JPH02211882A - 複製コンピテントｈｉｖ―ｉプロウィルスと異種遺伝子を含むベクター - Google Patents
複製コンピテントｈｉｖ―ｉプロウィルスと異種遺伝子を含むベクターInfo
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- JPH02211882A JPH02211882A JP1251693A JP25169389A JPH02211882A JP H02211882 A JPH02211882 A JP H02211882A JP 1251693 A JP1251693 A JP 1251693A JP 25169389 A JP25169389 A JP 25169389A JP H02211882 A JPH02211882 A JP H02211882A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は複製コンピテントＨＩＶ−Ｉプロウィルスと異
種遺伝子を含むベクター及び該ベクターの使用に関する
。最も好ましくは、異種遺伝子はＨＩＶ感染をトレース
するために使用され得るマーカー遺伝子である。
種遺伝子を含むベクター及び該ベクターの使用に関する
。最も好ましくは、異種遺伝子はＨＩＶ感染をトレース
するために使用され得るマーカー遺伝子である。
ヒト免疫不全ライ）Ｌｔス（ＨＩ Ｖ −Ｉ ： ＨＴ
ＬＶ−■、Ｌ Ａ Ｖ 又ハＨＴ Ｌ Ｖ −ＩＩ［Ｌ
Ａ Ｖとも呼称される）は、侵入性免疫不全症候群（
ＡＩＤＳ＞および関連疾患の病因である［ Ｂａｒｒｅ
−３ｉｎＯＵＳＳｉら、５ｃｉｅｎｃｅ ２２０ 、８
６８−８７１（１９８３） ： Ｇａ１ｌｏら、５ｃ
ｉ−ｅｎｃｅ ２２４． ５００−５０３（１９８４
） ： Ｌｅｖｙら 、 ５ＣｉｅｎＣｅ２
２５ 、８４０−８４２（１９８４） ＨＰｏｐｏｖｉ
ｃら 、 ５ｃｉｅｎｃｅ２２４ 、 ４９７−５００
（１９８４） ； Ｓａｒｎｇａｄｈａｒｅｎら 、
５ｃｉ−ｅｎｃｅ、 ２２４ 、５０６−５０８（１９
８４） ＨＳｉｅｇａｌら、Ｎ、Ｅｎｇｌ。
ＬＶ−■、Ｌ Ａ Ｖ 又ハＨＴ Ｌ Ｖ −ＩＩ［Ｌ
Ａ Ｖとも呼称される）は、侵入性免疫不全症候群（
ＡＩＤＳ＞および関連疾患の病因である［ Ｂａｒｒｅ
−３ｉｎＯＵＳＳｉら、５ｃｉｅｎｃｅ ２２０ 、８
６８−８７１（１９８３） ： Ｇａ１ｌｏら、５ｃ
ｉ−ｅｎｃｅ ２２４． ５００−５０３（１９８４
） ： Ｌｅｖｙら 、 ５ＣｉｅｎＣｅ２
２５ 、８４０−８４２（１９８４） ＨＰｏｐｏｖｉ
ｃら 、 ５ｃｉｅｎｃｅ２２４ 、 ４９７−５００
（１９８４） ； Ｓａｒｎｇａｄｈａｒｅｎら 、
５ｃｉ−ｅｎｃｅ、 ２２４ 、５０６−５０８（１９
８４） ＨＳｉｅｇａｌら、Ｎ、Ｅｎｇｌ。
Ｊ、１４ｅｄ、、 ３０５ 、１４３９−１４４４（１
９８１） ］ 、この疾患は、無症候が長く続いた後免
疫系および中枢神経系が徐々に退化していく特徴がある
。ウィルスのＭ究から、複製が高度にｔＪＪ ｍされ、
Ｔ−リンパ球のＣＤ４陽性ヘルパーサブセツトの潜在的
および溶菌感染が組織培養中で生ずることが判明した［
２ａｇｕｒｙら、５ｃｉｅｎｃｅ ２３１ 、 ８
５０−８５３（１９８６） ］ 。
９８１） ］ 、この疾患は、無症候が長く続いた後免
疫系および中枢神経系が徐々に退化していく特徴がある
。ウィルスのＭ究から、複製が高度にｔＪＪ ｍされ、
Ｔ−リンパ球のＣＤ４陽性ヘルパーサブセツトの潜在的
および溶菌感染が組織培養中で生ずることが判明した［
２ａｇｕｒｙら、５ｃｉｅｎｃｅ ２３１ 、 ８
５０−８５３（１９８６） ］ 。
感染ウィルスの力価が疾病の過程で低いままであること
から、感染患者においてはウィルスの発現がυＩ１１］
されるものと考えられる。ＨＩ Ｖ −１の制御および
ゲノム機構の分子研究から、少なくとも７個の遺伝子を
コードしていることが判明した［ Ｒａｔｎｅｒら、Ｎ
ａｔｕｒｅ ３１３． ２７７−２８４（１９８５）
： ５ａｈ−ｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒら、５ｃｉ
ｅｎｃｅ ２２７ 、４８４−４９２（１９８５）Ｈｕ
ｅｓ ｔ ｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３１３．４５０−４
５７（１９８５） ： １４ａｉｎ−ＨＯｂＳＯｎら
、Ｃｅ１ｌ ４０．９−１７（１９８５）］ 、 ３：
）の遺伝子、！ｌａり 、 ｐｏｔおよび匹遺ヒビはす
べてのレトロウィルスに共通である。しかしながら、ゲ
ノムは、多くのレトロウィルスに共通でない別の６つの
遺伝子、ｖｉｆ 、 ｔａｔ 、 ｒｅｖ （ａｒｔ
およびｔｒｓとも呼称される） 、 ３’ ｎｅｆ
、 ｖｐｒおよびＶｐＨ遺伝子をもコードする［ ５ｏ
ｄｒｏｓｋｉら、５ＣｉｅｎＣｅ ２３１ 。
から、感染患者においてはウィルスの発現がυＩ１１］
されるものと考えられる。ＨＩ Ｖ −１の制御および
ゲノム機構の分子研究から、少なくとも７個の遺伝子を
コードしていることが判明した［ Ｒａｔｎｅｒら、Ｎ
ａｔｕｒｅ ３１３． ２７７−２８４（１９８５）
： ５ａｈ−ｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒら、５ｃｉ
ｅｎｃｅ ２２７ 、４８４−４９２（１９８５）Ｈｕ
ｅｓ ｔ ｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３１３．４５０−４
５７（１９８５） ： １４ａｉｎ−ＨＯｂＳＯｎら
、Ｃｅ１ｌ ４０．９−１７（１９８５）］ 、 ３：
）の遺伝子、！ｌａり 、 ｐｏｔおよび匹遺ヒビはす
べてのレトロウィルスに共通である。しかしながら、ゲ
ノムは、多くのレトロウィルスに共通でない別の６つの
遺伝子、ｖｉｆ 、 ｔａｔ 、 ｒｅｖ （ａｒｔ
およびｔｒｓとも呼称される） 、 ３’ ｎｅｆ
、 ｖｐｒおよびＶｐＨ遺伝子をもコードする［ ５ｏ
ｄｒｏｓｋｉら、５ＣｉｅｎＣｅ ２３１ 。
？５４９−１５５３（１９８６） ； Ａｒｙａら、
５ｃｉｅｎｃｅ ２２９ 、６９−７３（１９８５）
； ５ｏｄｒｏｓｋｉら、５ｃｉｅｎｃｅ ２２７ 、
１７１−１７３（１９８５） Ｈ５ｏｄｒｏｓｋｉら、
Ｎａｔｕｒｅ ３２１．４１２−４１７（１９８６）；
Ｆｅｉｎｂｅｒｇら、 ＩＪＩ＋ ４６． ８０７−８
１７（１９８６） ： ＷＯｎ（１−ｓｔａａ ＋
ら 、 ＡＩＤＳ Ｒｅｓ、 ａｎｄ Ｈｕｍ
ａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ３゜３３−３９（１
９８７） ：および１９８８年５月１２日付出願の米
国特許出願筒１９３，３２１号明細−二これらの文献の
開示内容は参照により本明細書に包含されるものとする
］。
５ｃｉｅｎｃｅ ２２９ 、６９−７３（１９８５）
； ５ｏｄｒｏｓｋｉら、５ｃｉｅｎｃｅ ２２７ 、
１７１−１７３（１９８５） Ｈ５ｏｄｒｏｓｋｉら、
Ｎａｔｕｒｅ ３２１．４１２−４１７（１９８６）；
Ｆｅｉｎｂｅｒｇら、 ＩＪＩ＋ ４６． ８０７−８
１７（１９８６） ： ＷＯｎ（１−ｓｔａａ ＋
ら 、 ＡＩＤＳ Ｒｅｓ、 ａｎｄ Ｈｕｍ
ａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ３゜３３−３９（１
９８７） ：および１９８８年５月１２日付出願の米
国特許出願筒１９３，３２１号明細−二これらの文献の
開示内容は参照により本明細書に包含されるものとする
］。
これらの遺伝子の多くはウィルスのライフサイクルに必
要な生産物をコードする。
要な生産物をコードする。
ｔａｔ遺伝子はｌ−１１Ｖ複製及び遺伝子発現にとって
重要な１４ｋＤたんぱく質をコードする［１９８５年１
２月６日付出願の米国特許出願筒８０６．２６３号明細
１ ： ＲＯ３ｅｎＣ，Ａ、ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１９
．５５５−５５９（１９８６） ：５ｏｄｒｏｓｋｉ
Ｊ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ ２２７ 、１７１−１７３
（１９８５） ：Ａｒｙａら、５ｃｉｅｎｃｅ ２２
９ 、同上： ５ｏｄｒｏｓｋｉら、５ｃｔｅｎｃｅ
２２９ 、同上；およびＤａｙｔｏｎ Ａ、ら、Ｃｅ１
１４４、９４１−４９７（１９８６） ：これらの文
献の開示内容は参照により本明細書に包含されるものと
する］。
重要な１４ｋＤたんぱく質をコードする［１９８５年１
２月６日付出願の米国特許出願筒８０６．２６３号明細
１ ： ＲＯ３ｅｎＣ，Ａ、ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１９
．５５５−５５９（１９８６） ：５ｏｄｒｏｓｋｉ
Ｊ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ ２２７ 、１７１−１７３
（１９８５） ：Ａｒｙａら、５ｃｉｅｎｃｅ ２２
９ 、同上： ５ｏｄｒｏｓｋｉら、５ｃｔｅｎｃｅ
２２９ 、同上；およびＤａｙｔｏｎ Ａ、ら、Ｃｅ１
１４４、９４１−４９７（１９８６） ：これらの文
献の開示内容は参照により本明細書に包含されるものと
する］。
この遺伝子の機能性産物を発現し得る能力を欠く突然変
異は、ｔａｔたんぱく質を構成的に発現させる細胞系に
おいてｔｒａｎｓに相補され得る。
異は、ｔａｔたんぱく質を構成的に発現させる細胞系に
おいてｔｒａｎｓに相補され得る。
複製に必要な別の遺伝子はｒｅｖ遺伝子である［１９８
６年５月２０日付出願の米国特許出願第８６５１５１号
明細ｌ ： ５ｏｄｒＯ３ｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３２
１ 、４１２−４１７（１９８６） ：これらの文献の
開示内容は参照により本明細書に包含されるものとする
］。しかしながら、この遺伝子はエンベローブたんぱく
質のような構造たんぱく質の産生に必要であるが、ｔａ
ｔ遺伝子産物や３’ ｎｅｔ遺伝子産物のような機能性
調節たんぱく質の産生には必要でない。これらの産物は
ｒｅｖ欠損プロウィルスより作製され得る。
６年５月２０日付出願の米国特許出願第８６５１５１号
明細ｌ ： ５ｏｄｒＯ３ｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３２
１ 、４１２−４１７（１９８６） ：これらの文献の
開示内容は参照により本明細書に包含されるものとする
］。しかしながら、この遺伝子はエンベローブたんぱく
質のような構造たんぱく質の産生に必要であるが、ｔａ
ｔ遺伝子産物や３’ ｎｅｔ遺伝子産物のような機能性
調節たんぱく質の産生には必要でない。これらの産物は
ｒｅｖ欠損プロウィルスより作製され得る。
絶対に必然的ではないが、ｖｉｆ遺伝子はウィルス感染
性にとって重要な２３ｋＤたんぱく質をコードする［Ｆ
ｉｓｈｅｒ Ａ、Ｇ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ ２３７ 、
８８８−８９３（１９８７） ： ５ｔｒｅｂｅｌに
、ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２８．７２８−７３０（１９８
７）］ 。
性にとって重要な２３ｋＤたんぱく質をコードする［Ｆ
ｉｓｈｅｒ Ａ、Ｇ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ ２３７ 、
８８８−８９３（１９８７） ： ５ｔｒｅｂｅｌに
、ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２８．７２８−７３０（１９８
７）］ 。
ｅｎｖ遺伝子の直後にあって３’ ＬＴＲが重複してい
るウィルスゲノムの３′末端に位置する３′ｎｅｔ遺伝
子は、ウィルスの感染力もしくは細胞変性に必要かがま
だ確認されていない２７ｋＯたんぱく質をコードする［
