JPH02219576A - 魚類成長ホルモン遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 良東上２公１ 本発明は、新しい魚類成長ホルモン遺伝子、より詳細に
はマダイ（ｐａｇｒｕｓ　ｍａｊｏｒ　）の成長ホルモ
ン（（３ｒｏｗｔｈ　ｔ（ｏｒｍｏｎｅ　：　（３日）
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、これを含むベク
ター、該ベクターを保有する宿主細胞に関する。

旭−米一五一旦−■ 成長ホルモン（Ｇｌ（＞とは、ヒト及びその他の各種動
物の脳下垂体から分泌され、これら動物の成長促進作用
を発揮するポリペプチドであり、特にヒトではその分泌
異常によって、小人症、先端巨大症等の疾患を生じるこ
とがよく知られている〔鎖目和夫、三浦・鎖目編「ポリ
ペプチドホルモン」、朝倉書店、第１７７〜１９１頁（
１９７３年）〕。

従来よりヒト脳下垂体から抽出されたＧ）Ｊは、ＧＨの
欠損乃至分泌機能障害によって起こる小人症の治療の目
的で臨床的に用いられているが、その供給量は極めて微
量で、充分な治療を行なうには不充分である〔鎖目、日
本内分泌学会誌、６０゜１４９２−１５０２　（１９８
４））。

一方、家畜、魚類等の成長促進、増肉等の面でも、２等
動物のＧＨの有用性はおおいに期待されるが、上記と同
様の理由により、かかる用途面でのＧ）ｌの研究、開発
は殆んど進行していない。

また、ＧＨは種族特異性が高（、異種動物由来のＧＨの
転用は困難であるとされており〔上記文献（１９７３）
）、この面からもＧＨの研究は進んでいない。

上記ＧＨの化学構造についての最初の報告はリーら（Ｃ
，Ｈ，Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ、）によってなされ（Ｊ、　Ａ
ｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、ｓｏｃ、、８８．２０５０（１９６
６））、その後、遺伝子の単離及び構造解析技術より、
各種動物のＧｅｌ、例えばヒトＧｅ１（Ｊ、　Ｍ、　Ｍ
ａｒｔｉａｌ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、　２０
５゜６０２　（１９７９）ＬラットＧＨ（Ｐ、Ｈ。

５ｅｅｂｕｒｇ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｎａｔｕｒｅ　、　
２７０．４８６（１９７７））、ウシＧ）ｆ及びブタＧ
）ｌ　（Ｐ、　）ｌ。

Ｓｅｅｂｒｕｇ　ｅｔ　ａｌ、、ＤＮＡ、　２．３７　
（１９８３）　）、ヒツジＧＨ（特開昭６０−１１５５
７＠公！／Ｉｉ）、ニワトリＧｅｌ及びシチメンチョウ
ＧＨ（特Ｎ昭５９−５０１８５２号公報）、シロザケＧ
Ｈ（３ｅｋｉｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒ０Ｃ，Ｎａｔ
ｊ、ＡＣａｄ、３Ｃｉ、。

ＵＳＡ、８２，４３０６　（１９８５）　、ウナギＧ）
−Ｊ（特開昭６２−２２ＢＯＯ＠公報〕等の構造が明ら
かにされた。また之等に伴って、各種Ｇ）ｌ遺伝子も明
らかになり、単離された２等遺伝子を用いて、遺伝子組
換え技術によるＧＨの製造も種々検討されつつあり、か
（して得られた粗換え体ＧＨの実用性の検討も報告され
てきている（Ｋ。

Ｔａｋａｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎａｌ
、Ｊａｐａｎ、　５゜５８９　（１９８６）等参照）。

上記各種ＧＨが食料資源としての養殖魚、殊に主要海産
養殖魚であるマダイ、ブリ、ヒラメ等に応用できれば、
その実用価値は非常に高いが、Ｇｅｌの種属特異性を考
慮すれば、上記各種哺乳動物Ｇ）ｌについての研究成果
は全く役立たない。シロザケ、ウナギ等の魚類について
の報告もまた、之等とマダイ等とは分類学上大きな隔た
りがあり、その応用可能性は非常に低い。従って、現在
上記主要海産養殖魚類、中でも特に成長の遅いマダイの
Ｇ）−１の構造解析及びその量産化技術の確立が、斯界
で切望されている。

明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、上記斯界で切望されているマダイのＧ
Ｈを、遺伝子組換え技術を利用して、容易に高純度で且
つ大量に製造可能とする新しい技術を確立し、殊に該技
術に有用なマダイＧ）−１遺伝子を提供することにある
。

４題つを解決するための手段 本発明者らは、上記目的より鋭意研究を重ねた結果、遺
伝子組換え技術によるマダイＧＨの製造に有用なマダイ
Ｇ）Ｉのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＤＮＡ配列
）の単離、精製にはじめて成功し、ここに本発明を完成
するに至った。

即ち、本発明は、下記式（１）の魚類成長ホルモンポリ
ペプチドを含むアミノ酸配列をコードする魚類成長ホル
モン遺伝子に係わる。

Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉ　１ｅ−丁ｈｒ−ＡＳＩ）−ＧＩＶ
−Ｇｌｒｌ−ＡｒＯ−ＬｅＵ−１’ｇｅ−Ｓｅｒ−Ｉ　
１ｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌ
ｎ−旧５−ｔｅｕ−旧５−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｎ−ＡｒＱ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｈ
ｅ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ
−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−ａ？ｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−
Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｉ　１ｅ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−
Ｂｇｅ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｉ
　Ｉｅ−１１ｅ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−￥？ｅ−Ａｓｐ−Ｌ
ｙｓ−）ｆｉｓ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−３
ｅｒ−３ｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅ
ｕ−３ｅｒ−Ｉ　１ｅ−３ｅｒ−■ｙｒ−Ａｒｇ−ｔｅ
ｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−■ｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ
−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ａｒｇ−３ｅｒ−１（ｉ）Ｏ Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｐ
ｒｏ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇ　ｎ−ＧＩｙ−１１ｅ−Ｈｉ
ｓ−ＬｅＵ−ＬｅＵ−１１ｅ−Ａｒｐ−Ａｌａ−ＡＳｎ
−ａイｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−ＡＳｎ−ＣｙＳ−丁ｈｒ−
Ｌｅｕ　　　　　　　　　　　　　（１）本明細書にお
いて、ペプチド及びアミノ酸、核ｓｉ基及びＤＮＡ配列
ならびにその他の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＬ
ＪＢの規定乃至当該分野における慣用記号に従うもので
ある。

また、本明細書に記載のポリペプチドにおけるアミノＭ
番号は、上記式（１）に示すマダイＧＨアミノ酸配列の
アミノ末端（Ｎ末端）のＧｉｎを１とし、以下順次カル
ボキシ末１ｍ（Ｃ末端）方向に数えて表示するものであ
る。

