JPH0222298A - 水痘・帯状ヘルペスウイルス抗体に関する試験 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 水痘は、ヘルペスウィルス群のＬ種である水痘・帯状ヘ
ルペスウィルス（Ｖ　Ｚ　Ｖ）により発生し、しかも、
予め免疫性をもたないか又は低レベルのＶＺＶ免疫性を
もつヒトの場合に発生する。νＺＶ特異的抗体の存在量
は、罹患後直ちに証明することができ、＠後期間中は減
少するが、但し長年にわたり検出可能な量のままであり
、病気に対する免疫性と相互関係がある。水痘は高度の
感染性があり；９０％以上の人々は最初の２０年間ＶＺ
Ｖにさられるようになる。この病気は、免疫反応が抑制
された人々及び士民を過ぎた人々に対する罹患率が極め
て高い、大半の場合、但しすべての場合ではないが、Ｖ
ＺＶは後板神経節細胞中に潜伏するようになる。この潜
伏状態から、ｖＺｖは活発化し、特異的抗体存在下でさ
えも、おそらく細胞性免疫の退行に起因して、帯状庖疹
を発生させる。免疫性のない人と活性水痘患者との接触
管理は、水痘による罹患の危険性が高い人に感染するこ
とを防止する上で、一定の情況下においては必要とされ
る。

ＶＺＶは、その表面上に主に６種の糖タンパク質：即ち
、ｇｐＬＯ５、ｇｐ９２、ｇｐ８３、ｇｐ６２、ｇｐ５
７、ｇｐ５５を有していることが見出された。これらの
糖タンパク質は、明らかに、３種の遺伝子からの産物：
即ち、ｇＡ（ｇｐ１０５）　、ｇＢ　（ｇｐ６２、ｇｐ
５？）及びｇＣ（ｇｐ９２、ｇｐ８３、ｇｐ５５）であ
る０ｇＣ糖タンパク賞はＶＺＶ糖タンパク質の大部分を
占め、しかも最大の免疫原性を有している。ｇＡ及びｇ
Ｂに対する一定のモノクローナル抗体はイン・ビトロに
おいてウィルス感染性の補体非依存的中和を起こし、ｇ
Ｃに対するモノクローナル抗体は補体依存的中和を起こ
す。

水痘）帯状ヘルペスウィルス（Ｖ　Ｚ　Ｖ）に対スる抗
体の検出に関し現在知られている試験法としては、ウィ
ルス感染細胞又はウィルス感染細胞の溶解物を固体担体
に付着させ、次いでこれらを生物学的液体に接触させ、
しかる後酵素又は蛍光プローブで複合化された第二抗体
に接触させる方法、例えば、対膜抗原蛍光抗体法（ＦＡ
ＭＡ）　、免疫付着血球凝集法（ＩＡＨＡ）　、酵素結
合免疫ソルベント試験法（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）がある。

市販の水痘診断具、即ちメリーランド州、ホイッテカー
・エム・ニー・バイオプロダクツ・オブ・ウォーカース
ピル社（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ　Ｍ、Ａ、Ｂｉｏ−Ｐｒｏ
ｄｕｃｔｓ　ｏｆ　Ｗａｌｋａｒｓｖｉｌｌｅ）のバリ
セリサ（ＶＡＲ１’ＣＢＬＩＳＡ”　）試験キットは、
ヒト血清中のＶＺＶに対するＩｇＧ抗体に関したＥＬＩ
ＳＡ型アッセイを利用している。試験では全体的な感染
細胞抗原を利用する。技術的結果報告書において、診断
具カタログ第３０−３５２０号（プレート類）及びイン
・ビトロ操作に関する記載部分は、参考のために本明細
書に組み込まれるが、これらは本発明の糖タンパク質及
び方法と合わせて利用する場合において適用することが
できる。

上記の関連試験では、各種ＶＺＶ抗原と反応する広範囲
の抗体を検出する。しかしながら、その試験では、イン
・ビトロにおいてウィルス感染性の中和が可能な抗体の
産生を促進することについて現在ではそれぞれ公知とな
っている３種のＶＺＶ糖タンパク質、即ちｇＡ、ｇＢ、
及びｇＣと反応する抗体群をグループに識別することが
できず、あるいはｖｚｖｔＨタンパク質と反応する抗体
群を他のタンパク質から識別することができないのであ
る。

したがって、本発明の目的は、精製されたｇＡ、ｇＢ、
及びｇｃＶＺＶ［タンパク質に対して特異的な抗体群の
サブグループを検出することができる改善された試験法
を提供することにある。もう１つの目的は、これら精製
された糖タンパク賞と、抗原を検出する際のそれらのコ
ントロールに関して、分離方法及び診断的用途を提供す
ることにある０本発明のこれらの及び他の目的は、下記
記載から明らかとなるであろう。

本発明によれば、宿主哺乳類生物学的液体において水痘
・帯状ヘルペスウィルス（ＶＺＶ）ｇＡ。

ｇＢ及びｇｃ糖タンパク質に対する抗体の存否を調べる
ための方法が提供されるが、この方法は下記工程からな
る二 （ａｌ　　少なくとも１種の精製され未変性でかつ血清
学的に活性なｇＡ、ｇＢもしくはｇｃＶＺＶ［タンパク
質又はその混合物を固体表面に永続的に付着させ； 山）　　ＶＺＶｇＡ、ｇＢ又はｇＣ糖タンパク質と一緒
に共精製された、精製され未変性でかつ血清学的に活性
な未感染細胞タンパク質もしくは糖タンパク質又はその
混合物を固体表面に永続的に付着させ； （Ｃ）　　工程（ａ）における上記固体表面に付着した
糖タンパク質及び工程色）における上記固体表面に付着
したタンパク質もしくは糖タンパク質を生物学的液体と
接触させ、この場合において、糖タンパク質に対する抗
体は、もし液体中に存在しているとすれば、上記糖タン
パク賞と結合して糖タンパク質−抗体複合体を形成し； （ｄｉ　　工程（′ｂ）及び（Ｃ）における上記固体表
面に付着した糖タンパク質をサブクラスもしくは全体的
免疫グロブリン又は特異的免疫グロブリンに対する抗免
疫グロブリン−指示薬複合体と接触させ、この場合にお
いて、上記抗免疫グロブリンは、もし工程（ｂ）又は（
Ｃ１で存在しているとすれば、上記糖タンパク質−抗体
複合体における上記抗体と結合することにより、糖タン
パク質−抗体−抗免疫グロブリン−指示薬複合体を形成
し、しかもこの場合において、上記指示薬は結合体の測
定可能な応答を与え；次いで （ｅ）　　工程（ｄ）の操作終了後に指示薬応答を測定
し、かつ、個々のｖｚｖｔｌ！タンパク賞又はその混合
物に対する応答から、その各々の未感染細胞タンパク質
又は糖タンパク質コントロールに対する応答を差引（こ
とによ号補正する。

特に、ヒトの血清学的液体中における水痘・帯状ヘルペ
スウィルス（ＶＺＶ）ｇＡ、ｇＢ及びｇｃＩ！タンパク
質に対するヒト抗体の存否をインビトロで調べるための
方法が提供されるが、この方法は下記工程からなる： （ａｌＶＺＶ感染細胞由来の精製され未変性でかつ血清
学的に活性なｇＡ、ｇＢ又はｇｃＶＺＶ［タンパク質を
固体ポリスチレン表面に永続的に付着させ； ｃｂ＋　　ｖｚｖｇＡ、ｇＢ又はｇ　ＣｌＪＭタンハ’
ｙＴｔトー緒に共精製された、精製され未変性でかつ血
清学的に活性な未感染細胞タンパク質もしくは糖タンパ
ク賞又はその混合物を固体ポリスチレン表面に永続的に
付着させ； （Ｃ）　　工程（ａ）及び争）において得られた上記表
面に付着した糖タンパク質を血清学的液体 （ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｈｕｉｄ　）と接触させ
、この場合において、糖タンパク質に対する抗体は、も
し液体中に存在しているとすれば、上記糖タンパク質と
結合して垢タンパク質−抗体複合体を形成し； （司　工程（Ｃ）における上記表面に付着した糖タンパ
ク質を、上記抗体に応答して誘導されかつアルカリホス
ファターゼで複合化された抗ヒト免疫グロブリンと接触
させ、この場合おいて、上記抗免疫グロブリンは、もし
存在しているとすれば、上記糖タンパク質−抗体複合体
の上記抗体と結合し； （ｄａ）　　工程（Ｃ１の複合体をｐ−ニトロフェニル
ホスフェート溶液と接触させ； （ｅ）　　工程（ｄａ）における酵素基質溶液展開後の
アルカリ溶液中でのｐ−二トロフェノールによる吸光度
を測定し、かつ酵素基質溶液展開後の吸光度を測定し、
個々のＶＺＶ＠タンパク質又はその混合物に対する応答
から、その各々の未感染細胞タンパク質又は糖タンパク
質コントロールに対する応答を差引くことにより補正す
る。

下記糖タンパク質についても開示する：精製され未変性
の血清学的活性型のＶＺＶｇＡ糖タンパク質； 精製され未変性の血清学的活性型のＶＺＶｇＢ糖タンパ
ク質： 精製され未変性の血清学的活性型のｖ　ｚ　ｖ　ｇ　、
ｃ糖タンパク質； レクチンアフィニティークロマトグラフィーにより精製
され、かつｇＡ及び／又はｇＢ及び／又はｇＣ糖タンパ
ク質を含有する、精製された感染細胞ＶＺＶＩＪｉタン
パク質； 免疫アフィニティークロマトグラフィーによりＶＺＶ感
染細胞溶解物由来ＶＺＶｇＡ、ｇＢ又はｇｃと一緒に共
精製された、精製され未変性である血清学的活性型の未
感染細胞タンパク質；レクチンアフィニティークロマト
グラフィーによりＶＺＶ感染細胞溶解物由来ＶＺＶ＠タ
ンパク質と一緒に共精製された、精製済未感染細胞糖タ
ンパク質。

下記ＶＺＶ診断装置について更に開示する：固体表面に
永続的に付着した、精製され未変性である血清学的活性
型のＶＺＶｇＡ＠タンパク質からなる診断装置； 固体表面に永続的に付着した、精製され未変性である血
清学的活性型のＶＺＶｇＢＷタンパク質からなる診断装
置； 固体表面に永続的に付着した、精製され未変性である血
清学的活性型のＶ　Ｚ　Ｖ　ｇ　Ｃ［タンパク質からな
る診断装置； 精製され未変性である血清学的活性型のＶＺＶｇＡ、ｇ
ＢもしくはｇＣ糖タンパク質、又はその混合物からなり
、少なくとも２種の上記糖タンパク質が存在し、かつ固
体表面に永続的に付着している診＃ｒ装置； 免疫アフィニティークロマトグラフィーによりＶＺＶ感
染細胞溶解物由来ＶＺＶｇＡ、ｇＢ又はｇＣと一緒に共
精製された、精製され未変性である血清学的活性型の未
感染細胞タンパク質からなり、固体表面に永続的に付着
している診断装置；レクチンアフィニティークロマトグ
ラフィーにより精製され、かつ未変性の血清学的活性型
であるｇＡ、、ｇＢ及びｇＣ糖タンパク質を含有し、固
体表面に永続的に付着している精製された感染細胞ＶＺ
ＶＩ！タンパク賞からなる診断装置：レクチンアフィニ
ティークロマトグラフィーにより精製され、かつ未変性
の血清学的活性型である糖タンパク質を含有し、固体表
面に永続的に付着している精製された未感染細胞垢タン
パク質からなる診断装置。