ＴｅｒｗＨＩｉｇｅｒ Ｅ、ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６０
゜７５４−７６０（１９８６） ； Ｌｕｃｉｗ Ｐ
、Ａ、ら、ＰＮＡＳ ８４．１４３４−１４３８（１９
８７） ］ 。
るウィルスゲノムの３′末端に位置する３′ｎｅｔ遺伝
子は、ウィルスの感染力もしくは細胞変性に必要かがま
だ確認されていない２７ｋＯたんぱく質をコードする［
ＴｅｒｗＨＩｉｇｅｒ Ｅ、ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６０
゜７５４−７６０（１９８６） ； Ｌｕｃｉｗ Ｐ
、Ａ、ら、ＰＮＡＳ ８４．１４３４−１４３８（１９
８７） ］ 。
研究の大半はこのレテ０ウィルスの理解に向られている
が、そのライフサイクルは十分に解明されていない。前
記した如く、典型的にはウィルスに感染した人は長い間
無症候を呈し、この間のウィルス力価は低く、Ｔ４÷リ
ンパ球レベルは正常である。この相は通常数年にも及ぶ
。更に、多くの動物ではウィルス感染が認められない。
が、そのライフサイクルは十分に解明されていない。前
記した如く、典型的にはウィルスに感染した人は長い間
無症候を呈し、この間のウィルス力価は低く、Ｔ４÷リ
ンパ球レベルは正常である。この相は通常数年にも及ぶ
。更に、多くの動物ではウィルス感染が認められない。
チンパジーが感染することがあり得るが、感染の徴候を
容易に示さず旦つウィルスたんぱく質もしくはＲＮＡが
ほとんど作成されないためチンバジーにおいてウィルス
を追跡することは非常に難しい。
容易に示さず旦つウィルスたんぱく質もしくはＲＮＡが
ほとんど作成されないためチンバジーにおいてウィルス
を追跡することは非常に難しい。
従って、複製競合ＨＩＶプロウィルスと巽種遺伝子を含
むベクターは非常に有用であり、これによりウィルスた
んぱく質もしくはＲＮＡがほとんど作成されないときに
動物および感染組織における感染ルートをトレースする
ことができる。
むベクターは非常に有用であり、これによりウィルスた
んぱく質もしくはＲＮＡがほとんど作成されないときに
動物および感染組織における感染ルートをトレースする
ことができる。
更に、感染を抑制する薬物をスクリーンすべくウィルス
をインビトロで追跡し得るシステムにおいて前記ベクタ
ーを使用することは非常に有用である。
をインビトロで追跡し得るシステムにおいて前記ベクタ
ーを使用することは非常に有用である。
発明の要旨
本出願人は、ウィルス複製及び感染性に必要なＨＩＶ遺
伝子産物を発現させるべくＨＩＶゲノムに対応する十分
な数のヌクレオチド（ＨＩＶセグメント）と異種遺伝子
に対応するヌクレオチド配列（異種遺伝子セグメント）
を含むベクターを知見した。本明細書中、このベクター
を時々複製コンピテントプロウィルスと称する。このベ
クターはインビボおよびインビトロ系でウィルスの活性
と機能をトレースするために使用され得る。
伝子産物を発現させるべくＨＩＶゲノムに対応する十分
な数のヌクレオチド（ＨＩＶセグメント）と異種遺伝子
に対応するヌクレオチド配列（異種遺伝子セグメント）
を含むベクターを知見した。本明細書中、このベクター
を時々複製コンピテントプロウィルスと称する。このベ
クターはインビボおよびインビトロ系でウィルスの活性
と機能をトレースするために使用され得る。
好ましくは、ベクターはＨＩＶウィルスからの非必須の
ヌクレオチド配列群に対応しないＨＩＶセグメントを含
む。好ましくはＨＩＶセグメントが対応しない非必須配
列はＨＩＮゲノムの３′末端に存在し、より好ましくは
ＨＩＶセグメントは３’ ｎｅｔ配列に対応するヌクレ
オチド配列を含まない。典型的には、異種遺伝子に対応
するヌクレオチド配列を、これらの非必須配列が認めら
れるＨＩＶセグメントに挿入する。好ましくは、異種遺
伝子セグメントはクロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ（ｃＡＴ）遺伝子のようなマーカー遺伝子
又はヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のような成長ホルモン
に対応する。
ヌクレオチド配列群に対応しないＨＩＶセグメントを含
む。好ましくはＨＩＶセグメントが対応しない非必須配
列はＨＩＮゲノムの３′末端に存在し、より好ましくは
ＨＩＶセグメントは３’ ｎｅｔ配列に対応するヌクレ
オチド配列を含まない。典型的には、異種遺伝子に対応
するヌクレオチド配列を、これらの非必須配列が認めら
れるＨＩＶセグメントに挿入する。好ましくは、異種遺
伝子セグメントはクロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ（ｃＡＴ）遺伝子のようなマーカー遺伝子
又はヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のような成長ホルモン
に対応する。
好ましくは、ベクターはＨＩＶゲノムに比較して１キロ
ベース以下の長さである。サイズはＨＩＶゲノムに比較
してより好ましくは９００塩基以下、更に好ましくは１
５０塩基以下、最も好ましくは１００塩基以下の長さで
ある。
ベース以下の長さである。サイズはＨＩＶゲノムに比較
してより好ましくは９００塩基以下、更に好ましくは１
５０塩基以下、最も好ましくは１００塩基以下の長さで
ある。
図面の簡単な説明
第１図はＨＩＶｊロウィルスの構築物のダイアグラムで
ある。上図は異なる読み枠の位置を示す親クローンｐＨ
ＸＢｃ２の概略図である。下図はゲノムの３′末端及び
作製した各種構築物を示す概略図である。
ある。上図は異なる読み枠の位置を示す親クローンｐＨ
ＸＢｃ２の概略図である。下図はゲノムの３′末端及び
作製した各種構築物を示す概略図である。
第２図は異種セグメントＣＡＴ遺伝子インサート
歩としでＣＡＴ遺伝子を含む各種ベクターを用いて作製
したウィルスの複製速度論を示す。第２Ａ図はセル数、
第２Ｂ図は逆転写酵素活性、および第２Ｃ図は免疫沈降
測定によるＣＡＴ活性を示す。
したウィルスの複製速度論を示す。第２Ａ図はセル数、
第２Ｂ図は逆転写酵素活性、および第２Ｃ図は免疫沈降
測定によるＣＡＴ活性を示す。
第３図はベクターＤＨＸＢ−ＣＡＴ１を移入した（ｔｒ
ａｎｓ−ｒｅｃｔｅｔｉ）培養中のＣＡＴ活性を示す。
ａｎｓ−ｒｅｃｔｅｔｉ）培養中のＣＡＴ活性を示す。
第３Ａ図はＣＡＴアッセイのオートラジオグラムである
。第３Ｂ図は実験期間を通して記録されたＣＡＴ酵素レ
ベルの変化を示す。
。第３Ｂ図は実験期間を通して記録されたＣＡＴ酵素レ
ベルの変化を示す。
第４図は任意にｒｅｖ発現体を用いてベクタｐＨＸＢ−
ＣＡＴ１又はｒｅｖ欠損変異体ｐＨＸＢ／ＢＦＳ−ＣＡ
Ｔｌを移入した細胞のオートラジオグラムである。
ＣＡＴ１又はｒｅｖ欠損変異体ｐＨＸＢ／ＢＦＳ−ＣＡ
Ｔｌを移入した細胞のオートラジオグラムである。
第５ 図！；Ｌ ｐＨＸＢｃ−２オよＵ ｐＨＸＢ−Ｃ
ＡＴ１由来のウィルスを感染させた培養物におけるＡＺ
Ｔ、ｄｄＣ又はｄｄＡによるウィルス複製の抑制を示す
。第５Ａ図は免疫沈降を示し、第５Ｂ図はＣＡＴアッセ
イを示す。
ＡＴ１由来のウィルスを感染させた培養物におけるＡＺ
Ｔ、ｄｄＣ又はｄｄＡによるウィルス複製の抑制を示す
。第５Ａ図は免疫沈降を示し、第５Ｂ図はＣＡＴアッセ
イを示す。
発明の詳細な記載
本発明のベクターは、ウィルス複製および感染性に必要
なＨＩＶ遺伝子産物を発現させるべくＨ１ｖゲノムに対
応する十分な数のヌクレオチド（ＨＩＶセグメントと称
する）と異種遺伝子に対応するヌクレオチド配列（異種
遺伝子セグメントと称する）を含む。このベクターは時
々複製コンピテントプロウィルスまたはプロウィルスと
も呼ばれる。
なＨＩＶ遺伝子産物を発現させるべくＨ１ｖゲノムに対
応する十分な数のヌクレオチド（ＨＩＶセグメントと称
する）と異種遺伝子に対応するヌクレオチド配列（異種
遺伝子セグメントと称する）を含む。このベクターは時
々複製コンピテントプロウィルスまたはプロウィルスと
も呼ばれる。
好ましくは、ｌ−１１ＶセグメントはＨＩＶ−１又はＨ
ＩＶ−２ゲノムのヌクレオチドに対応する。
ＩＶ−２ゲノムのヌクレオチドに対応する。
より好ましくは、ＨＩＶセグメントはＨＩＶ−１ゲノム
のヌクレオチドに対応する。しかしながら、ＨＩＶセグ
メントはウィルス複製および感染性に必要でない多くの
ヌクレオチド配列に対応しないことが好ましい。なぜな
らば、ベクターが対応のＨＩＶゲノムに比べて １キロ
ベース以上大きくないことが好ましいからである。より
好ましくは、ベクターのサイズはＨＩＶゲノムに比べて
９００ヌクレオチド塩基以上大きくない。より好ましく
は、ベクターはＨＩＶゲノムに比べて７５０ヌクレオチ
ド塩基以上大きくない。更に好ましくは、ベクターはＨ
ＩＶゲノムに比べて１００ヌクレオチド塩基以上大きく
ない。従って、ベクターＨＩＶセグメントが対応すべき
非必須ヌクレオチドは異種遺伝子セグメントの大きさに
依存して変化し得る。異種遺伝子セグメントは好ましく
は約１キロベース以下、より好ましくは約８００ヌクレ
オチド未満である。
のヌクレオチドに対応する。しかしながら、ＨＩＶセグ
メントはウィルス複製および感染性に必要でない多くの
ヌクレオチド配列に対応しないことが好ましい。なぜな
らば、ベクターが対応のＨＩＶゲノムに比べて １キロ
ベース以上大きくないことが好ましいからである。より
好ましくは、ベクターのサイズはＨＩＶゲノムに比べて
９００ヌクレオチド塩基以上大きくない。より好ましく
は、ベクターはＨＩＶゲノムに比べて７５０ヌクレオチ
ド塩基以上大きくない。更に好ましくは、ベクターはＨ
ＩＶゲノムに比べて１００ヌクレオチド塩基以上大きく
ない。従って、ベクターＨＩＶセグメントが対応すべき
非必須ヌクレオチドは異種遺伝子セグメントの大きさに
依存して変化し得る。異種遺伝子セグメントは好ましく
は約１キロベース以下、より好ましくは約８００ヌクレ
オチド未満である。
本出願人の知見によれば、このベクターを用いると異種
遺伝子がウィルスによる感染および複製の経過を辿り、
従って、ウィルス感染およびウィルス機能を同定する手
段として使用され得る。
遺伝子がウィルスによる感染および複製の経過を辿り、
従って、ウィルス感染およびウィルス機能を同定する手
段として使用され得る。
ＨＩＶセグメントはＨＩＶゲノムからの非必須ヌクレオ
チド配列の小グループに対応しない。好ましくは、ＨＩ
Ｖセグメントが対応しない非必須配列はＨＩＶゲノムの
３′末端の非必須配列である。より好ましくは、ＨＩＶ
セグメントは３′弘配列に対応しない。例えば、ＨＩＶ
セグメントは例えば３′ＬＴＲの始めに対して５′側に
６０ヌクレオチド置いたにｌ）ｎ Ｉサイトと独特なＸ
ｂａ Ｉサイトの間のＨＩＶ−１における配列に対応し
なくてもよい（第１図参照）。しかしながら、ＨＩＶセ
グメントが対応し得ない他のヌクレオチド配列もある。
チド配列の小グループに対応しない。好ましくは、ＨＩ
Ｖセグメントが対応しない非必須配列はＨＩＶゲノムの
３′末端の非必須配列である。より好ましくは、ＨＩＶ
セグメントは３′弘配列に対応しない。例えば、ＨＩＶ
セグメントは例えば３′ＬＴＲの始めに対して５′側に
６０ヌクレオチド置いたにｌ）ｎ Ｉサイトと独特なＸ
ｂａ Ｉサイトの間のＨＩＶ−１における配列に対応し
なくてもよい（第１図参照）。しかしながら、ＨＩＶセ
グメントが対応し得ない他のヌクレオチド配列もある。
異種遺伝子がウィルスの複製を崩壊しない限り任意の異
種遺伝子を使用し得る。より好ましくは、セグメントは
、ウィルスの複製を追跡することができるように発現を
容易にトレースすることができる遺伝子に対応する。こ
の中には、ＣＡＴ遺伝子のようなマーカー遺伝子、ヒト
成長ホルモン遺伝子のような成長ホルモン遺伝子及び当
業者に公知の他の遺伝子が包含される。
種遺伝子を使用し得る。より好ましくは、セグメントは
、ウィルスの複製を追跡することができるように発現を
容易にトレースすることができる遺伝子に対応する。こ
の中には、ＣＡＴ遺伝子のようなマーカー遺伝子、ヒト