本発明遺伝子は、これを利用して遺伝子組換え技術によ
り、マダイＧＨを容易且つ大量に製造可能とするもので
あり、これにより得られるマダイＧＨは、魚類養殖産業
分野において非常に価値あるものである。

現在、各種動物由来のＧＨのアミノ酸配列は知られてい
るが、マダイＧ）（のそれはいまだ報告がなく、また本
発明により解明されたマダイＧＨのアミノ酸配列は公知
のいかなるＧＨのそれらとも異なっている。因みに本発
明マダイＧＨのアミノ酸配列はヒトＧ）（とは僅かに３
３％しか相同せず、シロザケＧＨとは約６８％、ウナギ
ＧＨとは約４５％の相同性の認められるものである。

以下、本発明遺伝子につき詳述する。

本発明遺伝子は、より詳しくは前記式（１）で表わされ
る魚類成長ホルモンポリペプチドのアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡ配列を包含している。

上記ＤＮＡ配列の具体例は、下記式（４）に示す通りで
ある。

５°−ＣＡＧ　　ＣＣＧ　　ＡＴＧ　　ＡＣＡ　　ＧＡ
丁　ＧＧＣＣＡＧ　　ＣＧＴ　　ＣＴＧ　　Ｔ丁Ｃ丁Ｃ
ＣＡＴＧ　　ＧＣ丁　ＧＴＣＡＧＣＡＧＡ　　Ｇ丁Ｔ　
　ＣＡＡ　　ＣＡＣＣ丁ＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＧＣ丁　
ＣＡＧ　　ＡＧＡ　　ＣＴＣＴＴＣ丁ＣＴ　　ＧＡＣＧ
ＡＧ　ＧＣＣＡＡＣＴＧＣＡＣＣＣＴＧ　−３°　　　
　（４）しかして、本発明遺伝子は、魚類成長ホルモン
（マダイＧＨ）のアミノ酸配列をコードするものであり
且つこれを利用して遺伝子工学的手法により得られる物
質がマダイＧＨの活性を発揮できるものである限り、上
記式（４）に示されるＤＮＡ配列に限定されるものでは
ない。例えば上記式（１）のアミノ酸配列を構成する各
アミノ酸について、それぞれ知られている１〜６種類の
ＤＮＡコドンの中から任意のコドンを選択して構成され
る改変されたＤＮＡ配列もまた之等がマダイＧｅｌ活性
発現を可能とする限り本発明遺伝子に包含される。また
上記式（４）に示されるＤＮＡ配列を基本として、その
５′末端にＭｅｔのコドンであるＡＴＧを付加したＤＮ
Ａ配列や之等のＤＮＡ配列の３′末端に終止コドンとし
てのＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ等を付加したＤＮＡ配列も
本発明遺伝子に包含される。

更に、マダイＧＨのアミノ酸配列も、これがマダイＧＨ
の活性を発揮するものである限り、前記式（１）で表わ
されるものに限定されるものではなく、遺伝子組換え技
術によりマダイＧＨ発現ベクターを創製し、該ベクター
を組込んで得られる宿主細胞が実際に上記マダイＧＨを
発現できる限り、その任意の一部、例えばＮ末端部又は
Ｃ末端部のアミノ酸配列の一部を欠失するか、之等を他
のアミノ酸配列に置換させるか、或いは之等に更に任意
のアミノ酸配列を付加することによって改変されたもの
であってもよい。２等改変されたアミノ酸配列をコード
するＤＮＡ配列も本発明遺伝子に包含される。その具体
例としては、後記実施例において詳述するマダイＧＨの
前駆体をコードするＤＮＡ配列やマダイＧＨの産生細胞
であるマダイ脳下垂体からポリ（Ａ＞　ＲＮ／’！−調
製し、これを鋳型として合成されるＣＤＮＡのＤＮＡ配
列を例示できる。

本発明遺伝子は、以下に示す各種の方法により製造する
ことができる。該方法としては、例えば上記マダイＧＨ
の産生細胞′であるマダイ脳下垂体からポリ（Ａ＞ＲＮ
ＡをＷａｌｌし、これを鋳型としてＣＤＮＡを合成し、
これを適当なベクターに接続して宿主細胞内で増幅させ
、目的のマダイＧＨのＣＤＮＡを有するクローンを選別
し、該クローンの有するベクターより単離する方法、本
発明遺伝子のＤＮＡ配列に基づいて、例えばホスホアミ
ダイト法（Ｎａｔｕｒｅ、３１０．　１０５　（１９８
４）　）等の常法に従って、核酸の化学合成を行なう方
法、之等の組合せ等を例示できる。

以下、上記マダイの脳下垂体から調製単離する方法につ
いて詳述する。

本発明遺伝子を入手するためのマダイの脳下垂体として
は、養殖マダイ及び天然マダイのいずれからでも摘出で
きるが、養殖マダイを用いるのが、−時に大きざの揃っ
た多数の固体を用意できるので有利である。摘出は常法
に従うことができ、か（して得られる脳下垂体は、即座
に液体窒素、ドライアイス−エタノール等を用いて凍結
させた後、ＲＮＡの抽出に用いるのが望ましい。上記Ｒ
ＮＡの抽出操作は、通常の方法、例えばチオシアン義り
アニシンー塩化セシウム法（Ｑｈｉｒｇｖｉｎ　ｅｔ　
ａｔ、。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　、　ｉ旦、５２９４　（１
９７９））、チオシアン酸グアニジン−フェノール・ク
ロロホルム法等に従うこととができる。上記チオシアン
酸グアニジン−塩化セシウム法は、より詳しくは、まず
凍結脳下垂体をチオシアン酸グアニジン、クエン酸ナト
リウム、Ｎ−ラウロイルザルコシン酸ナトリウム、β−
メルカプトエタノール等の混合液中で、機械的に破砕、
可溶化し、次いで塩化セシウムを含む水溶液上に重層し
、超遠心を行なうことにより実施される。かくして沈澱
としてＲＮＡを得ることができる。該沈澱中には、ｒＲ
ＮＡ％ｔＲＮＡ等の不純物が含まれているため、目的と
するポリＡ鎖を有するＲＮＡを、通常の方法に従い精製
する。これは例えばオリゴｄＴ−セルロース［コラボレ
イティプ　リサーチ社コ等の７フイニテイカラムを用い
て有利に実施できる。

かくして得られるポリ（Ａ）ＲＮＡは、これを鋳型とし
て、例えば逆転写酵素を用いて二本鎖ＤＮＡ　（ｃＤＮ
Ａ）の合成に供することができる。

このＣＤＮＡの合成は、通常の方法、例えばＳ１ヌクレ
アーゼ法、オカヤマーベルグ法（Ｏｋａｙａｍａｅｔ　
ａｌ、、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　３ｉｏ１．、３．２８０
−２８９　（１９８３））等により行ない得るが、実用
的には、例えばアマジャム社等から市販されているＣＤ
ＮＡ合成キットを用いて実施するのが便利である。