本発明は、生物学的液体において特異的ｇＡ、ｇＢ又は
ｇＣＶＺＩ！タンパク質に対する補乳類の抗体を検出す
るための試験法、更に詳しくは、生物学的液体、特にヒ
ト生物学的液体中のこれら抗体を検出する高感度酵素結
合試験法（ＥＬＩＳＡ）に関する０本発明において、公
知のタンパク貿凝集溶液から得られるＶＺＶｇＡ、ｇＢ
、ｇＣ糖タンパク質又はその混合物は、糖タンパク質を
吸着することが可能な固体表面、例えばプラスチック表
面に永続的に付着せしめられる。当該技術分野における
糖タンパク質の命名法によれば、参考のために本明細書
に組み込まれる論文：ダビソン（Ｄａｖｉｓｏｎ　）ら
のジャーナル・オブ・パイロロジーＵｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｆ　Ｖｔｒｏｌｏｇｙ　）−１９８６年３月、第１１９
５−１１９７頁に従い、ｇｐＩ（ｇｐＣ）、ｇｐＩＩ　
（ｇｐＢ）及びｇｐｍ＜ｇｐＡ＞とされる。

しかしながら、ｇｐＡ、ｇｐＢ及びｇｐｃの命名が本明
細書では使用される０本明細書で用いられる“永続的に
付着している”という語は、糖タンパク質が、水又はク
ロマトグラフィー溶出の際の緩衝液で単に洗浄するだけ
の未変性的方法によっては固体表面から容易に除去する
ことができないことを意味する。糖タンパク質を除去す
るには、水又は有機溶液中で煮沸するような過酷な条件
が必要とされるが、除去工程ではそれによって糖タンパ
ク質が変性される。

本明細書で用いられる“未変性“という語は、天然の未
精製糖タンパク質に結合可能な抗体と溶液中で反応し得
ることを意味する。

本明細書において用いられる１血清学的に活性”という
語は、動物に注射した場合に、天然の未精製糖タンパク
質と結合し得る抗体を誘導することができることを意味
する。

本明細書において用いられる“液体”という語は生物か
ら誘導される液体、例えば、血液、血清又は血漿を意味
する。

試験用抗原として利用可能な糖タンパク賞及びコントロ
ールは下記のとおりである： １．ＶＺＶ　　Ａ　　タンパク　　（″　Ａ′″）：Ｖ
　Ｚ　ＶｇＡ糖タンパク質と反応するモノクローナル抗
体Ａｔを用いた免疫アフィニティークロマトグラフィー
により、■Ｚ■感染ヒト細胞〔例えば、プロシーデイン
ゲス・オブ・ザ・ソサエテー・フォア・イクスピアリメ
ンタル・バイオロジー・アンド°メディシン（Ｐｒｏｃ
ｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｏｃｉｅｔｙｆｏｒ
　　Ｅｘｐｅｒｉｓ＋ｅｎｔａｌ　　Ｂｉｏｌｏｇｙ　
　ａｎｄ　　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　　）　　、第１６６巻
、第３３９−３４７頁に記載されているように、ＫＭｃ
Ｃ株活性弱毒化ＶＺＶウィルス４１０７１で感染された
ＭＲＣ−５細胞〕から精製される。ＭＲＣ−５ヒト肺繊
維芽細胞ＡＴＣＣ−１７１は公的に入手可能であり；Ｗ
！−３８ヒト肺繊維芽細胞、ＡＴＣＣ−７５は、他の発
癌性ヒト肺繊維芽細胞と同様に使用可能であって、同等
の結果を与える。ＫＭｃＣ株は、ＯＫａ野生型株から誘
導され、欧州において公的に入手可能なスミスクライン
（Ｓｍｉｔｈ−ｋｌｉｎｅ　）水痘ワクチンと同等の結
果を与える、例えば公的に入手可能な水痘・帯状ウィル
スＯＫａ株、ＡＴＣＣＶＲ７９５のような野生型又は弱
毒型のいずれの■Ｚ■株に変更されてもよい、モノクロ
ーナル抗体Ａｌの産生法は実施例１に挙げられ、ＶＺＶ
ｇＡＩＪｊタンパク質の産生法は実施例３に挙げられて
いる。変性型のこの糖タンパク質の同定については、下
記文献中に更に記載されており、それら文献はかかる目
的のために本明細書中に参考として組み込まれる：ケラ
ー（Ｋｅｌｌｅｒ）ら、ジャーナル・オブ・パイロロジ
ー、第５２巻、第２９３頁、１９８４年、即ち、ｇｐ１
０５ニゲロース（Ｇｒｏｓｅ　）ら、インフエクト・イ
ムノ　（Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｇｇｍｕｎ、　）　、第４０
巻、第３８１頁、１９８３年、即ち、精製型としてｇＡ
から単離されたｇｐＨ８；シラキ（Ｓｈｉｒａｋｉ　）
ら、ジエイ・ジェネ・バイロロ（Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏ
ｌ、）　、第６１−巻、第２５５頁、１９８２年、即ち
、ｇｐｌ：及び、フォルガニ（Ｆｏｒｇｈａｎｉ）ら、
ジャーナル・オブ・パイロロジー、第５２巻、第５５頁
、１９８４年、即ち、ｇｐＨ８゜ ２、ホ１ペプチド（“　Ａコントロール”）：未感染の
、例えばＭＲＣ−５細胞系から得られ、即ち、ＶＺＶｇ
Ａ［タンパク質と反応する上記モノクローナル抗体Ａｔ
を用いた免疫アフィニティークロマトグラフィーにより
、実質的には、実施例５のような、アイゼンベルブ（Ｅ
ｉｓｅｎｂｅｒｇ）ら、ジャーナル・オブ・パイロロジ
ー、第４１巻、第１０９９頁、１９８２年に記載された
方法により精製される。

３、ＶＺＶＢ　　　ンパク　　　　Ｂ”　　：ＶＺＶｇ
Ｂ糖タンパク質と反応するモノクローナル抗体Ｂ１を用
いた免疫アフィニティークロマトグラフィーによりＶＺ
Ｖ感染細胞から精製される。モノクローナル抗体Ｂ１の
産生法は実施例１に挙げられ、ＶＺＶｇＢ［タンパク質
の産生法は実施例２に挙げられている。−変性型のこれ
ら糖タンパク質の同定法については、下記文献中に更に
記載されており、それら文献はかかる目的のために本明
細書中に参考として組み込まれる：ケラーら、同上、即
ち、ｇｐｔｔｓ、ｇｐ６２、ｇｐ５７；オクノ　（Ｏｋ
ｕｒｏ　）ら、ウィルス学（ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　、第
１２９巻、第３５７頁、１９８３年、即ち、ｇｐ２、ｇ
ｐ５；グロースら、ｇｐ１４０、ｇｐｓｓ、“ジスルフ
ィド結合二量体°；及び、７　ｆ　／Ｌｚガニら、同上
、１２０Ｋ、１１８に、６４−６５Ｋ。

４、ｔＰ＋−ホ言ペプチド（“　Ｂコントロール”）：
ＶＺＶｇＢ［タンパク質と反応する上記モノクローナル
抗体Ｂ１を用いた免疫アフィニティークロマトグラフィ
ーにより、実質的には、実施例６に記載された方法によ
り精製される。

５、ＶＺＶ　　Ｃ’／ハク’　　Ｃ”　　　：ＶＺＶｇ
Ｃ糖タンパク質と反応するモノクローナル抗体Ｃ１を用
いた免疫アフィニティークロマトグラフィーによりｖｚ
ｖ感染細胞から精製される。

モノクローナル抗体Ｃ１の産生法は実施例１に挙げられ
、ＶＺＶ＠タンパク質の産生法は実施例４に挙げられて
いる。変性型のこれら糖タンパク賞の同定法については
、下記文献中に更に記載されている：ケラーら、同上、
即ち、ｇｐ９２、ｇｐ８３、ｇｐ５２、ｇｐ４５　；グ
ロースら、インフエクト・イムノ、第４０巻、第３８１
頁、１９８３年、即ち、ｇｐ９８、ｇｐ６３；オクノら
、同上、即ち、ｇｐ３、ｇｐ４、ｇｐ６；及び、フォル
ガニら、同上、９０Ｋ、８０に、６０Ｋ。

６、ｖ′−ボ１ペプチド（”　　Ｃコントロール”　：
ｖ　ｚ　ｖ　ｇ　ｃＨタンパク質と反応する上記モノク
ローナル抗体Ｃ１を用いた免疫アフィニティークロマト
グラフィーにより、実質的には、実施例７に記載された
方法により精製される。

７、　Ｖ　Ｚ　Ｖ　　　　ンパ　　　“レクチン”　：
すべてのｖｚｖＩ！タンパク質と広く交差反応する固定
化レクチンを用いたレクチンアフィニティークロマトグ
ラフィーによりｖｚｖ感染細胞から精製される。この方
法は〈実施例８のように、ハイマン（ｌａｙｍａｎ）ら
、エフ・イー・ビー・ニス・レター（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔ
ｔ、）　、第２９巻、第１８５頁、１９７３年に記載さ
れている。

８、ｔＰ′　　　　　　　ンバク　　（°レクチンコン
トロール”）：同様の固定化レクチンを用いたレクチン
アフィニティークロマトグラフィーと、実施例９のよう
な上記７に記載された方法とによって、未感染細胞から
精製される。

■Ｚ■ウィルス粒子の表面上に上記タンパク質が存在し
ていると、ウィルスに対する免疫性を賦活する。この免
疫性は、体液性免疫、即ち抗体を産生ずるものであって
も、又は細胞性免疫であってもよい、上記ｇＡ、ｇＢ及
びｇＣ抗原は、物理的及び化学的特性と、異なるモノク
ローナル抗体との反応性とによって区別されるが、上記
方法により細胞性免疫を測定する試験に際しての診断試
薬、診断装置及び精製ＶＺＶ垢タンパク質として使用す
ることができる。このような試験法の例としては、遅延
型過敏症ｖ：、験（皮石テスト抗原）及びイン・ビトロ
Ｔ細胞増殖能試験がある。更に、精製ｇＡ、ｇＢ又はｇ
ＣＶＺＶ糖タンパク質は、単独又は組合せで、ポリクロ
ーナル単一特異性抗体又はポリクローナルヒト急性期も
しくは回復期血清のいずれかを用いた免疫アフィニティ
ークロマトグラフィー等の方法により、診断試薬として
使用するために精製されかつ利用される。

本明細書に記載された本発明方法は、一般には、精製さ
れ未変性である血清学的活性型の上記糖タンパク質を、
ストリップ又は典型的にはポリスチレンマルチウェル試
験プレートのウェルの固体表面に永続的に付着させるこ
とにより、即ち約４〜８℃で典型的には約１８〜４８時
間インキエベートして表面を糖タンパク賞で覆うことに
より実施することができる０表面はしかる後排水され、
適切な溶液、例えば、０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ
　）２０”含有リン酸緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ　：　０．１
５Ｍ　ＮａＣ１。