成長ホルモン遺伝子のような成長ホルモン遺伝子及び当
業者に公知の他の遺伝子が包含される。
例えば、ＨＩＶセグメントとＣＡＴセグメントを含むベ
クターを用いると、機能性ＣＡＴ遺伝子を発現する感染
性ＨＩＶウィルスを移入することができる。ＣＡＴは感
受性の非常に高い酵素マーカーであるので、これにより
従来不可能であったウィルスによる感染を研究すること
ができる。こうした結果は、このベクターを移入した細
胞、例えばＪＵｒｋａｔ細胞では１０１１１程の少量の
感染培養物を使用するだけでＣＡＴ活性を検出すること
ができるために生ずる。従って、ウィルス産物の合成が
マーカーの存在を検出することにより直接測定すること
が困難な非常に低レベルで生じている早期の段階でウィ
ルス感染を間接的に検出することができる。前記したベ
クターの使用により、ウィルスセグメントにより感染し
た組織を迅速に分析することができ、いろいろな臓器に
おけるウィルス発現レベルを測定することができる。こ
のベクターは、重複感染の研究において並びにインビボ
およびインビトロにおけるウィルス感染の経過を追跡す
る際に有用である。
クターを用いると、機能性ＣＡＴ遺伝子を発現する感染
性ＨＩＶウィルスを移入することができる。ＣＡＴは感
受性の非常に高い酵素マーカーであるので、これにより
従来不可能であったウィルスによる感染を研究すること
ができる。こうした結果は、このベクターを移入した細
胞、例えばＪＵｒｋａｔ細胞では１０１１１程の少量の
感染培養物を使用するだけでＣＡＴ活性を検出すること
ができるために生ずる。従って、ウィルス産物の合成が
マーカーの存在を検出することにより直接測定すること
が困難な非常に低レベルで生じている早期の段階でウィ
ルス感染を間接的に検出することができる。前記したベ
クターの使用により、ウィルスセグメントにより感染し
た組織を迅速に分析することができ、いろいろな臓器に
おけるウィルス発現レベルを測定することができる。こ
のベクターは、重複感染の研究において並びにインビボ
およびインビトロにおけるウィルス感染の経過を追跡す
る際に有用である。
異種セグメントは、必要なウィルス機能を発現させる読
み枠を崩壊しない限りベクターの任意の場所に挿入され
得る。好ましくは、異種遺伝子セグメントは、ベクター
中の非必須配列、例えば３’ ｎｅｔ配列が認められる
ＨＩＶセグメント部分に挿入される。しかしながら、こ
れは必須ではなく、異種遺伝子セグメントは３’ ｎｅ
ｔ配列が認められる以外のベクター中の他の読み枠に挿
入され得る。例えば、ＨＩＶセグメントのサイズを縮小
させるべ（３’ ｎｅｔ配列を欠失させ、ＨＩＶセグメ
ントの他の場所に遺伝子を挿入することも可能である。
み枠を崩壊しない限りベクターの任意の場所に挿入され
得る。好ましくは、異種遺伝子セグメントは、ベクター
中の非必須配列、例えば３’ ｎｅｔ配列が認められる
ＨＩＶセグメント部分に挿入される。しかしながら、こ
れは必須ではなく、異種遺伝子セグメントは３’ ｎｅ
ｔ配列が認められる以外のベクター中の他の読み枠に挿
入され得る。例えば、ＨＩＶセグメントのサイズを縮小
させるべ（３’ ｎｅｔ配列を欠失させ、ＨＩＶセグメ
ントの他の場所に遺伝子を挿入することも可能である。
ベクターを作製する際、ウィルス複製に必要な配列が欠
失もしくは挿入により崩壊されないように注意しなけれ
ばならない。しかしながら、このことは実験テストによ
り容易に調べられる。
失もしくは挿入により崩壊されないように注意しなけれ
ばならない。しかしながら、このことは実験テストによ
り容易に調べられる。
本発明のベクターを作製する際多くの技術が可能である
。例えば、ＨＪＶセグメントに対するプロウィルスゲノ
ム又は異種遺伝子セグメントに対する外来ＤＮＡセグメ
ントを使用することができる。また、ＨＩＶおよび異種
遺伝子セグメントを化学的に合成することもできる。本
明細書の開示に基づいて当業者に公知の他の技術を用い
てベクターを作製することもできる。
。例えば、ＨＪＶセグメントに対するプロウィルスゲノ
ム又は異種遺伝子セグメントに対する外来ＤＮＡセグメ
ントを使用することができる。また、ＨＩＶおよび異種
遺伝子セグメントを化学的に合成することもできる。本
明細書の開示に基づいて当業者に公知の他の技術を用い
てベクターを作製することもできる。
１つの方法では、感染性ＨＩＶブＯウィルスクＯ−ンを
使用し、非必須配列、例えば３’ ｎｅｔ配列を欠失さ
せ、欠失領域に異種遺伝子に対するＤＮＡセグメントを
挿入して本発明のベクターを作製することができる。こ
の目的のために任意の複製コンピテントＨＩＶプ０ウィ
ルスプラスミドを使用することができるが、例えば、ｐ
ＨＸＢｃ２−Ｘｂａ Ｉと称されるｐＨＸＢｃ２由来の
感染性プロウィルスフ０−ン［Ｆｉｓｈｅｒ、Ａ、Ｇ、
ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１６ 、２６２−２６５（１９８
５）］が使用され得る。前記ｐ ＨＸ Ｂ Ｃ２はエン
ベローブトランスメンブランたんぱく質をコードする遺
伝子の３′末端近くに人工的に導入した１１限酵素開裂
サイトを含む［Ｌｏｂｅｌ、Ｌ、１．、 ＰＮＡＳ、
８１゜４１４９−４１５３（１９８４） ］。この突然
変異により、独特のＸｂａＩサイトとエンベロープグリ
コプロティンの天然の末端シグナルの前１１コドンの位
置に末端シグナルが導入されたく第１図参照）。このリ
ンカ−挿入が存在しても、ｐＨＸＢｃ２親に比べてウィ
ルスＩ製の速度論は変化しなかった。
使用し、非必須配列、例えば３’ ｎｅｔ配列を欠失さ
せ、欠失領域に異種遺伝子に対するＤＮＡセグメントを
挿入して本発明のベクターを作製することができる。こ
の目的のために任意の複製コンピテントＨＩＶプ０ウィ
ルスプラスミドを使用することができるが、例えば、ｐ
ＨＸＢｃ２−Ｘｂａ Ｉと称されるｐＨＸＢｃ２由来の
感染性プロウィルスフ０−ン［Ｆｉｓｈｅｒ、Ａ、Ｇ、
ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１６ 、２６２−２６５（１９８
５）］が使用され得る。前記ｐ ＨＸ Ｂ Ｃ２はエン
ベローブトランスメンブランたんぱく質をコードする遺
伝子の３′末端近くに人工的に導入した１１限酵素開裂
サイトを含む［Ｌｏｂｅｌ、Ｌ、１．、 ＰＮＡＳ、
８１゜４１４９−４１５３（１９８４） ］。この突然
変異により、独特のＸｂａＩサイトとエンベロープグリ
コプロティンの天然の末端シグナルの前１１コドンの位
置に末端シグナルが導入されたく第１図参照）。このリ
ンカ−挿入が存在しても、ｐＨＸＢｃ２親に比べてウィ
ルスＩ製の速度論は変化しなかった。
このプロウィルス中の３′ＬＴＲの始めに対して５′側
に６０ヌクレオチドを設けたＫｐｎＩサイトと独特なＸ
ｂａＩサイトの間の配列を除去すると、変異体プロウィ
ルス（ｐＨＸＢ−Δ３′）が得られた。このプロウィル
スは、３’ ｎｅｔ ｆｊｌＪ始コドン、３’ ｎｅｔ
遺伝子の２２０ヌクレオチドとｅｎｖ遺伝子の３′末端
を包含する２８０ヌクレオチドの欠失を含む。標準の技
術を用いて当業者は容易にこれと同等の変異体プロウィ
ルスを構築し得る。典型的には、各種配列を欠失および
／又は挿入すべく公知のυ１限酵素サイトを使用する。
に６０ヌクレオチドを設けたＫｐｎＩサイトと独特なＸ
ｂａＩサイトの間の配列を除去すると、変異体プロウィ
ルス（ｐＨＸＢ−Δ３′）が得られた。このプロウィル
スは、３’ ｎｅｔ ｆｊｌＪ始コドン、３’ ｎｅｔ
遺伝子の２２０ヌクレオチドとｅｎｖ遺伝子の３′末端
を包含する２８０ヌクレオチドの欠失を含む。標準の技
術を用いて当業者は容易にこれと同等の変異体プロウィ
ルスを構築し得る。典型的には、各種配列を欠失および
／又は挿入すべく公知のυ１限酵素サイトを使用する。
３’ ｎｅｔコード配列はにｐｎ Ｉサイトを越えて３
′方向に伸長しているが、これらの配列を除去しないほ
うが好ましい。なぜならば、別のヌクレオチドを除去す
ると３′ＬＴＲが崩壊される可能性があるからである。
′方向に伸長しているが、これらの配列を除去しないほ
うが好ましい。なぜならば、別のヌクレオチドを除去す
ると３′ＬＴＲが崩壊される可能性があるからである。
その後、機能性産物を発現させるべく十分な数の所望異
種遺伝子のヌクレオチドに対応する異種遺伝子セグメン
トをＨＩＶセグメントに挿入する。
種遺伝子のヌクレオチドに対応する異種遺伝子セグメン
トをＨＩＶセグメントに挿入する。
このセグメントは好ましくは開始および終止シグナルと
所望遺伝子に対するヌクレオチド配列を含む。好ましく
は、異種遺伝子セグメントは約１２００ヌクレオチド以
下、より好ましくは約１０００ヌクレオチド以下、更に
好ましくは約８００ヌクレオチド以下である。
所望遺伝子に対するヌクレオチド配列を含む。好ましく
は、異種遺伝子セグメントは約１２００ヌクレオチド以
下、より好ましくは約１０００ヌクレオチド以下、更に
好ましくは約８００ヌクレオチド以下である。
好ましくは、マーカーとして使用され得る異種遺伝子を
使用する。例えば、ＣＡＴ遺伝子は約８００ヌクレオチ
ド未満の遺伝子に対応する。この遺伝子に対する全体の
コード配列は１５０ヌクレオチド長さ領域内に位置する
。更に、この酵素活性に対する単純な感受性アッセイも
存在し［Ｇｏｒ−ｍａｎ、 Ｇ、Ｈ，ら、Ｍｏ１． ＆
Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、 ２．１０４４−１０５１（
１９８２）］ 、ＣＡＴタンパク質を認識する抗血清も
容易に入手し得る［Ｇｏｒｍａｎ、 Ｇ、Ｈ，ら、Ｃｅ
１１４２゜５１９−５２６ （１９８５）］。
使用する。例えば、ＣＡＴ遺伝子は約８００ヌクレオチ
ド未満の遺伝子に対応する。この遺伝子に対する全体の
コード配列は１５０ヌクレオチド長さ領域内に位置する
。更に、この酵素活性に対する単純な感受性アッセイも
存在し［Ｇｏｒ−ｍａｎ、 Ｇ、Ｈ，ら、Ｍｏ１． ＆
Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、 ２．１０４４−１０５１（
１９８２）］ 、ＣＡＴタンパク質を認識する抗血清も
容易に入手し得る［Ｇｏｒｍａｎ、 Ｇ、Ｈ，ら、Ｃｅ
１１４２゜５１９−５２６ （１９８５）］。
ＣＡＴ遺伝子に対応するヌクレオチド配列を含むプロ・
シイルスブラスミドは、標準の技術を用いて制限酵素開
裂サイト間、例えばＸｂａ ＪサイトとＫｐｎ Ｉサイ
６間にヌクレオチド配列を挿入することにより容易に作
製され得る。他のサイト、例えば３’ ｎｅｔ遺伝子の
Ｘｂａ ＩサイトやＸｈｏ Ｉサイトも異種遺伝子セグ
メントの挿入のために使用され得る。
シイルスブラスミドは、標準の技術を用いて制限酵素開
裂サイト間、例えばＸｂａ ＪサイトとＫｐｎ Ｉサイ
６間にヌクレオチド配列を挿入することにより容易に作
製され得る。他のサイト、例えば３’ ｎｅｔ遺伝子の
Ｘｂａ ＩサイトやＸｈｏ Ｉサイトも異種遺伝子セグ
メントの挿入のために使用され得る。
ベクターは標準の技術により所望の細胞を移入するため
に使用される。例えば、リン酸カルシウム共沈降法を用
いてインビトロで細胞を移入し得る。或いは、このベク
ターをインビボで生存細胞を移入するために使用するこ
ともできる。
に使用される。例えば、リン酸カルシウム共沈降法を用
いてインビトロで細胞を移入し得る。或いは、このベク
ターをインビボで生存細胞を移入するために使用するこ
ともできる。
インビトロもしくはインビボで細胞を移入後、標準の技
術を用いてマーカー遺伝子の存在を検出する。例えば、
ベクターがＣＡＴＩＩ伝子を含ヒビ記した場合には、単
にＣＡＴ活性を測定する。この方法により、インビボで
各種組織中でのウィルスの拡大をスクリーニンクするこ
とができる。いずれの組織がＣＡＴ活性を示すかを調べ
ることによりどの程度ウィルスが拡大しているかがわか
る。
術を用いてマーカー遺伝子の存在を検出する。例えば、
ベクターがＣＡＴＩＩ伝子を含ヒビ記した場合には、単
にＣＡＴ活性を測定する。この方法により、インビボで
