JPH02211899A - 細菌の薬剤感受性測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、例えば、細菌感染症の治療において、有効な
薬剤を選択するための細菌の薬剤感受性測定方法に関す
る。

〈従来の技術〉 従来、臨床検査室で行われている薬剤感受性検査は、薬
剤の被検菌に対する最小発育阻止濃度（以下、ｒＭＩＣ
Ｊという）を直接的または間接的に測定するものであり
、希釈法とディスり拡散法に大別される。

希釈法には、寒天平板希釈法と液体希釈法の２種があり
、それぞれ段階希釈した薬剤を含んだ寒天平板またはブ
イヨンを作製し、培地に一定菌量の被検菌を接種し、一
定時間培養後、培地中の細菌の生育の有無を肉眼的に判
定することによりＭＩＣを決定する方法である。

一方、ディスク拡散法は、一定量の薬剤を含有したディ
スク（濾紙）を予め被検菌が接種された寒天平板上に置
き、一定時間培養後、ディスクの周囲に形成される細菌
の発育阻止帯（阻止円）の大小を測定することにより感
受性／耐性を決定する方法である。

しかるに、上記いずれの方法も、細菌の生育に要する培
養時間が必要となるため、大腸菌に代表される速育性の
細菌であっても、検体提出後、測定結果が判明するまで
に４８時間以上を要し、感染症の治療上重要である初期
治療に検査結果が有効に利用されていない。

さらに、多数の検体を処理するためには、その操作法は
、結果の判定法と共に非常に煩雑である。

また、近年開発が進んでいる種々の自動化機器は、薬剤
存在下での細菌の生育な濁度または散乱光強度の変化と
して光学的にとらえることにより感受性／耐性を決定す
るものであるが、この場合、死滅菌や細胞壁合成阻害剤
の作用時に見られる菌体の伸（膨）長の影響を受けるこ
と、遅育性の細菌には適用できない等の精度的、感度的
な問題点を残しており、しかも装置価格およびラニング
コストが高価であるために、広（普及するには至ってい
ない。

〈発明が解決しよとする課題〉 本発明は、上記従来技術の欠点に鑑みなされたもので、
各種薬剤存在下における細菌の生育状態を、迅速、簡便
に検出できるようにした細菌の薬剤感受性測定方法を提
供することを目的とする。

〈課題を解決するための手段〉 このような目的は、以下の本発明により達成される。

即ち、本発明は、各種濃度の薬剤を含有する培地にて細
菌を培養し、前記細菌の酸化還元能を利用して、前記細
菌の前記薬剤に対する感受性を測定する細菌の薬剤感受
性測定方法であって、 酸化還元指示薬を前記培地に添加し、その色調変化の度
合または蛍光強度を光学的に測定することにより、前記
細菌の前記薬剤に対する感受性を測定することを特徴と
する細菌の薬剤感受性測定方法である。

また、前記酸化還元指示薬はレサズリンであり、該レサ
ズリンのレゾルフィンへの還元に基づく色調変化の度合
を検出するにあたり、５５ｅ〜６００　ｎｍの範囲の少
な（とも１点の波長における吸光度を測定することによ
り行う細菌の薬剤感受性測定方法であるのが好ましい。

また、前記酸化還元指示薬はレサズリンであり、該レサ
ズリンのレゾルフィンへの還元の度合を検出するにあた
り、励起光を照射し、波長５８０〜５９０　ｎｍの蛍光
強度を測定することにより行う細菌の薬剤感受性測定方
法であるのが好ましい。

以下、本発明の細菌の薬剤感受性測定方法について詳細
に説明する。

細菌は多数の有機物および無機物を酵素的に酸化還元し
、それによって必要な物質を合成し、不必要または有害
な物質を代謝し、あるいは生命維持に必要なエネルギー
を獲得する。　これらの反応に関与する酸化還元酵素は
、多数知られており、特に菌体内に最も多量に存在する
酸化還元酵素に関与する補酵素であるＮＡＤ　（Ｈ）や
ＨＡＤＰ　（Ｈ）を電子受容体（または供与体）とする
酵素は数多（知られ、その例として、アルコール、乳酸
、グリセルアルデヒド−３−リン酸、３−ヒドロキシス
テロイド等のデヒドロゲナーゼが挙げられる。

本発明は、細菌が普遍的に有する種々の酸化還元酵素活
性に着目し、薬剤存在下における細菌の生育状態を、細
菌の生育に伴う前記酵素活性の増大を指標として、細菌
の薬剤感受性を測定するものである。