０、０１　Ｍ　Ｍａｔ■ＰＯ＃、ｐＨ７，２）、で洗浄
される。

ＶＺＶＩ！タンパク貿に対する抗体９存否について試験
される生物学的液体の一連の希釈は、１％ウシ胎児血清
及び“グロブリン欠乏“ヤギ血清を含む０．０５％ツイ
ーン２０１含有ＰＢＳで行なわれ、ここで１グロブリン
欠乏３ヤギ血清はペンシルバニア州デンバーのへズレト
ン・ラブズ社（ＨａｚｌｅｔｏｎＬａｂｓ）の正常なり
ギ血ｔ〃から下記のようにして得られる： ａ、正常なりギ血清を水でｌ：２に希釈し；ｂ、攪拌し
て滴下しながら等量の飽和 （Ｎｌｆｔ）ｚｓＯ４と混合し； ｃ、４℃で一夜貯蔵し； ｄ、１０℃、１５００ｒｐ＋ｍで遠心分離し；ｅ、沈殿
物を捨て； ｆ、上澄を濾過滅菌する。

ウィルス学的液体のこれら一連の希釈液は洗浄された表
面と接触せしめられ、約０．５〜２．０時間約　２５〜
約４０℃でインキユベートされる。ウェルは次いで０．
０５％ツイーン２０”含有ＰＢＳで完全に洗浄され、存
在する未結合抗体が除去される。ウェルは次いで典型的
には抗免疫グロブリン−酵素複合体に接触せしめられ、
３７℃で！時間インキエベートされる。未結合複合体は
上記ＰＢＳ／ツイーン溶液で流去される０次いで、典型
的には、前工程と同様の条件下で酵素基質溶液が加えら
れるが、但し基質のインキユベートは１８〜２８℃で約
１時間行なわれ、しかる後塩基（ＩＮ　Ｎａ０Ｈ）の添
加により終了される。ウェルの光学濃度（Ａ）が次いで
４０５〜４９０ｎｍで測定される。

読取り値は次いで、未感染ＭＲＣ−５細胞糖タンパク質
に対し同一の方法を実施することにより得られたそれら
個々のコントロール値によって下記のように補正される
；例えば、抗体（ｇＡ）　＝吸光度（ｇＡ）　　（Ａ（
ｇＡ）　　）　　−Ａ　　（ｇＡ　　コントトル）；　
抗体　（ｇＢ）　　＝Ａ（ｇＢ）−Ａ（ｇＢ　　コント
トル）；抗体（ｇＣ）−Ａ（ｇＣ）−Ａ（ｇＣコントト
ル）：　抗体　（総糖タンパク１）−Ａ　　Ｃレクチン
）−Ａ（レクチンコントトル）。

上記の方法において、哺乳類生物学的液体は、水痘・帯
状ヘルペスウィルスに対して活性なネズミ、ウシ、ヤギ
、ヒト又はいずれかの哺乳類の液体である。好ましくは
、上記方法で使用される哺乳類生物学的液体はヒトの液
体である。

試験される液体自体は、哺乳類の全血液、血漿又は血清
である。好ましくは、血清が使用される。

本発明の方法に使用される固体表面は、ポリスチレン、
ナイロン、ポリエステル、ポリビニルクロリド、ポリア
クリロニトリル等をはじめとするいずれかの合成ポリマ
ーのものであっても、又はガラスもしくは炭素のような
物質からなる他の化学的に非反応性の固体粒子のもので
あってもよい。

好ましくはポリスチレンであり、特に好ましくは、例え
ばナンク社（Ｎｕｎｃ）　、リンブロー社（Ｌｉｎｂｒ
ｏ　）又はディナテフチ社（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）製造の
市販マルチウェル試験プレートのような平滑なポリスチ
レンである。

糖タンパク質−抗体複合体が形成されるのは、血清学的
に活性な抗体とそれらの各々のｇＡ、ｇＢ、、ｇＣ又は
その混合物からなる抗原糖タンパク賞との間の特異的相
互作用の結果であり：即ち、ｇＡ抗体はｇＡ抗原糖タン
パク質と反応する。

抗免疫グロブリン−指示薬複合体は、咄乳頻生物学的液
体宿主源以外の別の宿主から誘導される抗免疫グロブリ
ンを含有している。ヒトＶｚｖ抗体について試験する場
合に抗免疫グロブリンは別の供給源、例えば、マウス又
はウサギから誘導されるが、ヒト抗体はその動物体内に
導入されて抗免疫グロブリンを産生じ、これは当該技術
分野において公知の技術により単離精製することができ
る。好ましい抗免疫グロブリンはヤギ又はウサギ抗ヒト
ＩｇＧである。抗免疫グロブリンは、サブクラスの抗体
決定のために、ＩｇＭ又はＩｇＡに対しても利用するこ
とができる。他の指示薬複合６体としては、抗体と特異
的に結合するスタフ（ｓｔａｐｈ　）　Ａタンパク質又
は他の物質の複合体がある。

複合体の指示薬は、燐光性プローブ又は燐光剤；ローダ
ミン又はフルオレセインのような蛍光剤；Ｉ　Ｉｔｓの
ような放射線標識、あるいはアルカリホスファターゼ、
ビオチン−アビジン系、西洋ワサビペルオキシダーゼ又
はβ−Ｄ−ガラクトースのような酵素結合免疫ソルベン
ト試験（ＥＬＩＳＡ　）用試薬であってもよい、好まし
くは、ＥＬＩ　ＳＡ試薬が高感度かつ特異性の故に使用
される。

上記方法における好ましい酵素試薬はアルカリホスファ
ターゼである。

使用可能な酸素基質は、酵素により作用せしめられて、
抗体及び糖タンパク質の結合体、並びに抗体−糖タンパ
ク賞複合体及び抗免疫グロブリン−酵素もしくは他の指
示薬複合体の結合体についての存在を示唆する測定可能
な応答を発生するいずれかの基質である。応答は、一般
には、酵素基質溶液における光学密度（Ａ）即ち吸光度
の変化であり、通常は４００〜８００ｍμ可視領域での
変色である。応答は、標準的可視又は紫外分光光度系に
よって分光学的に測定される。

使用可能な酵素基質としては、３−アミノ−９−エチル
カルバゾール、３．３’、５．５’−テトラメチルベン
ジジン（ＴＭＢ）　、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ
）　、２．２　’−アジノジ〔３−エチルベンズチアゾ
リン−スルホネート〕（ＡＤＴＳ）及びｐ−ニトロフェ
ニルホスフェートがある。上記方法に使用される好まし
い酵素基質はｐ−ニトロフェニルホスフェートである。

放射線標識が用いられた場合の応答は、α、β又はＴ線
用の適切な放射線カウンター又はシンチレータ−により
定量することができる。

燐光又は蛍光プローブが用いられた場合は、当該技術分
野で公知の適切な分光光度計を使用することができる。

本発明の好ましい方法において、アルカリホスファター
ゼ酵素は、０−ニトロフェニルホスフェートに作用して
アルカリ溶液中４０５ｎ＋ａの吸収がある０−二トロフ
ェノールを放出し、光学的読取りのために結合体の存在
量について間接的測定値を与える。

上記方法においては、糖タンパク質−抗体複合体の完全
な洗浄が必要であり、これによって、抗免疫グロブリン
−指示薬もしくは他の指示薬複合体と複合化させる前に
すべての未結合抗体を除去し、読取りミスが多くなるこ
とを避けることができる。

同様に、完全な洗浄は糖タンパク質−抗体−抗免疫グロ
ブリン−酵素複合体又は糖タンパク質−抗体−指示薬に
対して必要であり、これによって、酵素基質と接触させ
る前に未結合抗免疫グロブリン−酵素複合体を除去する
ことができる。

上記のように、ｇＡ、ｇＢ及びｇＣコントロールは、例
えばＭＲＣ−５細胞系のＶＺＶ未感染細胞溶解物から、
糖タンパク質を用いたＥＬ　Ｉ　ＳＡ法により得られる
。ＶＺＶ未感染細胞溶解物から糖タンパク質を得るため
の方法については上述されている。

上記方法において、使用される糖タンパク質は、各々の
ｇＡ、ｇＢもしくはｇＣｌ又はいずれか２種もしくは３
種すべての各種割合の混合物である。

好ましくは、糖タンパク質は独立して使用され、例えば
ｇＡである。

総ｖｚｖ感染細胞タンパク質は、レクチンクロマトグラ
フィーによって精製されるが、試験において永続的に付
着した糖タンパク質として使用することもできる。

精製され未変性である血清学的活性型のＶＺＶ　ｇＡ、
ｇＢ及びｇｃＩ！タンパク質を同様に、新規な試薬及び
組成物として開示されている。

免疫アフィニティークロマトグラフィーによりＶＺＶ感
染細胞溶解物由来ＶＺＶｇＡ、ｇＢ及びｇＣと一緒に共
精製される、精製され未変性である血清学的活性型の未
感染細胞タンパク質も同様に、新規な試薬又は組成物と
して開示されている。

免疫アフィニティークロマトグラフィーによるこれら物
質の精製及び単離については実施例中に挙げられている
。

レクチンアフィニティークロマトグラフィーにより精製
され、かつｇＡ、ｇＢ及びｇｅ糖タンパク質を含有する
総ＶＺＶ感染細胞糖タンパク質も開示されている。この
精製混合物も本発明におレソて利用することができる。

レクチンアフィニティークロマトグラフィーにより精製
された総未感染細胞糖タンパク質も開示されている。こ
の精製混合物も本発明において利用することができる。

レクチンアフィニティークロマトグラフィーによるこれ
ら物質の精製及び単離については実施例中に記載されて
いる。

固体、例えば本明細書に記載されているような合成ポリ
マー、好ましくはポリスチレンの表面上に永続的に付着
せしめられた、精製され未変性でかつ血清学的に活性な
ＶＺＶｇＡ、ｇＢもしくはｇＣＬり、ンバク質又はその
混合物からなる診断装置も開示されている。

免疫アフィニティークロマトグラフィーによりＶＺＶ感
染細胞溶解物由来ＶＺＶｇＡ、ｇＢ又はｇＣと一緒に共
精製され、固体、例えば本明細書に記載されているよう
な合成ポリマー、好ましくはポリスチレンの表面上に永
続的に付着せしめることによって抽出された、精製され
未変性でかつ血清学的に活性な未感染細胞タンパク質か
らなる診断具も開示される。

レクチンアフィニティークロマトグラフィーにより精製
された総ＶＺＶ感染細胞糖タンパク賞も有用な診断具で
あって、固体表面に永続的に付着せしめられる。

レクチンアフィニティークロマトグラフィーにより精製
された総未感染細胞糖タンパク質も使用され、固体表面
に永続的に付着せしめられる。

下記実施例は本発明を説明するためのものであるが、し
かしながら、それと同一のものに限定させるためのもの
ではない。

ト　　グロブリン：カリフォルニア州９４０１０、バー
リンゲーム、タボ社（Ｔａｇｏ　Ｉｎｃ、　）から入手
できる。

３、ヤギ　−アルブミン：正常なりギ血清から調製され
、ペンシルバニア州、ハズレトン・ラブズ社から入手で
きるが、“グロブマン　　”ヤギ、ＩＬｔと称される方
が適しており、下記のようにして調製される： ａ、正常なりギ血清を水で１＝２に希釈し；ｂ、攪拌し
て滴下しながら等量の飽和（ＮＨ４）　ｚｓＯａと混合
し； ｃ、４℃で一夜貯蔵し； ｄ、１０℃、１５００ｒｐ−で遠心分離し：Ｃ０沈殿物
を捨て； ｒ、上澄を濾過滅菌する。

