、そしお、ほが生理的PH範
    囲をも぀リン酞塩−緩衡化された本質的に等匵
    の塩溶液で該暙本をすすぎ、その埌こうしお提
    出された組織片の现胞の䞭に残る螢光染料の出
    珟の有無を詊隓するこず から本質的に成るこずを特城ずするステロむドホ
    ルモン受容䜓特性をも぀癌組織现胞の怜出方法。
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