次いで、上記方法では、得られるＣＤＮＡから目的とす
るマダイＧＨのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を
単離する。このＤＮＡの単離は、ＣＤＮＡを適当なベク
ターに挿入し、このベクターを宿主に導入して増幅させ
ると共に該ＤＮＡ配列を含む宿主のプラーク又はコロニ
ーとして個別化した上で、目的のＤＮＡ配列を選択する
ことにより実施される。ここでＣＤＮＡの挿入に用いら
れるベクターとしては、通常のもの、例えばλフアージ
由来の各種ファージＤＮＡ１ｐＢＲ３２２を初めとする
各種プラスミド等を例示できる。上記ファージＤＮＡを
ベクターとする場合は、容易に多数の候補株を調製、ス
クリーニングできる利点がある。殊に例えばλｇｔｌ’
０ＤＮＡは、外来ＤＮＡ配列が挿入されたベクターのみ
宿主細胞ＮＭ５１４株に対してプラークを形成する特徴
があり、上記ベクターとしてより有利に利用できる。

上記ベクターへのＣＤＮＡの挿入は、合成リンカ−を用
いる方法、ホモポリマー法等の通常の方法により行なう
ことができ、例えばＣＤＮＡの両末端にＥＣ０ＲＩリン
カ−を付加した後、制限酵素ＥＣ０ＲＩで切断し、これ
をベクターのＥＣ０ＲＩ切断部位に挿入すればよく、こ
れにより所望の組換えベクターを得ることができる。ま
た得られる組換えベクターの宿主への導入及びこれによ
る組換えベクターの増幅と個別化は、一般に用いられて
いる各種の方法、例えば主として対数増殖期にある細胞
を集め、Ｍ　ｇＳＯ４処理を行なった後、粗換えファー
ジを感染させる方法、或いは同様にして集めた細胞をＣ
ａＣＱ２処理により自然にＤＮＡを取込みやすい状態と
し、これにベクターを取込ませる方法等により行ない得
る。更に上記組換えベクターの調製及び増幅と個別化は
、市販のＣＤＮＡクローニング用キットを用いて行なう
こともできる。

上記で得られるＣＤＮＡを含むベクターを導入された粗
換え体からの、目的ＤＮＡ配列を含む組換え体の単離は
、ベクターの種類に応じて、それぞれ公知の各種の方法
により実施できる。例えばファージＤＮＡをベクターと
する場合は、プラークハイブリダイゼーションにより、
またプラスミドをベクターとする場合は、コロニーハイ
ブリダイゼーションにより、それぞれ有利に行ない得る
。

之等各方法は、いずれもＢ、Ｈ，ＨａｍｅｓとＳ、Ｊ。

ＨｉｇｇｉｎＳにより編集された「ヌクレイツク　アシ
ッド　ハイブリダイゼーション（Ｎ　ｕｃｌｅｉｃＡｃ
ｉｄ　ｌ−５ｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ）　Ｊ　　（Ｉ
　ＲＬ　Ｐｒｅｓｓ。

１９８５＞に詳述されている。２等方法は、組換え体の
ＤＮＡをナイロンメンブラン等のフィルター上に固定し
、これを標識したプローブと反応させれば、プローブは
目的のＤＮＡ配列に選択的に結合するという性質を利用
して、目的の組換え体を単離するものである。ここでプ
ローブとは、目的のＤＮＡ配列に対して相捕的な配列を
有する核酸配列であり、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、
化学合成したＤＮＡ配列を用いるのが一般的でありまた
有利である。上記プローブのＤＮＡ配列は、目的とする
マダイＧＨの部分アミノ酸配列に基づいて設定すること
ができ、また上記マダイＧＨ遺伝子の少なくとも一部は
、シロザケＧＨ遺伝子のそれとかなり相同性が高いと考
えられるため、かかる相同性の高い既知のシロザケＧ）
−ＪのＣＤＮＡ配列部分を上記プローブとして利用する
ことも可能である。

かくして単離される粗換え体中に、本発明遺伝子が含ま
れている。

なお、上記方法において、採用される各種の操作、例え
ば一部ＤＮＡの化学合成、ＤＮＡ鎖の切断、削除、付加
乃至結合を目的とする酵素処理、ＤＮＡの単離、精製、
複製、選択等は、いずれも常法に従うことができる。よ
り具体的には、上記ＤＮＡの単離精製は、アガロースゲ
ル電気泳動法等に従うことができ、核酸配列のコドンの
一部改変は、サイトスペシフィック　ミ１−タジエネシ
ス（５ｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｎｕｔａａｅｎｅｓ
ｉｓ）　（Ｐ　ｒｏｃ、　Ｎ　ａｔｌ。

Ａｃａｄ、ｓｃｉ、、８ユ、５６６２−５６６６（１９
８４））等に従えばよい。

また上記で得られる本発明遺伝子のＤＮＡ配列の決定は
、サンガー法（ＹａｎｉＳＣｈ−ＰｅｒｒＯｎ　ｅｔ　
ａｌ、。

Ｇｅｎｅ、３３，１０３　（１９８５））やマキサム−
ギルバート法〔＾、Ｈ，Ｈａｘａｍ　ａｎｄ　Ｗ、Ｇ１
１ｂｅｒｔ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎｘｙｍｏｌｏＯＹ、６５．
４９９−５６０（１９８０））等により行ない得る。な
お、ファージＤＮＡベクターとして得られる組換え体の
ＤＮＡ配列を決定するに当たっては、該ベクターは分子
量が大きいために、予め上記組換え体中のＣＤＮＡ部分
を適当なベクター、例えばｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２等
に移しかえてから、そのＤＮＡ配列の決定を行なうのが
好ましい。

更に、上記ＤＮＡ配列の決定は、市販のシーケンスキッ
ト等を用いることによっても、容易に行ない得る。

上記により、各種の文献〔例えばＪ、Ｅ。

［）ａｒｎｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、”　Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　　Ｃｅ１ｌ　３ｉｏ１ｏｇｙ”５ｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　３ｏｏｋｓ　（１９Ｆ３５　
）の記載を参考にして、組換え体中に含まれる目的のマ
ダイＧＨ遺伝子を含むＤＮＡ配列、その中の本発明遺伝
子のＤＮＡ配列及びマダイＧＨのアミノ酸配列を決定で
きる。

かくして決定された目的のマダイＧＨ遺伝子を含むＤＮ
Ａ配列及び対応するアミノ酸配列は、下記式（５）に示
される通りである。これは正確には、マダイＧ）ｌ前駆
体のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。即ち、このＤ
ＮＡ配列はマダイＧＨのアミノ酸配列のＮ末端にシグナ
ルペプチドのアミノ酸配列の付加されたアミノ酸配列を
コードするＤＮＡ配列となっており、マダイＧ）−１が
上記前駆体としてまず生合成され、その後シグナルペプ
チド部分が除去される分泌性の蛋白質であることを明ら
かにしている。上記マダイＧＨ＃駆体アミノ酸配列中の
シグナルペプチド部分のアミノ酸配列は、例えばＶｏｎ
　Ｈｅ１ｊｎｅの方法（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、
、１４．４６８３　（１９８６））により決定できる。

