JPH02211900A - 真核生物ゲノムからの核酸断片及びその単離方法 - Google Patents

真核生物ゲノムからの核酸断片及びその単離方法

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JPH02211900A
JPH02211900A JP1226364A JP22636489A JPH02211900A JP H02211900 A JPH02211900 A JP H02211900A JP 1226364 A JP1226364 A JP 1226364A JP 22636489 A JP22636489 A JP 22636489A JP H02211900 A JPH02211900 A JP H02211900A
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acid fragment
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エベルハルト　ボーンケ
Hans-Hermann Dr Sonneborn
ハンス　ヘルマン　ゾンネボルン
Christian Rittner
クリスティアン　リットナー
Peter Mathias Dr Schneider
ペーター　マティアス　シュナイデル
Ulrike Schacker
ウルリケ　シャッケル
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は真核生物のゲノムからの核酸断片、その単離及
び合成方法並びに真核生物中の制限断片長多型（ＲＦＬ
ＰＳ　）の検出のためのその使用に関する。
真核生物のゲノム中の多型的配列は個体の同定及び個体
間の類縁関係の決定のために用いられる。
配列各型の検出の可能性は制限酵素によるゲノムＤ　Ｎ
　Ａの配列特異的切断に基づいている。これはゲノムＤ
ＮＡを特定の配列（制限部位）に於てＤＮＡ２本鎖を切
断する酵素により制限切断させることが該制限酵素によ
って同定された配列の位置によって異なる長さの断片を
もたらすからである。個体のすべての体細胞のゲノムは
若干の稀な体細胞突然異変以外は同一である。このため
、ＤＮＡがどんな組織から単離されたかは問題でなく、
完全な制限切断後に同じ制限断片が得られる。
しかし、遺伝学的に異なる個体は配列の差違を示し、そ
れによって特に制限酵素の切断部位又は２つの切断部位
間にある配列の長さが変わり得る。
それから生ずる遺伝子座における制限断片の長さの可変
は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）と呼ばれる。突然変異
によるＤＮＡ配列の変化は生殖経路でまれでもあるので
、制限部位は安定な方法で伝えられる。従って、両親の
一方の制限断片は彼（又は彼女）の子孫のおのおのの制
限断片と５０％同じである。従って、制限断片は個体の
典型及び類縁間、係の証明の両方のためのマーカーとし
て用いられる。ＲＦＬＰ、の解析のためには、サザン（
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ブロー）ト法〔サザン（Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎ）　、ｒＥ、、　Ｊ、Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｌ、　　Ｊ　９８．５０３−５１７、（１９７５
））が用いられた。この方法では、制限消化後に得られ
た２本鎮ＤＮＡ断片を最初に電気泳動によりそれぞれの
サイズによって分離し、１本鎖に解離した後、個体キャ
リヤーに結合させる。求めている断片は、−本鎮制限断
片とハイブリダイズして、２本鎖を形成する塩基対結合
によってプローブとの配列相同を示す標識核酸プローブ
によって検出される。プローブとハイブリダイズする各
制限断片の位置はプローブの標識によるバンドとして検
出される。
プローブによって得られろる遺伝情報の量は、該プロー
ブとの配列相同を有する遺伝子座の数及び該遺伝子座に
於ける多型の度合に依存する。それぞれの文献中には、
高度に多型の反復配列（ミニ付随体）と相同である数多
くのプローブが記載されている〔ジｓ７リーズ（Ｊｅｆ
ｆｒｅｙｓ）　、Ａ、Ｊ、。
ら、「ネーチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　　Ｊ　３１４．
６７−７３、（１９８５）　　；　ＥＰ−Ａ　１−０１
８６２７１号；ハラサート（Ｖａｓｓａｒｔ）　、Ｇ、
、　　ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　Ｊ　２３
５．６８３−６８４、（１９８７）　；Ｅ　Ｐ−Ａ　２
−０２６４３０５号；ジョーンズ（Ｇｅｏｒｇｅｓ）、
組、ら、ｒＮｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、Ｊ　　１５
．７１９３、（１９８７）］。ミニ付随体に於て、制限
断片の長さは、制限酵素によって同定される配列が反復
配列に含まれないことを条件として、反復配列の基本モ
チーフの反復数によって本質的に決定される。ミニ付随
体プローブは真核生物のゲノム中の多数の遺伝子座と相
同を示すので、多数の制限断片とハイブリダイズし、個
体特異性バンドパターン、すなわち個体の遺伝的典型の
ため及び類縁関係の決定のための高容量の情報を有する
「遺伝的指紋」を提供する。
「指紋」のバンドは強度が異なる。バンドの強度は結合
したプローブ分子の数によって本質的に決定される。結
合はプローブと標的配列との間の相同の程度、相同配列
の長さ及びハイブリダイゼーション条件（塩濃度、温度
）に依存する。低強度のバンドをも含むためには、極度
に高感度の検出装置の使用が必要である。従って、「遺
伝的指紋」のためのプローブは今まで放射性標識されて
きた。放射性標識が必要なためミニ付随体プローブのユ
ーザーの数が制限される。プローブをより広い範囲のユ
ーザーに有用にするためには、非放射性検出技術の導入
が必要である。
はとんどの非放射性方法では、ビオチンで標識されたプ
ローブが用いられる。結合したプローブの検出は酵素反
応によって行われ、ビオチン−アビジン（又はビオチン
−ストレプトアビジン）橋によるパイプリダイゼーショ
ン後に酵素をプローブへ結合させる〔リアリー（Ｌｅａ
ｒｙ）、Ｊ、　Ｊ、　、　　ら、ｒＰｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、＾、」８０．
４０４５−４０４９、（１９８３）；フォースター（Ｆ
ｏｒｓｔｅｒ）、＾、Ｃ８，ら、　ｒＮｕｃｌ、Ａｃ１
ｃｌｓ　Ｒｅｓ、Ｊ　　　１３．７４５−７６１、（１
９８５）；ビッシジ（Ｖｉｓｃｉｄｉ）、Ｒ，Ｐ、　、
　　ら、ｒＪ、　ＣＩ　ｉｎ、　Ｍｉｃｒｏｂ、Ｊ　２
３．３１１−３１７．１９８６）。ビオチン標識プロー
ブと関連する酵素検出系の感度は１倍体真核生物ゲノム
