JPH02211894A - クラミジア抗原、淋菌抗原およびヘルペス抗原の抽出におけるプロテアーゼの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、クラミジア生菌体、淋菌生菌体またはヘル
ペス生体の測定におけるプロテアーゼの使用に関する。

具体的には、全血または粘液をも含有する生物学的被験
体中に存在する前記の生物体由来の検出可能な抗原を抽
出するための方法に関する。

〔従来の技術〕

最近では、イムノアッセイが感染性疾患の存在を検出す
るのに使用されてきた。このアッセイが有用であるため
には、高度の信頼性を保ちながら特殊な生菌体を検出し
なければならない。これには殆どの場合に、生菌体に関
する特定抗原の単離およびその抗原と対応する抗体とめ
反応が必要である。商業的に成功するための試金石とし
ては、加えて、相当安価であり使用が簡便で、かつ迅速
であることも必要である。

イムノアッセイによって検出することができるかかる生
菌体の１つは、タラミジアーレス（勘」−ｍｙｄ　ｉａ
　１ｅｓ）　目、タラミジアクラミジア・トラコマチス
（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）　
（本明細書では、「Ｃ，トラコマチス」という）である
。トラコーマ、包入体性結膜炎、性病性リンパ肉芽腫、
非淋菌性尿道炎および直腸肛門炎を包含する多数のヒト
の眼および性器の疾病の原因となるこの種に属する１５
以上の菌株が存在する。Ｃ，トラコマチスに由来する感
染症は、普通の人々の間で蔓延し、そのため非淋菌性尿
道炎だけをとっても各年毎に数百万人存在すると信じら
れる。

ワクチンや各種の抗ウィルス剤による各種ウィルスの抑
制が増大しているにもかかわらず、単純ヘルペスウィル
ス（ＩＩＳＶ）などの生物体による感染には重大な課題
が残存する。第１の型は口の周辺に生じ、第２の型は人
体の性器周辺に主に生ずる２つの型のＨ３Ｖが存在する
。皮膚感染およびウィルス性脳炎は、Ｈ５Ｖ感染により
もたらされる重大事の単に２つの例にすぎない。

淋病は、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、特にＮ
。

ゴノロｘｘ　（Ｎｌｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）に属する
細菌により惹起される性器接触で一般に伝播される疾病
でるとはいえ、いまだ世界の多くの地域の流行期にある
人々の間に存続している。この生菌体の検出右よび処置
の重要性は、十分に認識されている。

Ｎ、メニンギチジス（Ｎｌｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）
およびＮ。

ラクタミカ（Ｎ、　ｌａｃｔａｍｉｃａ）　　もまた医
療上およびミジア生菌体、淋菌生菌体およびヘルペス生
体の迅速、簡便かつ信頼できる試験法を人手することに
相当な興味が存在する。これらの生物体から検出可能な
抗原を抽出する有用な方法を見い出すべくかなりの研究
が行われてきた。

正確、迅速かつ感度のよいアッセイを提供するには、生
物学的被験体中のこれらの生物体に由来する抗原の抽出
が重要である。抽出には、超音波、加熱または遠心によ
る細胞破砕を含む多種多様な方法が使用されてきている
。化学的な抽出組成物もまた開発されてきた。例えば、
Ｃ，）ラコマチスはフェノールと水の混合物を使用して
抽出された。

固体支持体を使用して実施するＣ、　　）ラコマチスお
よびＮ、ゴノロエエについてのアッセイは、米国特許第
４．４９７．８９９号および同４．４９７．９００号明
細書に記載されている。記載されているアッセイは、ア
ニオンまたは非イオン界面活性剤、デオキシコール酸塩
およびジチオスレイトールの組み合わせ物を使用して生
物体から抗原を抽出し、次いで抗原を裸の固体支持体上
に塗布することによって行われている。次に、塗布され
た抗原は、１種または２種の抗体（これらの１つは適当
に標識されている）のいずれかにより検出される。抗原
の付着は、支持体上へ抗原の付着を起こすのに十分長い
時間その塗布支持体をインキユベーションすることによ
って達成されていることが明らかである。

〔発明が解決しようとする課題〕

妨害するように作用する。さらに、全血や粘液の存在は
、たとえ抗原の抽出が迅速で効率よく行われた場合でも
しばしばアッセイ感度を低下させる。

高い信頼性を有しそして室温で実施することができるク
ラミジア生菌体、淋菌生菌体またはヘルペス生体に対す
るさらに一層迅速な試験法を入手率よく抽出しそしてそ
れらの効率的なアッセイを提供することも望まれるであ
ろう。

〔課題を解決するための手段〕 前記の課題は、（Ａ）クラミジア生菌体、淋菌生菌体ま
たはヘルペス生体を含むことが予測される被験体を供給
する工程、（Ｂ）前記生物体から抗原を抽出する前か後
に被験体をプロテアーゼと接触させる工程、を含んでな
るクラミジア生菌体、淋菌生菌体またはヘルペス生体か
らの抗原の抽出方法により解決される。また、 （Ａ）クラミジア生菌体、淋菌生菌体またはヘルペス生
体を含むことが予測される被験体から、それぞれクラミ
ジア抗原、淋菌抗原またはヘルペス抗原を抽出する工程
、 （Ｂ）工程Ａの抽出の前または後に、被験体をプロテア
ーゼと接触させる工程、 （Ｃ）工程ＡおよびＢの後に、抽出された抗原をそれら
に対する抗体と接触させることにより免疫複合体を形成
する工程、ならびに （Ｄ）被験体中のクラミジア生菌体、淋菌生菌体または
ヘルペス生体のそれぞれの存在を示すものとして、それ
ぞれ前記複合体を測定する工程、を含んでなるクラミジ
ア抗原、淋菌抗原またはヘルペス抗原の測定方法によっ
ても前述の課題は解決される。