＾ＴＣＡＧＡＴＣＣＡ 上記により得られる本発明の７ダイＧ）ｌ遺伝子を含む
ベクターの具体例としては、後記実施例に詳述するｐＴ
ＧＨＥｌ　１を例示できる。該ベクターｐＴＧＨＥ１１
は、大きさ３．６キロベースペアーズ（ｋｂｐ）のプラ
スミドであり、前記式（１）に示したマダイＧＨをコー
ドするＤＮＡ配列と共に、アンピシリン耐性遺伝子を保
有している。

本発明者らは、該ベクターｐＴＧＨＥ１１を、大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株に保有させ、該大腸菌を工業技術院微生物工
業研究所に微工研条寄第１４５７号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ
１４５７）として寄託した。

本発明遺伝子は、上記ベクターより制限酵素を利用する
常法に従い取り出すことができる。またこの本発明遺伝
子の利用によれば、遺伝子組換え技術に従って、高純度
のマダイＧＨを容易に且つ大量に製造することができる
。

このマダイＧ）ｆの製造は、本発明遺伝子を利用するこ
とを除いて、基本的には通常の遺伝子組換え技術に従う
ことができる。より詳しくは、本発明遺伝子が宿主細胞
中で発現されるような組換えＤＮＡを作成し、これを宿
主細胞に導入して形質転換させ、該形質転換株を培養す
ればよい。

ここで宿主細胞としての代表例としては大腸菌ＪＭ１０
９株（Ｖａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　ｅｔ　ａＪ、、　
Ｑｅｎｅ。

３３．１０３　（１９８５））を例示できるが、他の公
知の各種大腸菌株も同様に宿主細胞として利用できる。

宿主細胞によるマダイＧＨの産生は、大別してＮ末端に
シグナルペプチドを持たない形で宿主の細胞質内に産生
させる場合と、シグナルペプチドを利用して宿主細胞か
ら分泌産生させる場合とに別れる。いずれの場合も、目
的ポリペプチドのＮ末端は開始コドンに由来するメチオ
ニン（ｆＭｅｔ）であり、またＣ末端をコードするＤＮ
Ａ配列は、その直後に終止コドンとしてのＴＡＡＳＴＡ
Ｇ又はＴＧＡを有するものとされる。従って本発明遺伝
子には、かかる開始コドンと終止コドンとが付加される
。

上記開始コドンの付与された本発明遺伝子によりコード
されるアミノ酸配列の例は、下記式（２）及び（３）で
表わされる。

）１ｅｔ−ＡＳｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−ＬｅＵ−
）１ｅｔ−Ｌｅｌｊ−３ｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−３ｅｒ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−
Ｐｒｏ−Ｉ　１ｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−
Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−Ｉ　１ｅ−Ａｌａ−
Ｖａｌ−３ｅｒ−Ａｒｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌ
ｅｕ−旧ｓ−ｔｅｕ−ｔｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ
−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−
３ｅｒ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｙ
ｓ−Ｉ　１ｅ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｃｙ
ｓ−Ａｓｎ−３ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ
−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−
Ｌｅｕ−３ｅｒ−１１ｅ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｌ
ｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−丁ｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈ
ｅ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−３ｅｒ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−
Ａｓｎ−Ｇｌｎ−１１ｅ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌ
ｅｕ−３ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｎｅｔ−ＧＪ
ｙ−１１ｅ−）１　ｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ａ
ｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｌ
ａ−Ｇｌｕ−Ｉ　１ｅ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−３ｅ
ｒ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＬｅｔＪ−Ａ　
　ａ−ｐｒｏ−丁ｙｒ−ＧＩｙ−ＡＳｒｌ−丁ｙｒ−丁
ｙｒ−Ｇｌｎ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓ
ｐ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｐ−丁ｈｒ
−■ｙｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−
Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｈｅｔ−Ｈｉｓ−Ｌ
ｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−丁ｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−丁ｈ
ｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ｃｙｓ−
丁ｈｒ−Ｌｅｕ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　（２＞Ｎｅｔ−Ｇｉｎ−Ｐｒｏ−Ｉ　１
ｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
−Ｐｈｅ−３ｅｒ−Ｉ　１ｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−３ｅｒ
−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−１１ｉｓ
−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−
Ｐｈｅ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−３
ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌ
ｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−１１ｅ
−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−ｐｈｅ−ｃｙｓ−Ａｓｎ−
ｓｅｒ−Ａｓｐ−■ｙｒ−１１ｅ−Ｉ　１ｅ−３ｅｒ−
Ｐｒｏ−ＩＩｅ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−丁
ｔｌｒ−Ｇｌｊｌ−Ａｒｐ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｖａｌ−
Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｉ　１ｅ−
３ｅｒ−丁ｙｒ−Ａｒｇ−ｔｅｕ−ｖａｌ−ＧＪｕ−３
ｅｒ−■ｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ａｒ
ｇ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−３ｅｒ
−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−ＧＩｎ−１１ｅ−
３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−１１ｅ−旧５−Ｌｅｕ
−Ｌｅｕ−Ｉ　１ｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ
−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉ　１ｅ−Ｐｈｅ
−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−丁ｙｒ−ｃ＋ｙ−Ａ
ｓｎ−Ｔｙｒ−丁ｙｒ−Ｇｌｎ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−ＬｅＵ−Ａｒｐ
−Ａｒｐ−Ｔｈｒ−丁ｙｒ−ＧＩＵ−ＬｅＬｌ−１ｅＵ
−Ａｌａ−ＣｙＳ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−
）１ｅｔ−旧５−Ｌｙｓ−Ｖａ　Ｉ　−Ｇｌ　ｕ−Ｔｈ
ｒ−丁ｙｒ−ｔｅｕ−丁ｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｙｓ
−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−
Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ　　　　　（
３）また、前記式（５）に示されるマダイＧＨのｃＤＮ
Ａ配列中には、既に終止コドン（ＴＡＧ）が存在してお
り、これは改めて終止コドンを導入することなく本発明
遺伝子として利用することができる。

上記開始コドンの導入は、常法に従い、例えば前記式（
４）の本発明遺伝子の５′末端側を適当な制限酵素で切
断後、これに適当な開始コドンを有するＤＮＡ配列を連
結させることにより行ない得る。より詳しくは、上記開
始コドンの導入は、例えば前記式（４）で表わされる本
発明遺伝子を制限酵素３ａｌＩで切断後、これに下記式
（６）で表わされるＤＮＡ配列を連結させることにより
実施できる。尚、該式中上線を付した配列はりボゾーム
結合部位である。