各種組織中でのウィルスの拡大をスクリーニンクするこ
とができる。いずれの組織がＣＡＴ活性を示すかを調べ
ることによりどの程度ウィルスが拡大しているかがわか
る。
更にＣＡＴ活性を定量することもでき、これにより各種
組織におけるウィルスレベルを決定することができる。
組織におけるウィルスレベルを決定することができる。
インビトロで細胞を移入すべくこのベクトルを使用する
ことにより、薬物を非常に迅速にスクリニングするシス
テムが提供され得る。ＣＡＴのような敏感なマーカーを
用いて、細胞を移入してから約１日後にマーカーの発現
を検出することができる。従って、このベクターを用い
ると、感染した細胞中のウィルスの拡大に影響を及ぼす
薬物およびウィルスの細胞に感染する能力に影響を及ぼ
す薬物を迅速にスクリーンすることができる。
ことにより、薬物を非常に迅速にスクリニングするシス
テムが提供され得る。ＣＡＴのような敏感なマーカーを
用いて、細胞を移入してから約１日後にマーカーの発現
を検出することができる。従って、このベクターを用い
ると、感染した細胞中のウィルスの拡大に影響を及ぼす
薬物およびウィルスの細胞に感染する能力に影響を及ぼ
す薬物を迅速にスクリーンすることができる。
例えば所定の化合物を細胞培養中に添加し、該細胞に本
発明のベクターを移入する。その後、細胞中のマーカー
のレベルを測定してウィルスの拡大を防止する化合物の
有効性を調べることができる。
発明のベクターを移入する。その後、細胞中のマーカー
のレベルを測定してウィルスの拡大を防止する化合物の
有効性を調べることができる。
或いは、細胞に本発明のベクターを移入し、マーカーの
活性レベルを測定し、細胞に所定化合物を添加する。そ
の侵、マーカーの活性を測定して化合物の有効性を調べ
ることもできる。
活性レベルを測定し、細胞に所定化合物を添加する。そ
の侵、マーカーの活性を測定して化合物の有効性を調べ
ることもできる。
マーカーの活性レベルを測定することにより、ウィルス
に対する所定化合物の有効性を調べるだけでなく、該化
合物の有効性の度合も調べることができる。このテスト
物質のテストと同時に又はそのすぐ後に対照物質もテス
トする。
に対する所定化合物の有効性を調べるだけでなく、該化
合物の有効性の度合も調べることができる。このテスト
物質のテストと同時に又はそのすぐ後に対照物質もテス
トする。
インごトロでウィルスに対する効果が示された化合物を
標準の技術を用いて上記したインビボ系の１つに投与し
て、インビボにおける化合物の有効性をテストすること
ができる。
標準の技術を用いて上記したインビボ系の１つに投与し
て、インビボにおける化合物の有効性をテストすること
ができる。
以下、実施例に基づいて本発明を更に説明する。
これらの実施例は本発明の理解を助けるものとして提示
したのであって、本発明を限定するつもりはない。
したのであって、本発明を限定するつもりはない。
１−一厘一一例
３１６ 、２６２−２６５ （１９８５）に記載のよ
うに、ＨＩＶｊロウィルス性（ｐｒｏｖｉｒａｌ）クロ
ーンｐＨＸＢｃ２を使用した。ジャーカット（Ｊｕｒｋ
ａｔ ）セルラインは、コックスチルホースト研（ｔｈ
ｅ ｔａｂ ｏｆ ＣｏｘｒｅｒｈｏｒｓＢから提供さ
れたＴ４＋ヒト悪性Ｔ−リンパ芽球（ｌｙａ＋ｐｈｏｂ
ｌａｓｔｉｃ ）ラインである。細胞は、１０％のウシ
胎児血清、グルタミン、ペニシリン（１０００／ＭＬ）
及びストレプトマイシン（１００埒／ｒｔｒｆｌ’）で
補われたＲＰＭＩ １６４０培地中、二酸化炭素培養
鼎中で３７℃で維持した。０８１６６細胞は、５ａｌａ
ｈｕｄｄｉｎ Ｓ、Ｚ、らのＶｉｒｏｌｏｇｙ、 １２
９ 、５１−６４に記載のように、Ｔ４マーカーを高レ
ベルで発現すべ るＨＴＬＶ−１形質転換ヒトリンパ球ラインである。こ
の細胞は匪タンパク質以外にＨＴＬＶ−１の公知生成物
を発現しない。ｍ胞はジャーカットラインと同じ条件Ｆ
で維持した。ヒト頚部癌ラインであるＨｅＬａ細胞は、
培地として１０％のウシ胎児血清を加えたドウルベツコ
の変形イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｏｓ Ｍｏｄｉ
ｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ Ｍｅｄｉｕｍ、０ＮＥ）を用
いる以外は同様の条件下で維持した。
うに、ＨＩＶｊロウィルス性（ｐｒｏｖｉｒａｌ）クロ
ーンｐＨＸＢｃ２を使用した。ジャーカット（Ｊｕｒｋ
ａｔ ）セルラインは、コックスチルホースト研（ｔｈ
ｅ ｔａｂ ｏｆ ＣｏｘｒｅｒｈｏｒｓＢから提供さ
れたＴ４＋ヒト悪性Ｔ−リンパ芽球（ｌｙａ＋ｐｈｏｂ
ｌａｓｔｉｃ ）ラインである。細胞は、１０％のウシ
胎児血清、グルタミン、ペニシリン（１０００／ＭＬ）
及びストレプトマイシン（１００埒／ｒｔｒｆｌ’）で
補われたＲＰＭＩ １６４０培地中、二酸化炭素培養
鼎中で３７℃で維持した。０８１６６細胞は、５ａｌａ
ｈｕｄｄｉｎ Ｓ、Ｚ、らのＶｉｒｏｌｏｇｙ、 １２
９ 、５１−６４に記載のように、Ｔ４マーカーを高レ
ベルで発現すべ るＨＴＬＶ−１形質転換ヒトリンパ球ラインである。こ
の細胞は匪タンパク質以外にＨＴＬＶ−１の公知生成物
を発現しない。ｍ胞はジャーカットラインと同じ条件Ｆ
で維持した。ヒト頚部癌ラインであるＨｅＬａ細胞は、
培地として１０％のウシ胎児血清を加えたドウルベツコ
の変形イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｏｓ Ｍｏｄｉ
ｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ Ｍｅｄｉｕｍ、０ＮＥ）を用
いる以外は同様の条件下で維持した。
−ゝスフエ ２ヨ
ジャーカット細胞を１１００Ｏｒｐで５分間ベレット化
し、無血＊ＲＰＭ １培地で一回洗浄し、その後１０７
細胞／ｄの密度で新鮮なＲＰＭＩ培地中に懸濁した
。次いで１ｍの細胞をトランスフェクション毎に、２ｍ
の無血清ＲＰＭ１と５４／ｄの一髪 ｐＨ７，３１Ｍ）リスーＣＩ中のＤＥＡＥデキストラン
のストック溶液１５０λとの中のプラスミドＤＮＡをす
でに含有しているチューブに加えた。
し、無血＊ＲＰＭ １培地で一回洗浄し、その後１０７
細胞／ｄの密度で新鮮なＲＰＭＩ培地中に懸濁した
。次いで１ｍの細胞をトランスフェクション毎に、２ｍ
の無血清ＲＰＭ１と５４／ｄの一髪 ｐＨ７，３１Ｍ）リスーＣＩ中のＤＥＡＥデキストラン
のストック溶液１５０λとの中のプラスミドＤＮＡをす
でに含有しているチューブに加えた。
チューブをその後時折撹拌しながら３７℃で１時間培養
した。次いで細胞をペレット化し、１０ｍの無血清ＲＰ
ＭＩで１回洗浄し、１５ｄのＲＰＭｌと１５％のウシ胎
児血清との中に再懸濁した。すべての細胞について、実
験中−貫して、引き続き毎日完全に培地交換を行なった
。
した。次いで細胞をペレット化し、１０ｍの無血清ＲＰ
ＭＩで１回洗浄し、１５ｄのＲＰＭｌと１５％のウシ胎
児血清との中に再懸濁した。すべての細胞について、実
験中−貫して、引き続き毎日完全に培地交換を行なった
。
トランスフェクションの前日に、ＨｅＬａ細胞を１０
ｌ［胞／１００ｍプレートの密度で植え付けた。
ｌ［胞／１００ｍプレートの密度で植え付けた。
トランスフェクシ］ンミックスは撹拌で変形を加えた１
−のｏｅｐｅｓ トランスフェクションバッファーとＯ
，１ｌａｄ！の１．２５塩化カルシウムとの中にＤＮＡ
を含有していた。トランスフェクシミンミックスは室温
′ｃ３０分間培養し、次いで）（ｅ Ｌ ａ細胞の培地
に滴下した。
−のｏｅｐｅｓ トランスフェクションバッファーとＯ
，１ｌａｄ！の１．２５塩化カルシウムとの中にＤＮＡ
を含有していた。トランスフェクシミンミックスは室温
′ｃ３０分間培養し、次いで）（ｅ Ｌ ａ細胞の培地
に滴下した。
その後、細胞を２４時間培養した。次いで培地を除去し
、細胞を７ａｅの無血清培地で一回洗浄した。
、細胞を７ａｅの無血清培地で一回洗浄した。
その後、２ｍの１０％ＤＭＳＯで処理することにょ一シ
リ、細胞にショクを与えた。１０分侵、ＤＭＳＯを４８
時間後、アッセイのために細胞を採取した。
時間後、アッセイのために細胞を採取した。
ｍんエヱヱ上イ
細胞を取り出しく ５ｐｕｎ ｄｏｕｎＬリン酸バッフ
ァー塩溶液（Ｐｕｓ）で−・回洗浄し、ｐＨ７，５の少
量の２００１Ｍ トリス中で３回凍結／解凍を繰り返し
た。分解物（１ｙｓａｔｅｓ）を次いで、ソドロスキー
（Ｓｏｄｒｏｓｋｉ） 、 Ｊ、Ｇ、らのサイエンス（
ｓｃｔｅｎｃｅ）誌２２５３８１−３８５ （１９８
４） ＧＣ記載（７）につ１．：、１４ｃｍクロラムフ
ェニコールとアセチルＣｏＡとを含む標準アッセイミッ
クス中ｒｃＡＴ活性を分析した。
ァー塩溶液（Ｐｕｓ）で−・回洗浄し、ｐＨ７，５の少
量の２００１Ｍ トリス中で３回凍結／解凍を繰り返し
た。分解物（１ｙｓａｔｅｓ）を次いで、ソドロスキー
（Ｓｏｄｒｏｓｋｉ） 、 Ｊ、Ｇ、らのサイエンス（
ｓｃｔｅｎｃｅ）誌２２５３８１−３８５ （１９８
４） ＧＣ記載（７）につ１．：、１４ｃｍクロラムフ
ェニコールとアセチルＣｏＡとを含む標準アッセイミッ
クス中ｒｃＡＴ活性を分析した。
プレートから切り出したスポットの薄層り０マドグラフ
イー及び液体シンチレーシ１ンカウンティングによって
、クロラムフェニコールのアセチル体へのパーセント変
換率を測定した。
イー及び液体シンチレーシ１ンカウンティングによって
、クロラムフェニコールのアセチル体へのパーセント変
換率を測定した。
゛（ツ
≧５
各々アッセイ毎に、各サンプルから１ｄの培地を採取し
、１ｇあたり１５０００回転で１時間遠心分離しピリオ
ンをペレット化した。ベレットを１０成のｐＨ７，５の
５０１１ＭトリスＨＣｊ！、１膳Ｍジチオトレイトール
、０．２５Ｍ ＫＣＩ、及び２０％グリセリン中に再
懸濁した。Ｒｈｏ Ｈ，１４，ら（１）Ｌ匹ｎＬ、
１１２゜３５５−３６０（１９８１）に記載のように、
オリゴ（ｄｔ）−ポリ（Δ）テンプレートプライマーと
マグネシウムコファクターとを用いて５０λ反応ミック
ス中でＲＴ活性をアッセイした。
、１ｇあたり１５０００回転で１時間遠心分離しピリオ
ンをペレット化した。ベレットを１０成のｐＨ７，５の
５０１１ＭトリスＨＣｊ！、１膳Ｍジチオトレイトール
、０．２５Ｍ ＫＣＩ、及び２０％グリセリン中に再
懸濁した。Ｒｈｏ Ｈ，１４，ら（１）Ｌ匹ｎＬ、
１１２゜３５５−３６０（１９８１）に記載のように、
オリゴ（ｄｔ）−ポリ（Δ）テンプレートプライマーと
マグネシウムコファクターとを用いて５０λ反応ミック
ス中でＲＴ活性をアッセイした。
工
Ｈ矛ｖ ２４アツセイ
各々のウェルから１ｄの培地を採取し、１ｇあたり１５
０００回転で１時間遠心分離しピリオンをペレット化し
た。ペレットを０．５％トリトンＸ−１００を含む１０
０成のアッセイバッファー中に再懸濁し、製造者の指示
に従って市販の調製ＨＩＶｐ２４ラジオイムノアッセイ
キット（Ｌｅｅ、 Ｔ、 Ｈ，ら、Ｐｒｏ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳ＾、 ８１．３８５６−３８
６０（１９８４））を用いてアッセイした。キットに供
給されたスタンダードを用いて、サンプル中のタンパク
質レベルの定量を行なった。
０００回転で１時間遠心分離しピリオンをペレット化し
た。ペレットを０．５％トリトンＸ−１００を含む１０
０成のアッセイバッファー中に再懸濁し、製造者の指示
に従って市販の調製ＨＩＶｐ２４ラジオイムノアッセイ
キット（Ｌｅｅ、 Ｔ、 Ｈ，ら、Ｐｒｏ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳ＾、 ８１．３８５６−３８
６０（１９８４））を用いてアッセイした。キットに供
給されたスタンダードを用いて、サンプル中のタンパク
質レベルの定量を行なった。
澱（ｉｍｍｕｎｏｐｒｃｃｉｐｉｔａＮｏｎ）細胞を取
り出し、ＰＢＳで一回洗い、５０μｃ＋７−の３５ｓ−
システィンを加えた１０％ウシ胎児血清及び２．５蛇の
無システィンのＲＰＭｌ中に再懸濁した。細胞を一晩で