〔具体的な態様〕

本発明は、標準的な医療および微生物学的手法により患
者から得られた生物学的被験体中のクラミジア生菌体、
淋菌生菌体またはヘルペス生体の存在を測定するための
抽出方法ならびに測定方法を含む。このような被験体に
は、例えば、患者の頚管、尿道、眼、咽喉または肛門に
由来する被験体、ならびに滑液または病巣由来の流体の
ごとき体液が含まれる。こうし得られる生物学的被験体
は、測定される目的の抗原を含む細菌生菌体またはウィ
ルス生体を含むことが予測される。

従来技術の幾つかのアッセイは、細菌生菌体またはウィ
ルス生体そのものから抗原の検出が行われているものの
、アッセイ感度を高めるにはそれらの生物体から抗原を
抽出することが一般に必要である。

標準的な手法、例えば、溶媒希釈または高ｐＨ溶解溶液
、酵素処理右よび超音波もしくは遠心のような物理的撹
拌を使用し、生物体を溶解して抗原を遊離することがで
きる。加熱法は、ヨーロッパ特許公開第１８３３８３号
公報に溶解法として記載されている。ドデシル硫酸ナト
リウムおよびデオキシコール酸ナトリウムのようなアニ
オン洗浄剤または胆汁塩の使用は、米国特許第４．４９
７．８９９号、同４、４９７．９００号および同４．６
６３．２９１号明細書に記載されている。

好ましい態様では、本発明に従って検出される抗原は、
クラミジア生菌体のりポボリサッカライド（糖脂質群抗
原）である。加えて、その生菌体の主要外層膜蛋白もま
た抽出されるが、この主要外層膜蛋白はプロテアーゼが
分解する傾向を示すので本発明の興味の主たる抗原はり
ポポリサッカライドにある。

さらにもう一つの態様では、各種の淋菌生菌体（例えば
、Ｎ、ゴノロエエ）がその生菌体に由来する蛋白ＩＡお
よびＩＢのような抽出された外層膜蛋白抗原の存在を測
定することによって検出される。単一の菌株が検出可能
であるが、好ましくは混合菌株が検出される。

さらにもう一つの態様では、Ｈ３Ｖ株、Ｈ５Ｖ−１もし
くはＨ３Ｌ−２単独かまたは両者を共に検出する方法が
提供される。本発明によりそれらのピリオンの糖蛋白が
抽出されそして検出される。さらに、ウィルス感染細胞
が溶解、可溶化され、細胞内ウィルス抗原または膜会合
性ウィルス抗原が遊離されうる。

抗原抽出の前か後に、被験体は１種以上のプロテアーゼ
と接触される。プロテアーゼは、蛋白質のペプチド結合
を加水分解してより小さなペプチドを生成する一群の酵
素である。それらは、微生物（例えば、細菌、カビ）、
動物またはヒトの器官（例えば、膵臓）、植物（例えば
、パパイヤ）ふよび当該技術分野で既知の他のものを含
む多様な起源から入手することができる。プロテアーゼ
はまた、遺伝的に変異した微生物から入手することもで
きる。数多くのプロテアーゼは市販されている（例えば
、Ｓｉｇ＋ｎａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）。

本発明の実施上、細菌によって生産されるプロテアーゼ
が特に有用である。これらのプロテアーゼは、２種の一
般型として分類することができる。

それらは（１）中性ｐＨで活性を示し、一般に補因子（
例えば、亜鉛）を必要とするいわゆる中性プロテアーゼ
、（２）高いｐＨで活性を示し、アルカリ加水分解と類
似のプロセスでペプチド結合を開裂するいわゆるアルカ
リプロテアーゼである。アルカリプロテアーゼは、それ
らの活性部分にセリン残基を有する蛋白分解酵素であψ
セリンプ・テアーゼとも称されている。それらには、キ
モトリプシン様プロテアーゼおよびズブチリシン（ｓｕ
ｂｔｉ−１ｉｓｉｎ）様プロテアーゼが含まれる。

ズブチリシンプロテアーゼは、一般に蛋白質またはペプ
チドの内部ペプチド結合を開裂するように作用し、バチ
ルス属のいろいろな種〔例えば、バチルス−リケニホル
ミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　１＋ｃｈｅｎ＋−ｆｏｒｍ
ｉｓ）　、バチルスφズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ）　、バチルス・ズブチリスＤＹ株およ
びバチルス・アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）　］によっ
て一般に産生される。

この発明で使用するのに好ましいプロテアーゼは、国際
公開（ＷＯ）８７１０４４６１号公報に記載されている
。このプロテアーゼは、１個以上の＾５ｎ−Ｇｌｙ配列
からなるアミノ酸配列を有し、その配列のアミノ酸残基
の１個または両者が欠失しているか、あるいは種々のア
ミノ酸、例えばセリンまたはアスパラギン酸の残基によ
って置換されているバチルス・ズブチリスのプロテアー
ゼの類縁物である。

１０９位および２１８位の前記アスパラギンがセリン残
基で置換されているものが特に好ましい。これらの好ま
しいプロテアーゼは、長期間の貯蔵に対して安定である
。

最も好ましいプロテアーゼは、前記の特性を有し、さら
にアミノ酸配列中に存在するカルシウムパインディング
部位のアミノ酸残基１個以上が負荷電のアミノ酸によっ
て置換されている。例えば、その配列の７６位のアスパ
ラギンのアミノ酸残基がアスパラギン酸で置換され貯蔵
安定性を改良する上で非常に有利となっている。このよ
うなプロテアーゼの製造方法は、ＷＯ８７１０４４６１
号公報の教示により明らかなごとく当該技術分野で広く
知られている。

この発明に利用可能なとくに好ましいプロテアーゼの１
つは、Ａｍ１ｄｅｃｋ”としてＥｉａｓｔｍａｎ　Ｋｏ
ｄａｋＣｏｍｐａｎｙのＢｉｏ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｄ
ｉｖｉｓｉｏｎから人手可能である。