ｆＨｅｔＧｌｎＰｒｏｌ　１ｅＴｈｒＡｓｐＧｌｙ５°
　　　　ＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡ＾＾ＴＴ＾ＴＧＣＡＧ
ＣＣＧ八ＴＣＡＣＡＧ八ＴＧＧ３°ＣＴ＾ＧＧＡＣＣＴ
ＣへＴＴＴＴＴＴへＡＴ＾ＣＧＴＣＧＧＣＴＡＧＴＧＴ
ＣＴＡＣＣ本発明遺伝子を利用したマグ４０８発現ベク
ターの構築は、この種遺伝予相換え技術に慣用される通
常の方法に従うことができる。該方法に用いられる各種
操作乃至手法は、一部前述した通りであり、各種制限酵
素による切断処理、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等を用いる連結
処理、アガロースゲル電気泳動法、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法等の単離、精製処理、フェノール抽出法
による回収、精製処理等を包含する。また得られるベク
ターのｉｇも常法に従って、例えばそのＤＮＡ配列を前
記マキサム−ギルバート法で解析するか、ミニプレバレ
ージョンやマツピング法により遺伝子の導入やその方向
を確認する方法（Ｈ，Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　ｅｔａｌ
、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、、７．
１５１３−１５２３　（１９７９））等によることがで
きる。

上記マグ４０８発現ベクターの構築に利用される起源ベ
クターしては、特に制限はな（、従来公知の種々のもの
でよく、これには例えばバタテリオフ？−ジ及び動物ウ
ィルスを含む各種ウィルスベクター、各種プラスミド、
コスミド等が包含される。之等の内では特にｐＢＲ３２
２又はこれに由来する各種の確立されたプラスミドベク
ターが好適である。

また、上記発現ベクターには、これが宿主ＩＩＩＩ胞内
に導入されて目的とするマダイＧＨを実際に発現するた
めに、本発明遺伝子の外に、その発現に必要な各種の遺
伝情報、例えばプロモーター、転写終結信号、ポリＡ鎖
付加信号（真核細胞を宿主とする場合）等の転写のため
の情報やりボゾーム結合部位（シャイン・ダルガルノ配
列、ＳＤ配列）等の翻訳のための情報等が必要でおる。

かかる情報は、宿主細胞に応じてそれぞれよくしられて
おり、例えばプロモーターとしては、大腸菌に対するｔ
ｒｐプロモーター、ｒｅｃプロモーター、λＰＬプロモ
ーター、ｌｌｐプロモーター、ｔａｃプロモーター等、
枯草菌に対する５ｐｏｉプロモーター、５ＰＯ２プロモ
ーター、ｐｅｎプロモーター等、酵母その他の真核細胞
に対するＰＨ０５プロモーター、ＰＧにプロモーター、
ＧＡＰプロモーター、ＡＤ）ｌプロモーターＶ４０由来
プロモーター等を例示できる。之等の遺伝情報は、目的
とするマグ４０８発現ベクターの構築に当たって、之等
を含むプラスミド等を選択して起源ベクターとして用い
ることにより、又は之等を含むプラスミド等より常法に
従い単離するか、化学合成した後、適当なベクターに組
込むことにより、それぞれ所望ベクターに導入存在させ
ることができる。

かくして所望のマグ４０８発現ベクターを収得できる。

本発明はかかるマグ４０８発現ベクターをも提供するも
のである。

本発明のマグ４０８発現ベクターは、上記のように本発
明遺伝子の上流にプロモーター及びリボゾーム結合部位
を、また下流に転写終結信号をそれぞ連結されてなる一
組のマダイＧＨ発現情報単位を有することにより特徴つ
けられる。

また、本発明者らの研究によれば、同一ベクター内に上
記マダイＧｅ１発現情報単位の二組以上を保有させたベ
クターによれば、所望のマダイＧＨの生産性が高められ
る場合のあることが見出された。従って、本発明はかか
るマダイＧ）１発現情報単位の複数個を保有するベクタ
ーをも提供するものである。

上記本発明マダイ発現ベクターは、これを適当な宿主細
胞に導入（形質転換）させることによって、該宿主細胞
に所望のマダイＧ１−１産生能を付与できる。ここで用
いられる宿主細胞としては、特に限定されるものではな
く、公知の各種のもの、例えば大腸菌等のグラム陽性細
菌、枯草菌等のグラム陽性細菌、放線菌等の原＠細胞、
酵母、動植物細胞等の真核細胞のいずれでもよ（、特に
大腸菌に１２株由来の８８１０１株（Ｈ，Ｗ、　Ｂｏｙ
ｅｒａｎｄ　　Ｄ、　Ｒｏｕｌｌａｎｄ−Ｄｕｓｓｏｉ
ｘ、、Ｊ、　ＭＯ＋。

３ｉｏ１．、旦、４５９−４７２（１９６９））及びＪ
Ｍ１０３株［Ｊ、　Ｍｅｓｓｔｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎ
ＵｃＩｅｉｃＡｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ、、９．３０９　（
１９８１）　）は好適である。

上記宿主細胞への本発明マダイＧｌ（発現ベクターの導
入及びこれによる形質転換の方法は、一般に用いられて
いる各種の方法に従うことができ、例えば宿主細胞を低
温で塩化カルシウムを含む水溶液中で処理し、該溶液中
にベクターを添加する方法（Ｅ、　Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ
　ａｎｄ　　３．　Ｃｏｈｅｎ、　Ｊ。

３ａｃｔｅｒｉｏ１．．１１９．１０７２　（１９７４
）　）等によることができる。

かくして本発明ベクターを導入され、形質転換された細
胞を収得できる。本発明は、かかるマグ４０８発現ベク
ターを保有し、マダイＧＨ産生能を有する形質転換細胞
をも提供するものである。

上記形質転換細胞は、これを通常の細胞培養用培地で培
養することにより、マダイＧＨを生産、蓄積できる。該
細胞の培養に利用できる培地としては、例えばＬ培地、
Ｅ培地、Ｍ９培地、Ｍ６３培地等の各種のものをいずれ
も使用できる。また２等培地には更に通常知られている
各種の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン類、天然物抽
出物、生理活性物質等を添加存在させることができる。

形質転換細胞の培養は、該細胞の生育に適したｐ＋、温
度、通気、撹拌等の条件を採用した各種方法により実施
できる。例えば大腸菌の場合には、ｐＨ約５〜８の範囲
、特にｐＨ７付近が適当であり、約２０〜４３℃の温度
で、通気撹拌条件下で培養するのが望ましく、培養のス
ケールは特に限定はない。上記培養により、通常約５〜
９０ｒｆ１で培養懸濁液中に、所望のマダイＧ）（が蓄
積される。

かくして蓄積されるマダイＧＨは、通常の操作により分
離できる。該操作としては、例えば細胞の超音波破砕、
機械的破砕、凍結融解、浸透圧ショック等による抽出操
作や培養上清の分離操作等を例示できる。