臨床上分離される細菌および臨床上使用される薬剤存在
下において、細菌の前記酵素活性、即ち酸化還元能を測
定する方法としては、酸化還元指示薬（以下、単に指示
薬という）を培地、特に液体培地に添加し、その色調変
化の度合または蛍光強度の大小を、それぞれに応じた光
学的測定方法により検出するのが好ましい。　このよう
な指示薬としては、例えばレサズリン、テトラゾリウム
塩、またはこれらに類するものが挙げられる。

以下、指示薬としてレサズリンを用い、細菌がレサズリ
ンを還元してレゾルフィンを生成せしめる反応を利用す
る場合について代表的に説明する。

レサズリンは、細菌の生育に伴う種々の酸化還元酵素活
性により、レゾルフィンに還元される。　この反応式を
次に示す。

この反応は非可逆的で、上記式中のプロトンおよび電子
は各種酸化還元反応において授受されるプロトンおよび
電子により供給される。

一方、細菌が薬剤に対して感受性である場合は、上記反
応は起こらないかまたは最低限に抑えられる。　即ち、
各種薬剤存在下における細菌のレサズリン還元能を測定
することにより、細菌の薬剤に対する感受性を容易に判
定することができる。

レサズリンは、中性条件下で青色を示し、波長６００　
ｎｍ付近に吸収極大を有する。　一方、レゾルフィンは
、桃色を示し、波長５７０ｎｍ付近に吸収極大を有する
。

なお、レサズリンは、アルキル基、ニトロ基、メトキシ
基、ハロゲン原子等の置換基を有するものであってもよ
い。

本発明においては、各種濃度の薬剤と、レサズリンとを
含有する培地にて細菌を培養し、その色調の変化（青色
→桃色）等を、正確な測定結果を得るために、光学的に
測定する。　そして、所定の判定基準に基づいて、ＭＩ
Ｃ等を決定する。

以下、光学的な測定の具体的方法について説明する。

段階希釈した薬剤（臨床上使用されるもの）を含有する
培地に所定濃度（好ましくは、１０〜１０１００ＩＬの
レサズリンを添加し、被検菌を接種、一定時間培養後、
５５０〜６００ｎｍの範囲の少な（とも１点の波長の吸
光度を測定する。

レサズリンの還元、即ち細菌の生育の度合は、 ■レサズリンの吸収極大である６００ｎｍの吸収の減少
、■レゾルフィンの吸収極大である５　７０　ｎｍの吸
収の増加、または■５７０ｎｍと６００　ｎｍの吸光度
差［ＯＤ！？。−ＯＤ、、。］を指標として検出するの
が好ましい。

特に、上記■の場合、培養に伴う濁りの散乱によるベー
スラインの浮き上がり等の妨害成分の影響を排除した測
定が行えるため、有用である。

本発明では、前記吸光度値をそのまま薬剤感受性測定の
指標とすることもできるが、さらに詳細な判定を行うた
めに、吸光度差［ＯＤＢ？。−ＯＤ、。。］値から次式
（１）により算出される生育％を求め、これにより判定
するのが好ましい。

Ａ：薬剤存在下における吸光度差 ［ｏＤｓｔ。−ＯＤ、。。］ Ｂ：薬剤を含まないときの吸光度差 （耐性対照） Ｃ：細菌を接種しないときの吸光度差 （感受性対照） なお、生育％からの感受性の判定基準は、薬剤毎に異な
り、薬剤の作用機序、作用時間および濃度等の条件に基
づいて決定される。

また、本発明では、リサズリンのレゾルフィンへの還元
の度合を蛍光強度の測定により求めることができる。

レサズリンは、蛍光性を有さず、レゾルフィンは、蛍光
性を有する。　従って、レサズリンのレゾルフィンへの
還元は、蛍光物質の生成としてとらえることができる。

具体的には、前記と同様にして細菌を培養した後、例え
ば波長５４０〜５５０　ｎｍの励起光を照射し、蛍光波
長５８０〜５９０　ｎｍの強度を測定し、その蛍光強度
の大小を測定することにより感受性を判定する。

なお、この場合、励起光の種類、波長等は特に限定され
ない。

〈実施例〉 （実施例１） ニスケリチア・コリＡＴＣＣ２５９２２株をミューラー
・ヒントン寒天培地で、３７℃、１８時間培養して得ら
れたコロニーを釣菌し、滅菌蒸留水にマクファーランド
濃度Ｎ００１（約１０　”／ｍｌ）となるように懸濁し
た。