この発明で利用可能な好ましいプロテアーゼの一般的な
製造方法は、次の工程を含む。

（１）　　Ｂ、ズブチリス（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）由
来の代表的なズブチリシン遺伝子球」の単離工程、（２
）オリゴヌクレオチドの特定部位の突然変異誘発の利用
を可能にするベクターにＶμ遺伝子をクローニングして
目的の変性を起こす工程、（３）特定部位の突然変異誘
発および得られるＤＮＡの配列決定を行い目的の変異の
存在を確認する工程、 （４）Ｂ、ズブチリスによる変異酵素の合成に向けた発
現ベクターの構築、 （５）ズブチリシンと中性プロテアーゼを合成しない変
異Ｂ、ズブチリス株の構築、 （６）細胞外増殖培地における酵素の単離とその精製工
程、ならびに （７）　Ｂ、ズブチリス株のクロモシームに変性酵素を
コードする遺伝子の挿入処理を行った後、変異処理して
内因性プロテアーゼの合成を阻止する工程。

具体的な製造方法は、以下の例の直前に示す。

この発明を実施するに際して利用可能なプロテアーゼ量
は、個々の使用プロテアーゼ、その起源、その活性およ
び分解すべき被験体中の全血または粘液の量ならびに当
業者に自明の他の因子に応じて変化しうる。−船釣に、
最少量は、ＤｅｌＭａｒらの＾ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ
、９９．３１６〜３２０ページ（１９７９）に記載され
ている方法で決定することができる。＾ｍ１−ｄｅｃｋ
＠プロテアーゼとして前記した好ましいプロテアーゼに
ついては、最少量が一般に１０単位／ｍｇであＤ、好ま
しくは１００〜１０００単位／■である。

この発明の抽出方法は次の２つ独立した工程を含む： （１）一般にｐＨ７〜１０に緩衝化してプロテアーゼの
使用、および （２）一般にｐＨ８〜１３．５を有する前述のような高
ｐＨ抽出組成物の使用。

前記プロテアーゼは、それが失活する可能性があるので
高ｐＨ（すなわち、ｐＨ１０を越える）環境下を避けね
ばならない。従って、プロテアーゼを最初に使用する前
記工程順が好ましい。しかしながら、前記高ｐＨ抽出組
成物がプロテアーゼを失活させないｐＨより低い場合に
は、両工程を逆にしてもよい。幾つかの抗原、例えば、
クラミジア主要外層膜蛋白は、プロテアーゼにより悪影
響を受ける可能性がある。従って、当業者は目的の抗原
に応じてこの発明の方法で使用するプロテアーゼを調整
しなければならないであろう。

抽出はいずれかの適当な容器で実施することができる。

幾つかの抽出装置がこのような目的のために特別に設計
されておＤ、それらをいかに使用するかについては当業
者に既知であろう。米国特許第４．７４６．６１４号明
細書は特定の有用な抽出装置を記載している。

必須ではないが、場合により生物体から抗原の抽出がさ
れた後、次の操作を行う前に被験体を予備濾過して細胞
残層、微小粒子および他の不要な物質を除去してもよい
。予備濾過は、いずれかの適当な容器または既知の方法
を使用する装置で行うことができる。

抽出された抗原は、その存在を測定するために数種の分
析法にかけることができる。このような方法には、特定
の場合にのみ選ばれるので必ずしも好ましくはないが、
培養法、カウンターイムノ電気泳動法および血清試験が
含まれる。

好ましくは、抽出された抗原は、それが１種以上の抗体
と免疫学的に反応するイムノアッセイを使用して検出さ
れる。得られた免疫複合体は、適当な放射線、比色、蛍
光または酵素標識試薬を使用して検出される。ある場合
には、試薬は抗原に対する標識抗体であＤ、またある場
合には、抗原と反応する未標識抗体に向けられる標識抗
−抗体である。このようなイムノアッセイは、一般に、
塗布されているかまたは塗布されていないある型の固体
支持体上での検出可能な免疫複合体の形成、それに続く
適当な検出法を含む。別のアッセイは、免疫複合体の少
なくとも１種の反応体く例えば、抗体）が複合体形成中
に一緒に凝集するようなある型の標識または未標識粒子
に付着された場合に免疫複合体の凝集を伴う。

有用なアッセイの例としては、コンペティティれる）が
挙げられる。このようなアッセイは米国特許第４．４２
７．７８２号明細書（前記）およびＳｃｈｍｅｅｒらに
よＤ、Ｊ、ＣＩｉｎｌＭｉｃｒＣｌｌｎｌ、、　　１５
（５）、　８３０〜８３４ページ（１９８２）に種違さ
れている。使用されるクラミジア抗体、淋菌抗体または
ヘルペス抗体は、それらの生物体から抽出されているい
ずれかの抗原または数種の抗原に向けることができる。

−の態様では、抗体がＣ，）ラコマチスのりポポリサッ
カライドのような単一抗原に向けられる。もう一つの態
様では、各種抗体混合物が数種の淋菌株から抽出される
ような数種の抗原に向けられる。

抽出された抗原が長い時間商められた温度でインキコベ
ーションすることによって塗布されていない支持体に吸
着される類似の固相イムノアッセイは、米国特許第４．
４９７．８９９号および同４．４９７．９００号明細書
に記載されている。。

好ましいイムノアッセイは、抽出された抗原を表面上に
複数の正荷電基を有するポリマー固体支持体と接触させ
ることによって行われる。この支持体は、抽出された抗
原をイオン結合しろる適当なカチオン基を表面に有する
いずれかの天然または合成ポリマー材料から構築するこ
とができる。

有用なポリマーとしては、必要な荷電基を有するポリエ
ステノにポリアミド、ポリカーボネート、ポリエチレン
イミン、セルロース系材料およびエチレン系不飽和ビニ
ルモノマーから製造される付加ポリマーならびに当該技
術分野で既知の他のポリマーが挙げられる。一般に、カ
チオン基としては、第四級アンモニウム塩、第四級ホス
ホニウム塩、第四級スルホニウム塩、第四級ピリジニウ
ム塩、第四級ピリミジニウム塩または第四級イミダゾリ
ウム塩が挙げられ、第四級アンモニウム塩が好ましい。