実施例１ ｇＡ、ｇＢ及びｇＣＦ’タンパク質に対するモノクロー
ナル抗体を産生ずるための下記操作は、かかる目的のた
めに本明細書に参考のために組み込まれるケラ−ら、同
上に基づいている。

１０週齢ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、完全フロインドアジュ
バントで乳化された精製ウィルス〔ネフ・ビー・ジエイ
、アール・イー・ウェイベル、ブイ・エム・ビラレジョ
ス、イー・ビー・バイナック、ニー・ニー・マクリーン
、デー・エッチ・モートン、ビー・ニス・ウォランスキ
ー及びエム・アール・ヒルマン（Ｎｅｆｆ、　Ｂ、　Ｊ
、、　Ｒ，Ｅ、　Ｗｅｉｂｅｌ＋Ｖ、　Ｍ、　Ｖｉｆｌ
ａｒｅｊｏｓ、　Ｅ、　Ｂ、　Ｂｕｙｎａｋ、　Ａ、　
Ａ、　Ｍｃｌｅａｎ。

Ｄ、　Ｈ，Ｍｏｒｔｏｏ、　Ｂ、　Ｓ、　Ｗｏｌａｎｓ
ｋｉ、　ａｎｄ　Ｍ、　Ｒ。

旧１１ｅｍａｎ）　、１９８１年、”ＫＭｃＣ株活性弱
活性弱毒化水痘ウィルス１０７１）の臨床的及び実験室
的研究“、プロシーデインゲス・オブ・ザ・ソサエテー
・フォア・イクスピアリメンタル・バイオロジー・アン
ド・メディシン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆｔｈｅ　
５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　
Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄＭｅｄｉｃｉｎｅ）　、第１６
６巻、第３３９−３４７頁に記載されたＶＺＶ　　ＫＭ
ｃＣ株〕　２０μｇ　ｃローリ−、オー・エッチ、エヌ
・ジェイ・ローズプロ、ニー・エル・ファール、及びア
ール・ジェイ・ランドール（Ｌｏｗｒｙ、　０．　Ｉｌ
、、　Ｎ、　Ｊ、　ＲｏｓｅｂｒｏｕｇｈＡ、　Ｌ、　
Ｆａｒｒ、　ａｎｄ　Ｒ，Ｊ、　Ｒａｎｄａｌｌ　）　
、１９５１年、“フォリンフェノール試薬によるタンパ
ク賞測定°、ジャーナル・オブ・バイオロジカ、ル・ケ
ミストリー　（Ｊｏａｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　、第１９３巻、第２
６５−２７５頁に記載されているようにして測定〕で多
段部位に皮下的に免疫し、２週間後精製ＶＺＶ２５μｇ
をアジユバントなしで腹腔的に追加免疫した。すべての
血清は、二次注射の２週間後に分析され、活性細胞膜フ
ルオレセイン（ＦＡＭＡ）分析によると抗ウイルス力価
〉４００及び抗細胞力価〈５０であり、感染細胞抽出物
のウェスターン法においてｖＺｖタンパク賞と反応した
（データ示さず）、二次免疫の１か刃稜のマウスに精製
ＶＺＶ２５μｇをアジユバントなしで静脈内投与した。

３日後、最大の抗ＶＺＶ力価をもつ２匹のマウスから肺
臓を摘出した。肺臓細胞をＳ　Ｐ　２１０マウス骨髄腫
細胞〔インスティテユート・フォア・メディカル・リサ
ーチ社（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｍｅｄｉｃａｌ
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　）と融合させ、ハイブリドーマ
細胞を培養基に入れ、以前に公表された操作二オイ・ブ
イ・チー、及びエル・ニー・ベンゼンベルブ（Ｏｉ、　
Ｖ、　Ｔ、、　ａｎｄ　Ｌ、　Ａ。

）１ｅｒｚｅｎｂｅｒｇ）　、１９８０年、“免疫グロ
ブリン産生ハイブリッド細胞系”、第３５１−３７２頁
、ビー・ビー・ミシェル及びニス・エム・シーギ（編集
）　　（Ｂ、　Ｂ、　Ｍｉｓｈｅｌｌ　ａｎｄ　Ｓ、　
Ｍ、　Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄ、）に従い培養した。サンフ
ランシスコ、ダブル・エッチ・フリーマン・アンド・カ
ンパニー社（Ｗ、　Ｈ。

Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ。Ｉｎｃ、　）の細胞性免疫
学に記載された方法を選択した。２週間後、活発に増殖
している細胞のウェルから得た上澄をＦＡＭＡ法により
抗ＶＺＶ反応性について試験した。ＶＺＶ膜抗原と反応
する細胞分泌性抗体を限界希釈法により複製し、腹水中
に拡散させた。一般に、各ポリクローン中の２種のモノ
クローンを用いて腹水を得た、いずれの２つの１姉妹′
クローンに関しても、特異性に差異のないことが観察さ
れた。

腹水中において、ＶＺＶ膜抗原を認識する１０種の各々
のモノクローナル抗体が産生せしめられた。ＶＺＶ感染
ＭＲＣ−５細胞に対する反応性について試験した場合に
、ＦＡＭＡ力価は１：３２．０００〜ｉ：ｚｓｓ、ｏｏ
ｏの範囲であり、方いずれの抗体もＦＡＭＡ法において
は未感染細胞と反応しなかった（表１）、サブクラス抗
体の特性についても調べた（表１）、各腹水中での抗体
濃度は約２■／ｍｌであった。

モノクローナル抗体の血清学的特異性を免疫沈降法によ
り分析した。抗体を、コントロール腹水とともに、（！
５Ｓ）メチオニン標識感染細胞抽出物、（１４Ｃ）グル
コサミン標識感染細胞抽出物及び（３５Ｓ）メチオニン
標識精製ウィルス粒子と反応させた。ドデシル硫酸ナト
リウム（Ｓ　ＯＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動分
布を示しく図ＩＡ−Ｃ）、これら分布の解析結果を要約
するＣ表１）、我々は、モノクローナル抗体Ｃ１〜Ｃ８
が■Ｚ■ポリペプチドに対し実質的に同一の反応性を示
しく但し、表１の脚注ｆで示されたものを除＜）；シた
がって、抗体Ｃ８で示される分布（図ＩＡ２、Ｂ２及び
Ｃ２）がｃｉ−ｃａのグループの代表例であることを観
察した。１０種のモノクローナル抗体の中で３つの反応
パターンが観察された。（ｉ）クローンＡ１抗体は、感
染細胞及びウィルス粒子の両方から単一のポリペプチド
ｇｐ１０５　（分子量１０５．０００の糖タンパク質）
を認識した。（ｉｉ）クローンＢ１抗体は、感染細胞か
らｐＨｏ　　（非糖タンパク質）、ｇｐ１１５、ｇｐ６
２及びｇｐ５７を認識し、ウィルス粒子からはｇｐ６２
及びｇｐ５７のみを認識した。　　（ｕｉ）８種のＣ抗
体は、感染細胞のみからｇｐ４５を認識し、感染細胞及
びウィルス粒子の両方からはｇｐ９２、ｇｐｓｓ及びｇ
ｐ５２を認識した。

モノクローナル抗体の特異性について更に特徴づけるた
めに、精製ウィルス及び感染細胞の再抽出物を変性し、
ウェスターン法で分離し、腹水の反応性について試験し
た。ＡＩ及びＢ１はいずれのポリペプチドとも反応せず
、一方８種のＣ抗体のうち７種は細胞性抗原ｇｐ９２、
ｇｐｓｓ、ｇｐ５２及びｇｐ４５のすべてのグループと
反応した。精製ウィルス粒子からは、免疫沈降解析（図
ＩＣ２）の場合と同様に、ｇｐ９２及びｇｐｓｓが反応
性の面で主流を占めていた。７種のＣ抗体反応性グルー
プのうち１つに関する代表的分布を示す（図２）０重要
なことは、ウェスターン法のデータは、非特異的共沈の
可能性があるものを除外することによって、各種のポリ
ペプチド、即ちｇｐ９２、ｇｐｓｓ、ｇｐ５２及びｇｐ
４５を単一の抗原群に分類することに役立ったというこ
とである。ウェスターン法で反応した７種すべてのＣ抗
体は免疫沈降法においても陽性であったことが注目され
る。このことは初期の研究と異なっており、即ちウェス
ターン法によるスクリーニングのみで免疫沈降法による
スクリーニング単独よりも多い数のモノクローナル抗体
を検出したのであったニブラウン・デー・ケイ（Ｂｒａ
ｕｎ、　ｏ、　Ｋ、）、エル・ベリーラ（Ｌ、　Ｐｅｒ
ｅｉｒａ）　、ビー・ノリルド（Ｂ、　Ｎｏｒｒｉｌｄ
）及びビー・ロイズマン（Ｂ、　Ｒｏｊｚｍａｎ）、１
９８３年、“モノクローナル抗体の検出及びウィルスタ
ンパク質の性質の研究のための、単純ヘルペスウィルス
感染細胞における変性され電気泳動で分離されかつ固定
化された溶解物の応用。

ジャーナル・オブ・パイロロジー、第４６巻、第１０３
−１１２頁。

免疫沈降分析によって分類されたポリペプチドのうちい
（つかは、同様の電気泳動移動性を示した。ウィルス遺
伝子産物における抗原性の差異及び可能性のある血清学
的分類について更に研究するために、交差除去（ｃｒｏ
ｓｓ−ｃｌｅａｒｉｎｇ）免疫沈降法を、モノクローナ
ル抗体及び（！１３）メチオニン標＠悪染細胞抽出物間
で実施した（図３）、抽出物をＡ１で２回除去した後、
抗体Ａ１はそれ以上のｇｐ１０５を免疫沈降させなかっ
たが（図３Ａ３）、一方抗体Ｂ１はＡ　ｒ除去抽出物か
ら効果的にｇｐ１１５、ｇｐＨｏ及びｇｐ６２を免疫沈
降させた（図３Ｂ３）、抗体８１次いでＡ１（Ｃ及びＤ
列群）続いて抗体Ｃ６（Ｅ及びＦ列群）による逆の実験
でも同様の識別性を示している。

したがって、我々のモノクローナル抗体は抗原性におい
て区別される３種の垢タンパク質を識別しており、我々
はそれらをｇＡ、ｇＢ及びｇＣと称する。

上記のように分類された糖タンパク質と他の文献〔グロ
ース・シー（Ｇｒｏｓｅ、　Ｃ，）　、１９８０年、“
水痘・帯状ウィルスで感染されたヒト骨髄腫細胞におけ
る糖タンパク譬の合成”、ウィルス学、第１０１巻、第
１−９頁；グロース・シー、１９８３年、“担癌の子供
における帯状庖疹：発病前後における血清の放射免疫沈
降分布°、ジェイ・インフェクト・ディジ（Ｊ、　Ｉｎ
ｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　）　ｓ第１４７−１、第４７−
５６頁；シマー・ワイ・ニス・レベントンークリス及び
アイ・サロフ（Ｓｈｅａ＋ｅｒ、　Ｙ、。