一方、アンピシリン（ＡＢＰＣ）を滅菌蒸留水に溶解し
、２倍段階希釈したＡＢＰＣ溶液を９６穴マイクロプレ
ートに１ウェル当り１００μＥずつ分注した。　ＡＢＰ
Ｃ濃度は、菌液接種後、最終的に０．５．１．２．４．
８．１６．３２．６４μｇ力価／ＩＩＩｊとなるように
調製した。

次に濾過滅菌したミューラー・ヒントンブロス　（ｐＨ
７，４）４．８ｍｆｆ１に４．ＯＸｌｏ−３Ｍレサズリ
ン水溶液１００μ恋を添加し、上記ニスケリチア・コリ
懸濁液１００μＥを接種したこの菌液を、上記ＡＢＰＣ
溶液が分注されたマイクロプレートに、１ウェル当たり
１００μｍずつ接種し、３７℃、４時間培養後、島原製
作所社製吸光度計ＵＶ−１６０型により各ウェルの吸光
度ＯＤ、、。およびＯＤ　ｓ。。を測定した。

第１図にＯＤｉ、。およびＯＤ　ｓ。。の測定結果、第
２図に吸光度差［ＯＤ、？。−ＯＤ、。。Ｊ１第３図に
生育％をそれぞれ示す。　第１図〜第３図のいずれより
も、ＡＢＰＣ濃度が２Ｍｇ／ｍｊでレサズリン還元が抑
制されていることがわかる。　この結果は、ＮＣＣＬＳ
により標準化されたＭＩＣ測定法で測定したＭＩＣ値（
＝２μｇ／　ｍｌ）と一致するものである。

（実施例２） 実施例１と同様の方法で、各種濃度のアンピシリン（Ａ
ＢＰＣ）、セファゾリン（ＣＥＺ）およびゲンタミシン
（ＧＭ）の存在下における、下記表１に示す各菌種のレ
サズリン還元能を測定し、レサズリン還元が抑えられた
薬剤濃度をＭＩＣとして求めた。

表１に、吸光度測定結果より前記式（１）に基づいて算
出した生育％の結果とこれにより求めたＭＩＣおよびＮ
ＣＣＬＳ標準法により測定したＭＩＣを示す。

なお、本発明法によるＭＩＣは、生菌数と生育％の相関
性、生菌数一定のときの生育％等を総合的に考慮し、生
育％が５０％以下となる最大の薬剤濃度をＭＩＣとした
。

表１に示すように、本発明法とＮＣＣＬＳ法によるＭＩ
Ｃ値はいずれの菌種および薬剤においても一致しており
極めて信頼性の高いものであることがわかる。

〈発明の効果〉 本発明の細菌の薬剤感受性測定方法によれば細菌の酸化
還元能を指標とすることにより、従来の測定法に比べ、
迅速かつ簡便に細菌の薬剤感受性検査を行うことができ
る。

特に、レサズリンのレゾルフィンへの還元の度合を光学
的に検出する場合には、薬剤感受性の測定精度が高い。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１における吸光度０Ｄｓｙ。 およびＯＤ、。。を示すグラフである。 第２図は、実施例１における吸光度差 ［ｏＤｓｙ。−ＯＤ、。。］を示すグラフである。 第３図は、実施例１における生育％を示すグラブである
。 （−ｅ−）ＯＬ’＋　（ＩＱ （−ｏ−）００９（ＩＱ Ｆ　Ｉ　Ｇ：　２ ＡＢＰＣ濃！（Ｐ９２Ｉイａ／ｍｌ　　）ＦＩＧ、３

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）各種濃度の薬剤を含有する培地にて細菌を培養し
   、前記細菌の酸化還元能を利用して、前記細菌の前記薬
   剤に対する感受性を測定する細菌の薬剤感受性測定方法
   であって、 酸化還元指示薬を前記培地に添加し、その色調変化の度
   合または蛍光強度を光学的に測定することにより、前記
   細菌の前記薬剤に対する感受性を測定することを特徴と
   する細菌の薬剤感受性測定方法。
2. （２）前記酸化還元指示薬はレサズリンであり、該レサ
   ズリンのレゾルフィンへの還元に基づく色調変化の度合
   を検出するにあたり、５５０〜６００ｎｍの範囲の少な
   くとも１点の波長における吸光度を測定することにより
   行う請求項１に記載の細菌の薬剤感受性測定方法。
3. （３）前記酸化還元指示薬はレサズリンであり、該レサ
   ズリンのレゾルフィンへの還元の度合を検出するにあた
   り、励起光を照射し、波長５８０〜５９０ｎｍの蛍光強
   度を測定することにより行う請求項１に記載の細菌の薬
   剤感受性測定方法。