ポリマー支持体は、いずれかの適当な形状、例えばビー
ズ、フィルム、ゲルまたは膜の状態であってもよい。こ
の支持体は、アッセイ性能を高めうる界面活性剤を塗布
することができる。以下に記載するような微孔質膜が好
ましい。

本明細書で開示される支持体は、アッセイを実施するた
めの他の備品（ボトノペ試験管、綿棒、ビーカーまたは
カップ）と組み合わせて使用することができる。また、
好ましくは、支持体はアッセイを実施しそしてすべての
流体に適合しうる使い揄で試験装置中に固定された微孔
質膜を有する。

利用可能な試験装置の構成は、米国特許箱３、８２５．
４１０号、同３．８８８．６２９号、同３．９７０．４
２９号および同４．４４６．２３２号明細書を含む従来
技術で知られている。特に有用な装置は、ヨーロッパ特
許公開第２８０５５８号および同３０８２１３号公報に
記載されている。

界面活性剤塗布またはイオン荷電支持体を使用する好ま
しい態様では、抗原と支持体の接触により殆ど瞬間的に
抗原は直接的かつ優先的に支持体へ結合される。「直接
的」とは、支持体に付着されている結合性生物学的化合
物（例えば、抗体）を介して抗原が結合されないことを
意味する。

「優先的」とは、実質的に抗原のみが支持体に結合し、
反応媒体中の他の物質は結合されないことを意味する。

従って、接触の１０分以内、好ましくは１〜５分以内に
、結合された抗原がクラミジア抗体、淋菌抗体またはヘ
ルペス抗体（抗原に応じて）のいずれかと接触すること
により支持体に結合された免疫複合体を形成する。アッ
セイが使い捨て試験装置を使用して実施される場合、支
持体は、抗原が膜に結合されるにつれ流体と結合されて
いない物質が濾過されるような微孔質であることができ
る。

このアッセイで使用されるクラミジア抗体、淋菌抗体ま
たはヘルペス抗体は、アッセイで検出するだめに抽出さ
れる抗原と特異的に免疫反応する抗体といえる。それは
、ポリクロナルまたはモノクロナルで°あってもよく、
市販のものまたは既知の方法で調製してもよい。

−の態様では、抗原に対する抗体は検出、Φために標識
される。有用な標識は当該技術分野で既知である。

特に好ましい態様では、標識がペルオキシダーゼであＤ
、アッセイのある時点で過酸化水素および適当な色素生
成試薬を添加し、検出可能な色素を提供する。例えば、
有用な色素生成試薬には、テトラメチルベンジジンおよ
びその誘導体、ならびにトリアリールイミダゾールロイ
コ染料（例えば、米国特許箱４．０８９．７４７号明細
書に記載）、またはペルオキシダーゼおよび過酸化水素
の存在下で反応して色素を提供する（すなわち、ペルオ
キシダーゼの触媒作用により色素を提供する）他の化合
物が含まれる。

最も好ましい態様では、クラミジア抗体、淋菌抗体また
はヘルペス抗体は標識されておらず、そして形成され支
持体に結合されている抗体−抗原複合体の検出は、それ
ぞれ前記クラミジア抗体、淋菌抗体またはヘルペス抗体
に特異性を有し、かつ適当に標識されている第二の抗体
く以下に記載する）を使用して行われる。

クラミジア抗体、淋菌抗体またはヘルペス抗体は、支持
体との非特異的な相互作用を減少させる１種以上の蛋白
質の存在下で支持体結合抗原と接触することができる。

有用な蛋白質は周知であＤ、例えば、カゼイン、α−カ
ゼイン、ウシ胎仔血清およびブタガンマ（γ）グロブリ
ンが挙げられる。

特に有用な阻止（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）組成物は、非免疫
学的な蛋白質と両性界面活性剤からなる。

支持体に結合される免疫複合体の形成を促進するために
、抗体と抗原は、一般に１０分未満１５〜３０℃の温度
でインキュベーションされる。好ましくは、インキュベ
ーションは、室温（すなわち、１８〜２５℃）で５分ま
でである。

前記インキュベーション後であって抗体−抗原の接触１
０分以内に、前記結合された複合体は、般にｐＨ７〜１
１を有する緩衝化洗浄液で１度以上洗浄される。この溶
液は、好ましくは、支持体上の複合体から複合体化して
いない物質を分離するのに役立つ１種以上の界面活性剤
を含む。

前述の態様で、クラミジア抗体、淋菌抗体またはヘルペ
ス抗体が標識されている場合には、洗浄後のアッセイ手
順は、直接的なその標識を検出か、または適当な試薬添
加後の間接的な検出となる。

検出は、結合された複合体の洗浄後、比較的速やかに行
われる。場合により標識の検出は、試薬がインキュベー
ションすることを許容するならそれによって促進するこ
とができる。次に、標識が標準的な装置および方法を使
用して検出される。

好ましい態様では、第一の抗体は未標識であＤ、結合さ
れた複合体が洗浄された後、それが未標識抗体に向けら
れる標識抗体と接触される。この第二の抗体くすなわち
、抗−抗体）は、前述の標識のいずれかで適当に標識さ
れる。この抗体は、モノクロナルまたはポリクロナルで
あってもよく、また市販のものかもしくは既知の方法で
調製したもののいずれであってもよい。

この接触後、支持体に結合されている得られた抗原−抗
体−抗体複合体は、１５〜３０℃の温度で１０分未満、
好ましくは室温で５分未満インキュベーションされる。

さらに、洗浄を行って複合体化されていない物質を除去
し、適当な酵素基質または他の必要な試薬を添加して検
出可能な種を提供する。次に、結合された抗原−抗体−
標識抗体複合体は、標準的な放射線、比色、蛍光または
他の検出法を使用して支持体上で検出される。