更に上記により分離される目的のマダイＧＨは、その物
理学的性質や化学的性質を利用した各種の精製操作によ
り精製することができる。該精製操作としては、例えば
通常の蛋白沈澱剤を利用する沈澱処理、限外濾過処理、
ゲル濾過処理、吸着クロマトグラフィー処理、イオン交
換クロマトグラフィー処理、アフィニティクロマトグラ
フィー処理、高速液体クロマトグラフィー処理等を適宜
組合せることにより実施できる。

上記により、工業的規模で容易に、しかも高純′度、高
収率で所望のマダイＧＨを製造することができる。

得られるマダイＧＨは、５Ｏ８−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（Ｒ，Ｆ、　５ｃｈｌｅｉｆ　ａｎｄ　　ｐ
。

Ｃ，Ｗｅｎｓｉｎｋ、”　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　　Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ＩｎＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ
”、　ｓｐｒｔｎｇｅｒ−ｖｅｒ＋ａｇ（１９８１））
にかけ、クマーシーブリリアントプルー等で染色するこ
とにより、検出できる。

かくして得られるマダイＧＨは、マダイの成長ホルモン
として、殊にマダイ養殖産業分野で非常に有用である。

！−−五一一方 以下、本発明遺伝子の製造、マダイＧＨの製造のための
該遺伝子の利用につき、実施例を挙げてより詳述する。

実施例１ マ　イ脳下垂体からのポリ（Ａ）ＲＮＡの調平均魚体重
９００ｇの養殖マグ４８０尾から摘出し、瞬時凍結した
脳下垂体を調製用材料とした。

この脳下垂体の全湿重量は約５００ｍ０であった。

また、ポリ（Ａ）ＲＮＡの調製は、チオシアン酸グアニ
ジン−塩化セシウム法（Ｃｈｉｒｇｖｉｎ　ｅｔａｌ、
、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　、　１８．５２９４（
１９７９））に従い、以下の通り行なった。

即ち、上記脳下垂体を、６Ｍチオシアン醗グアニジン、
５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５％Ｎ−ラウロイルザ
ルコシン酸ナトリウム及び０．　ＩＭβ−メルカプトエ
タノールからなる溶液７．５−中で、テフロンホモジナ
イザーにて破砕（１０ストローク）して可溶化させた。

この可溶化物を１８Ｇ注射針に数回通してＤＮＡを分断
し、日立ＲＰＲ２０−２０−ターにて１１００００ｒｐ
で１０分間遠心して組織片、蛋白を除き、上滑を回収し
た。

回収された上漬約８ｍ１２を、ベックマン５Ｗ４０Ｔｉ
用ポリアロマ−チューブ中に予め入れておいた５、７Ｍ
塩化セシウム−０，１Ｍ　　ＥＤＴＡ溶液３溶液３和Ｑ
上し、ベックマン５ｗ４０Ｔｉローターにて３５０００
　ｒｐｍで１８時間超遠心後、ＲＮＡを沈澱として回収
した。上滑を７スピレーターを用いて完全に除去した後
、ＲＮＡの沈澱を１０ｍＭトリス塩ＩＩ（ｐＨ７，５＞
及び１ｍＭＥＤＴＡからなる溶液（以下ｒＴＥＪと略記
する）０．９ｒｒＩＱに溶解させ、５Ｍ　　ＮａＣ；９
０．１ｍＧを加えて、６５℃で５分間インキュベートし
、水中で急冷した。この混合液１１１１０を、予め０．
５ＭＮａＣＱを含む丁Ｅで平衡化しておいたオリゴ（ｄ
Ｔ）セルロースカラム（ベーリンガーマンハイム山之内
社製、カラム容積０．３５ｍＱ＞にかけ、吸着されたＲ
ＮＡをＴＥにて溶出させた。この溶出液５．５朦に、５
Ｍ　　ＮａＣＱｏ、６１ｍＱを加えて、６５℃の水浴中
で５分間加熱し、水中で急冷した後、この混合液６．１
１−を、再度オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムにかけた
。吸着されたＲＮＡをＴＥにて溶出させて、０．８μＱ
のポリ（Ａ）ＲＮＡを得た。

立見Ｎへ匁塗濾 ｃＤＮＡの合成を、ＣＤＩ’、ＩＡ合成キット（アマジ
ャム社製）を用い、該キットに添附されたプロトコール
に従って、以下の通り行なった。

ポリ（Ａ）ＲＮＡの０．８μＱを含む水溶液６．８μＱ
に、上記キットに含まれる５Ｘフア一ストストランド合
成用バッフ１−４μＱ１ビロリン酸ナトジナトリウム溶
液１μＱ１２５単Ｑヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビ
ター１μＱ１デオキシヌクレオシド三リン酸混液（ｄＡ
ＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ各々１０．１０．
１０．５ｍＭ）４１！、２ｍａ／ｍＱオリゴ（ｄＴ　　
　　）プライマー１μＱ及び１８単位／戒逆転写酵素２
．２μＱをそれぞれ加えて全量を２０μＱとし、４２℃
で４０分間反応させて、ＲＮＡに相補的なりＮＡを合成
させた。

次に、得られた反応液２０μＱに、上記キットに含まれ
るセカンドストランド合成用バッフ？−３７，５μＱ、
大腸菌リボヌクレアーゼ８０．８単位、大腸菌ＤＮＡポ
リメラーゼＩ２３単位及び蒸留水を加えて全量を９９μ
Ｑとし、これをまず１２℃で６０分間、次に２２℃で６
０分間、最後に７０℃で１０分間それぞれインキュベー
トした。

水冷後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ４単位（１μＱ）を加
えて３７°Ｃで１０分間反応させた。この反応によりＲ
ＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ部分がＤＮＡに置換され、
完全な二本鎖ＣＤＮＡが得られた。

上記反応液に、０．２５Ｍ　　ＥＤＴＡ（ｐｌ（８，０
＞１０μＱ及び１０％５ＤＳ１０μＱを加えて反応を停
止させ、該反応物をフェノール−クロロホルム抽出し、
エタノール沈澱により、二本鎖ＣＤＮＡ６０μｑを回収
した。

組　えベクターのｗ４製 上記で合成されたＣＤＮＡを、ベクターλｇｔ１０　（
Ｔ、　Ｖ、　Ｈｕｙｎｈ　ｅｔ　ａｔ、、　”ＤＮＡｃ
＋ｏｎｔｎｇ：Ａｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃ
ｈ　ｔｔ　、　ＱＩＯＶｅｒ　Ｉ１゜４９−７８．ＩＲ
Ｌ　　Ｐｒｅｓｓ（１９８４））に挿入する操作を、Ｃ
ＤＮＡクローニングシステム（アマジャム社製）に添附
のプロトコールに従って、以下の通り行なった。

上記で合成したＣＤＮＡの全量を含む水溶液１３μＱに
、上記キットに含まれる５　Ｘ　Ｅ　ＣＯＲＩメチラー
ゼ反応液４μＱ、０．８ｍＭアデノシルメチオニン液２
μＱＳＥＣＯＲ■メチラーゼ１μＱ（２０単位）を加え
て全量を２０μＱとし、混合物を３７℃で６０分間イン
キュベートして、上記ＣＤＮＡ中に含まれているＥＣ０
ＲＩサイトをメチル化した後、７０℃で１０分間加熱し
てＥＣ０ＲＩメチラーゼを不活性とした。