中（“単一コピー″　ｒＧｅｎｅｓ　Ｊ　）中に１回し
か起こらない配列の検出に充分であることが知られてい
る〔ダイクス（Ｄｙｋｅｓ）、Ｄ、、ら、「エレクトロ
フォレシｘ　（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）」７
．２７８−２８２、（１９８６）；ジェルトン（Ｓｈｅ
ｌｄｏｎ）、ε、１．、ら、ｒＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、［Ｊ、Ｓ、＾、」８３．９０８５−９
０８９、（１９８６）　　；　７７クインス（Ｍｃｌｎ
ｎｅｓ）ら、［バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ）　Ｊ５．２６９−２７２、（１９８７
）］。
「遺伝的指紋」中の幾つかのバンドは上に挙げたように
ほんの低い強度であるので、非放射性検出技術の使用は
信号増強によって改良されるだろう。かかる増強の１つ
の可能性は標的分子１個当たりの結合プローブの数を増
すことである。ヨーロッパ特許Ａ　１−０１２４２２１
号、ヨーロッパ特許Ａ　３−０２０４５１０号及びＷｏ
　８７１０３６２２号中に、それぞれの提案が記載され
ている。これに関連して、信号の増強は少なくとも２タ
イプのプローブの複合体の生成によって達成された。第
１タイプのプローブは異なる機能を有する２部分からな
る。
第１部分は目的配列と相同であり、第２部分は第２タイ
プのプローブの少なくとも１つと相同である。プローブ
の配列は、タイプ２の幾つかのプローブがタイプ１のプ
ローブのおのおのに結合し、それによって標的分子１個
当たりの結合プローブ数を増加することができるように
選択される。これらのアプローチには、いくつかの連続
的ハイブリダイゼーション段階またはプローブの混合物
とのハイブリダイゼーションのいずれかが要求される。
従って、本発明の基礎をなす技術的課題は真核生物から
のＲＦＬＰｓを高い検出感度で確認するのに適しており
かつこの目的のために放射性標識なしに使用することも
できる核酸断片を提供することである。さらに、本発明
の基礎をなす第二の技術的課題は該特性を有する核酸断
片を単離又は合成する方法を提供することである。
該技術的課題は本発明の特許請求の範囲中で特徴づけら
れる主題を提供することによって解決される。
従って、本発明によれば、下記の特徴：（ａ）　　バク
テリオファージＭ１３の蛋白質■遺伝子のＮｃｉＩ／Ｃ
１ａｌ断片により真核生物の遺伝子ライブラリーをスク
リーニングすることによって得られうること、及び （ｂ）　　ベクターＤＮＡの分子が、ベクターＤＮＡと
相同の標的配列に結合するよりも、それがその中に含ま
れている少なくとも５乃至１０倍数量の組換えＤＮＡ分
子を核酸配列と相同の標的配列に結合させること を有する、真核生物ゲノムの核酸断片が提供される。
本発明の核酸断片は、好ましくは塩基配列５’　−ＣＧ
ＧＣＧＧＷＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＴＹＧＧＴＴＧＴＧＳ
−３’（上記配列中、Ｗｌ！Ｔ又はＡであり、ＳはＧ又
はＣであり、ＹはＣまたはＴである。） を有する反復配列を少なくとも１回含む。
本発明の核酸断片はＤＮＡ又はＲＮＡ断片であり、好ま
しくはＤＮＡ断片である。
本発明の核酸断片は真核生物のミニ付随体配列及びその
中に存在するＲＦＬＰｓの検出用のプローブとして特に
適している。
本発明の核酸断片は、ヨーロッパ特許Ａｌ−０１８６２
７１号及びヨーロッパ特許Ａ２−０２６４３０５中に記
載されている核酸断片とは、その「指紋」パターン及び
その使用によってもたらされる増強効果が異なる。この
効果は、本発明の核酸断片とヨーロッパ特許Ａ　１−０
１８６２７１号及びヨーロッパ特許Ａ　２−０２６４３
０５号中に記載されている核酸断片との間の構造の差違
によるものである。
ヨーロッパ特許Ａ　２−０２６４３０５によれば、ヒト
及び動物のＲＦＬＰｓの検出のために完全なＭ１３分子
を用いている。しかし、本発明は、Ｍ１３分子とハイブ
リダイズするが、Ｍ１３分子とは構造が異なっていなけ
ればならない真核生物ゲノムからの核酸断片を、その使
用が増強効果を含むので使用する。
既知の最初に記載した信号増強スキームを越える利益は
、標的配列自体が信号増強に寄与するので、標的の認識
及び信号増強が同一配列の核酸断片すなわち１タイプの
断片によって達成されることである。
１つの好ましい実施態様に於て、核酸断片は哺乳動物の
ゲノムに由来する。
１つの特に好ましい実施態様に於ては、核酸断片はヒト
のゲノムに由来する。
特に好ましい実施態様の１つはヒトのゲノムからのプラ
スミドｐＵＣ−Ｍ２１．３に含まれる１、９ｋｂ　Ｐｓ
ｔ／　ＢａｍＨＩ制限断片である。このインサートのＤ
ＮＡ配列はそれ自体既知の方法で決定される。
プラスミドｐＵＣ−Ｍ２１．３は、ブダペスト条約の規
定に従って、ドイツ連邦共和国、ブラウンシュバイク（
Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）　、ＤＳＭ　　ＣＤｅｎｔ
ｓｃｈｅＳａｍｍＩｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇ
ａｎｉｓｍｅｎ＝ドイツ微生物コレクション（Ｇｅｒｍ
ａｎ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｏｒｇ
ａｎｉｓｍｓ）］に、１１９８８８８月２３に寄託番号
Ｏ５Ｍ　４７７２で寄託された。
上記の特定のＤＮＡ配列はプラスミドｐＵＣ−ＭＺ１．
３中に含まれる。
本発明の核酸断片は１本鎖でも２本鎖でもよい。
さらに、本発明の核酸断片は部分的又は完全に相同な個
々の鎖からなることができる。
本発明の核酸断片は放射性標識され得る。
螢光標識又は酵素標識があるいは別の標識への分子橋と
して働く化学基が施された本発明の核酸断片はその使用
に含まれる増強効果のために、真核生物のＲＦＬＰｓの
検出にも適している。
本発明の核酸断片は、完全なＭ１３ゲノムによる、好ま
しくはＭ１３ゲノムの蛋白質■遺伝子のＮｃｉ　Ｉ　／
Ｃ１ａ　Ｉ断片によるハイブリダイゼーションによって
真核生物の遺伝子ライブラリー中で同定され得る。同定
された配列は次にそれ自体既知の方法で遺伝子ライブラ
リーから単離される。この方法で用いられるハイブリダ
イゼーション条件は４０−４５℃、０．４−０．９Ｍ　
ＮａＣｌ！、　４０−５０％ホルムアミド、ｐＨ７−７
，５、好ましくは４２℃、０．９ＭＮａＣｊ！、４０％
ホルムアミド、ｐＨ７，４である。厳重な洗浄工程は６
５℃に於て０．３−０．０３Ｍ　ＮａＣｌ！、ｐＨ７−
７，５まで、好ましくは０．１５Ｍ　Ｎａ１ＳｐＨ７，
４まで行われる。これらは通常のハイブリダイゼーショ
ン条件である。
上記単離方法のもう１つの実施態様に於ては、本発明の
核酸断片の同定は、それ自体上記のようにして単離され
た核酸断片とのハイブリダイゼーションによって行われ
る。
最後に、本発明の核酸断片は、上記のようにして単離さ