〔実施例〕

以下の例で本発明をより具体的に説明するが、本発明の
範囲を限定するものでない。

なあ、本明細書でｒＴＭ　Ｊまたは「■」が付される名
称は、商品名または商標であることを意味する。

抗原の調製 血液型亜型（ｓｅｒｏｖａｒ）　　Ｈ抗原は、Ｉｎｄｉ
ａｎａ　ｔｌｎｉ−ｖｅｒｓｉｔｙのＷ、Ｊ、　Ｎｅｗ
ｈａｌｌ教授から入手した基本小体を精製した。リン酸
緩衝溶液（ＰＢＳ）　（０，１ｍｇ／　ｄ　）中ウシ血
清アルブミン溶液（５０Ｉｉ１）に保存抗原溶液（５ｔ
ｄ　、　３２４０ｎｇ抗原／Ｉ含有）を加え、−８０℃
で貯蔵して溶液Ａを得た。この溶液を解凍し、撹拌およ
び超音波処理により混合し、次いで前記ウシ血清アルブ
ミン溶液（９４５ｉｌり　と撹拌して混合し、溶液Ｂを
得たく抗原濃度は、４　Ｘ１０’ｌ）ｇ／１００１１１
であった）。次に溶液Ｂ（１００ｉ１１）をＰＢＳ（９
００１１１）中ウシ血清アルブミンと混合して抗原濃度
４．６　ＸＩＯ’ｐｇ／　１００１１１を有する溶液Ｃ
を得た。

抗体の調製 クラミジアのりポポリサッカライド（ＬＰＳ）抗原に対
するマウスモノクロナル抗体は、標準的ハイブリドーマ
法およびマウス細胞系を使用して調製し、防腐剤として
アジ化ナトリウムＯ０旧重量％含有ＰＢＳ　（ｐＨ７，
４）の溶液として保存した。阻止蛋白質としてのカゼイ
ン（０，５重量％）およびＬｏｎｚａｉｎｅ＠Ｃ両性界
面活性剤（０，０１重量％、Ｌｏｎｚａ　Ｃｏｍｐａｎ
ｙから入手可能）を含有するＰＢＳに前記抗体溶液試Ｉ
Ｍ　（１９ＩＩｌ）を加えて抗体溶液を調製しく１：８
００希釈）次いで０．２２ｍ＋フィルターで濾過して使
用液を得た。

クラミジア主要外層蛋白（ＭＯＭＰ）抗原に対するマウ
スモノクロナル抗体は、標準的ハイブリドーマ法および
マウス細胞系を使用して調製し、アジ化ナトリウム０．
０１重量％含有ＰＢＳ（Ｊ］Ｈ７，４）の溶液として保
存した。阻止量白質としてのカゼイン（０，５重量％）
およびＬｏｎｚａ　１ｎｅＯＣ両性界面活性剤（０，０
１重量％）を含有するＰＢＳに前記抗体溶液試料（１４
ｍ）を加えて抗体溶液としく１：１１００希釈）、次い
で０，２２−のフィルターで濾過して使用液を得た。

使用される標識ポリクロナル抗体は、ワサビペルオキシ
ダーゼに接合させてヤギ抗マウスＩｇＧ抗体であった。

この接合体を、カゼイン（０，５重量％）ふよびＬｏｎ
ｚａｉｎｅＯＣ両性界面活性剤（０，０１重量％）含有
ＰＢＳで１：２０００まで希釈し、次いで０．２２−の
フィルターで濾過して使用液を得た。

アッセイで使用される市販のプロテアーゼ示した活性（
供給者により測定された）を有する以下のプロテアーゼ
酵素を、例１および２で使用した。

蛋白１　ｍｇ当たり１０〜２０単位の活性を有するタイ
プＸＩ　（カビ）、 固形分１　ｍｇ当たり０．７〜１単位の活性を有するタ
イプＩＶ　Ｃストレプトミセス・カエスピトシス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｃａｅｓｐｉｔｏｓｉｓ）　
　由来〕、固形分１ｍｇ当たり７〜１４単位の活性を有
するタイプＸＨＶ　（細菌）、 蛋白１ｍｇ当たり１０〜２０単位の活性を有するタイプ
ｘｘｖＩＩｒ〔トリチラチウム・アルブム（Ｔｒｉｔｉ
ｒａ−ｃｈｉｕｍ　　ａｌｂｕｍ）由来〕、および固形
分１　ｍｇ当たり１５〜２０単位の活性を有するタイプ
ＸＸＩ　　（ストレプトミセス・クセウス（Ｓｔｒｅｐ
−例３で使用される＾ｍｉｄｅｃｋｇプロテアーゼは、
７６位にアスパラギン酸を有し、かつ１０９位と２１８
位の両方にセリンを有するズブチリシン（ｓｕｂｔｉ−
１ｉｓｉｎ）　＠縫物である。

次式 （上式中、Ｇ、Ｃ，ＴおよびＡはヌクレオチド塩基につ
いての標準的な記号であＤ、Ａｌａ、　Ｌｅｕ。

ＡＳＪ）、　Ａｓｎ、　Ｓｅｒおよびｌｉｅはアミノ酸
についての標準的な略号である）で示されるブライマー
に、バクテリオファージＭ１３ｍｐ１８ａｐｒ４　［Ｓ
ｅｒ”ｓ、　Ｓｅｔ”’］（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能な
Ｍ１３ｍｐ１ｇバタテリオファージ）由来の一本鎖ＤＮ
Ａをアニールさせた。このブライマーは、Ｂｅａｕｃａ
ｇｅらの、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、
　　２２．　１８５９〜１８６２ページ（１９８１）に
記載されているホスファイト法（ｐｈｏｓｐｈｉｔｅ　
ｍｅｔｈｏｄ）で合成した。それは、ａｐｒＡズブチリ
シンのアミノ酸７４位〜７９位についてのコドンが１個
の塩基が変化（星印を付した）していること〔アデニン
がグアニンに変化してＡｓｎ”（コドンＡＡＴ）がＡｓ
ｐ”（コドンＧＡＴ）にトランジションを可能にする〕
を除き、それらを含有するヌクレオチドに相同であった
。