得られた反応液２０μＱに、上記キットに含まれる１０
ＸＴ４ＤＮＡリガーゼバツフ？−３μＱ１末端をリン酸
化したＥＣ０ＲＩリンカ−［５°ｄ（ｐＧＧＡＡＴＴＣ
Ｃ）］　２μＱ（１μＱ）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２μＱ
及び蒸留水３μＱを加えて３０μＱとした後、１５℃で
１６時間反応させてＣＤＮＡ末端にＥＣ０ＲＩリンカ−
を付加し、７０℃で１０分間反応させてＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを不活性とした。

得られた反応液３０μＱに、上記キットに含まれる１０
ｘＥｃｏＲＩバツフアー１０μＱ１制限酵素ＥＣ０ＲＩ
２μＱ及び蒸留水５８μＱを加えて１００μＱとし、３
７℃で５時間インキュベートして、末端にＥＣ０ＲＩリ
ンカ−由来のＥＣ０ＲＩ粘着末端を有するＣＤＮＡを得
た。

得られた反応液をＣＤＮＡクローニングシステムに添附
のカラムにかけ、１００ｍＭ　　ＮａＣＱを含むＴＥに
て溶出させた。これによりＥＣ０ＲＩリンカ−由来の低
分子１ＤＮＡが除去された。上記で溶出されたＥＣ０Ｒ
Ｉ粘着末端を有するＣＤＮＡをエタノール沈澱により回
収した。

上記で回収されたｃＤＮＡの半量３０ｎｏを含む水溶液
６μｇに、上記キットに含まれるＩＯＸリガーゼバッフ
１−１μΩ、λｇｔ７０ＥＣＯＲＩアーム２μＭ１μＱ
）及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１μＱ　（２，５単位）を加
えて、全量を１０μＱとし、１２℃で一夜インキユベー
トし、ＣＤＮＡを含む粗換えλＱｔ１０ＤＮＡ＠得た。

この反応物をエタノール沈澱により回収し、ＴＥ２．５
μＱに溶解させた後、大腸菌ＢＨ３２６８８株ｌＮ２０
５ｒｅｃΔ″″（λ　１ｍｍ４３４　ＣＩｔＳ　ｂ２ｒ
ｅｄ３　Ｅ　ａｍ４　Ｓａｍ７　）　／　／１　］　（
Ｄ凍ｔａＭＩＷｌｊｈ出Ｈ１０μＱ及び大腸ｍＢＨＢ２
６９０株［Ｎ２０５ｒｅｃＡ−（λ　１ｍｍ４３４　ｃ
ｌ　ｔｓ　ｂ２　ｒｅｄ３　Ｄａｍ１５Ｓａｍ７）／λ
］の超音波破砕抽出液１５μＱを加えて、２０℃で２時
間インキユベートシ、インビトロパッケージングを行な
った。その後、反応混合液に、１００ｍＭ　　ＮａＣＱ
、５０ｍＭトリ０．０１％ゼラチンからなる溶液０．５
戒及びクロロホルム２０μＱを加えた。

上記により、ＣＤＮＡを含む組換えλＱｔ１０ＤＮＡが
λファー２粒子内に封入された。

マダイＧＨＣ［）ＮＡを　む組　えＤＮＡの１上記で得
られた組換えファージの全量を、マニアティスらの方法
（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｆ、。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃ１ｏｎｉｎｐ、ｐ６３．　Ｃ
ｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｖｏｒ　Ｌ　ａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ（１９８２）　）に従って調製された宿主細胞Ｎ
Ｍ５１４（アマジャム社製）の懸濁液１ｍＧ（１０９細
胞／鵬）に感染させ、得られた約１　Ｘ　１０Ｓ個のフ
ァージプラークを、ナイロンメンブレン　バイオダイン
Ａ（日本ボール社製）上に固定した。

次いでシロザケ成長ホルモンのＣＤＮＡ配列中、ＬｅＬ
ｌ　　　−Ｖａｔ１７５の領域に相当する５０塩基のＤ
ＮＡ、即ち下記ＤＮＡを、ＤＮＡ合成機３８１Ａ型（ア
プライドバイオシステムズ社製）を用いて合成し、３２
Ｐで標識してプローブとした。

５’　　　ＧＡＣＧＧ丁ＣＡＧＧＴＡＧＧＴＣ丁ＣＧＡ
ＣＣ丁ＴＧ丁ＧＣＡＴＧＴＣ（ＪｒＣＴｒＧＡＡＧＣＡ
ＴＧＣＣＡ　　３゜ ベントン（３ｅｎｔｏｎ　）とディビイス（［）ａｖｉ
ｓ）の方法〔前掲書、”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌ０
ｎｉｎＱ”ｐ３２０参照〕に従って、６５℃でプラーク
ハイブリダイゼーションを行なった結果、約１×１０３
個のプラークが、３２Ｐ標識プローブと結合することが
示された。そのうちの１２個のプラークをそれぞれ里離
し、λＴＧＨ１〜λＴＧＨ１２と命名した。

マ　イＧＨＣＤＮＡの塩基　　の決定 上記で得られた１２個の粗換えファージから、フェノー
ル抽出及びエタノール沈澱を行なって、それぞファージ
ＤＮＡを調製した。

次に得られたＤＮＡの各々を、以下の通り、制限酵素Ｅ
Ｃ０ＲＩで切断し、該ＤＮＡ中に保持されているＣＤＮ
Ａｅ得た。即ち、ファージＤＮＡ５ｔｌＱを、１００ｍ
Ｍ　　ＮａＣＱ、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，５＞、
１０ｍＭ　　ＭａＳＯｔ及び１ｍＭジチオスレイトール
（ＤＴＴ）を含む水溶液（以下「高塩濃度緩衝液」とい
う）に溶解させ、これにＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）５０
単位を加えて３００μＱとし、３７℃で３時間反応させ
た後、エタノール沈澱により切断されたＤＮＡを回収し
、これをＴＥ２０μＱに溶解させた。

別に、プラスミドｐ　ＵＣ１９（Ｙａｎｉｓｃｈ　−Ｐ
ｅｒｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　、　３３．１
０３（１９８５））３μＱ＠ＥｃｏＲ１２０単位を含む
高塩濃度緩衝液１００μＱ中で、３７℃にて１２時間反
応させた後、エタノール沈澱を行なって回収したＤＮＡ
をＴＥ２０μＱに溶解させた溶液を調製した。