れた核酸断片のＤＮＡ配列を考慮に入れて行われるＤＮ
Ａ合成によって調製されることができる。合成に於て数
回のＤＮＡ断片を考慮すること及びこれらの断片に対応
するコンセンサス配列を合成することも可能である。
第１図はサザンプロットでの制限マツピングによるバク
テリオファージクローンＭ２１．３のヒトインサートの
解析を示す。
ａ、２時間露出 す、１６時間露出 ０．８％７カｏ−スケル；　Ｌ／−：／１　：λＭＺ１
．３の完全なＰｓｔ　Ｉ　／　ＢａｍＨＩ−消化ＤＮＡ
Ｉ、！Ｊｇ；レーン２−５：１，１２１．３の精製１．
９　ｋｂ　Ｐｓｔｌ／Ｂａｍ）ＩＩ断片１１００ｎ；レ
ーン２：完全断片；レーン３：部分Ｍｓｐ　Ｉ消化；レ
ーン４：完全Ｍｓｐ　Ｉ−及び部分５ａｕ３Ａ−消化；
レーン５：部分３ａｕ３Ａ−消化。プローブ二Ｍ１３の
蛋白質■遺伝子の２８２　ｂｐ　ＨａｅＩＩＩ／Ｃ１ａ
　Ｉ断片、比放射能１，４ＸＩＯ″ｃｐｍ　／μｇ、３
　Ｘ　Ｉ　Ｑ　’ｃｐｍ／ｒｎｌ！ハイブリグイゼーシ
ョン溶液；ハイブリダイゼーション緩衝液：５ｘＳＳＣ
，１％ＳＤＳ、１０ｍＭ）リス／Ｈ＋ｌ！　　（ｐｌ（
８，０）　、２Ｍ　ＥＤＴＡ、５μｇ／ｍ１ｔＲＮＡ、
２％乾燥粉乳。プレハイブリダイゼーション＝６０℃、
３時間。ハイブリダイゼーション＝６０℃、２０時間、
洗葎工程：室温に於て２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳで２
ＸＩ５分、６５℃に於て２ＸＳＳＣ１０，１％ＳＤＳで
２Ｘ３０分。コダックＸＡＲ−５Ｘ線フィルムの露出、
室温に於て１時間。
第２図１２ｐＵｃ１８中（１１）１．９　ｋｂ　ＭＺ　
１．３断片の制限地図である。
制限部位：　Ｐｓｔ　Ｅ　７１ＢａｍＨＩ　＊、　Ｍｓ
ｐ　Ｉ、３ａｕ３ＡＸ（ベクター中のＭｓｐｌ及び５ａ
ｕ３Ａ切断部位は示してない）。
第３図はｐＵＣ−ＭＺｌ、３のインサートと相同を有す
るＭ１３ゲノムからの制限断片の同定を示す。
０．６％アガロースゲノペ制限酵素によって消化された
Ｍ１３ＤＮＡ１００ｎｇをル−ン当たりに適用する。レ
ーン１及び４：Ｃ１ａＩ消化：レーン２及び５　：　Ｃ
１ａ　Ｉ／Ｎｃｉ　Ｉ消化；レーン３及び６　：　Ｎｃ
ｉ　Ｉ消化。プローブ：レーン１−３：Ｍｌ３、比放射
能：５．４Ｘ１０”　　Ｃｐｍ／Ａｔｇ、ｌＸ１０’ｃ
ｐｍ／−ハイブリダイゼーション溶液、レーン４−６　
：ＭＺ１．３　（１，９ｋｂ　ＰｓｔＩ／ｆ３ａｍＨＩ
＞、比放射能：１．７ＸＩ　Ｑｓ　ｃｐｍ　／μＩｆ　
　ＩＸＩ　Ｏ’　Ｃｐｍ　／ｍ！！ハイブリダイゼーシ
ョン溶液、ハイブリダイゼーション緩衝液：５ＸＳＳＣ
，１％ＳＤＳ、１０ｒｎＭ）リス／）ＩｔＪ（ｐＨ８，
０）　、２ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　５　Ａ１ｇ／ｍｌ　ｔ
ＲＮＡ。
２％乾燥粉乳。プレハイブリダイゼーション二６０℃、
３時間；ハイブリダイゼーション＝６０℃、２０時間；
洗浄工程：室温に於て２×ｓｓｃ、ｏ、１％ＳＯ３で２
ＸＩ５分；６５℃に於て２ｘｓｓｃ、ｏ、ｉ％ＳＤＳで
２Ｘ３０分。コダックＸＡＲ−５Ｘ線フィルムの露出、
室温に於て１時間。
第４図は放射性標識プローブｐＵＣ−Ｍ２１．３による
２種の非血縁血液供与体のＲＦＬＰ断片の解析を示す。
制限消化：１０．！ｊＨのＤＮＡ、４０Ｕの旧ｎｆｌ；
０．６％アガロースゲルニブローブ：　ｐＵＣ−ＭＺＩ
、３、比放射能：　３　ｘ　１０’　ｃｐｍ　／ｐｇ。
ハイブリダイゼーション緩衝液：５ＸＳＳＣ；１％ＳＤ
Ｓ、ｌＯ＋ｎＭ）す：ｘ、／ＨＣＩ　　（ｐＨ８，０）
、２ＢＤＴＡ、５μｇ／ｍｆｔＲＮＡ０プレハイブリダ
イゼーション６０℃、３時間；ハイブリダイゼーション
：６０℃、２０時間、１．６Ｘ１０６ｃｐｍ　／　ｒｒ
ｄｉ　；洗浄工程：温度：６０℃；２ＸＳＳＣ１０，１
％ＳＤＳでＩ×３０分；１ｘｓｓｃ。
０、１％ＳＤＳで２Ｘ３０分；０．５ＸＳＳＣ。
０．１％ＳＤＳで２Ｘ３０分。コダックＸＡＲ−５の露
出、増強用スクリーンを用いて一７０℃に於て３時間。
第５図はクローン化ＤＮＡ断片についてのサインプロッ
ト中のｐＵＣ−ＭＺ１．３及びＭｌ　３プロ一ブ間の比
較を示す。
０．６％アガロースゲル；レーン１−５及び１１−１５
：Ｃ１ａＩ−消化Ｍ１３ｍｐ８の希釈系列；レーン６−
１０及び１６−２０　：　Ｐｓｔｌ／ＢａｍＨＩ−消化
ｐｕｃ−Ｍ２１．３の希釈系列。各５希釈段階：　０．
０４ｎｇ、　０．１　ｎｇ、　０．３ｎｇ、１ｎＬ　３
ｎｇ。
プローブ：　レ−ｙ　１−１０１；！　ｐＵＣ−ＭＺ　
１．３、比放射能：　２　Ｘ　１０９ｃｐｍ　／μｇ、
Ｉ　Ｘ　１０’ｃｐｍ　／−ハイブリダイゼーション溶
液、とハイブリダイズさせた。レーン１１−２０はＭ１
３ｍｐ８、比放射能：２Ｘ１０’ｃｐｍ／μｇ、ｌｘ１
０”　ｃｐｍ　／ｍｌハイブリダイゼーション溶液、と
ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション緩衝液
：５ｘＳＳＣ，１％ＳＤＳ、１０ｍＭ）すｘ／ＨＣ１（
ｐＨ８，０’）　、２ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　　５μｇ／
ｍｌ　ｔＲＮＡ、２％乾燥粉乳。プレハイブリダイゼー
ション＝６０℃、３時間。ハイブリダイゼーション＝　
６０℃、２０時間。洗浄工程：室温に於て２ｘＳＳＣ，
０，１％ＳＤＳで２Ｘ１５分：６５℃に於て２ＸＳＳＣ
，０，１％ＳＤＳで２×３０分。コダ７　’）　ＸＡＲ
−５ＸＭフィルムの露出、室温に於て３０分。
第６図は酵素標識プローブｐＵＣ−Ｍ２１．３による３
種の非血縁血液供与体のＲＦＬＰ断片の解析を示す。
制限消化：１０／ＪｇのＤＮＡ、４０Ｕの旧ｎｆｉ；０
．６％アガロースゲル；プローブ：ビオチンで標識され
たρＵＣ−ＭＺ１．３；ハイブリダイゼーション緩衝液
：５ＸＳＳＣ，１％ＳＤＳ。
１０ｍＭ）リス／ＨＣ１（ｐＨ８，０）　、２ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ　、５μｇ／ｍｌ　ｔＲＮＡ０ブレハイブリダイ
ゼーション：６０℃、３時間。ハイブリダイゼーション
＝６０℃、２０時間、１．６　Ｘ　１０″Ｃｐｍ　／ｍ
ｊ’０洗浄工程：温度６０℃、１×３０分、２　Ｘ５Ｓ
Ｃ。
０．１％ＳＤＳ；２Ｘ３０分、１ｘｓｓｃ、０．１％Ｓ
ＤＳ；２Ｘ３０分、０．５ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ、
ストレプトアビジンセイヨウワサビベルオキシダーゼ及
びＴＭＢによる検出。
以下、実施例によって本発明を説明する。
材料及び方法 特に断らない限り、用いた方法はマニアナイス、Ｔ、（
Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、）　　、フリッチュ、Ｅ、Ｆ、
　（Ｆｒｉｔｓｃｈ。
巳、Ｆ、）及びサムプルツク、Ｊ、　（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ、　Ｊ、　）の「モレキュラー・クローニング、ア・