このブライマーを、６５℃でＭ１３ｍｐｌＢａｐｒ４　
Ｃ３ｅｒ”’Ｓｅｒ”’）　ＤＮＡにアニール化し、そ
のアニール化ＤＮＡを約２２℃まで徐々に冷却し、次い
でアニール化ＤＮＡ溶液１２．５Ｊ１１．各１０ミリモ
ル濃度のｄＡＴＰ。

ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ　２０ｄ、１２ミリモル濃度の
ＡＴＰ　２０４、フレノウＤＮＡポリメラーゼ０．１　
＃ＳＴ４　ＤＮＡリガーゼｏ、１Ｊｌｌならびに滅菌蒸
留水１３１１１からなる反応混合物において１５℃で２
時間重合させた。得られた二重鎖で共有結合的に閉環し
た環状ＤＮＡを、Ｅ、コリー（Ｂ、　ｃａｄｉ）　ＪＭ
１０３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｉｎｃ。

から入手可能）にトランスフェクションで導入した。

バクテリオファージプラークをハイブリダイゼーション
膜（例えば、Ｇｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎ”）　　に移し、
目的の塩基交換を伴うＤＮＡを含むものを、４６℃で放
射線活性標識（γ３２Ｐ）合成オリゴヌクレオチドにハ
イブリダイゼーションすることによって同定した。陽性
プラークの１つが、Ｍ１３ｍｐ１ｇａｐｒ４〔八５ｐ７
６．５ｅｒ１０９，５ｅｒ２１ｓ〕　と認められるバク
テリオファージを含んでいた。このバクテリオファージ
由来の二重鎖ＤＮＡを、旧ｎｄ■とＫｐｎ　Ｉ　　の組
み合わせの下で消化し、次いで刑−ズブチリシン遺伝子
の３ケ所に突然変異を有する７５０ｂｐの断片を、予め
旧ｎｄＩＩＩとＫｐｎ　Ｉ　　で消化したプラスミドｐ
ＡＭＢ１０６に連結した。得られたプラスミド（ｐＡＭ
１３１）を、Ｂ、ズブチリス宿主細胞に導入して（Ａｓ
ｐｆｆ６゜３ｅｒ１０９．３ｅｒ２１８　）ズブチリシ
ン（すなわち、プロテアーゼ）を合成分泌させた。

このプロテアーゼの活性は、基質として合成ペプチド：
スクシニル−Ｌ−Ａｌａ　−Ｌ−Ａｈａ−Ｌ−Ｐｒｏ　
−し−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌから入手可能）を使用し、ｐ−ニトロアニ
リンの遊離に起因する４１０ｎｍにおける吸光度の増加
率をモニターしながら測定した。典型的な反応混合物（
１ｒｎ１）は、塩酸トリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン緩衝液（０，５モル濃度、ｐＨ８）、塩化カルシ
ウム（１ミリモル濃度）、前記ペプチド（１ミリモル濃
度）を含ませ、次いで２５℃でプロテアーゼ活性を連続
的に測定した。比活性は、１分以内に４１０１ｍで測定
される吸光度の変化１．０を１単位とする、固形分１　
ｍｇ当たりの単位で表示される。

抽出組成物 抗原抽出溶液は、次の成分から調製した二アジ化ナトリ
ウム（０，０２７２７モル濃、塩化ナトリウム（０，２
７モル濃度）、塩酸エタノールアミン（０，４７モル濃
度）、エチレンジアミン四酢酸・２ナトリウム（０，０
４５４５モル濃　、ＥｍｃｏｌＯＣＣ−３６力チオン界
面活性剤（０，４５重量％、メタノール中１０％溶液か
ら添加した）および水酸化ナトリウム（０，６６モル濃
度、ｐ）Ｉｌｌ、Ｑ）　。ＥｍｃｏｌＯＣＣ−３６力チ
オン界面活性剤は、Ｗｉｔｃｏ　Ｃｈｅｍｉｃａｌから
入手可能なポリプロポキシ−ｔ−アミンの第四級アンモ
ニウムクロライド混合物である。

これらの例は、生物学的被験体に全血の存在による課題
を解決するために抽出組成物と共にプロテアーゼを使用
する有意性を例示する。

アッセイは４種の試験溶液と対照溶液ならびに２種の抽
出方法を使用して実施した。例１では、抽出組成物を加
えた後プロテアーゼを添加した。

例２では、最初にプロテアーゼを添加した。

例１では、クラミジア抗原溶液Ｃ（３６４、前述）と全
血（２５ｊ１１）含む溶液１を室温下で５分間混合した
。次に、この溶液を前述の抽出組成物（３６４ｄ）に加
え、室温で５分間インキュベーションした。

クエン酸溶液（０，６モル濃度溶液１００ｐ１）を、ｐ
Ｈが約８に低下するまで加えた。適当なプロテアーゼ酵
素（２ｍｇ／ＰＢＳ　ｍｌの４００４）を添加し、この
溶液を室温で５分間インキュベーションした。

過酸化水素溶液（１ＯＮの水酸化ナトリウム４０ハを含
有する１０．５重量％溶液４０Ｍ　、　ｐＨ１０，５）
を添加し、得られた溶液を室温で５分間インキニベーシ
ョンした。次に、それを５μＢｉａｄｙｎｅ９　Ａ膜で
濾過した。

前記溶液の一部（１６０ｐ１）を、使い捨て試験装置の
各ウェルに添加し、直に膜を通して流体を流した。この
装置は、Ｐａ１ｌ　ＢｉｏｄｙｎｅＯ−８膜として市販
されている表面に第四級アンモニウム基を有する５迦の
微孔質膜を含ませた。この膜は、使用前にＦ　１ｕｏｒ
ａｄＯＦＣ１３５で処理した。次に、ＥｍｃｏｌＯＣＣ
−９力チオン界面活性剤（０，７５重量％）含有ＰＢＳ
（２００４）で洗浄した。

抗ＬＰＳおよび抗ＭＯＭＰ抗体溶液（前述のように調製
）のそれぞれ一部（１２０４）を、別個の装置の各ウェ
ルに添加した。室温で５分間インキニベーション後、前
記膜にイオン結合している得られた抗原−抗体複合体を
、前述の洗浄液（２０ｈｊ）で洗浄した。