ラベルしたのち、採取し、ＰＢＳで一回洗い、１％トリ
トンｘ−１００，１％デオキシコール酸ナトリウム及び
０．１％ＳＤＳを含有する０、 ５ｍｌ！の０．０５Ｍ
トリス、 ＨＣｌ２． １１＋＋７．０と０．１５Ｍ
ＮａＣｊ中で溶解（１ｙｓｅｄ）した。
り出し、ＰＢＳで一回洗い、５０μｃ＋７−の３５ｓ−
システィンを加えた１０％ウシ胎児血清及び２．５蛇の
無システィンのＲＰＭｌ中に再懸濁した。細胞を一晩で
ラベルしたのち、採取し、ＰＢＳで一回洗い、１％トリ
トンｘ−１００，１％デオキシコール酸ナトリウム及び
０．１％ＳＤＳを含有する０、 ５ｍｌ！の０．０５Ｍ
トリス、 ＨＣｌ２． １１＋＋７．０と０．１５Ｍ
ＮａＣｊ中で溶解（１ｙｓｅｄ）した。
ＡＩＤＳ患者抗血清を用いた免疫沈澱とポリアクリルア
ミドゲル電気泳動とを、Ｔ、 Ｈ，Ｌｅｅら（ＰＮＡＳ
Ｕ、上記と同じ）の記載に従って行った。
ミドゲル電気泳動とを、Ｔ、 Ｈ，Ｌｅｅら（ＰＮＡＳ
Ｕ、上記と同じ）の記載に従って行った。
ふ欠久二立】１
ｐＨＸＢｃ ２ ［Ａ、Ｇ、 Ｆｉｓｈｅｒら、 Ｎａ
ｔｕｒｅ ３１６ 。
ｔｕｒｅ ３１６ 。
上記と同じ（１９８５）］から誘導した非感染性プロウ
ィルスクー［１ンであるｐＨＸＢｃ ２−ＸｂａＩプラ
スミドを使用した。ｐＨＸＢｃ ２はエンベロープトラ
ンスメンブランタンタンパク質をコードする遺伝子の３
′末端近傍に人為的に導入した制限酵素開裂部位を含ん
テイル［Ｌ、１． Ｌｏｂｅｌ、 ＰＮＡＳ ８１：
４１４９−４１５３ ］。
ィルスクー［１ンであるｐＨＸＢｃ ２−ＸｂａＩプラ
スミドを使用した。ｐＨＸＢｃ ２はエンベロープトラ
ンスメンブランタンタンパク質をコードする遺伝子の３
′末端近傍に人為的に導入した制限酵素開裂部位を含ん
テイル［Ｌ、１． Ｌｏｂｅｌ、 ＰＮＡＳ ８１：
４１４９−４１５３ ］。
この突然変異により、エンベロープ糖タンパク質の天然
終止シグナル前部の１７コドン位に終止シグナルと唯一
のＸｂａＩ部位とを導入したく第１図参照）。このよう
なリンカ−挿入物が存在しても、ｐＨＸＢｃ ２親プラ
スミドと比較して、ウィルスの複製速度は変化しなかっ
た。
終止シグナル前部の１７コドン位に終止シグナルと唯一
のＸｂａＩ部位とを導入したく第１図参照）。このよう
なリンカ−挿入物が存在しても、ｐＨＸＢｃ ２親プラ
スミドと比較して、ウィルスの複製速度は変化しなかっ
た。
次に、このブＯウィルス内の、唯一のＸｂａＩ部位と３
′ＬＴＲの始めの部分に６０ヌクレオチド５゛を配置さ
せたＫｐｎＩ部位との間の配列を除去してプロウィルス
突然変異体（ｐｌ（Ｘ Ｂ−Δ３゛）とした。
′ＬＴＲの始めの部分に６０ヌクレオチド５゛を配置さ
せたＫｐｎＩ部位との間の配列を除去してプロウィルス
突然変異体（ｐｌ（Ｘ Ｂ−Δ３゛）とした。
ｐＨＸ［３−Δ３′は並立遺伝子の３°末端、３°凹Ｌ
１始コドン及び３°ｎｅｆ ３１７伝子の２２０ヌクレ
オチドを含有する２８０ヌクレオチドの欠失を含む。３
°ｎｅｔをコードする配列はＫｐｎＩ部位を越して３゛
方向に伸長しているけれども、ヌクレオチドをさらに除
去することは３′ＬＴＲを妨害するために好ましくない
。
１始コドン及び３°ｎｅｆ ３１７伝子の２２０ヌクレ
オチドを含有する２８０ヌクレオチドの欠失を含む。３
°ｎｅｔをコードする配列はＫｐｎＩ部位を越して３゛
方向に伸長しているけれども、ヌクレオチドをさらに除
去することは３′ＬＴＲを妨害するために好ましくない
。
次に、異種遺伝子セグメントを挿入した。このセグメン
トは、好ましくは、所望遺伝子のヌクレオチド配列と開
始及び終止シグナルとを含んでいる。第１図に示すよう
に、プラスミドｏ Ｂ Ｒ３２２から誘導した２つのＤ
ＮＡセグメントを、欠失セグメントの位置に挿入してプ
ラスミドｐＨＸＢ−Δ３°−０，５及びｐＨＸＢ−Δ３
°−１，２を作製した。
トは、好ましくは、所望遺伝子のヌクレオチド配列と開
始及び終止シグナルとを含んでいる。第１図に示すよう
に、プラスミドｏ Ｂ Ｒ３２２から誘導した２つのＤ
ＮＡセグメントを、欠失セグメントの位置に挿入してプ
ラスミドｐＨＸＢ−Δ３°−０，５及びｐＨＸＢ−Δ３
°−１，２を作製した。
ｅｎｖ遺伝子の３゛末端への１２塩基対ＸｂａＩリンカ
−挿入物と３°担１−遺伝子内に位置するＫｐｎＩ部位
との間の領域を欠失することによりｐＨＸＢ−Δ３゜を
構築した。１）ＨＸＢ−Δ３°−０，５及Ｕ ｐ ＨＸ
ＢΔ３°−１，２はｐＨＸ Ｂ−Δ３°中の欠失領域
に挿入されたｐＢＲＤＮＡセグメントを含む。ｐＨＸＢ
−Δ３°−０，５に挿入したセグメントは、プグメント
から誘導された。
−挿入物と３°担１−遺伝子内に位置するＫｐｎＩ部位
との間の領域を欠失することによりｐＨＸＢ−Δ３゜を
構築した。１）ＨＸＢ−Δ３°−０，５及Ｕ ｐ ＨＸ
ＢΔ３°−１，２はｐＨＸ Ｂ−Δ３°中の欠失領域
に挿入されたｐＢＲＤＮＡセグメントを含む。ｐＨＸＢ
−Δ３°−０，５に挿入したセグメントは、プグメント
から誘導された。
これらのプロウィルス性クローンは次いで、ジャーカッ
ト細胞にトランスフェクションし、上記の方法を用いＵ
ＨＩＶ感染（１ｎｆｅｃｔｉｏｎ）（７）徴候ヲｆｆ１
日モニターした。チエツクしたパラメーターは、培養上
清の転写酵素の活性細胞数及びシンクチア（５ｙｎｃｔ
ｉａ）の生成である。表１を参照されたい。
ト細胞にトランスフェクションし、上記の方法を用いＵ
ＨＩＶ感染（１ｎｆｅｃｔｉｏｎ）（７）徴候ヲｆｆ１
日モニターした。チエツクしたパラメーターは、培養上
清の転写酵素の活性細胞数及びシンクチア（５ｙｎｃｔ
ｉａ）の生成である。表１を参照されたい。
上記のようにＯｎＶと３′ｎｅｆシーケンスの２８０ヌ
クレオチドの削除を含む、ｐＨＸＢｃ２−Ｘｂａ工によ
って上述のようにトランスフェクションされた細胞は野
生型プロウィルスによって生成されると同様に複製した
。さらに４１５ヌクレオチドの挿入を含み全体として
１９０ヌクレオチドが増加したｐ ＨＸ ［３−Δ３’
−０，５でトランスフェクションされた細胞もまた、野
生型と同様に複製されたウィルスを生成した。１．１７
キロベースの挿入物を含み全体として約８９０塩基対が
増加したｐＨＸＢΔ３’ −１，２でトランスフェクシ
ョンされた細胞は、特に初期の複製においてより多くウ
ィルスを生成した。このプラスミドでのトランスフェク
ションにより、初期においてごく少数のシンクチアが出
現し、また逆転写酵素の活性は極めて低いレベルとなる
。トランスフェクション後のかなりあとになって（１０
−１２日）、生きた細胞の数の減少と共に、ｐＨＸＢ−
Δ３°−゛１□２でトランスフェクションした培地中で
シンクチアの数の増加及び逆転写酵素の活性の増大が認
められた。
クレオチドの削除を含む、ｐＨＸＢｃ２−Ｘｂａ工によ
って上述のようにトランスフェクションされた細胞は野
生型プロウィルスによって生成されると同様に複製した
。さらに４１５ヌクレオチドの挿入を含み全体として
１９０ヌクレオチドが増加したｐ ＨＸ ［３−Δ３’
−０，５でトランスフェクションされた細胞もまた、野
生型と同様に複製されたウィルスを生成した。１．１７
キロベースの挿入物を含み全体として約８９０塩基対が
増加したｐＨＸＢΔ３’ −１，２でトランスフェクシ
ョンされた細胞は、特に初期の複製においてより多くウ
ィルスを生成した。このプラスミドでのトランスフェク
ションにより、初期においてごく少数のシンクチアが出
現し、また逆転写酵素の活性は極めて低いレベルとなる
。トランスフェクション後のかなりあとになって（１０
−１２日）、生きた細胞の数の減少と共に、ｐＨＸＢ−
Δ３°−゛１□２でトランスフェクションした培地中で
シンクチアの数の増加及び逆転写酵素の活性の増大が認
められた。
この時点でのｏＨＸＢ−Δ３°−１，２でトランフェク
ションした培地から採取した濾過上清は、新鮮な非感染
ジャーカット細胞に加えた際、感染の新しいサイクルを
開始できないことが判った。
ションした培地から採取した濾過上清は、新鮮な非感染
ジャーカット細胞に加えた際、感染の新しいサイクルを
開始できないことが判った。
野生型ｐＨＸＢｃ ２、ｐＨＸＢ−Δ３°アルイハｐＨ
ＸＢ−Δ３′−０．５シラスミドのいずれかでトランス
フェクションした培地からの１０００〜２ＱＯＯ１１位
の逆転写酵素活性を含有づる上清は、新鮮なジャーカッ
ト細胞中で感染の新ラウンドを開始することができる。
ＸＢ−Δ３′−０．５シラスミドのいずれかでトランス
フェクションした培地からの１０００〜２ＱＯＯ１１位
の逆転写酵素活性を含有づる上清は、新鮮なジャーカッ
ト細胞中で感染の新ラウンドを開始することができる。
次いで、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ（ｃＡＴ）に対する遺伝子を用いて、ベクターを構
築した。この遺伝子は熟練者にとって容易に入手しうる
ちのである。この遺伝子の完全にコーディングシーケン
スは７５０ヌクレオチド長の領域内に位置している。さ
らに、その酵素活性をアッセイする簡便で粘度の高い方
法が知られており（Ｇｏｒｍａｎ、 Ｃ，Ｈ，ら、Ｈｏ
１．ａｎｄ Ｃｅ１１．ＢＩ０２ 、１０４４−１０５
１（１９８２））、またＣＡＴタンパク質を認識する抗
血清（ａｎｔｉｓｃｒａ）も入手しうる（Ｇｏｒｍａｎ
、 Ｃ，Ｈ，ら、収旦、 ４２．５１９−５２６ （
１９８５））。
ーゼ（ｃＡＴ）に対する遺伝子を用いて、ベクターを構
築した。この遺伝子は熟練者にとって容易に入手しうる
ちのである。この遺伝子の完全にコーディングシーケン
スは７５０ヌクレオチド長の領域内に位置している。さ
らに、その酵素活性をアッセイする簡便で粘度の高い方
法が知られており（Ｇｏｒｍａｎ、 Ｃ，Ｈ，ら、Ｈｏ
１．ａｎｄ Ｃｅ１１．ＢＩ０２ 、１０４４−１０５
１（１９８２））、またＣＡＴタンパク質を認識する抗
血清（ａｎｔｉｓｃｒａ）も入手しうる（Ｇｏｒｍａｎ
、 Ｃ，Ｈ，ら、収旦、 ４２．５１９−５２６ （
１９８５））。
ＣＡＴ遺伝子をコードするシーケンスを付加した２つの
ベクターを調製した。ＣＡＴ遺伝子を完全にコードする
シーケンス並びに転写の開始及び停止シグナルを含む約
８００ヌクレオチド長のＤＮＡセグメントを各々のプロ
ウィルスに挿入した。ｐＨＸＢ −ＣＡＴｌ に対し／
Ｔ、ＣＡＴｍ仏子を、削除したプロウィルスｐＨＸＢ−
Δ３゛において除去したシーケンスの部分のＸｂａ Ｉ
とＫｐｎ １部位との間に挿入した（図１参照）。ｐＨ
ＸＢ−双方の構築において、ＣＡＴ遺伝子は３°弘タン
パク買の生成に用いられる天然のスプライスアクセプタ
ーから下流側に位置しているＢｕｅｓ；ｎｇ。
ベクターを調製した。ＣＡＴ遺伝子を完全にコードする
シーケンス並びに転写の開始及び停止シグナルを含む約
８００ヌクレオチド長のＤＮＡセグメントを各々のプロ
ウィルスに挿入した。ｐＨＸＢ −ＣＡＴｌ に対し／
Ｔ、ＣＡＴｍ仏子を、削除したプロウィルスｐＨＸＢ−
Δ３゛において除去したシーケンスの部分のＸｂａ Ｉ
とＫｐｎ １部位との間に挿入した（図１参照）。ｐＨ
ＸＢ−双方の構築において、ＣＡＴ遺伝子は３°弘タン
パク買の生成に用いられる天然のスプライスアクセプタ
ーから下流側に位置しているＢｕｅｓ；ｎｇ。
Ｈ１＾、ら、ネイチｔｙ＋、丑、 ４５０−４５８
（１９８５））。
（１９８５））。
プラスタｔ’ １）ＨＸＢ −ＣＡＴ １ ハ野生型ｐ
ＨｘＢｃ ２プロウイルスク［］−ンに対して全体とし
て５７ＯｂＤサイズが増加しており、一方ＤＨＸＢＣＡ
Ｔ２よりは１１０ｂｐ小さい。この２つのベクターを、
上記のトランスフェクション法によりジャーカッし・細
胞にトランスフ１クシコンし、その後ＨＩＶ感染の徴候
を毎日モニターした。
ＨｘＢｃ ２プロウイルスク［］−ンに対して全体とし
て５７ＯｂＤサイズが増加しており、一方ＤＨＸＢＣＡ
Ｔ２よりは１１０ｂｐ小さい。この２つのベクターを、
上記のトランスフェクション法によりジャーカッし・細
胞にトランスフ１クシコンし、その後ＨＩＶ感染の徴候
を毎日モニターした。
第２図は、ｐＨＸＢ −ＣΔＴ１ベクターにより産生さ
れたウィルスが野生型ウィルスと全く同様に複製したこ