ラボラトリ−１？二、アル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ、Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）
　Ｊ　　Ｃコールド・スプリング・ハーバ−・ラボラト
リ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ）、１９８２）中に記載されている。
Ｍ１３配列と相同を有するヒト配列の単離ヒトのリンパ
球のゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ（好ましく
は５ａｕ３Ａ）で部分的に消化した。断片を、断片の挿
入のために調製されたλバクテリオファージゲノム（好
ましくはファージＥＭＢＬ３のＢａｍＨＩ消化ゲノム）
中へ、Ｔ。
リガーゼによって触媒される反応中に挿入させた。
次に、λパッケージングエクストラクト〔バッカジーン
ーキット　（Ｐａｃｋｇｅｎｅ−Ｋｉｔ）　、プロメガ
−ビオチック（Ｐｒｏｍｅｇａ−Ｂ　１ｏｔｅｃ）、マ
ジソン、ＷＩ、　Ｕ、　Ｓ、＾〕を用いて、結合生成物
を集めて感染性ファージをつくった。このファージの増
殖に適した株の細菌（好ましくは大腸菌ＮＭ５３９）を
少なくとも８ＸＩＯ’　ＰＦＵ　（プラーク形成単位）
のファージで感染させ、遺伝子ライブラリーの増幅のた
めに平板培養した。増幅されたファージを溶出によって
培養皿から採取した。遺伝子ライブラリーの作成のため
には、マニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）　　ラ（１９
８２，２５６−３０７頁）が記載している方法を用いた
。遺伝子ライブラリーの作成の詳細な記載はシュナイダ
ー、Ｐ、　Ｍ、（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、　Ｐ、　Ｍ、　
）〔学位論文、マイン７　（Ｍａｉｎｚ）、（１９８７
）：］中に見られる。
インサートがバクテリオファージＭ１３の蛋白質■遺伝
子中の反復配列と相同であるλファージの同定はベント
ン（Ｂｅｎｔｏｎ）及びデービス（Ｄａｖｉｓ）〔「サ
イｘンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」１９６．１８０−１８２
、（１９７７）　）のその場でのハイブリダイゼーショ
ン方法によって行われた。すなわち適当な株の細菌（好
ましくは大腸菌Ｑ３５８）を増幅されたファージライブ
ラリーのアリクオツド　（１０ｓ〜１０’　ＰＦＵ）で
感染させ、寒天皿上で１５０−３００プラーク／ｃｄの
密度で平板培養した。皿のし７’　ＩＪ力は、ニトロセ
ルロースフィルター上で調製された（ＢＡ８５、シニラ
イヒ＋　−（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ）及びシュル（Ｓｃ
ｈｉ；１１）　、ダッセル；ビオトレースＮＴ　（Ｄａ
ｓｓｅｌ　；Ｂｉｏｔｒａｃｅ　ＮＴ）、ゲルマンサイ
エンス（Ｇｅｌｍａｎ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）、アン・ア
ーバー（Ａｎｎ＾ｒｂｏｒ）、Ｍｌ、Ｕ、Ｓ、Ａ、］　
。−ｙアージＤＮＡの解離、変性及び固定後、フィルタ
ーをバクテリオファージＭ１３＋ｒ＋ｐ８の完全なゲノ
ムからなるプローブと、あるいはバクテリオファージＭ
１３の蛋白質■のＮｃｉＩ／ＣｌａＩ断片を含むプロー
ブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションに
先立って、プローブをニック・トランスレーションによ
って放射性情同位体３２ｐで標識しておく。フィルター
のブレハイブリダイゼーションは、６ＸＳＳＣ（２０Ｘ
Ｓ　ＳＣ：　３Ｍ　ＮａＣ１，０，３Ｍクエン酸ナトリ
ウム１）８７．０のストック溶液から調製）、４０％ホ
ルムアミド、５ｍＭ　ＥＤＴＡ　　（エチレンジアミン
四酢酸塩）及び０．２５％乾燥粉乳中で、４２℃に於て
４時間行った。フィルター表面の１　ｃａｔ当たり０．
１５ｍ１の緩衝液を用いた。ハイブリダイゼーションは
、同じ緩衝液中で、標識プローブ（Ｉ　Ｘ　１０’　ｃ
ｐｍ　／ｒｎｌ）を加えて行った。ハイブリダイゼーシ
ョン時間は１５時間であり、１　ｃｃ＋ｌ当たり０．１
５−の緩衝液を用いた。ハイブリダイゼーション後、フ
ィルターを下記のように洗浄した。
室温に於て２Ｘｓｓｃ、０．１％ＳＤＳ　（ドデシル硫
酸ナトリウム）で１５分間２回、６５℃に於て２ＸＳＳ
Ｃ，０，１％ＳＤＳで１５分間２回、６５℃に於て１ｘ
ｓｓｃ、０．１％ＳＤＳで１５分間１回、６５℃に於て
ＳＤＳ無しでｌＸ５ＳＣで１５分間１回。フィルターを
室温に於て空気中で乾燥した後、フィルターと増強用ス
クリーンとの間にＸ線フィルム〔フビＲＸ＝ｘ　−（Ｆ
ｕｊｉ　ＲＸ　ＮεＷ）］を置き、−７０℃に於て５日
間露出させた。プローブによる陽性シグナルを与えるλ
プラークを遺伝子ライブラリー皿から取り出し、これら
のプラークをもう１度より低濃度で平板培養した。Ｍ２
Ｓと反応した個々のプラークは新しいハイブリダイゼー
ションにより上記のようにして同定された。このハイブ
リダイゼーション後に残る陽性λクローンからＤＮＡを
単離した。同定及び単離方法はマニアナイス（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ）　　ら（１９８２，３０９−３７３頁）中に
詳述されている。
λバクテリオファージからのＤＮＡの単離個々のプラー
クのバクテリオファージを適当な宿主株（好ましくは大
腸菌Ｑ３５８）の４ｒｎｌ培養中で培養した〔マニアナ
イス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）　　ラ、１９８２．３７３頁
〕。これらの培養からマニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ
）ら（１９８２，３７１頁）記載の方法によって少量の
ＤＮＡを単離した。多量のλＤ　Ｎ　Ａの調製のために
は、４１ｎ１培養の５×１０８フアージを１０１０菌（
大腸菌Ｑ３５８）と混合し、さらに５００ｍ１培養に拡
張した〔マニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、１９８
２．７７−７８頁〕。
この培養からファージの単離、Ｃ５Ｃｊｌ！勾配上での
精製及びＤＮＡの抽出をマニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ）ら（１９ｇ　２．８０−８３頁）に従って行った。
プラスミドＤＮＡの単離 マニアナイス（Ｉｌａｎｉａｔｉｓ）　　ら（１９８２
，３６Ｂ−３６９頁）記載のアルカリ解離方法に従って
、２−３ｍｊ！の小培養のプラスミドＤＮＡを単離した
。
より多量のプラスミドＤＮＡはガーガー（Ｇａｒｇｅｒ
）ら（ｒＢｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃ
ｏｍｍ、　Ｊ　１１７．８３５、（１９８３））の方法
に従って１又は２！の培養からＩＩｌ！！！された。
バクテリオファージＭ１３ｍｐ８の２重鎮ＤＮＡの単離 ２水制Ｍ　１３ｍｐ８　ＤＮＡ　（複°製形）の精製ハ
メッシング、Ｊ、　（！Ｊｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ）　（Ｍ
ｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、ｌ旧、２０−７９．１９８
３）の方法に従って行われた。
プラスミド及びバクテリオファージＤＮＡの制限マツピ
ング 菌培養又はファージ培養から単離されたＤＮＡを制限酵
素で消化し〔マニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、１
９８２．９８−１０６頁〕、得られた断片をアガロース
ゲル上で電気泳動によって分離し、エチジウムプロミド
で染色した〔マニアナイス（］ａｎｉａｔｉＳ）ら、１
９８２．１５０−１６３頁〕。
ＤＮＡ長さマーカーとして、制限酵素Ｈｉｎｄ　■によ
って消化されるバクテリオファージλ〔ギブコ（Ｇｉｂ
ｃｏ）　　ＢＲ１．　エッゲンスタイン（εｇｇｅｎｓ
ｔｅｉｎ）　］からのＤＮＡ、及び制限酵素Ｈａｅｍで
消化されるバクテリオファージＰｈ１Ｘ１７４からのＤ
ＮＡを用いた。幾つかの制限酵素による部分的消化及び
消化の結果に従って制限地図を作成した。
制限断片の単離及びグラミド中の断片のサブクロプラス
ミド又はバクテリオファージＤＮＡからの制限断片を分
取ゲル電気泳動によって単離した〔ドレッツエン（Ｄｒ
ｅｔｚｅｎ）、Ｇら、ｒＡｎａｌ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ　１２．２９５−２９８、（１９
８１）　］。
単離された断片の結合には、Ｔ４　リガーゼ〔ファルマ
シ７（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　ＬＫＢ　ＧｍｂＨ，フラ
イブルグ〕を用いた。プラスミド（好ましくはｐＵｃ１
８）の適当な細菌株中への形質転換〔ヤニッシ二−ペロ
ン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）　　、Ｃ，ら、ジ
ーン（Ｇｅｎｅ）３３．１０３−１１９、（１９８５）
］には、ハハハン（Ｈａｈａｈａｎ）、Ｄ（ｒＪ、Ｍｏ
１．Ｂｉｏｌ−Ｊ　１６６．５５７−５８０、（１９８
３）の方法を用いた。
ＤＮＡプローブの放射性標識 放射性標識プローブの調製のためには、精製されたプラ
スミド及びバクテリオファージＤＮＡを、放射性デオキ
シアデノシン三燐酸で、ニックトランスレーション〔ニ
ック・トランスレーションφリージェント・キット　（
Ｎ１ｃｋ　ＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ　Ｋ
ｉｔ）、ギブ：）　（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲ１．　−１−ッ
ゲンスタイン（Ｂｇｇｅｎｓｔｅｉｎ）　）又はランダ
ムプライミング反応〔ランダム・プライニドＤＮＡラベ
リング・キット（Ｒａｎｄｏｍ　Ｐｒｉｍｅｄ　ＤＮＡ
　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ　）　、べ一すンガー−７
ンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　
）Ｇｏ＋ｂ　Ｈ、マツハイム；マルチプライムＤＮＡラ
ベリング・システム（Ｍｕｌｔｉｐｒｉｍｅ　ＤＮＡ　
ＬａｂｅｌｌｉｎｇＳｙｓｔｅｍ）　、アメルシャムＱ
ブフラ−（Ａ＋ｎｅｒｓｈａｍＢｕｃｈ　１ｅｒ）、ブ
ラウンシュワイク（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）　）に
よって、キットメーカーの指示に従って標識した。標識
には、３０００　Ｃｉ／ｍＭの比放射能を有する放射性
ヌクレオシド三燐酸〔アルファ３２Ｐ−ｄＡＴＰ；デュ
ポン（ＤｕＰｏｎｔ）　、ネン・プロダクト・デイビジ
ョン（ＮＥＮ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、
ドライアイヒ（Ｄｒｅｉｅｉｃｈ）　；　アメルシャム
・ブフラー（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｕｃｈｌｅｒ）　、
ブラウンシニワイク（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）　〕
を用いた。
ＤＮＡプローブのビオチン化 ビオチン化デオキシウリジン三燐酸〔ビオチン−１１−
ｄＵＴＰ　（Ｂｉｏｔｉｎ　−１１−ｄＵＴＰ）、ギブ
コ　（Ｇｉｂｃｏ）　Ｂ　ＲＬ　、エッゲンスタイン（
Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ）；　エンゾ・ビオヘム（Ｅｎｚ
ｏ　Ｂｉｏｃｈｅｍ）Ｉｎｃ、、　　＝、、　　Ｅｌ−
り、ＮＹ、　Ｕ、Ｓ、＾、〕での、キットメーカーの指
示によるニック・トランスレーションによってビオチン
標識プローブを調製した。
クローン化ＤＮＡのサザンプロット解析プラスミド又は
バクテリオファージＤＮＡからの制限断片を上記制限マ
ツピングの項で記載したようにして得、電気泳動によっ
て分離しかつ同定した。次に、この断片をニトロセルロ
ース膜１：ＢＡ８５、シニライヒ＋　−（Ｓｃｈｌｅｉ
ｃｈｅｒ）及びシュル（Ｓｃｈｉｉ’ｌ　ｌ）　；　ビ
オトレース（Ｂｉｏｔｒａｃｅ）ＮＴ　。
ゲルマン・サイエンセス（Ｇｅｌｍａｎ　５ｃｉｅｎｃ
ｅｓ）　］又はナイロン膜〔ビオトレース（Ｂｉｏｔｒ
ａｃｅ）ＲＰ、ゲルマン・サイエンセス（Ｇｅｌｍａｎ
　５ｃｉｅｎｃｅｓ）　）へ移した。サインプロット法
はサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）　、Ｅ。
（ＪｏＭｏｌ、　、Ｂｉｏｌ、　　９８．５０３−５１
７．１９７５）によって開発され、マニアティス（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ）　　ら（１９８２，３７４−３８９）中
に詳述されている。ナイロンフィルターへのＤＮＡの移
行には、リード（Ｒｅｅｄ）及びマン（Ｍａｕｎ）　（
Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。
１３．７２０２−７２２１．１９８５）のアルカリ性移
行法（ａｌｋａｌｉｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌ　）を用いた。移行後、フィルターを８０℃に
於て２時間焼きつけた。
ハイブリダイゼーション緩衝液は５ＸＳＳＣ。
１％ＳＤＳ、１０ｍＭ）リス（ＨＣｊｌ！でｐＨ８，０