Ｓ、　Ｌｅｖｅｎｔｏｎ−Ｋｒｉｓｓ、　ａｎｄ　１．
５ａｒｏｖ　）　、１９８０年、“水痘・帯状ウィルス
の単離とそのポリペプチドの特徴”、ウィルス学第１０
６巻、第１３３−１４０頁；シラキ・ケイ、チー・オク
ノ、ケイ・ヤマニシ及びエム・タカハシ（Ｓｈｉｒａｋ
ｉ、　Ｋ−＋Ｔ、０ｋｕｎｏ、に、Ｙａｍａｎｉｓｈｉ
、ａｎｄ　　Ｍ、Ｔａｋａｈａｓｈｉ）　　、１９８２
年、“水痘・帯状ウィルス（ＶＺＶ）のポリペプチドと
ＶＺｖ及び単純ヘルペスウィルス（Ｈ３Ｖ）の免疫学的
関係”、ジエイ・ジエネ・パイロ口Ｕ、　Ｇｅｎ、　Ｖ
ｉｒｏｌ、）　、第６１巻、第２５５２６９頁：ツヴイ
ーリンク・エッチ及びビー・ジェイ・ネフ（Ｚｗｅｅｒ
ｉｎｋ、　Ｉｆ、　ａｎｄ　Ｂ、　Ｊ、　Ｎｅｆｆ　）
、１９８１年、“水痘・帯状ウィルスに接触させた後の
免疫応答：ウィルス特異的抗体の特徴及びそれらの対応
する抗原“、インフェクト・イムノ（Ｉｎｆｅｃｔ、　
Ｉｓｓ＋ｕｎ、）第３１巻、第４３６−４４４頁〕に報
告された糖タンパク質とのおおまかな比較では、全体と
゛しての我々のモノクローナル抗体はすべての主なＶＺ
Ｖ＠タンパク質を検出したことを示唆した。この問題に
直接答えるために、非免疫沈降性の（１４ｃ　）グルコ
サミン標識ウィルス粒子を溶解し、電気泳動に付した（
図ＩＤＩ）。

同様に、（”Ｃ）グルコサミン標識感染細胞抽出物を高
力価ヒト帯状庖疹回復期血清で免疫沈降させた（図ＩＤ
２）、これら２つの実験における主な検出可能な糖タン
パク質は、モノクローナル抗体によって検出されたｇＡ
、ｇＢ及びｇＣバンドの全体と一致した。他の主な糖タ
ンパク質の存在についてはこの分析から除かれている。

それにもかかわらず、モノクローナル抗体による我々の
分析では、ｇＡ、ｇＢ及びｇＣが３種の主なＶＺＶ糖タ
ンパク譬遺伝子に基づいていることを強く示唆している
。

モノクローナル抗体を、中和試験によって、ｖＺｖに対
する生物活性に関し試験した。クローンＡ１抗体は、補
体の非存在下で強く中和された。

ｇＣポリペプチドと反応する８種のモノクローナル抗体
は、補体存在下でのみ中和された。我々のｇＢ反応性抗
体は中和されなかった。しかしながら、我々はシー・エ
ドソン（Ｃ，Ｈｄｓｏｎ）　　（マサチューセッツ州、
ボストンのタフツ大学）からモノクローナル抗体を入手
し、免疫沈降法によってクローンＢ１抗体と同一の血清
学的反応性があることを証明することができた〔データ
示さす：エドソンらの命名による（シー・エドソンが公
表）ｇｐ６３、ｇｐ１２５と反応〕、これらの抗体は補
体の非存在下が感染性を中和した（データ示さす：エド
ソンが公表）。したがって、３種すべての主なりｚｖ糖
タンパク質遺伝子は中和エピトープをもつポリペプチド
についてコードしている。

このような結果は、単純ヘルペスウィルス系においては
４種の異なる糖タンパク質遺伝子が中和エピトープをも
つ糖タンパク賞についてコードしていることが見出され
ていたことと矛盾するものではない〔パラカントラン・
エヌ、デー・ハーニンシェ、アール・ニー・キリングト
ン、ニス・バチエラティ及びダブル・イー・ロールズ （Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ、　Ｎ、、　Ｄ、　Ｈａｒ
ｏｉｓｈ、　Ｒ，Ａ。

Ｋｉｌｌｉｎｇｔｏｎ、　Ｓ、　Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ、
　ａｎｄ　Ｉｄ、　Ｂ、　Ｒａ＆４１ｓ）、１９８１年
、“単純ヘルペスウィルス２型の２種の糖タンパク質に
対するモノクローナル抗体”ジャーナル・オブ・パイロ
ロジー、第３９巻、第４３８−４４６頁；ペリーラ・エ
ル、デー・トンプロ、ビー・ノリルド及びビー・ロイズ
マン（Ｐｅｒｅｉｒａ、　Ｌ、、　Ｄ、　Ｄｏｎｄｅｒ
ｏ＋　Ｂ、　Ｎｏｒｒｉｌｄ、　ａｎｄＢ、　Ｒｏｉｚ
ｍａｎ）　、１９８１年、“ヘロ（Ｖｅｒｏ）及びＨＥ
　ｐ　−２細胞において産生された単純ヘルペスウィル
ス１型及び２型の糖タンパク？（ｇＡ及びｇＢにおける
特異的な免疫学的反応性及びプロセッシング′、プロシ
ーデインゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーク
・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔ
ｈｅ　Ｎａｔｉｏｎｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆＳｃｉｅ
ｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅ＋ｆ　５ｔａｔｅ
ｓ　ｏｆ　Ａｇｍｅｒｉｃａ）第７８巻、第５２０２−
５２０６頁；ペリーラ・エル、チー・クラセン及びジェ
イ・アール・バリンジ＋　−（Ｐｅｒｅｉｒａ、　Ｌ、
、　Ｔ、　Ｋｌａｓｓｅｎ、　ａｎｄ　Ｊ、　Ｒ＋Ｂａ
ｒｉｎｇｅｒ）　、１９８０年、“単純ヘルペスウィル
ス１型に対する型共通性かつ型特異性のモノクローナル
抗体”、インフェクトーイムノ、第２９巻、１７２４−
７３７頁；シッワルター・ニス・デーエム・ツヴアイク
及びビー−・バンパー（Ｓｈｏｗａｌｔｅｒ。

Ｓ、　Ｄ−＋　Ｍ、　Ｚｗｅｉｇ、　ａｎｄ　Ｂ、　Ｈ
ａｍｐｅｒ）　、１９８１年、“即時型初期タンパクｔ
Ｉ　ＣＦ２を含む単純ヘルペスウィルス１型タンパク賞
に対するモノクローナル抗体“、インフエクト・イムノ
、第３４巻、第６８４−６９２頁〕。

標識細胞抽出物とウィルス粒子とにおける各種糖タンパ
ク質の差異の発現は、異なるポリペプチド種の関係につ
いて一定の仮説を立てることを我我に可能ならしめる。

（ｉ）ｇＡ遺伝子産物のｇｐ１０５は、シラキ（Ｓｈｉ
ｒａｋｉ　）ら（同上）のｇｐｉｔｓ及びグロースら〔
グロース・シー、デー・ビー・エドワーズ、ダブル・イ
ー・フレンド１）−／チス、ケー・ニー・ウェイグル及
びダブル・エル・マクギア（ＩＩ；ｒｏｓｅ＋　Ｃ，、
Ｄ、　Ｐ、　Ｅｄｗａｒｄｓ、　Ｉｔｓ。

Ｅ、　Ｆｒ１ｅｄｒｉｃｂｓ、　Ｋ、　Ａ、　Ｗｅｉｇ
ｌｅ、　ａｎｄ　１１４．　Ｌ、　Ｍｃｇｕｉｒｅ）。

１９８３年、１水痘・帯状ウィルスの３種の主な糖タン
パク質に対するモノクローナル抗体”、インフェクト・
イムノ、第４０巻、第３８１−３８８頁〕のｇｐｉｔｓ
におそらく相当し、グロースらはｇｐｌｌＢに対するモ
ノクローナル抗体が補体の非存在下でも中和されると報
告している。（ｉｊ）ｇＢ遺伝子産物のｇｐ６２及びｇ
ｐ５７は、ｇｐ１１５及びｇｐＨＯが感染細胞において
のみ存在していることから、おそらくウィルス粒子にお
けるｇＢの最終複製型を表わしている。更に、非糖タン
パク１ｔＰ　１１０はｇｐｉｔｓの前駆体を表わしてい
るのであろう。同様の結論は、他の者〔エドソン、公表
済；オクノ・チー、ケイ・ヤマニシ、ケイ・シラキ及び
エム・タカハシ、１９８３年、“ｖＺｖ抗原に対するモ
ノクローナル抗体と関連して研究された水痘・帯状ウィ
ルス（Ｖ　Ｚ　Ｖ）タンパク賞の合成及びプロセッシン
グ３、ウィルス学、第１２９巻、第３５７−３６８頁〕
によっても達成されたが、各グループは分子量６３．０
００〜６４，０００の単一のウィルス粒子垢タンパク質
種のみを検出し、１つのグループは２種のより高い分子
量の糖タンパク質を検出したオクノら、同上）、同様の
パルスチエイス関係が単純ヘルペスウィルス２型におい
ても見出された（パラカントラン・エヌら、同上；ベリ
ーラ・エル、同上）。

（ｉｉ）　ｇＣ遺伝子産物のｇｐ９２．２ｇ８３、ｇｐ
５２及びｇｐ４５は、精製された（”Ｃ）グルコサミン
標識ウィルス粒子のＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動並びに帯状庖疹回復期血清の免疫沈降法による主な
ウィルス糖タンパク質種を代表する。それらは、本研究
では１００種中８のｇＣ２他の報告では５種中４種のｇ
Ｃ（ｇｐ９８、ｇｐ６３、ｇｐ５５及びｇ＋）４５　（
グロースら、インフェクト・イムノ、同上）〕、更に他
の報告では１２２種中８のｇｃ［ｇｐ９４、ｇｐ８３、
ｇｐ５５及びｇｐ４５　　（オクノ・チーら、同上）］
に対するモノクローナル抗体を容易に単離できたことか
ら、最大の免疫原性をもつ糖タンパク賞のようである。

ｇｐ９２及びｇｐ８３は、ウィルス粒子においてｇｐ５
５に比例した率以上の高率で誘導されることから、成熟
ウィルス粒子ポリペプチドを代表するようである０ｇＣ
に対するモノクローナル抗体が２以上の糖タンパク質を
検出することは注目に値するが、このような観察は他の
ヘルペスウィルス種（例えば、単純ヘルペスウィルス〔
パラカントラン・エヌ、同上；エベール・アール及びア
ール・ジェイ・コートニー（Ｅｂｅｒｌｅ、　Ｒ，、ａ
ｎｄ　Ｒ，Ｊ、　Ｃｏｕｒｔｎｅｙ）　、１９８２年、
“多重結合型の単純ヘルペスウィルス２型糖タンパク質
”、ジャーナル・オブ・パイロロジー第４１巻、第４３
８−３５１頁；ベリーラ・エルら、インフェクト・イム
ノ、同上〕、エプスタイン−バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−
Ｂａｒｒ）ウィルス〔エドソン・シー・エム及びデー・
ニー・ドーリ−・ローソン（Ｅｄｓｏｎ、　Ｃ，Ｍ、、
　ａｎｄ　Ｄ、　Ａ、　Ｔｈｏｒｌｅｙ−Ｌａｗｓｏｎ
）、１９８３年、“エプスタイン−バールウィルスの３
種の主なエンベロープ糖タンパク賞の合成及びプロセッ
シング、ジャーナル・オブ・パイロロジー、第４６巻、
第５４７−５５６頁；ストランド・ビー・シー、チー・
シュスター。アール・クライン、アール・エフ・ホブキ
ンス■、チー・ウィツトマー、アール・エッチ・ノイバ
ウアー及びエッチ・ラビン（Ｓｔｒａｎｄ、　Ｂ、、　
Ｃ，、Ｔ、　５ｃｈｕｓｔｅｒＲ，Ｋ１ｅｉｎ＋　　Ｒ
，Ｆ、　　Ｈｏｐｋｉｎｓ　　ｍ、　Ｔ、　　Ｗｉｔｍ
ｅｒ、　　Ｒ，Ｈ。