とを示している。
れたウィルスが野生型ウィルスと全く同様に複製したこ
とを示している。
Ｊｕｒｋａｔｌ［ｌ胞を、０日日に、１０埒以上のブＯ
ウィルスク［ｌ−ンの１つを用いてトランスフエクシヨ
ンした。トランスフェクション後、該細胞のウィルス活
性信号を毎日モニターした。充分量の細胞がサンプリン
グ時に確実に得ることができるように、各プラスミドを
用いて培養物を二重にトランスフェクションした。細胞
上の培養液を毎日交換し、４日目に各培養物から細胞を
１／２量取り出し、ランスフエクション；０−ｐＨＸＢ
−ＣＡＴ２：Δ−ｐＨＸＢ−ＣＡＴ１ ：■−ｐＨＸ
Ｂ−Δ３：及びＸ −ＤＨＸＢＣ２を意味する。
ウィルスク［ｌ−ンの１つを用いてトランスフエクシヨ
ンした。トランスフェクション後、該細胞のウィルス活
性信号を毎日モニターした。充分量の細胞がサンプリン
グ時に確実に得ることができるように、各プラスミドを
用いて培養物を二重にトランスフェクションした。細胞
上の培養液を毎日交換し、４日目に各培養物から細胞を
１／２量取り出し、ランスフエクション；０−ｐＨＸＢ
−ＣＡＴ２：Δ−ｐＨＸＢ−ＣＡＴ１ ：■−ｐＨＸ
Ｂ−Δ３：及びＸ −ＤＨＸＢＣ２を意味する。
％＞ν図は逆転写酵素活性を示し、但し、記号は上記の
意味を有する。第２Ｃ図はタンパク質の免疫沈降を示し
ている。トランスフェクション後２臼目、５日目及び９
日目に、各培養物から５ｄのアリコートを採取し、標準
法により一晩３５Ｓ−システィンで標識した。次に、サ
ンプルを採集し、洗剤（ｄｅｔｅｒｇｃｎｔ）で溶解し
、標準法を使用してＡＩＤＳ患者抗血清で免疫沈降した
。レーンＡは一〇〇にトランスフェクションを、レーン
ＢはｐＨＸＢ −ＣＡＴ２を、レーンＣはｐＨＸＢ −
ＣＡＴｌを、レーンＤは１）ＨＸＢ −ｖ３°を、及び
レーンＥはＤＨＸＢＣ２を示す。
意味を有する。第２Ｃ図はタンパク質の免疫沈降を示し
ている。トランスフェクション後２臼目、５日目及び９
日目に、各培養物から５ｄのアリコートを採取し、標準
法により一晩３５Ｓ−システィンで標識した。次に、サ
ンプルを採集し、洗剤（ｄｅｔｅｒｇｃｎｔ）で溶解し
、標準法を使用してＡＩＤＳ患者抗血清で免疫沈降した
。レーンＡは一〇〇にトランスフェクションを、レーン
ＢはｐＨＸＢ −ＣＡＴ２を、レーンＣはｐＨＸＢ −
ＣＡＴｌを、レーンＤは１）ＨＸＢ −ｖ３°を、及び
レーンＥはＤＨＸＢＣ２を示す。
ｐＨＸＢ−ＣＡＴＩでトランスフェクションした細胞中
での感染過程は、測定された全パラメーターから示唆さ
れるように、約２−３日目までｐＨＸＦ３ｃ ２でトラ
ンスフェクシヨンした培養物中での感染過程より遅れる
。しかしながら、ボストートランスフェクシ」ン８−９
活性までに、ｐＨＸＢ −Ｇ△１゛１培養物は高レベル
の逆転写酵素活性と、野生型培養物で認知されたものと
非常に類似の劇的な［ｌ胞変性効果とを獲得した。これ
に対して、ｐＨＸＢ−ＣＡＴ２ｒトランスフェクション
した培養物は、ポストトランスフェクション３８目以降
低レベルの逆転写酵素活性を示し、また意味のあるシン
シチウム形成を示したけれども、感染は通常どおり進行
せず及び、意味のあるシンシチウム効果はポストトラン
スフェクション１０日目までに観察されなかった。さら
に、ｐＨＸＢ−ＣΔＴ２でトランスフェクションした培
養物から１００日目取り出した上清ろ過液は、これを新
鮮なＪｕｒｋａｔ細胞に適用したとき、ウィルス感染の
徴候を生起しなかった。ｐＨＸＢｃ ２．ＤＨＸＢΔ３
゛及びｐＨ−＋ｘｓ−ＣＡＴ１でトランスフェクション
した培養物からの対応上清は全て、新鮮な細胞を用いて
培養するとき、サンプル間のＲＴレベルの差を相殺する
ために最初に希釈するときでさえ、新しい感染サイクル
を開始した（データを示さず）。
での感染過程は、測定された全パラメーターから示唆さ
れるように、約２−３日目までｐＨＸＦ３ｃ ２でトラ
ンスフェクシヨンした培養物中での感染過程より遅れる
。しかしながら、ボストートランスフェクシ」ン８−９
活性までに、ｐＨＸＢ −Ｇ△１゛１培養物は高レベル
の逆転写酵素活性と、野生型培養物で認知されたものと
非常に類似の劇的な［ｌ胞変性効果とを獲得した。これ
に対して、ｐＨＸＢ−ＣＡＴ２ｒトランスフェクション
した培養物は、ポストトランスフェクション３８目以降
低レベルの逆転写酵素活性を示し、また意味のあるシン
シチウム形成を示したけれども、感染は通常どおり進行
せず及び、意味のあるシンシチウム効果はポストトラン
スフェクション１０日目までに観察されなかった。さら
に、ｐＨＸＢ−ＣΔＴ２でトランスフェクションした培
養物から１００日目取り出した上清ろ過液は、これを新
鮮なＪｕｒｋａｔ細胞に適用したとき、ウィルス感染の
徴候を生起しなかった。ｐＨＸＢｃ ２．ＤＨＸＢΔ３
゛及びｐＨ−＋ｘｓ−ＣＡＴ１でトランスフェクション
した培養物からの対応上清は全て、新鮮な細胞を用いて
培養するとき、サンプル間のＲＴレベルの差を相殺する
ために最初に希釈するときでさえ、新しい感染サイクル
を開始した（データを示さず）。
これらの観察は、第２Ｃ図に記載のタンパク質標識実験
結果を密接に反映している。ト１１■タンパク質は、わ
ずかポストトランスフェクション４８時間目に標識化を
開始したときでさえ、野生型構築物又はｐＨＸＢ−Δ３
゛構築物のいずれかを用いてトランスフェクションした
培養物からの標識アリコート中に強くその存在を示して
いる。この特定実験で認知し得る２日目のｐＨＸＢ−Δ
３°及びｐＨＸ［３ｃ ２レ一ン間の小差は再現し得な
かった。
結果を密接に反映している。ト１１■タンパク質は、わ
ずかポストトランスフェクション４８時間目に標識化を
開始したときでさえ、野生型構築物又はｐＨＸＢ−Δ３
゛構築物のいずれかを用いてトランスフェクションした
培養物からの標識アリコート中に強くその存在を示して
いる。この特定実験で認知し得る２日目のｐＨＸＢ−Δ
３°及びｐＨＸ［３ｃ ２レ一ン間の小差は再現し得な
かった。
ウィルス特定タンパク質は、ｐＨＸＢ−ＣＡＴｌ又は１
）ＨＸＦ３−ＣＡＴ２でトランスフェクションしたｌｌ
１ｌ胞由来の２日目の溶解物（ｆｙｓａｔｅ）を表わす
レーンにおいて、弱いながらその存在を示して物中では
さらに強まっており、９日目までにｐＨＸＢ −ＣΔＴ
ル−ンはｐＨＸＢｃ ２及びｐＨＸＢ−Δ３°レーンと
実質的に区別し得なかっ・た。これに対して、ｐトＩＸ
Ｂ−ＣＡ王２でトランスフェクションした培養物からの
５日目の溶解物は、２日目の溶解物とあまり重要な違い
はない。
）ＨＸＦ３−ＣＡＴ２でトランスフェクションしたｌｌ
１ｌ胞由来の２日目の溶解物（ｆｙｓａｔｅ）を表わす
レーンにおいて、弱いながらその存在を示して物中では
さらに強まっており、９日目までにｐＨＸＢ −ＣΔＴ
ル−ンはｐＨＸＢｃ ２及びｐＨＸＢ−Δ３°レーンと
実質的に区別し得なかっ・た。これに対して、ｐトＩＸ
Ｂ−ＣＡ王２でトランスフェクションした培養物からの
５日目の溶解物は、２日目の溶解物とあまり重要な違い
はない。
９日目において初めて、ｐ）−ＩＸＢ−ＣＡＴ２培養物
中のウィルス特定バンドの強度増加を認知することがで
きる。この時点ではまだ、ウィルスタンバク質の検出量
は他のトランスフェクション培養物からの溶解物中で観
察された量よりも十分に低い。
中のウィルス特定バンドの強度増加を認知することがで
きる。この時点ではまだ、ウィルスタンバク質の検出量
は他のトランスフェクション培養物からの溶解物中で観
察された量よりも十分に低い。
挿入ＣΔＴ遺伝子の発現をテストするために、ｐＨＸＢ
−ＣＡＴＩでトランスフェクションしたＪｕｒｋａｔｌ
ｌ胞のアリコートを毎日採取した。これらのサンプルの
ＣＡＴアッセイ結果を第３Ａ及び３Ｂ図に要約して示し
た。培養物から毎日１ｄを採取した。細胞をＰＢＳで１
度洗浄した後、ＣΔＴアッセイ用の２００ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ（ＤＨ７，５） １５０ｔ１１に再懸濁した。
−ＣＡＴＩでトランスフェクションしたＪｕｒｋａｔｌ
ｌ胞のアリコートを毎日採取した。これらのサンプルの
ＣＡＴアッセイ結果を第３Ａ及び３Ｂ図に要約して示し
た。培養物から毎日１ｄを採取した。細胞をＰＢＳで１
度洗浄した後、ＣΔＴアッセイ用の２００ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ（ＤＨ７，５） １５０ｔ１１に再懸濁した。
第３Ａ図はＣＡＴアッセイの実際のオートラジオグラム
であり、実験の１日目〜４日目までの抽出物を用いて得
られた変換を示している。
であり、実験の１日目〜４日目までの抽出物を用いて得
られた変換を示している。
オートラジオグラム中の各スポット対は反応時開５及び
６０分後の変換を示している。ポストトランスフＩクシ
コン３活性以降の培養物からの抽出物は、アッセイの直
線範囲内の変換を維持するために、１０倍又は１００倍
希釈でアッセイされるべきであった。第３Ｂ図は、実験
の全過程にわたって記録したＣＡＴｉｌ活性のレベル変
化を要約して示している。
６０分後の変換を示している。ポストトランスフＩクシ
コン３活性以降の培養物からの抽出物は、アッセイの直
線範囲内の変換を維持するために、１０倍又は１００倍
希釈でアッセイされるべきであった。第３Ｂ図は、実験
の全過程にわたって記録したＣＡＴｉｌ活性のレベル変
化を要約して示している。
グラフ中で使用したスケールは、１Ｘ１０希釈の初１１
１］９ンブル７０ｐ１による１分間当りの１４Ｃ−クロ
ラムフェニコールのパーセント変換である。
１］９ンブル７０ｐ１による１分間当りの１４Ｃ−クロ
ラムフェニコールのパーセント変換である。
ＣＡＴ活性はわずかポストトランスフＬクシ３ン１活性
に容易に検出され得、培養物を通じての感染拡大から分
かるように極めて高レベルに急速に進展した。ポストト
ランスフェクション後期でのＣＡＴ発現レベルのわずか
な減少は、この期間に起こる培養物の生存率の激烈な低
下をおそらく反映していると思われる。
に容易に検出され得、培養物を通じての感染拡大から分
かるように極めて高レベルに急速に進展した。ポストト
ランスフェクション後期でのＣＡＴ発現レベルのわずか
な減少は、この期間に起こる培養物の生存率の激烈な低
下をおそらく反映していると思われる。
ＨＩＶのＯａＯ／ｐｏｔ及びエンベロープタンパク質の
発現では、ｒｅｖ遺伝子産物の存在を必要とすることが
知られている。３°ｎｅ４−遺伝子産物が独立にｒｅｖ
から生成されることを暗示する証拠もある。３°弘産物
のｍＲＮＡはｒｅＶ調節に決定的な公知の正及び負のｃ
ｉｓ作用エレメントを結合する。
発現では、ｒｅｖ遺伝子産物の存在を必要とすることが
知られている。３°ｎｅ４−遺伝子産物が独立にｒｅｖ
から生成されることを暗示する証拠もある。３°弘産物
のｍＲＮＡはｒｅＶ調節に決定的な公知の正及び負のｃ
ｉｓ作用エレメントを結合する。
ｐＨＸＢ−ＣＡＴｌによるＣＡＴＩｙ素の発現がｒｅｙ
ｗ４節下にあるのか否かをテストするために、ウィル
スセグメントの機能性二タンパク質産生能を除去したＢ
ａｌ ｌ−１ｉ部位にフレームシフトを導入Ｌ ／％、
。次に、ｐＨＸＢ −ＣＡＴｌ 及ｆｆｐＨＸＢ／ＢＦ
Ｓ−ＣＡＴ１プラスミドを、上記のトランスフェクショ
ン法により、ｒｅｖ発現発現ラプラスミドｐＩ！１８ｘ
ａ、ｒｔ）の存在又は非存在下１０６個の）ｌ ｃＬ
ａｌＧＩｌｌを含むプレート中に同時トランスフェクシ
ョン＜ ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）Ｌ、、た。
ｗ４節下にあるのか否かをテストするために、ウィル
スセグメントの機能性二タンパク質産生能を除去したＢ
ａｌ ｌ−１ｉ部位にフレームシフトを導入Ｌ ／％、
。次に、ｐＨＸＢ −ＣＡＴｌ 及ｆｆｐＨＸＢ／ＢＦ
Ｓ−ＣＡＴ１プラスミドを、上記のトランスフェクショ
ン法により、ｒｅｖ発現発現ラプラスミドｐＩ！１８ｘ
ａ、ｒｔ）の存在又は非存在下１０６個の）ｌ ｃＬ
ａｌＧＩｌｌを含むプレート中に同時トランスフェクシ