前述のペルオキシダーゼ標識抗−抗体溶液の一部（１２
０ｐ１）を、各試験ウェルに添加し、次いで室温下５分
インキニベーションし、もう−度洗浄した。

検出可能な色素を提供する目的で、ロイコ染料組成物（
１２０Ｉｌりを添加した。この組成物は、過酸化水素（
１０ミリモル濃度）　、２−（４−ヒドロキシ−３−メ
トキシフェニル）　−４、５−ビス（４−メトキシフェ
ニル）イミダゾールロイコ染料（０，００５重１％）、
ポリ　（ビニルピロリドン）（１重量％）、４′−ヒド
ロキシアセトアニリド（５ミリモル濃度）およびジエチ
レントリアミン五酢酸（１０ミリモル濃度）からなる。

次に、さらに１０分後に透過濃度を測定した。

以下の溶液も前記の方法でアッセイした：溶液２は、こ
の発明の抽出溶液（３７５Ｉｌｌ）　に添加され、室温
で５分間インキコベーションした全血（２５Ｊ１１）を
含有する対照溶液（抗原ナシ）であった。

溶液３は、前記抽出組成物（３６４４）に添加され、室
温で５分間インキュベーションした抗原溶液（３６ｕ＞
のみを含めた。

溶液４は、抽出組成物（４００４）のみを含有する対照
であった。

以下の第１表は、全血の存在下における回収率として各
種溶液間の透過濃度差（ΔＤＴ）で表示する例１に関す
るこれらのアッセイで得られたデ−夕を示す。これらの
データは、プロテアーゼの使用が全血の存在下での抗原
抽出を著しく　（すなわち使用されるプロテアーゼに応
じて７８％まで）改善することを示す。

ナシ　　　　　　０．１８２　　０．０２５　　　１４
タイプＸＩ　　　　　Ｏ，０６７０，１４２７８タイプ
ＸＸＩＶ　　　　０．１０１’０．１０１　　　　５５
タイプＸＸＶｒｌｌ　　　Ｏ，０６３０，１０６５８タ
イプＸＸＩ　　　　　Ｏ，０６８０，０６８３７例２は
、プロテアーゼ（タイプｘｘＩのみ、２ｍｇ／−のＰＢ
Ｓ　４００ｍ）を溶液１〜４と混合し、室温でそれぞれ
５分間インキュベーションした以外は例１と同様であっ
た。次に、抽出組成物（４００Ｊｌりを各溶液に添加し
、次いで過酸化水素溶液（９，６重量％、４００ｍ）を
添加して室温で５分間インキュベーションした。次に、
各溶液を５μ膜で濾過した。

その後、各溶液の一部（１４４１１１）を別個の試験装
置のそれぞれのウェルに添加して膜に抽出された抗原を
付着させ、次いで例１の洗浄液で洗浄した。

アッセイの残りの工程は、その例に記載されるように行
った。

このアッセイの結果を以下の第■表に示す。これらは、
血液が被験体中に存在する場合には、プロテアーゼの存
在が抗原の抽出を改善することを示す。

第■表（例２） す　　シ　　　　　　　　０．１８２　　　　　　０．
０２５タイ７’ＸＸＩ　　　　　０．０６８　　　　０
゜０６８例３：好ましいプロテアーゼを使用するＬＰＳ
抗原のアッセイ この例は、前述のように貯蔵安定性が著しく改善された
Ａｍ１ｄｅｃｋ＠プロテアーゼを使用するクラミジア生
菌体のリポポリサッカライド抗原の測定についての本発
明の実施例である。

１８個の被験体を子宮頚管綿棒を使用して女性患者から
得た。この被験体は、相当量の全血もしくは粘液または
その両者を含んでおＤ、標準的な培養、法を使用してＣ
，ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ　（Ｃ６）ラコマチス）の存
在を試験した。

この例で使用した材料 米国特許箱４．７４６．６１４号明細書に記載される抽
出装置に、（１）チメロサール防腐剤（０，０１重量％
）を有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン緩
衝剤（１，６５モル濃度溶液２０ＩＩ！、　ｐＨ１１，
１）、ならびに（２）２−（Ｎ−モルホリノ）エタンス
ルホン酸緩衝剤（１（Ｈ！Ｊモル濃度）、アジ化ナトリ
ウム（１，５４ミリモル濃度）、エチレンジアミン四酢
酸（５，４ミリモル濃度）、ジメドン（２１，４ミリモ
ル濃度）およびポリ　（アクリルアミド）　（６，３５
重量％）含有溶液５０Ｊ１１を基礎とするジチオ゛スレ
イトール（０，１８８８８モル濃の乾燥塗布物を別個に
保持させて作製した。

プロテアーゼ溶液は、Ａｍｉｄｅｃｋｇプロテアーゼ（
４ｍｇ／　ｍｌ、　　１７０単位／ｍｇ）　、２−　（
Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝剤（１０ミリモ
ル濃度、ｐＨ６）、塩化ナトリウム（５０ミ’Ｊモル濃
度）、塩化カルシウム（５ミリモル濃度）、１．２−プ
ロパンジオール（１０％Ｗ／Ｖ）およびチメロサール防
腐剤（０，０１重量％）を保持させて調製した。

過酸化水素溶液は、過酸化水素１２重量％、ジエチレン
トリアミン五酢酸（１０マイクロモル濃度）およびチメ
ロサール防腐剤（０，０１重量％）を含有させて調製し
た。

洗浄液には、３−シクロへキシルアミノ−２−ヒドロキ
シ−１−プロパンスルホン酸緩衝剤（ｐＨ１０、０、０
，０５モル濃度）　、Ｅｍｃａｌ’ＣＣ９力チオン界面
活性剤（０，７５重量％）および防腐剤（０，０１重量
％）を含めた。

対照試薬溶液は、ＰＢＳ　（ｐＨ７゜２）中、抗りレア
チンキナーゼＭＢ抗体（５ｇ／−）、カゼイン（０，５
重量％）　、ＬｏｎｚａｉｎｅＱＣ両性界面活性剤（０
，０１重量％）および防腐剤（０，０１重量％）を含ん
でなる。