Ｎｅｕｂａｕｓｅｒｔ　ａｎｄ　Ｈ，Ｒａｂｉｎ、　１
９８２年、１エプスタイン−バールウィルス膜抗原に対
するモノクローナル抗体の産生及び特徴”、ジャーナル
・オブ・パイロロジー、第４１＠、第２５８−２６４頁
〕及びサイトメガロウィルス〔ベリーラ・エル、エム・
ホフマン、デー・ガロ及びエフ・フレマー（Ｐｅｒｅｉ
ｒａ、　　Ｌ、、　　Ｍ、　　Ｈｏｆｆｍａｎ、　　Ｄ
、　　Ｇａ１ｌｏ、　　ａｎｄ　　Ｎ。

Ｃｒｅｍｅｒ）　、１９８２年、“ヒトサイトメガロウ
ィルスに対するモノクローナル抗体：独特な免疫学的及
び電気泳動的特性をもつ３種の膜表面タンパク質が交差
反応決定基を特異化させている“、インフェクト・イム
ノ、第３６巻、第９２４−９３２頁〕においてなされた
ものである。これらの交差反応は自然界では非特異的で
ないようであるため、多数の型のポリペプチドは、関係
があるものの区別される前駆体から産生ずることができ
、パルスチエイス関係を有することができ、あるいは糖
タンパク質パターンの異質性を表わすことができる。

ｇＡ、ｇＢ及びｇＣに対するこれらのモノクローナル抗
体は、ウィルス抗体を適切な基質、例えば、ニトロセル
ロースに結合させ、結合抗原をモノクローナル抗体と一
緒にインキユベートし、しかる後この複合体を抗−抗体
／酵素複合体で処理し、次いで酵素基質と接触させた後
、反応した酵素基質の量を測定することにより、ｖｚｖ
ｔｉタンパク質の定量のために使用することもできる。

回圧 ａ、ハイブリドーマ細胞を、９６−ウェルプレート中の
放射線照射（ｂａＣＯ源から１０，０００ラド）された
ＭＰＣ−５細胞上で限界希釈することにより複製させた
。腹水中で抗体を産生させるために、プリスタン（２，
６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を飽食さ
せたマウスに、マウス当たり４Ｘ１０’細胞を注射した
。

約１０日後、腹水を集めた。

ｂ、免疫グロブリンのサブクラスにつき、マウス免疫グ
ロブリンＧｌ　　（ＩｇＧ１）　、ＩｇＧ２ａ。

ＩｇＧ２ｂ及びＩ　ｇＧ３に対するヤギ単一特異性抗血
清〔リサーチ・プロダクツ・インターナショナル（Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌＣｏｒｐ、　）　）を用いて免疫拡散試験法に
より調べた。

Ｃ３腹水中の抗体は１：２５°０で試験された。これら
の欄では図１及び２のデータを要約している。

ｄ、下記方法はプラーク減少試験を修正したちのであっ
た〔アサノ・ワイ、ビー・アルブレヒト。

エル・ケー・ヴユジュシル、ジー・ブイ・キンマン及び
エム・タカハシ（Ａｓａｎｏ、　ｙ、ｔ　ｐ。

Ａｌｂｒｅｃｈｔ、　Ｌ、　Ｋ、νｕｊｃｉｌ、　Ｇ、
　Ｖ、　Ｑｕｉｎｎａｎ、　ａｎｄＭ、　Ｔａｋａｈａ
ｓｈｉ）　、　　１９８３年、“強化中和試験及び対膜
抗原螢光体試験による水庖・帯状ウィルスに対する体液
性免疫の評価”、アーキ・パイロ口（Ａｒｃｈ、　Ｖｉ
ｒｏｌ、）　、第７５巻、第２２５−２２８頁〕、連続
希釈された腹水を、１０％の新鮮なモルモット補体（Ｃ
′）と−緒に又は−緒ではなく、等量の無細胞ＶＺＶ　
　ＫＭｃＣ株と混合し、室温で１時間インキエベートし
た。

試験は、２５〜５０ＰＦＵ（プラーク形成単位）がウェ
ル当たりで加えられるように設定され、４個のウェルが
抗体希釈物当たりで分析された。

抗体−ウィルス混合物（０，１■２）を、２４−ウェル
（１６ｍ）プレート中のベロ細胞の排水表面上に接種し
た。ウィルスを３６℃で１時間吸着させ、細胞を再培養
（ｒｅｆｅｄ　）　Ｌ、７日間インキエベートした。抗
体価は、プラーク数を５０％減少させる希釈倍数の逆数
として計算された。

ｅ、ＦＡＭＡ試験は、実質的に〔ガーション・エニー、
アール・レーカー、ニス・シュタイ７　ヘ／ｌｚ　り、
　ビー・トフーオスタイン及びエル・エム・ドルシル（
Ｇｅｒｓｈｏｎ、　Ａ、　Ａ、、　Ｒ，Ｒａｋｅｒ。

Ｓ、　Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ、　Ｂ、　Ｔｏｐｆ−Ｏｓｔ
ｅｉｎ、　ａｎｄ　Ｌ、　Ｍ。

Ｄｒｕｓｉｎ）　　１９７６年、“臨月の婦人及び彼女
らの生後１年以内の子供の水痘、帯状ウィルスに対する
抗体”、小児科学（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ）　、第５８
巻、第６９２−６９６頁；ウィリアムス・ブイ、ニー・
ガーション及びピー・ニー・プルネル（Ｗｉｌｌｉａｍ
ｓ、　Ｖ、、　Ａ、　Ｇｅｒｓｈｏｎ、　ａｎｄ　Ｐ、
　Ａ。

Ｂｒｕｎｅｌｌｓ　１９７４年、“間接免疫螢光法によ
り測定された水痘、帯状ウィルス膜抗原に対する血清学
的応答°、ジェイ・インフェクト・ディスＵ、　Ｉｎｆ
ｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　）　（第１３０巻、第６６９−６
７２頁において〕以前に記載されたように、指示細胞と
してＶＺＶ感染もしくは未感染ＦＳ−４（ヒト包皮繊維
芽細胞）を用い、第二抗体としてフルオレセイン標識ヤ
ギ抗マウス免疫グロブリン（γ・Ｌ鎖特異性；タボ社）
を用いて行なわれた。抗体価は検出可能な免疫螢光を発
生する希釈倍数の逆数として計算された。

［、これらのクローンは、ｇｐ８３よりもｇｐ９２対し
て高い血清学的反応性を有することが証明された。

ｇ、この抗体はウェスターンプロット法では未反応であ
った。

皿上皇翌ユ 図１：ＶＺＶポリペプチド免疫沈降物の電気泳動分析、
ヒト二倍体繊維芽細胞（ＭＲＣ−５）を、イーグル塩及
び１０％ウシ胎児血清含有イーグル基礎代謝培地中３６
℃で増殖させ、細胞結合貯蔵物として継代されたＶＺＶ
　　ＫＭｃＣ株（ネフ・ビー・ジェイら、同上）用の２
５代〜３０代目のウィルス宿主として使用した。７５０
ｃｄローラーボトル中で５０％細胞変性効果を示したＶ
ＺＶ感染細胞を、無メチオニンダルベツコ修正イーグル
培地＋２％透析つシ胎児血清の１０■２及びＬ−［”Ｓ
）メチオニン５０μＣｉ／　ｔａＩ！［１，４５０Ｃｉ
／ｍｍｏｊ？；アメルシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃ
ｏｒｐ、）　）で、あるいは１０％グルコース、２％透
析ウつ胎児血清含有ゲルベフコ修正イーグル培地１０１
Ｉｌｌ及びＤ−［”Ｃ）グルコサミン塩酸塩１０μＣｉ
／ｍｌ　　（５４Ｃｉ／ｍ　ｔｒｏｌ　；アメルシャム
社）で標識化した。２４時間後、０．０４Ｍリン酸ナト
リウム−０，１５Ｍ塩化ナトリウム（リン酸緩衝液）で
単層細胞を２回洗浄することにより超音波処理細胞抽出
物を調製し、ＳＰＧ緩衝液（０，０４ＭＩＪン酸ナトリ
ウム、５％スクロース、０．１％グルタミン酸ナトリウ
ム）　　３　ｖｘｌを各ローラーボトルに加えた。遠心
管中水で細胞を摩擦し、それぞれ６０秒間で３回超音波
処理し、２．０００Ｘｇで１０分間４℃にて遠心分離し
た。ウィルス精製に使用しないならば、超音波処理細胞
抽出物を一７０℃で貯蔵するが、このような場合にそれ
らは直ちに下記の如く処理された。抽出物を１０〜３５
％スクロース密度勾配（ＳＰＧ緩衝液中）上に重層し、
１０４．０００ｘｇで２５分間４℃にて遠心分離した。

下層のウィルス帯を管の側面からシリンジで除去し、３
５〜５５％スクロース密度勾配（ＳＰＧ緩衝液中）上に
重層し、１３１，０００ｘｇで８時間４℃にて遠心分離
した。下層帯を集め、ＳＰＧ緩衝液で希釈し、３５〜５
５％スクロース密度勾配上に再度１ｉ層した。ウィルス
帯を次いで集め、ＳＰＧ緩衝液で希釈し、１３１，００
０ｘｇで２時間４℃にてベレット化し、ＳＰＧ緩衝液で
再懸濁し、必要時まで一７０℃で貯蔵した。精製物質の
電子顕微鏡観察では、エンベロープ化したウィルス粒子
は８０％であった。別個に標識化された感染（２Ｈ−標
識）及び未感染（１４ｃ−標識）細胞溶解物の精製後、
３５倍精製ウィルス調製物を評価した。免疫沈降分析、
試料調製及びＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を
図３の説明で記載されているようにして実施した。これ
らの分析で使用された抗原は、（Ａ）−（”Ｓ）メチオ
ニン標識超音波処理感染細胞抽出物、ＣＢ）（”Ｃ）グ
ルコサミン標識超音波処理感染細胞抽出物、又は（Ｃ）
（３ｓＳ）メチオニン標識精製ウィルス粒子であった、
これらの試料を次のモノクローナル抗体（列）：即ち、
１列、コントロール腹水、２列、Ｃ８；３列、Ｂ１；４
列、ＡＩを用いて免疫沈降させた。（Ｄ）ＶＺＶの主な
糖タンパク質種の電気泳動分析；１列、精製〔１“Ｃ〕
グルコサミン標識ウィルス粒子；２及び３列；　　（１
４Ｃ）グルコサミン標識超音波処理細胞は、（２列）帯
状庖疹回復期抗血清（ＶＺＶ　　ＦＡＭＡ力価、１：８
００）又は（３列）正常ヒト血清（ＶＺＶ　　ＦＡＭＡ
力価、１：１０）で免疫沈降せしめられた０分子量マー
カーは、ミオシン〔２００゜ＯＯＯ（２００Ｋ）　）　
。