ョン＜ ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）Ｌ、、た。
■４を発現しないｌ−１ｅ ｌ、 Ｉ”ｉ組胞ヲ使用し
て、非感染性ｐＨＸＢＣＡ １’ １ ｙｃ’ｌウィル
スによる１１１１ａの再感染が起こらない才うｒシミご
、。
て、非感染性ｐＨＸＢＣＡ １’ １ ｙｃ’ｌウィル
スによる１１１１ａの再感染が起こらない才うｒシミご
、。
第４図を参照せよ。１０埒の各プロウィルスプラスミド
を８埒のｐＩ［ＩｅＸａｒｔと共に使用した。ポストト
ランスフェクション４８時間目に、細胞をＰＢＳ中で破
砕し、スピンダウンし、ＣＡＴアッセイ用の０．２５Ｍ
Ｔｒｉｓ Ｃｊ（ｐＨ７，５） １５０４に一再懸濁
シタ。
を８埒のｐＩ［ＩｅＸａｒｔと共に使用した。ポストト
ランスフェクション４８時間目に、細胞をＰＢＳ中で破
砕し、スピンダウンし、ＣＡＴアッセイ用の０．２５Ｍ
Ｔｒｉｓ Ｃｊ（ｐＨ７，５） １５０４に一再懸濁
シタ。
オートラジオグラムは、各溶解物１０成を用いて５分く
各スポット対の第ル−ン）及び６０分（各スポット対の
第２レーン）インキｌベーション後に（、） 得られたバセント変換を示す。対照溶解物は、ＣＡＴ遺
伝子が逆方向に挿入されたｐＨＸＢ −ＣＡＴ １ （
ｐＨＸＢ −ＣＡＴ−ａｎｔｉ）と同一（７）別の構築
物のトランスフェクション由来のちのである。
各スポット対の第ル−ン）及び６０分（各スポット対の
第２レーン）インキｌベーション後に（、） 得られたバセント変換を示す。対照溶解物は、ＣＡＴ遺
伝子が逆方向に挿入されたｐＨＸＢ −ＣＡＴ １ （
ｐＨＸＢ −ＣＡＴ−ａｎｔｉ）と同一（７）別の構築
物のトランスフェクション由来のちのである。
第４図に示すように、ｐＨＸＢ／ＢＦＳ −ＣＡＴｌで
トランスフェクションした細胞中のＣＡＴ活性は、ｐＨ
ＸＢ−ＣＡＴｌでトランスフェクションした細胞中で見
られる活性と類似していた。
トランスフェクションした細胞中のＣＡＴ活性は、ｐＨ
ＸＢ−ＣＡＴｌでトランスフェクションした細胞中で見
られる活性と類似していた。
二発現プラスミド即ちｐｌｅｘユ皿でのＨＸＢ／ＨＯｄ
ｅｒｎ Ｃ０ｎＣｅＤｔＳ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅ
ｕｔｉｃ ＣｈａｌｌｅｎｇｅｓＢＦＳ−ＣＡＴｌの同
時トランスフェクションにより、ＣＡＴ活性が約１７４
に減少した。このことが減少するという報告と一致して
いる。従って、ｐＨＸＢ−ＣＡＴｌ中でのＣＡＴ発現ハ
、ＨＩＶｒｅＶタンパク質の存在に非依存的である。
ｅｒｎ Ｃ０ｎＣｅＤｔＳ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅ
ｕｔｉｃ ＣｈａｌｌｅｎｇｅｓＢＦＳ−ＣＡＴｌの同
時トランスフェクションにより、ＣＡＴ活性が約１７４
に減少した。このことが減少するという報告と一致して
いる。従って、ｐＨＸＢ−ＣＡＴｌ中でのＣＡＴ発現ハ
、ＨＩＶｒｅＶタンパク質の存在に非依存的である。
抗ウィルス剤をスクリーニングするためのアッセイをＤ
ＨＸＢ−ＣＡＴ１ベクターを用いて行った。Ｃ８１６６
培養物の二重セットを、ｐＨＸＢｃ ２又はｐＨＸＢ−
ＣＡＴｌのいずれかから誘導した等力価のウィルススト
ックを用いて感染させた。
ＨＸＢ−ＣＡＴ１ベクターを用いて行った。Ｃ８１６６
培養物の二重セットを、ｐＨＸＢｃ ２又はｐＨＸＢ−
ＣＡＴｌのいずれかから誘導した等力価のウィルススト
ックを用いて感染させた。
ＨＩＶ複製を阻害する公知の３種の薬剤、即ちアジドチ
ミジン（Ａ Ｚ Ｔ ） ［Ｈｉｔｓｕｙａ、Ｈ，ら
、胆於８２ ： ７０９６〜７１００（１９８５） ］
、２’、３°−ジデオギシシトシン（ｄ ｄ Ｃ）
［Ｈｉｔｓｕｙａ、Ｈ，ら、ＡＩＤＳ：１）ｌ）、３０
３−３３３ （Ｎｅｗ Ｗｏｒｋ： ）ｌａｒｃｅｌ
Ｄｆ３ｋｋｅｒ）（１９８７）、）又は２°、３゛−ジ
デオキシ−ア汐ノシン（ｄｄＡ）［ｔ４ｉｔｓｕｙａ、
）１．ら、Δｒｏｓ：上記文献］のいずれかを種々濃度
を変えて被感染培養物に添加した。
ミジン（Ａ Ｚ Ｔ ） ［Ｈｉｔｓｕｙａ、Ｈ，ら
、胆於８２ ： ７０９６〜７１００（１９８５） ］
、２’、３°−ジデオギシシトシン（ｄ ｄ Ｃ）
［Ｈｉｔｓｕｙａ、Ｈ，ら、ＡＩＤＳ：１）ｌ）、３０
３−３３３ （Ｎｅｗ Ｗｏｒｋ： ）ｌａｒｃｅｌ
Ｄｆ３ｋｋｅｒ）（１９８７）、）又は２°、３゛−ジ
デオキシ−ア汐ノシン（ｄｄＡ）［ｔ４ｉｔｓｕｙａ、
）１．ら、Δｒｏｓ：上記文献］のいずれかを種々濃度
を変えて被感染培養物に添加した。
対照は該薬剤を含まない培養物とした。第５図に示すよ
うに、至適投与量の異種薬剤の存在中で観察されるウィ
ルスタンパク質発現の著しい減少は、ＣＡＴｊｊ素の測
定レベルの変化と密接に相関する。
うに、至適投与量の異種薬剤の存在中で観察されるウィ
ルスタンパク質発現の著しい減少は、ＣＡＴｊｊ素の測
定レベルの変化と密接に相関する。
０８１６Ｂ細胞を、種々の薬剤濃度で又は薬剤を含有さ
せずに、２Ｘ１０５細胞／ｄ！の密度で２４ウエルプレ
ート（１ｍ／つＳル）に配置した。二重ウェルを各薬剤
濃度に関して準備した。２０００ＲＴユニツトの野生型
ＤＨＸＢｃ ２ｍ導ウィルス又は２０００ＲＴユニツト
のｐＨＸＢ−ＣＡＴＩＸＷウィルスを各ウェルに添加し
た。ウィルスストック中のＲＴ活性を上述のように測定
した。次に、細胞を１週間インキュベーションし、この
間４日目に培養液を一部交換した。７日目に、細胞及び
培養物のアリコートを採取してアッセイした。
せずに、２Ｘ１０５細胞／ｄ！の密度で２４ウエルプレ
ート（１ｍ／つＳル）に配置した。二重ウェルを各薬剤
濃度に関して準備した。２０００ＲＴユニツトの野生型
ＤＨＸＢｃ ２ｍ導ウィルス又は２０００ＲＴユニツト
のｐＨＸＢ−ＣＡＴＩＸＷウィルスを各ウェルに添加し
た。ウィルスストック中のＲＴ活性を上述のように測定
した。次に、細胞を１週間インキュベーションし、この
間４日目に培養液を一部交換した。７日目に、細胞及び
培養物のアリコートを採取してアッセイした。
第５Ａ図はタンパク質免疫沈降を示す。ｐＨＸＢｃ ２
誘導ウイルスで感染させたウェル中の細胞を３５ｓ−シ
スティンで一晩標識した。次に、サンプルを採集し、洗
剤で溶解し、ＡＩＤＳ患者抗血清を用いて免疫沈降した
。
誘導ウイルスで感染させたウェル中の細胞を３５ｓ−シ
スティンで一晩標識した。次に、サンプルを採集し、洗
剤で溶解し、ＡＩＤＳ患者抗血清を用いて免疫沈降した
。
第５Ｂ図はＣＡＴアッセイの結果を示している。
ｐＩ−ＩＸＢ−ＣＡＴ１誘導ウィルスで感染させたウェ
ル中の細胞を洗浄しＴＯ，２５Ｍ Ｔｒｉｓ Ｃｊ！（
ｐｆ−１７，５）８５Ｉｄ中に採集した。このグラフで
使用したスケールは、各抽出物７０成による６０分での
１４Ｃ−り１］ラムフエニコールのパーセント変換を表
わす。
ル中の細胞を洗浄しＴＯ，２５Ｍ Ｔｒｉｓ Ｃｊ！（
ｐｆ−１７，５）８５Ｉｄ中に採集した。このグラフで
使用したスケールは、各抽出物７０成による６０分での
１４Ｃ−り１］ラムフエニコールのパーセント変換を表
わす。
無細胞逆転写醇素活性の測定により決定されるように、
ＤＨＸＢＣ２及びｐＨＸＢ−ＣＡＴ１ウィルス調製物の
等量混合物を用いて実験を繰返した。これらの条件下で
、複製する野生型ウィルスの存在はＤＨＸＢ−ＣＡＴ１
誘導ウィルスによるＣＡＴ酵素の産生を阻害しなかった
。１週間後、ＡＺＴ濃度を増加させて処理した培養物中
のＣＡ Ｔ酵素レベルは、培養物中に存在するウィルス
タンパク質の全量と密接に相関した（データを示さず）
。
ＤＨＸＢＣ２及びｐＨＸＢ−ＣＡＴ１ウィルス調製物の
等量混合物を用いて実験を繰返した。これらの条件下で
、複製する野生型ウィルスの存在はＤＨＸＢ−ＣＡＴ１
誘導ウィルスによるＣＡＴ酵素の産生を阻害しなかった
。１週間後、ＡＺＴ濃度を増加させて処理した培養物中
のＣＡ Ｔ酵素レベルは、培養物中に存在するウィルス
タンパク質の全量と密接に相関した（データを示さず）
。
この結果は、外来遺伝子をＨＩＶベクター中に取込み得
ること並びにウィルス複製及び細胞変性効果に決定的な
機能を妨害せずに外来遺伝子を上首尾に発現１ノ得るこ
とを実証している。主たる制約はサイズであるように思
われる。野生型と比較される７００以上のヌクレオチド
の正味のサイズ増加をもつプロウィルスは、これらのプ
ラスミドで感染させた細胞由来の上清にＴ細胞をさらに しｌ後、首尾よく感染に持込むことができないために、
正常のフルレンゲストＩＩＶは効果的伝達（ｔｒａｎｓ
ｍｉｓｓｉｏｎ）を可能にする最大サイズに明らかに近
接している。この結果はまた、ＨＩＶＣＡＴ１ウィルス
を用いて抗ウイルス剤効果を測定し得ることを示してい
る。このウィルスの使用は抗ウイルス剤活性の迅速！定
量手段を可能にするだろう。
ること並びにウィルス複製及び細胞変性効果に決定的な
機能を妨害せずに外来遺伝子を上首尾に発現１ノ得るこ
とを実証している。主たる制約はサイズであるように思
われる。野生型と比較される７００以上のヌクレオチド
の正味のサイズ増加をもつプロウィルスは、これらのプ
ラスミドで感染させた細胞由来の上清にＴ細胞をさらに しｌ後、首尾よく感染に持込むことができないために、
正常のフルレンゲストＩＩＶは効果的伝達（ｔｒａｎｓ
ｍｉｓｓｉｏｎ）を可能にする最大サイズに明らかに近
接している。この結果はまた、ＨＩＶＣＡＴ１ウィルス
を用いて抗ウイルス剤効果を測定し得ることを示してい
る。このウィルスの使用は抗ウイルス剤活性の迅速！定
量手段を可能にするだろう。
この結果はさらにまた、３°倶■一部位中の遺伝子をｒ
ｅｖ活性の非存在下に発現させ得ることを示している。
ｅｖ活性の非存在下に発現させ得ることを示している。
ｐＨＸＢ−Δ３°中での変異は、アミノ酸をざらに付加
することなく、ｅｎｖ ｍヒビ中に時ならぬオー （ｐｒｅｍａｔｕｒｅ）終結コドンを導入する。結論と
して、１；１ｐ４１エンベロープ糖タンパク質の１７Ｉ
ＮのＣ末端アミノ酸は通常の複製及び培養Ｔ細胞中のＨ
ＩＶの細胞変性効果にとって不必要である。
することなく、ｅｎｖ ｍヒビ中に時ならぬオー （ｐｒｅｍａｔｕｒｅ）終結コドンを導入する。結論と
して、１；１ｐ４１エンベロープ糖タンパク質の１７Ｉ
ＮのＣ末端アミノ酸は通常の複製及び培養Ｔ細胞中のＨ
ＩＶの細胞変性効果にとって不必要である。
前記開示の利益を受ける当業者は、開示の多数の他の使
用及び変形並びに本発明の概念からはずれることなく本
明細書に記載の特定の実ｔｆＭＢ様からの逸脱を為し得
ることは明白であり、本発明は（千 添趙クレームの範囲及び思想によりもっばら限定される
べきものである。
用及び変形並びに本発明の概念からはずれることなく本
明細書に記載の特定の実ｔｆＭＢ様からの逸脱を為し得
ることは明白であり、本発明は（千 添趙クレームの範囲及び思想によりもっばら限定される
べきものである。
第１図はＨＩＶｊロウィルス構築物の図解を示す。図中
、上図は異なるリーディングフレームの位置を示す親ク
ローンｐ）−ＩＸＢｃ ２の概略図であり、下図はゲノ
ムの３゛末端及び種々の異なる調製構築物を示す概略図
である。 第２図は、異種セグメントＣＡＴ遺伝子挿入物としてＣ
ＡＴｍ伝子をヒビする異なるベクターにより産生された
ウィルスの複製速度を示す。第２Ａ図は細胞数を示し、
第２Ｂ図は逆転写酵素活性の測定値を示し、第２Ｃ図は
免疫沈降により判別し得るＣＡＴ活性を示す。 第３図はベクターｐＨＸＢ −ＣΔＴ１を用いてトラン
スフェクションした培養物中のＣＡＴ活性を示す。第３
Ａ図はＣＡＴアッセイのオートラジオグラムであり、第
３Ｂ図は実験の全過程にわたって記録したＣＡＴ酵素レ
ベルの変化を要約して示している。 第４図は、べ’ｙターｐＨＸＢ−ＣＡＴＩ又はｒｅｖ発
現体を含有する若しくは含有しない二欠損変異体ｐＨＸ
Ｂ／ＢＦＳ −ＣＡＴＩのいずれかを用いてトランスフ
ェクションした細胞のオートラジ”オグラムを示す。 第５図は、ｐＨＸＢｃ−２及びｐｌ−ＩＸＢ−ＣＡＴ１
誘導ウィルス、で感染させた細胞中の、ＡＺＴ。 ｄｄＣ又はｄｄＡによるウィルス複製阻害を示す。 第５Δ図は免疫沈降を示し、第５Ｂ図はＣＡＴアッセイ