に調節されたトリスヒドロキシメチルアミノメタン）、
２ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　ｐＨ８，０，５μｇ／ｒｎｌ！
の酵母からのｔＲＮＡ　Ｃベーリンガー・マンハイム（
Ｂｏｅｈｒ　ｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）　Ｇｍｂ　
Ｈ、マンハイム〕及び２％脱脂粉乳からなっていた。プ
レハイブリダイゼーションのために、フィルターを標識
プローブ無しで６０℃に於て３時間この緩衝液中でイン
キユベートした。次に、同じ緩衝液中で、標識プローブ
を添加し、６０℃に於て２０時間ハイブリダイゼーショ
ンを行った。ハイブリダイゼーション終了後、ＳＳＣ濃
度を減少させながらかつ０．１％ＳＤＳの一定濃度でフ
ィルターを６５℃に於て多数回洗浄した。フィルターを
室温に於て乾燥した後、フィルターと増強用スクリーン
との間に置いたＸ線フィルム〔フジ（Ｆｕｊｉ）　ＲＸ
　ＮＥＩＩＩを一７０℃に於て露出した。
ヒトＤＮＡによるサザンプロット解析 ヒ）ＤＮＡについてのサザンプロットのために用いた方
法はクローン化ＤＮＡについてのサザンプロットのため
に上記した方法と大体同じである。
下記の工程中にずれを示す。
１解析につき、１０μｇのヒ）ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｌ
Ｔｌｆｌで完全に消化した。０．６％アガロースゲル上
で制限断片を分離した。ゲルをエチジウムプロミドで染
色した後、断片の消化及び分離を調節し、ＤＮＡ長さマ
ーカーとして、制限酵素旧ｎｄＩ［Ｉで消化されるバク
テリオファージλ〔ギブコ（Ｇ　１ｂｃｏ）　ＢＲ１．
エッゲンスタイン（Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ）　）からの
ＤＮＡを使用した。
ＤＮＡのナイロンフィルター〔ゲルマン・サイエンセス
（Ｇｅｌｍａｎ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）　〕への移行はア
ルカリ性移行〔リード（Ｒｅｅｄ）　、Ｋ、Ｃ，及びマ
ン（Ｍａｎｎ）、Ｄ、Ａ、、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅｓ　　１３、？　２０　？−７２２１，１９８５］に
よって行われた。
フィルターを放射性標識プローブ又はビオチン化プロー
ブと共にインキュベートした。プレハイブリダイゼーシ
ョン用緩衝液は５ＸＳＳＣ，１％Ｓ　ＤＳ、１０ｍＭ　
）リス／ＨＣ１，ｐＨ８，０，２ｍＭ　ＥＤＴＡｌ）Ｈ
８，Ｏ１５ｐｇ／ｍｌ！の酵母からのｔＲＮＡ　（べ一
リンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）　　ＧｍｂＨ，マン
ハイム〕からなっていた。バックグラウンドを減少させ
るため、２％の脱脂粉乳を添加することも可能である。
ハイブリダイゼーションはプローブを添加して同じ緩衝
液中で行われた。ハイブリダイゼーションは６０℃に於
て行われた。プレハイブリダイゼーション時間は２−３
時間であり、ハイブリダイゼーション時間は２０時間で
ある。ハイブリダイゼーション後、フィルターを多数回
の厳重な洗浄工程にかけた。このために、フィルターを
、減少する塩濃度（ＳＳＣ）を有し、０．１％のＳＤＳ
を含む緩衝液中で、６０℃に於てインキュベートした。
放射性標識プローブと共にインキュベートしたフィルタ
ーを、次に室温で乾燥し、フィルターと増強用スクリー
ンとの間に置いたＸ線フィルム〔コダック（Ｋｏｄａｋ
）ＸＡＲ−５）を７０℃に於て露出した。ビオチン標識
プローブと共にインキュベートしたフィルターは洗浄後
酵素的検出について上記したインキュベーション工程に
かけられた。
サザンプロットフィルター上のＲＦＬＰ断片の非放射性
検出 ＲＦＬＰ断片の酵素的検出のためには、ストレプトアビ
ジンセイヨウワサビペルオキシダーゼ複合体〔シー・フ
ェンス（Ｓｅｅ−Ｑｕｅｎｃｅ”″）ＨＬＡ−Ｄキット
、セタス・コーポレーション（Ｃｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐｏ
ｒａｔｉｏｎ）、エメリービ／ｌ／　（Ｆｉｍｅｒｙｖ
ｉｌｌｅ）　、ＣＡ、Ｕ、Ｓ、Ａ、：ｌ又はアビジンセ
イヨウワサビペルオキシダーゼ複合体〔ベタスティン（
Ｖｅｔａｓｔａｉｎ”）＾ＢＣｘライト（ＥＬＩＴＥ）
　　キット、ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　、バーリンゲーム、Ｃ
Ａ。
Ｕ、　Ｓ、＾、〕をセイヨウワサビペルオキシダーゼ基
質３．３’、５．５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭ
Ｂ、ジグ？　（Ｓｉｇｍａ）、ミュンヒエン〕と共に用
いた。
若干の修正以外は、作業方法はジェルトン（Ｓｈｅｌｄ
ｏｎ）ら（ｒＰｒｏｃ　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
［Ｊ、Ｓ、Ａ、　Ｊ８３．９０８５−９０８９、（１９
８６））が記載している方法と同じである。
最後の厳重な洗浄工程後、５％（ｖ／ｖ）　）ライドン
Ｘ−１００，２，７ｍＭ　ＫＣｌ　、　２３７ｍ！Ｊ　
ＮａＣＩ！、ｌ、　５ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４及び３ｍＭ　
Ｎａ２ＨＰＬのｐＨ７，４を有する緩衝液（Ａ）で５分
間洗浄した。次に、フィルターを、メーカーの指示に従
って希釈したストレプトアビジン／セイヨウワサビペル
オキシダーゼ複合体を添加した同じ緩衝液中で４０分間
インキュベートした。次に、１Ｍ尿素及び１％硫酸デキ
ストラン（分子量５００．０００）添加した緩衝液（Ａ
）からなる緩衝液（Ｂ）中での毎回５分の洗浄工程を５
回行った。フィルターを、次に０．０１Ｍクエン酸ナト
リウム及び０．０１Ｍ　Ｅ［］ＴＡ　（ｐＨ５，０）の
緩衝液で５分間１回洗浄した。次に、フィルターを、Ｔ
ＭＢを添加した同じ緩衝液中で５分間インキュベートし
た。ＴＭＢは予め１００％エタノール中に溶解しておい
た（濃度２ｍｇ／−）。インキュベ−ションにはＴＭＢ
のエタノールストック溶液１部とクエン酸塩／ＥＤＴＡ
緩衝液１９部との混合物を用いた。発色のため、フィル
ターを、上記溶液のように０．０１Ｍクエン酸ナトリウ
ム、０．０１ＭＥＤＴ＾、０．１ｍｇ／ｍｌＴＭＢ及び
５％エタノールからなるｐＨ５，０の緩衝液に使用直前
に０．００１４％の８．０□を添加した緩衝液中に移し
た。この緩衝液中で、フィルターを３０〜６０分間イン
キュベートした。蒸留水で４回洗浄することによって発
色を停止させた。湿ったフィルターをプラスチック箔中
に溶接し、写真をとった。インキュベーションはすべて
室温で行った。
ＤＮＡシーケンシング メーカーの指示に従ってｐＵＣシーケンシングキット〔
ベーリンガー拳マンハイム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａ
ｎｎｈｅｉｍ）　ＧｍｂＨ，７ンハイム〕を用いて、チ
ェノ（Ｃｈｅｎ）　、Ｅ、Ｙ、及びシーブルグ（Ｓｅｅ
ｂｕｒｇ）　Ｐ、Ｈ。
の方法（ＤＮＡ４．１６５．１９８５）によるＤＮＡシ
ーケンシングを行った。標識には、３＄３−ｄＡＴＰ［
：比放射能１．０００　Ｃｉ／ｍＭ以上；アメルシャム
φブフラ−（Ａ＋ｎｅｒｓｈａｍ　Ｂｕｃｈｌｅｒ）　
、ブラウンシニワイク（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）　
］を用いた。ゲル電気泳動には６−８％ポリアクリルア
ミドゲルを用いた。ゲルを上に置いたＸ線フィルム〔フ
ジ（Ｆｕｊｉ）ＲＸ　ＮＥＷ）を２日間露出させた。
ＤＮＡ合成 りＮＡ断片を、ＤＮＡ−シンセサイザー（ＤＮＡ−３ｙ
ｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）　３８１　Ａ　Ｃアプライド・バ
イオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）　、ダルムスタット・エバースタット（Ｄａｒｍｓ
ｔａｄｔＪｂｅｒｓｔａｄｔ）　）で、装置メーカーの
指示に従って、β−シアノエチレンホスホルアミダイト
法によって合成した。断片の精製には、ＤＥＡＥイオン
交換ＨＰＬＣカラムを用いた。
実施例１ バクテリオファージＭ１３のゲノムは、ヒトのゲノム中
のミニ付随体とハイブリダイズする反復配列を含む〔バ
ラサート（Ｖａｓｓａｒｔ）、Ｇら、「サイエンス（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ）　Ｊ　２３５．６８３−６８４．１９８
７：］。従って、Ｍ１３からのＤＮＡをかかるミニ付随
体の同定のためのプローブとして用いることができる。
Ｍ１３プローブと相同を有する配列を含むヒトゲノムか
らの断片をλバクテリオファージでヒト遺伝子ライブラ
リーから単離し、単離したファージクローンのサザンプ
ロット解析によってキャラクタリゼーションすることが
できる。ヒトゲノムからのかかる断片の１例はＭ１３ゲ
ノムと相同を有する１、　９　ｋｂ　Ｐｓｔ　Ｉ　／　
ＢａｍＨＩ断片を含むλクローンＭ２１．３のインサー
トである（第１図）。
プローブのサブクローンニング及び制限マツピング プローブとして用いるためには、λファージで同定され
た断片を細菌プラスミド中へ移行させることが得策であ
る。このため、断片をゲル電気泳動で精製し、単離し、
ベクターとして適当であるプラスミド中へ挿入した。Ｐ
ｓｔ　ｒ　／　ＢａｍＨＩ断片の結合のためには、ｐＵ
Ｃシリーズのベクター〔ヤニッシューペロン（Ｙａｎ　
１ｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）Ｃ，ら、「ジーン（Ｇｅｎｅ）
　Ｊ　３３．１０３−１１９　、（１９８５））が適当
である。プラスミドｐＵＣ−Ｍ２１．３はベクターｐＵ
ｃ１８とベクター中へ対応する制限部位を通して挿入さ
れたλクローンＭ２１．３の１．９ｋｂ　Ｐｓｔ　Ｉ　
／　ＢａｍＨＩ断片とからなっていた。プラスミドｐＵ
ｃ−ＭＺ１．３の制限解析は第２図に示した地図をもた
らした。サザンプロット解析によってプラスミドｐＵＣ
−Ｍ２１．３のインサートと相同であるＭ１３ゲノム中
の領域を、該反復配列を含む０．６ｋｂ　Ｎｃｉ　Ｉ／
Ｃ１ａ　ｒ断片ニ制限スルことが可能であった（第３図
）。サヂンプロットでのｐＵＣ−Ｍ２１．３の制限解析
は制限酵素５ａｕ３Ａ及びＭｓｐ　Ｉを用いる同時消化
によって得られたインサートからの４断片が該反復部位
を含むＭ１３断片とハイブリッドすることを示した（第
１図）。レーン３及び５の１゜９ｋｂバンド、レーン３
のｌｋｂバンド及びレーン４のＱ、９ｋｂバンドは部分
消化によって生じたものである。
ハイブリダイゼーション実験に於けるプローブｐＵＣ−
ＭＺ−１，３とＭ１３ｍｐ８との間の比較プラスミドｐ
ＵＣ−ＭＺＬ３は、サザンプロット技術を用いるヒトゲ
ノム中のＲＦＬＰ、の検出のための適当なプローブであ
る。各型の放射性検出のためには非常に短い露出時間で
充分であり、この目的のために、プローブを３２ｐ含有
ヌクレオチドで標識した（第４図）。プラスミドのイン
サートと相同を有する標的配列に結合されるプローブ分
子数が高いためにプローブの高い検出感度がもたらされ
た。ｐＵＣ−ＭＺｌ、３インサートの結合が標的配列と
完全相同を有する他のプローブ配列の場合よりも高いと
いうことが、プローブとしての完全プラスミドｐＵＣ−
Ｍ２１．３又は完全Ｍ１３ｍｐ８ゲノムを用いてｐＵＣ
−ＭＺｌ、３及びＭ１３ｍｐ８からの制限断片を試験す
るハイブリダイゼーション実験で立証されたく第５図）
。プラスミドｐＵｃ−ＭＺ１．３のインサー）（１，９
ｋｂバンド）はベクターの部分（２，７ｋｂバンド）よ
り約１０倍数量のプローブｐＵＣ−Ｍ２１．３の分子と
結合したが、プローブは両断片と完全相同を有していた
（第５図レーン６−１０）、レーン１０の３バンドのセ
レンコツ（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ）カウントの測定は２．７
ｋｂバンドが３．７　Ｘ　１０３ｃｐｍ　、　１．９ｋ
ｂバンドが３．５　Ｘ　１０’　ｃｐｍであった。５ｘ
ｌＯ２ｃｐｍと測定された４、７ｋｂバンドは不完全消
化のためであり、直鎖化、完全ｐＵＣ−Ｍ２１．３プラ
スミドに対応する。Ｍ１３ｍｐ８断片を検出するための
プローブとしてＭｌ　３ｍｐ８ＤＮＡを用いたならば、
ＭＺｌ、３インサートと相同である反復配列を担持する
２、９ｋｂ断片、及びファージの残りの４，４ｋｂ断片
はほぼ同数のプローブを結合したく第５図、レーン１ｌ
−１５）。ｐＵＣ−ＭＺｌ、３のインサートとは対照的
に、該インサートと相同なＭ１３ゲノム中の領域は増加
したプローブの結合を示さなかった。Ｍｌ３とｐＵＣ−
Ｍ２１．３　ト（ＤｆＪ（ＭＵ同同第第５図レーン１−
５）及び第５図（レーン１６−２０）から明らかとなる
。プラスミドの１．９ｋｂバンドとＭｌ３の２．５ｋｂ
バンドとはプラスミドのインサートとそれと相同なＭ１
３断片とのハイブリダイゼーションによって説明される
ことができるプラスミドの２，７ｋｂバンドとファージ
の４．４ｋｂバンドとは両配列が共通に持っているラフ
クオベロンの配列によって相同を示した〔ビエイラ（Ｖ
ｉｅｉｒａ）、Ｊ、及びメッシング（Ｍｅｓｓｉｎ’ｇ
）、「Ｊ、、ジーン（Ｇｅｎｅ）　Ｊ　１９．２５６−
２６８、（１９８２）　］。
これらの結果は、ｐＵＣ−ＭＺｌ、３のインサートにつ
いて発見された増強効果がプローブと標的分子の両方の
配列に依存することを示している。
従って、増強に対する限定工程は、標的分子とそれに結
合される第１プローブとの間の反応であった。もし第１
プローブが第５図中のベクター配列である非増強配列に
よって標的分子へ結合されたならば、増強は起こらなか
った。
シグナル増強のための条件としての標的分子の所要先行
必要条件は、プラスミドｐＵｃ−Ｍ２１．３のインサー