ボスホリラーゼｂ（９２Ｋ）、ウシ血清アルブミン（６
８Ｋ）及びオボアルブミン（４３Ｋ）である。

口」ｊｕ夏肌 図２：ＶＺＶポリペプチドに対するモノクローナル抗体
の反応性に関するウェスターン法分析。

試料調製後、図３の説明で記載されているようにして、
ポリペプチドを還元条件下７．５％不連続ＳＤＳポリア
クリルアミドゲルによる電気泳動に付し〔ラエムリ・ニ
ー・ケー（Ｌａｅａｉａ＋Ｉｉ、　Ｕ、　Ｋ　）、１９
７０年、“バクテリオファージＴ４の頭部の集合中にお
ける構造タンパク質の切断”、ネーチャー　（Ｎａｔｕ
ｒｅ）　　（ロンドン）、第２２７巻、第６８０−６８
５頁〕、バーネットの方法によりニトロセルロースに移
動させた〔バーネット・ダブル・エフ（Ｂｕｒｎｅｔｔ
ｅ、　Ｗ、　Ｎ、　）　、１９８１年、“ウェスターン
法ニドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
から未変性ニトロセルロースへのタンパク質の電気泳動
移動と抗体及び放射性ヨウ素化タンパクｉＡによるＸ線
撮影検出”アナライティカル・バイオケミストリー（Ａ
ｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　
翫第１１２巻−第１９５−２０３頁〕、シかる後のすべ
てのインキュベートは室温で行なわれた。移動後、ニト
ロセルロースを緩衝液Ａ　（０，１５Ｍ　　ＮａＣ１，
５０ｅａＨトリス（ｐＨ７，６）　、０．１％ＮａＮ５
）＋２０％無Ｔ−グロブリンウシ胎児血清Ｋ−夜浸漬し
、インキュベート用緩衝液（緩衝液Ａ中の５％無ｒ　−
グロブリンウシ胎児血清）で洗浄し、インキュベート用
緩衝液で所望倍率に希釈された抗血清中に２時間振盪し
ながら載置した。ニトロセルロースを次いで、１０分間
緩衝液Ａで１回、ＩＯ分間緩衝？＆、Ａ＋ｏ、ｏｓ％ト
リトンＸ−１００で２回、及び再び緩ｄｉ液Ａ″′？：
１回洗浄した。マウス抗体が使用された場合は、この工
程の後に、インキュベート用緩衝液中ウサギ抗マウス免
疫グロブリンＧ・Ｈ及びＬ鎖の１　：　１０００希釈物
と一緒に１時間インキュベートし、次いで上記の洗浄処
理を行なった。プロット　（ｂｌｏｔ）をしかる後イン
キュベート用緩衝液中′ｔｓ■−タンパクｉｒＡ　にニ
ー・イングランド・ヌクレアー社（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｉａ
ｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒｃｏｒｐ、　）　）　０．２５　
ｐｃｉ／　ｔａｇと一緒に１時間インキュベートし、上
記のように洗浄し、乾燥し、自動Ｘ線撮影を行なった。

精製ウィルス粒子（１列）又は超音波処理細胞溶解物（
２列）を電気泳動に付し、プロットし、モノクローナル
抗体Ｃ５と反応させた。

■主■災凱 図３二交差除去免疫沈降法により証明されるＶＺＶＦ’
タンパク譬間の抗原性識別、ホルマリン固定スタフ（ｓ
ｔａｐｈ　）　Ａ細胞〔ベセスダ・リサーチ゛ラボラト
リーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ）　）をリチャートら〔リチャート・
エフ・デー、ビー・ジエイ・ニー・デービス、シー・ジ
ェイ及びアイ・エッチ・パスタン（Ｒｉｃｈｅｒｔ。

Ｎ、　Ｄ、、　Ｐ、　Ｊ、　Ａ、　Ｄａｖｉｅｓ、　Ｇ
、　Ｊａｙ　ａｎｄ　１．　Ｈ。

Ｐａ５ｔａｎ）　％　　１９７９年、“トリ肉腫ウィル
ス形質転換繊維芽細胞の免疫沈降における免疫複合体キ
ナーゼに関する特徴”、ジャーナル・オブ・パイロロジ
ー、第３１巻、第６９５−７０６頁〕に記載されている
ようにして洗浄し、６％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）にＢＷ緩衝
液〔０，１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸、１％
トリトンＸ−１００，０，ＯＩＭ）リス（ｐｏｌｏ）　
、０．１Ｍ　ＨａＣｌ、０．００２Ｍ　ＨＤＴＡ　）で
懸濁し、ヒト抗体の免疫沈降用Ｋ−７０℃で貯蔵した。

マウス抗体による免疫沈降の場合には、スタフＡｆｆｌ
製物をベレット化し、ウサギ抗マウス免疫グロブリンＧ
−Ｈ及びＬ鎖〔キャペル・ラボラトリーズ（Ｃａｐｐｅ
Ｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）　）を加え、懸濁液
をリン酸緩衝液で元の容積に戻した。懸濁液を室温で２
時間混合した後、リン酸緩衝液で２回洗浄し、０．０４
Ｍｌ−リス（ｐＨ８，０）　−０，０２％ＮａＮ、で６
％（ｖｏｌ／ｖｏｌ　）に戻し、使用前１か月以内４℃
で貯蔵した。放射線標識超音波処理細胞抽出物又は精製
ウィルス粒子を１％トリトンｘ−ｔｏｏ及び０．５％デ
オキシコール酸に加え、１２、ＯＯＯＸｇで２０分間４
℃にて遠心分離することにより再清澄化した。約１０　
’　ｃｐｓ含存抗原画分を０．０２Ｍ１−リス塩酸（ｐ
Ｈ７，４）−０゜ＩＭＮａＣｌ　　１％トリトン−Ｘ１
００−０．５％デオキシコール酸−０，００５Ｍ　　Ｍ
ｇＣ１ｚ　３００μｌ及び様々な量の腹水（１〜ｌＯμ
りに加えた。混合物を４℃で２時間インキエベートし、
スタフＡ調製物５０μｌを混合しながら４℃で１時間イ
ンキエベート中に加えた。混合物を次いで１８、ＯＯＯ
Ｘｇで３分間４℃にて遠心分離にすることによりペレッ
ト化し、ペレットをＢＷ［衝液１　ｖａｌで４回洗浄し
た。最後の洗浄後、２％５ＤＳ−４％メルカプトエタノ
ール−１０％グリセロール−０，０６３Ｍ　トリスリン
酸（ｐＨ７，５）　　４０１１　Ｎを加え、３分間沸騰
することにより、抗原を溶出させた。除去免疫沈降を上
記のようにして行なったが、但し、最初の抗原−抗体−
スタフＡ反応による抗体処理上澄を保存し、第２及び第
３回目の免疫沈降のために二次抗体と混合した。沈降タ
ンパク質を上記のようにスクフＡから各サイクル毎に溶
出させた。試料を還元条件下７，５％不連続ＳＤＳポリ
アクリルアミドゲルの電気泳動に付した（ラエムリ・ニ
ー・ケイ、同上）、免疫沈降を行なう際に、ゲルを７％
酢酸−２５％メタノールで一夜固定し、１５分間ジメチ
ルスルホキシド１００　置Ｊ’で３回洗浄し、ジメチル
スルホキシド中で２′　５′−ジフェニルオキサゾール
（２１ｇ／１００ｍｊりに１時間浸漬した。ゲルを冷流
水で洗浄した後、それらを減圧乾燥し、フルオログラフ
ィー用（１ａＳ）メチオニン標識感染細菌抽出物を３回
までモノクローナル抗体で連続的に免疫沈降させた。各
３組の列（Ａ−Ｆ）は、それぞれ第一（１）、第二（ツ
及び第三（３）モノクローナル抗体による単一の連続的
実験を表わしている。各列で使用されたモノクローナル
抗体は（Ａ）１、Ａ１；２、ＡＩ及びＡ１；３、Ａ１、
ＡＩ及びＡｌ；（Ｂ）１、Ａｌ　；　２、Ａ１及びＡｌ
；３、ＡＩ、Ａ１及びＢｌ；（Ｃ）１、Ｂ１；２、Ｂ１
及びＢ１；３、Ｂｌ、Ｂｌ及びＡｌ；（Ｄ）１、Ｂ１；
２、Ｂ１及びＢ１；３、Ｂ１、Ｂ１及びＢ１；（Ｅ）１
、Ｂ１；２、Ｂ１及びＢ１：３、Ｂ１、Ｂ１及びＣ５：
（Ｆ）１、Ａ１；２、Ａ１及びＡ１；３、Ａ１、Ａ１及
びＣ５であった。

実施例２ モノクローナル抗体（Ｂ１）免疫アフィニティクロマト
グラフィーによるＶ　Ｚ　Ｖ　ｇ　８１１Ｍタンパク質
の 実施例１に記載されたモノクローナル抗体Ｂｌを担持し
た腹水をマウスから採取した０等量の０、１５　Ｍ　Ｎ
ａＣ１を加えた０次いで、飽和（ＮＬ）　ｔｓＯａ溶液
を等量加え、４℃で一夜保持した。この混合物を２００
Ｏｒｐｍで１０分間４℃にて遠心分離した。ペレットを
蒸留水（２■／ｌｌ１）に再ｇ、濁し、カップリング用
緩衝液（０，１Ｍ　　ＮａＨＣＯユ、０．５Ｍ　　Ｎａ
Ｃｌ！、ｐ＋＋　ｓ、　４　）に対して一夜透析しり、
臭化シアン活性化セファロース４Ｂにニージャージー州
、ビスキャントウエイ、７７１１７９７社（Ｐｈａｒｌ
ｌａａｃｉａ　）　）　１　ｇを０．００１Ｎ　　ＨＣ
Ｎで膨潤させ、次いで６０ｍｊ！粗焼結ガラス漏斗に注
いだ、これをＯ，０ＯＩＮ　　ＨＣｊ！２００ｍ７！続
いてカップリング用緩衝液５０ｍ７！で洗浄した。

セファロースを次いでモノクローナル抗体溶液１０−２
と混合し、２３℃で２時間回転させた。

次いで、エタノールアミン８０μｉを加え、溶液を２３
℃で１時間回転させた。樹脂をディスポーザブルクロマ
トグラフィーカラム〔バイオ５７１社（ＢｉｏＲａｄ）
　３に注ぎ、次の溶液１０１１ｊ！；１）カップリング
用緩衝液；　２　）　０．１　Ｍ　ＮａＪＰＯｔ、０．
５Ｍ　　ＮａＣ１、ｐＨ８，２；　３　）　０．１　Ｍ
　Ｎａ０Ａｃ。

０．５Ｍ　　ＮａＣ１、ｐＨ４，０；　４−＞　０．１
　Ｍ　ＮａＨＢＯ＜、ｐＨ８，２：　５）　　３Ｍ　　
ＫＳＣＮ　：　６）　０．１Ｍ　ＮａＨＢＯ４、ｐＨ８
，２で連続的に溶出・洗浄し、次いで使用するまでは０
．１　Ｍ　ＭａＨＢＯ＃、ｐＨ８，２中４℃で貯蔵した
。