上記ファージＤＮＡのＥＣ０ＲＩ断片液２μＱ、ｐＬＩ
ｃ１９ＥｃｏＲＩ断片液１μＱ、ＩＯＸ断片−ゼ緩衝液
［６６０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，５＞、６６　ｍ　Ｍ
　　Ｍ　Ｑ　Ｓ　Ｏを及び１００ｍＭ　　ＤＴＴの水溶
液１１μＱ、１０ｍＭ　　ＡＴＰ１μＱ、蒸留水４μＱ
及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）１μＱ　（３５
０単位）を混合し、１２℃で１６時間反応させた。

次いで、上記反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（Ｙａ
ｎｉＳＣｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　（３ｅｎ
ｅ　、　３３　。

１０３　（１９８５））を、形質転換させた。この形質
転換はリーデルベルグ（Ｌ　ｅｄｅｒｂｅｒｇ　）とコ
ーエン（ＣＯｈｅｎ）の方法（Ｊ　、１３ａｃｔｅｒｉ
ｏ１．、１　’ｌ　９　。

１０７２　（１９７４））に従って、次の通り実施した
。即ち、ＣａＣＱ２処理したＪＭ１０９株の懸濁液２０
０μＱに、上記反応液１０μＱを加えて６０分間氷冷し
た後、４２．５℃の水浴中で９０秒間加温し、これにし
−ブロス［１％バタトトリプトン、０．５％酵母エキス
及び０．５％ＮａＣＱの水溶液］　２，８ｍ１２を加え
、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで得られ
た懸濁液を１０枚の選択プレートに３００μＱづつ塗抹
し、３７℃にて一夜培養した。尚、上記選択プレートと
しては、アンピシリン５０μｇ／１１１０、イソプロピ
ルβ−Ｄ−チオガラクトシド１２．５μＱ／１Ｔｌ１２
及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ
−ガラクトシド４０μＱ／ｍＱを含むＬ−ブロスに、寒
天１．５％を添加して固めた平板培地（２５ｍＧ／プレ
ート）を用いた。

上記選択培地のプレートに生育する白色のコロニーを分
離し、該コロニーからプラスミドＤＮＡを単離した。得
られたプラスミドは、その由来する組換えファージの名
と同一番号を付して、それぞれｐＴＧＨＥ１〜ｐＴＧＨ
Ｅ１２と命名した。

上記で得られた１２種のプラスミドを、各種の制限酵素
、例えばＢｐｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、　Ｈｉｎｄ　ｍ、Ｈ
ｌ）ａＩ、ＰＳｔＩ、ＰＶｕＩＩ（以上いずれも宝酒造
社製）　、Ｂａ１Ｉ　（二ｙボンジーン社ｆ％ｊ）　、
ＣＩａＩにューイングランドバイオラブズ社１）、ＳＳ
ｔ工（ベセスダ　リサーチ　ラボラトリーズ社製）で切
断して、解析することにより、各プラスミドに含まれる
ＣＤＮＡの制限酵素地図を作成Ｃた。

また、これと共にＣＤＮＡの長さを推定した。

その結果、ｐＴＧＨＥｌｌのＣＤＮＡが最も長く、約９
２０塩基からなっており、Ｂａ１Ｉ、ＢＯＩ■、Ｃｌａ
Ｉ、ＨｉｎｄＩ［Ｉ、Ｈａ　Ｉ、ＰｓｔＩ、ｐｖｕ［，
３ｓｔＩのそれぞれの制限酵素により切断される部位を
各１個ずつ有することが確認された。

上記ｐＴＧＨＥ１１に含まれるＣＤＮＡの制限酵素地図
を第１図に示す。

また、上記１）ＴＧ）−ＩＥ１１以外の各プラスミドに
含まれるＣＤＮＡについても上記と同様の制限酵素地図
を有することが確認された。

次に、ＤＴＧＨＥｌ　１のＣＤＮＡの全塩基配列をＭ１
３ファージを用いたサンガー法（Ｙａｎｉｓｃｈ−ｐｅ
ｒｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　（３ｅｎｅ　、　３３．１
０３（１９８５））に従い、Ｍ１３シーケンスキット（
東洋紡社製）を用いて決定した。

その結果は、前記式（５）に示した通りである。

該式（５）より、この塩基配列の一方の末端には、真核
生物の通常のｍＲＮＡに共通して存在するポリ（Ａ）鎖
があり、且つその上流にはポリ（Ａ＞付加信号として知
られる（５°）ＡＡＴＡＡＡ（３’　）の塩基配列が存
在している。

また該塩基配列は、２０３個のアミノ酸配列をコードす
る翻訳領域を含んでいる。該アミノ酸配列は前記式（２
）に示すものであり、そのうち−１７（Ｍｅｔ）から−
１（Ｓｅｐ）までのアミノ酸配列はハイネ（Ｈｅｉｊｎ
ｅ）の方法（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、１４．４
６８３　（１９８６））に従い、分泌タンパクのシグナ
ルペプチドであることが確認された。このことは、本発
明により得られるマダイＧＨが、ヒトＧＨ，シロザケＧ
Ｈ等と同様に、本来そのＮ末端にシグナルペプチドを持
った前駆体として産生細胞より合成されるものであるこ
とを明らかにしている。

更に、上記アミノ酸配列からシグナルペプチドのそれを
除いた１８６個のアミノ酸配列（マダイＧＨのアミノ酸
配列）を、既知の各種動物のＧＨのそれらと対比して相
同性を検討した結果、本マダイＧＨのアミノ酸配列は、
シロザケＧＨとは６８％、ヒトＧＨとは３３％共通して
いると認められた。因みに、シロザケＧＨとヒトＧＨと
は３６％の相同性が認められる。

更にまた、一般にＧＨとしての活性発現に重要であると
考えられているＣｙＳ残基の数と位置を、上記各ＧＨに
ついて比較した所、３者の間で完全な一致が認められた
。

以上のことより、上記アミノ酸配列がマダイＧＨのアミ
ノ酸配列であると確認できた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明プラスミドｐＴＧＨ６１１に含まれる
ｃＤＮＡの制限酵素地図を示すものである。 （以上）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ［１］下記式（１）の魚類成長ホルモンポリペプチドを
   含むアミノ酸配列をコードする魚類成長ホルモン遺伝子
   。 【遺伝子配列があります】（１） ［２］下記式（２）及び（３）のいずれかのアミノ酸配
   列のポリペプチドをコードする特許請求の範囲第１項に
   記載の遺伝子。 【遺伝子配列があります】（２） 【遺伝子配列があります】（３） ［３］３′末端に更にＴＡＡ、ＴＡＧ及びＴＧＡのいず
   れかの終止コドンが付加された特許請求の範囲第１項に
   記載の遺伝子。 ［４］魚類成長ホルモン産生能を有する組織乃至細胞か
   ら調製されたポリ（Ａ）ＲＮＡに対応するｃＤＮＡとし
   て単離された特許請求の範囲第１項記載の遺伝子。 ［５］特許請求の範囲第１項乃至第４項に記載の遺伝子
   を含む魚類成長ホルモン発現ベクター。 ［６］特許請求の範囲第４項に記載のベクターを保有す
   る宿主細胞。