トによって満たされたばかりでなく、プローブによって
検出されたヒトゲノム中の多数の配列によっても満たさ
れた。この陳述は放射性標識プローブｐＵＣ−Ｍ２１．
３とのハイブリダイゼーション後のサヂンプロットのた
めの上述した短時間の露出によって立証される（第４図
）。
従って、本発明の断片Ｍ　２１．３に加えて、Ｍｌ３と
ハイブリダイズするヒトゲノムからの他の断片ももしそ
れらをプローブとして用いるならば同様な増強効果を示
すと仮定されるべきである。さらに、Ｍｌ３によって検
出することができるミニ付随体を含む他の真核生物のゲ
ノムからかかる断片を単離することもでき・ると仮定さ
れるべきである。
標的分子への結合に於てプローブｐＵＣ−Ｍ２１．３に
よって見いだされた増強効果は、３２ｐを用いる放射性
検出方法よりも低感度の非放射性検出方法の使用を可能
にする。第６図はビオチン標識ｐＵＣ−Ｍ２１．３プロ
ーブ及び酵素的検出によるサヂンプロット実験の結果を
示す。同じ条件下でビオチン化Ｍ１３ＤＮＡをプローブ
として用いた実験では、バンドは検出できなかった。
実施例２ ｐＵＣ−ＭＺｌ、３中に含まれたヒト核酸断片のＤＮＡ
配列は、チェノ（Ｃｈｅｎ）　、Ｅ、　Ｙ、及びシーブ
ルク　（Ｓｅｅｂｕｒｇ）、Ｐ、Ｈ，（ＤＮＡ４．１６
５、（１９８５））に従って測定した。プラスミドｐＵ
Ｃ−Ｍ２１．３は、その基本モチーフが下記の塩基配列 ５’　−ＣＧＧＣＧＧＷＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＴＹＧＧ
ＴＴＧＴＧＳ−３’（上記配列中、ＷはＴ又はＡであり
、ＳはＣ又はＧであり、ＹはＣまたはＴである）。
を有する反復配列を含む。
２７ｂｐ基本モチーフはプローブｐＵｃ−Ｍ２１．３と
ハイブリダイズするミニ付随体の検出のために必要な配
列を含み、プローブｐＵＣ−Ｍ２１．３（第４図）を用
いてサザンプロットで検出できるバンドはプローブｐＵ
Ｃ−ＭＺＲ７によっても検出される。後者は２７ｂｐ基
本パターンの７反復を含むベクターｐＵｃ１８でクロー
ニングされた断片からなる。
測定された配列は本発胡の核酸断片の合成を可能にする
。
【図面の簡単な説明】
第１図はサザンプロットでの制限マツピングによるバク
テリオファージクローンＭＺＬ３のヒトインサートの解
析を示す。 第２図はｐＵＣ１８中の１．９ｋｂ　ＭＺ　１．３断片
の制限地図である。 第３図はｐＵＣ−ＭＺ１．３のインサートと相同を有す
る？ＶＩ　Ｌ　３ゲノムからの制限断片の同定を示す。 第４図は放射性標識プローブｐＵＣ−Ｍ２１．３による
２種の非血縁血液供与体のＲＦＬＰ断片の解析を示す。 第５図はクローン化ＤＮＡ断片についてのサザンフＣＩ
　７　）中ノＩ）ＵＣＭＺ　１．３及びＭ１３プローブ
間の比較を示す。 第６図は酵素標識プローブｐＵＣ−Ｍ２１．３による３
種の非血縁血液供与体のＲＦＬＰ断片の解析を示す。 Ｆｉ＜４．　ｌａ Ｆｉｇ−４ Ｆｉｇ　３ ■ ！ マＩ ６１　Ｇ（鵠）　４ ２３．１ ９，４− ６．６− ４．４ ２、〇　＝ Ｆｉｇ、　６

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、下記の特徴： （ａ）バクテリオファージＭ１３の蛋白質III遺伝子か
    らのＮｃｉ I ／Ｃｌａ I 断片を用いる真核生物の遺伝
    子ライブラリーのスクリーニングによって得られうるこ
    と、及び （ｂ）ベクターＤＮＡの分子が、ベクターＤＮＡと相同
    の標的配列に結合するよりも、それがその中に含まれて
    いる少なくとも５倍量の組換えＤＮＡ分子を核酸配列と
    相同の標的配列に結合させること を有する真核生物ゲノムの核酸断片。 ２、塩基配列 【遺伝子配列があります】 （上記配列中、ＷはＴ又はＡであり、ＳはＧ又はＣであ
    り、ＹはＣまたはＴである）。 を有する反復配列を少なくとも１回含む、請求項１記載
    の核酸断片。 ３、哺乳動物のゲノムから誘導される、請求項１又は２
    記載の核酸断片。 ４、ヒトのゲノムから誘導される、請求項１〜３のいず
    れか１項に記載の核酸断片。 ５、組換えプラスミドｐＵＣ−ＭＺ１．３、ＤＳＭ４７
    ７２中に含まれる、請求項４記載の核酸断片。 ６、ＤＮＡ合成によって調製される、請求項１〜５のい
    ずれか１項に記載の核酸断片。 ７、二本鎖として存在する、請求項１〜６のいずれか１
    項に記載の核酸断片。 ８、２本の部分的に又は完全に相同な１本鎖からなる、
    請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸断片。 ９、同位体標識で標識される、請求項１〜８のいずれか
    １項に記載の核酸断片。 １０、螢光又は酵素標識が供給されるか又はかかる標識
    への分子橋として働く化学基が供給される、請求項１〜
    ９のいずれか１項に記載の核酸断片。 １１、核酸断片が完全なＭ１３ゲノム、好ましくはＭ１
    ３ゲノムの蛋白質III遺伝子からのＮｃｉ I ／Ｃｌａ
    I 断片とのハイブリダイゼーションによって真核生物遺
    伝子ライブラリー中で同定され、かつ次いで遺伝子ライ
    ブラリーから単離される、請求項１〜８のいずれか１項
    に記載の核酸断片の単離方法。 １２、核酸断片が請求項１１によって得られる核酸断片
    とのハイブリダイゼーションによって真核生物遺伝子ラ
    イブラリー中で同定され、かつ次に該遺伝子ライブラリ
    ーから単離される、請求項１〜８のいずれか１項に記載
    の核酸断片の単離方法。 １３、真核生物のゲノム中の制限断片長多型（ＲＦＬＰ
    ＿ｓ）の検出のための、請求項１〜１０のいずれか１項
    に記載の核酸断片の使用。 １４、真核生物のゲノムが哺乳動物のゲノムである、請
    求項１３記載の使用。 １５、真核生物のゲノムがヒトのゲノムである、請求項
    １４記載の使用。
JP1226364A 1988-08-31 1989-08-31 真核生物ゲノムからの核酸断片及びその単離方法 Pending JPH02211900A (ja)

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FR2603047B1 (fr) * 1986-08-19 1990-03-02 Vassart Gilbert Sonde d'hybridation pour la detection de sequences nucleotidiques polymorphes contenues dans un echantillon d'adn humain ou animal, procede de detection de sequences d'adn polymorphes utilisant une telle sonde, ses applications biologiques

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