リポポリサッカライド抗原に対するモノクロナル抗体（
４ｕ／ｍりは、前述のようにカゼイン、Ｌｏｎｚａｉｎ
ｅＯＣ両性界面活性剤および防腐剤も含むＰＢＳ　（ｐ
）１７．２）に供給した。

ワサビペルオキシダーゼに接合したヤギ抗マウスＩｇＧ
抗体（１ニア００希釈）は、前述のようなカゼイン、Ｌ
ｏｎｚａｉｎｅ９両性界面活性剤および防腐剤ならびに
４′−ヒドロキシアセトアニリド（１０ミリモル濃度）
を有するＰＢＳ　（ｐｔ（７，２）に供給した。

ロイコ染料組成物は、例１および２で特定したトリアリ
ールイミダゾールロイコ染料（０，００８重量％）、ポ
リ　（ビニルピロリドン）（１重量％）、リン酸ナトリ
ウム緩衝剤（ｐＨ６，Ｂ、１０ミリモル濃度）、ジエチ
レントリアミン五酢酸（１０マイクロモル濃度）、４′
−ヒドロキシアセトアニリド（２ミリモル濃度）および
過酸化水素（１０ミリモル濃度）を含ませた。

アッセイ 各被験体について別個の試験装置を使用して得た１８種
の被験体それぞれに対して、以下のようにアッセイを実
施した。プロテアーゼ溶液（約２８０ｐ１）を、抽出装
置に添加し、その後それらの中に患者の綿棒を置き５〜
１０秒間回転させ、次いで室温で３分間インキュベーシ
ョンした。

次に、抽出溶液（約２８０ｄ）を前記綿棒含有装置に加
え、さらに５〜１０秒間回転させた後、３分間室温でイ
ンキュベーションした。

この装置に過酸化水素溶液を添加し、同じ操作を繰り返
した。

抽出装置中で得られた溶液を、ピペットを使用してその
装置から採取した後、予備濾過しそして例１および２で
記載したような使い捨て試験装置の各ウェルに移した（
各ウェルには約１６０バ加えた）。各試験装置の一つの
ウェル（＃１）を対照ウェルとし、一方、他の２つのウ
ェル（＃２および＃３）を試験ウェルとした。この装置
のベントを開放にしてすべての流体を排出させた。次に
、排液しながら前述の洗浄液（１６０ｕりで各ウェルを
洗浄した。

排液することなく、ウェル＃１に対照抗体溶液（約８０
１１りを添加し、一方、ウェル＃２および＃３のそれぞ
れに抗リポポリサッカライド抗体溶液（約８０Ｉｌｌ）
を添加した。室温でのインキュベーションを２分間行っ
た。

排液後、洗浄工程を繰り返し、ペルオキシダーゼ標識抗
体溶液（約８０ＩｉＩ）を排液することなくすべてのウ
ェルに加え、次いで５分間室温でインキュベーションし
た。

排液およびさらなる洗浄工程に続き、排液することなく
ロイコ染料組成物を各ウェルに添加した。

室温で５分間インキュベーションした後、アジ化ナトリ
ウム溶液０．０１％（前述）　（１２０Ｊ）を各ウェル
に添加することにより色素生成を停止させた。

各ウェルの膜上で生成した色素を、視覚的に観察し、段
階付けした（０〜１０．０は無着色を示す）。

結果を以下の表に示し、標準的培養法で見い出されたア
ッセイ結果と比較した。アッセイは、すべてのネガティ
ブ被験体と８３％のポジティブ被験体が測定されている
ように高い精度を有することが明らかとなった。

表 ＋ ＋ ＋ ■ 十 ＋ ＋ ＋ ＋ 表（続き） １７　　　　＋　　　１　　　　５−６　　　　５−６
　　　　　　＋１８＋ｌｌ　　　　　　　Ｏ−１ ☆　試験せず、すなわち、アッセイ操作を誤った。

〔発明の効果〕

この発明の抽出組成物は、生物学的被験体中のクラミジ
ア生菌体、淋菌生菌体またはヘルペス生体を迅速、かつ
効率よく溶解する。従って、本発明は全血、粘液または
その成分の存在下で抽出された抗原を効率よく検出する
手段を提供するための改良がなされている。好ましい態
様の一つでは、Ｃ，）ラコマチスのりボポリサッカライ
ド抗原と主要外層膜蛋白抗原の両者が抽出されるが、リ
ポポリサッカライドが主要な対象である。

これらの利点は、いずれかの適当な抽出法を使用する抗
原の抽出の前後のいずれかでプロテアーゼを使用するこ
とにより達成される。プロテアーゼは、全血および粘液
を効率よく分解するので、それらがアッセイを妨害しな
くなる。有用なプロテアーゼの詳細は先に提案した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ａ、クラミジア生菌体、淋菌生菌体またはヘルペス
   生体を含むことが予測される被験体を供給する工程、 Ｂ、前記生物体から抗原を抽出する前か後に被験体をプ
   ロテアーゼと接触させる工程、を含んでなるクラミジア
   生菌体、淋菌生菌体またはヘルペス生体からの抗原の抽
   出方法。 ２、Ａ、クラミジア生菌体、淋菌生菌体またはヘルペス
   生体を含むことが予測される被験体から、それぞれクラ
   ミジア抗原、淋菌抗原またはヘルペス抗原を抽出する工
   程、 Ｂ、工程Ａの抽出の前か後に、被験体をプロテアーゼと
   接触させる工程、 Ｃ、工程ＡおよびＢの後に、抽出された抗原をそれらに
   対する抗体と接触させることにより免疫複合体を形成す
   る工程、ならびに Ｄ、被験体中のクラミジア生菌体、淋菌生菌体またはヘ
   ルペス生体のそれぞれの存在を示すものとして、それぞ
   れ前記複合体を測定する工程、を含んでなるクラミジア
   抗原、淋菌抗原またはヘルペス抗原の測定方法。