結果である。
、上図は異なるリーディングフレームの位置を示す親ク
ローンｐ）−ＩＸＢｃ ２の概略図であり、下図はゲノ
ムの３゛末端及び種々の異なる調製構築物を示す概略図
である。 第２図は、異種セグメントＣＡＴ遺伝子挿入物としてＣ
ＡＴｍ伝子をヒビする異なるベクターにより産生された
ウィルスの複製速度を示す。第２Ａ図は細胞数を示し、
第２Ｂ図は逆転写酵素活性の測定値を示し、第２Ｃ図は
免疫沈降により判別し得るＣＡＴ活性を示す。 第３図はベクターｐＨＸＢ −ＣΔＴ１を用いてトラン
スフェクションした培養物中のＣＡＴ活性を示す。第３
Ａ図はＣＡＴアッセイのオートラジオグラムであり、第
３Ｂ図は実験の全過程にわたって記録したＣＡＴ酵素レ
ベルの変化を要約して示している。 第４図は、べ’ｙターｐＨＸＢ−ＣＡＴＩ又はｒｅｖ発
現体を含有する若しくは含有しない二欠損変異体ｐＨＸ
Ｂ／ＢＦＳ −ＣＡＴＩのいずれかを用いてトランスフ
ェクションした細胞のオートラジ”オグラムを示す。 第５図は、ｐＨＸＢｃ−２及びｐｌ−ＩＸＢ−ＣＡＴ１
誘導ウィルス、で感染させた細胞中の、ＡＺＴ。 ｄｄＣ又はｄｄＡによるウィルス複製阻害を示す。 第５Δ図は免疫沈降を示し、第５Ｂ図はＣＡＴアッセイ
結果である。
Claims (14)
- （１）（ａ）ウィルス複製および感染性に必要なＨＩＶ
遺伝子産物を発現させるべくＨＩＶゲノムに対応する十
分な数のヌクレオチド（ＨＩＶセグメント）と （ｂ）機能性たんぱく質を産生すべく異種遺伝子に対応
する十分な数のヌクレオチド（異種遺伝子セグメント）
を含むベクター。 - （２）異種遺伝子セグメントがマーカー遺伝子に対応す
る請求項１に記載のベクター。 - （３）ＨＩＶセグメントがＨＩＶゲノムの３′末端の非
必須ヌクレオチド配列に対応しない請求項２に記載のベ
クター。 - （４）ＨＩＶセグメントがＨＩＶゲノムの３′ｎｅｆ配
列の非必須ヌクレオチド配列に対応しない請求項２に記
載のベクター。 - （５）ＨＩＶセグメントがＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２ゲ
ノムのヌクレオチドに対応する請求項２に記載のベクタ
ー。 - （６）ＨＩＶセグメントがＨＩＶ−１ゲノムのヌクレオ
チドに対応する請求項５に記載のベクター。 - （７）ＨＩＶセグメントが約￥ｅｎｖ￥遺伝子の５１
３′ヌクレオチドに対応しないし、３′ＬＴＲの始めに
対して５′側に６０ヌクレオチドを置いたＫｐｎ Ｉサ
イトまで３′方向に介在ヌクレオチドにも対応しない請
求項６に記載のベクター。 - （８）マーカー遺伝子がクロラムフェニコールアセチル
トランスフェラーゼ遺伝子又は成長ホルモン遺伝子であ
る請求項２に記載のベクター。 - （９）全ベクターのサイズがＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２
ゲノムのサイズに比べて約１キロベース未満である請求
項２に記載のベクター。 - （１０）ベクターの全サイズがＨＩＶゲノムに比べて約
７５０ヌクレオチド塩基以下である請求項２に記載のベ
クター。 - （１１）ベクタ−がＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２ゲノムに
比べて約７００ヌクレオチド塩基以下である請求項２に
記載のベクター。 - （１２）所定のインビボ動物系においてウィルスの拡大
をアッセイする方法であって、 （ａ）所定動物の細胞を感染させるべく該動物に請求項
２に記載のベクターを投与し、 （ｂ）該動物におけるマーカーの存在をスクリーニング
することからなる方法。 - （１３）ＨＩＶウィルスに対して有効な化合物をアッセ
イする方法であつて、 （ａ）細胞系に請求項２に記載のベクターを移入して感
染した培養物を得、 （ｂ）感染した培養物に所定の化合物を添加し、（ｃ）
マーカー遺伝子の存在をスクリーニングして移入した培
養物に対する化合物の効果を調べることからなる方法。 - （１４）ＨＩＶウィルス感染に対する化合物の有効性を
アッセイする方法であって、 （ａ）細胞の培養物に所定の化合物を添加し、（ｂ）ス
テップ（ａ）の細胞培養物に請求項２に記載のベクター
を移入し、 （ｃ）ステップ（ｂ）の細胞中のマーカー遺伝子の存在
をスクリーニングして所定化合物の有効性を調べること
からなる方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US249,918 | 1981-04-01 | ||
| US24991888A | 1988-09-27 | 1988-09-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02211882A true JPH02211882A (ja) | 1990-08-23 |
Family
ID=22945570
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1251693A Pending JPH02211882A (ja) | 1988-09-27 | 1989-09-27 | 複製コンピテントｈｉｖ―ｉプロウィルスと異種遺伝子を含むベクター |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6033902A (ja) |
| EP (1) | EP0361749B1 (ja) |
| JP (1) | JPH02211882A (ja) |
| AT (1) | ATE118247T1 (ja) |
| CA (1) | CA1336075C (ja) |
| DE (1) | DE68921034D1 (ja) |
Families Citing this family (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5716826A (en) * | 1988-03-21 | 1998-02-10 | Chiron Viagene, Inc. | Recombinant retroviruses |
| DE69033975T2 (de) * | 1989-01-23 | 2002-10-02 | Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville | Rekombinanttherapien für Infektionen und hyperproliferative Störungen |
| AU648261B2 (en) * | 1989-08-18 | 1994-04-21 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Recombinant retroviruses delivering vector constructs to target cells |
| US5334498A (en) * | 1992-08-18 | 1994-08-02 | Arch Development Corporation | Herpes simplex virus 1 UL13 gene product: methods and compositions |
| US6242187B1 (en) * | 1996-01-29 | 2001-06-05 | Virologic, Inc. | Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening |
| EP0852626B1 (en) * | 1996-01-29 | 2002-04-03 | Virologic, Inc. | Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening |
| US20020034732A1 (en) * | 1997-07-30 | 2002-03-21 | Daniel J. Capon | Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening |
| US20030028011A1 (en) * | 1997-07-30 | 2003-02-06 | Parkin Neil T. | Compositions and methods for determining susceptibility of hepatitis C virus to anti-viral drugs |
| US7037644B1 (en) | 1998-05-26 | 2006-05-02 | Virologic, Inc. | Means and methods for monitoring non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor antiretroviral therapy and guiding therapeutic decisions in the treatment of HIV/AIDS |
| EP2386646B1 (en) * | 1998-10-01 | 2016-12-21 | University Of Southern California | Gene delivery system and methods of use |
| US6899871B2 (en) * | 1998-10-01 | 2005-05-31 | University Of Southern California | Gene delivery system and methods of use |
| US7138231B2 (en) * | 2000-09-15 | 2006-11-21 | Monogram Biosciences, Inc. | Means and methods for monitoring protease inhibitor antiretroviral therapy and guiding therapeutic decisions in the treatment of HIV/AIDS |
| US7186506B1 (en) | 2000-06-12 | 2007-03-06 | Monogram Biosciences, Inc. | Means and methods for monitoring protease inhibitor antiretroviral therapy and guiding therapeutic decisions in the treatment of HIV/AIDS |
| US6869759B1 (en) | 1999-06-22 | 2005-03-22 | Virologic, Inc. | Means and methods for monitoring protease inhibitor antiretroviral therapy and guiding therapeutic decisions in the treatment of HIV/AIDS |
| US20030108857A1 (en) * | 2001-06-04 | 2003-06-12 | Parkin Neil T. | Means and methods for monitoring protease inhibitor antiretroviral therapy and guiding therapeutic decisions in the treatment of HIV/AIDS |
| AU7268000A (en) * | 1999-07-21 | 2001-02-13 | Martin Heinkelein | Method for quantization of the antiviral effect of antiviral active principles |
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