ＶＺＶ垢タンパク質を、細胞変性効果８０％までｖｚｖ
で感染させたＭＲＣ−５ヒト二倍体繊維芽細胞から精製
した。７５０ａ＋Ｉローラーボトル中の細胞を０．　ｌ
　５　Ｍ　ＮａＣ（！　、　０．　ＯＩ　Ｍ　　Ｎａｚ
ｔｌＰＯｓ、ｐＨ７，２で二回洗浄し、十分に排水させ
た。５０ｍＭトリス、ｐ＋１７．５．２％トリトンＸ−
１００，４ｍ？！フェニルメチルスルホニルフルオリド
（ＰＭＳＦ）１０ａ＋ｊ！をボトルに加え、回転しなが
ら１５℃でインキュベートした。同様の１０ｍｊ！を次
いで用い、更に９個のローラーボトルに連続的に移した
。

抽出物２０ａＩ！が１０個のローラーボトル中の物質を
含有するように、調製したばかりの緩衝液ｌＱｍｊ！ず
つを用いて１０個のローラーボトルを連続的に洗浄し、
最初の緩衝液と一緒にプールした。抽出物を使用時まで
一７０℃で貯蔵した。

抽出物を解凍し、０．１５　Ｍ　　ＨａＣ１！、０．０
１ＭＮａｚｌｌＰ０４．０．０５％トリトンＸ−１００
、ｐＨ７゜２に対し４℃で一夜透析し、次いで１５００
ｒｐｍで１５分間４℃にて遠心分離することにより清澄
化した。抽出物２０ｍｆｆをモノクローナル抗体結合樹
脂１ｇに加え、４℃で振盪しながら一夜インキユベート
した。スラリーを１５００ｒｐｍで１５分間４℃にて遠
心分離し、０．　Ｌ　Ｍ　　ＮａｆｌＢＯ，、ｐＨ８，
２で３回洗浄した。糖タンパク質を３Ｍ　　ＫＳＣＮＩ
Ｑ＋＋＋ｊ？と一緒に２３℃でインキュベートすること
により溶出させた。溶出物を４℃で一夜０．１５ＭＮａ
Ｃ！！、０．０１　Ｍ　　ＮａＪＰＯ４，０，０５％ト
リトンＸ−１００，ｐＨ７，２に対して直ちに透析させ
た。

精製ｇＢ糖タンパク質のおおよその収量はローラーボト
ル１０個につき１■であった。純度は実施例１０に記載
されているとおりである。

実施例３ 実施例２に記載されているのと実質的に同一の方法に従
ったが、但し、実施例１に記載されているようにして産
生されたモノクローナル抗体ＡＩを使用しており、クロ
マトグラフィー的に純粋なｇＡＶＺＶ糖タンパク質を実
施例１０に記載されたようにして得た。

実施例４ 実施例２に記載されているのと実質的に同一の方法に従
ったが、但し、実施例１に記載されたようにして産生さ
れたモノクローナル抗体Ｃ１を使用しており、クロマト
グラフィー的に純粋なｇＣＶ　Ｚ　Ｖ　ｔ／、ｌｉタン
パク賀を実施例１０に記載されたようにして得た。

実施例５〜７ （それぞれモノクローナル抗体ＡＩ、Ｂｌ又はＣ１によ
り＞　ＶＺＶ感染細胞溶解物由来ＶＺＶｇＡ、ｇＢまた
はｇＣと一緒にそれぞれ独立して共精製される、未感染
細胞タンパク質の精製操作は、抗体を変更しかつ未感染
ＭＲＣ−５細胞を使用したこと以外は、実施例２と実質
的に同一に行なわれた。対応する感染細胞糖タンパク質
百分中におけるこれら物質の存在については、実施例１
０に記載されている。

実施例８ レクチンアフィニティークロマトグラフィーによるｖｚ
ｖ　　ｔｔ′−ンバク　の レクチン結合マトリックス〔ウルトラゲル・リアクティ
フス（Ｕｌｔｒａｇｅｌ　Ｒｅａｃｔｉｆｓ　）　　Ｉ
　Ｂ　Ｆレンズ豆レクチン、ＬＫＢ）を充填用緩衝液（
ＬＭＮａＣｊ！、０．１％トリトンＸ−１００，５０ｍ
Ｍトリス、ｐＨ７，５）で予め平衡化させた。実施例２
に記載されたようにして調製された感染細菌抽出物を２
００ａ＋６容量のカラムに充填した（１００個のローラ
ーボトル）、カラムを大量の充填用緩衝液で洗浄し、糖
タンパク質を０．２　Ｍα−メチルマンノシド含有充填
用緩衝液で溶出させた。抽出物を次いで０．１５　Ｍ　
　ＮａＣ１，０，ＯＩ　Ｍ　　ＮａｔＨＰＯａＯ１０５
％トリトンＸ　−１００、ｐＨ７，２に対し４℃で一夜
透析した。精製糖タンパク質のおおよその収量は１００
個のローラーボトルにつき５０■であった。生成物の特
徴及び同定は実施例１０に示されている。

実施例９ （レクチンアフィニティークロマトグラフィーによる）
未感染細胞糖タンパク質の精製例は、未感染細胞を使用
したこと以外は実施例８と完全に同一である。

実施例１０ ＶＺＶ　　タンパク　の　　　　活 各々のＶ　Ｚ　Ｖ　ｆＪ！ｉタンパク質及び感染細胞糖
タンパク譬（“レクチン”）を実施例２．３．４及び８
に記載したようにして精製した。各々の糖タンパク質百
分をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、銀染色し
た。これらの分析では、各百分は純度７５％であること
を証明した。い（っかの小バンドがアフィニティー精製
未感染糖タンパクπ画分において観察された。これらと
同様の小バンドが相当するアフィニティー精製感染糖タ
ンパク賞画分において観察されたが、このことは換言す
れば、ｇＡアフィニティークロマトグラフィーに付され
た未感染細胞溶解物バンドが、精製された感染ｇＡＩ！
タンパク質画分中にも存在していることを意味する。更
に、精製糖タンパク質の分子量は公表データと完全Ｋ−
致した（ケラ−ら、同上、実施例１参照；グロースら、
同上；シラキら・同上；ヘオルガニら、同上；オクノら
、同上）。

もう１つの実験では、（”Ｓｌメチオニン標識ＶＺＶ感
染細胞の溶解物が、３種の各糖タンパク質及びレクチン
溶出物精製用の出発源として使用された。精製糖タンパ
ク質を、（ケラ−ら、同上、実施例１参照に）記載され
たようにして、３種の各々の糖タンパクｔｇＡ、ｇＢ及
びｇＣに対する３種の各モノクローナル抗体（Ａｌ、Ｂ
１、Ｃ１）とそれぞれ沈降させた。免疫沈降物を５ＤＳ
−ＰＡＧＥにより分離し、自動Ｘ線撮影を行なった。

これらの分析では、各精製糖タンパク賞調製物はその均
一モノクローナル抗体によってのみ免疫沈降することが
でき、レクチン溶出物は免疫学的に活性型の３種すべて
の糖タンパク質を含存していたことを証明した。更に、
免疫沈降したタンパク質の分子１ｃｔ上記公表データ及
び実施例１のデータと完全Ｋ−致した。

３種の各精製糖タンパク質及びレクチン溶出物をアルミ
ナに吸着させ、モルモットを免疫するためにｌＯ■用量
で使用した。免疫動物の血清を用い、（ケラ−ら、同上
、実施例１参照に）記載されたようにして、（３Ｓｓ）
メチオニン標識ＶＺＶ感染細胞の溶解物からタンパク質
を免疫沈降させた。更に、（ケラ−ら、実施例１参照に
）記載されたようにして、血清をウェスターン法により
５ＤＳ−ＰＡＧＥ分離ＶＺＶ感染細胞タンパク質と反応
させた。これらの試験により、３種の各精製糖タンパク
質抗原はウェスターン法及び免疫沈降法のいずれによっ
ても均−糖タンパク質と反応する抗体を抽出することが
できることが見出された。更に、均一の糖タンパク質に
対する抗体の反応性は、実施例５及び６に記載されたＥ
Ｌ　Ｉ　ＳＡ法によって証明された。レクチン溶出液は
、免疫沈降法、ウェスター　ン法及びＥＬ　Ｉ　ＳＡ法
により３種の各糖タンパク質と反応する抗体を抽出する
ことができた。更に、各モルモット血清を（ケラ−ら、
同上に）記載されたようにしてイン・ビトロ中和試験に
使用した。この試験により、各精製ｇＡ、ｇＢ及びｇＣ
は中和抗体を抽出した。したがって、３種の各精製糖タ
ンパク！調製物及びレクチン溶出物は、１）モノクロー
ナル抗体による免疫沈降性、２）イン・ビトロでのウィ
ルス中和抗体の抽出能力、及び３）ウェスターン法及び
免疫沈降法において血清学的反応性が明らかになった抗
体の抽出能力、といった基阜によると、免疫学的に活性
であることが示された。

実施例１１ ＥＬＩＳＡ法ににおけるｖｚｖｌタンパク質に対るヒト
　　　　　の− 各ウェルの容量が約０．３ｍβのポリスチレンマルチウ
ェル試験プレートからなる４個のウェル各８組に、０．
５４％　Ｎａ、ＧＯ，、ｐＨ９，８，０，１５ｍｆ。

及び特異的ｇＡ、ｇＢもしくはｇＣＶＺＶ糖タンパク賞
又は未感染細胞タンパク賞０．１μｇを加えた。これら
のタンパク質調製物は、上記の方法により、即ち、各ｇ
Ａ、ｇＢもしくはｇ　ｃ　ｖ　ｚ　ｖｇタンパク質と特
異的に反応する異なるモノクローナル抗体を用いたＶＺ
Ｖ感染もしくは未感染ＭＲＣ−５ヒト二倍体繊維芽細胞
溶解物（各々３種の調製物）の免疫アフィニティークロ
マトグラフィー（実施例２〜７）により、あるいは、す
べてのＶＺＶ糖タンパク賞と広汎に交差反応する固定化
レクチンを用いたＶＺＶ感染もしくは未感染細胞溶解物
（各々１種の調製物）のレクチンアフィニティークロマ
トグラフィー（実施例８．９）により得られたものであ
る。ウェルを密封し、４℃で１８時間インキュベートし
た。抗原溶液を捨て、永続的に糖タンパク質が付着した
ウェルをＯ，ＯＳ％ツイーン２０”含有ＰＢＳ溶液０．
２５ｍｊ！で３回洗浄した。試験すべき生物学的液体の
血清を１０％１グロブリン欠乏”ヤギ血ｔ〃含［ＰＢＳ
で１　：　１００及び１　：　１０００に希釈した。各
希釈口？７Ｆ０．１ｍｊｌ！を密封されたプレート中の
各付着ウェルと一緒に３７℃で１時間インキュベートし
た。

陰性のコントロールは、第三の付着ウェルに上記のＰＢ
Ｓｉ衝液０，１ｍｆｆ１を加え上記のようにして洗浄す
ることにより得られた。陽性のコントロールは、第四の
ヤギ血清付着ウェルに公知の力価のＶＺＶ抗体含有血清
１：１０；０００希釈物０．１１１１を加えることによ
り得られた。血清溶液を捨て、空のウェルをＯ，ＯＳ％
ツイーン２０’含有ＰＢＳ溶液０．２５ｍ６で３回洗浄
した。アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ヒトｒ
ｇｃ；（カリフォルニア州、バーリンガム、タボ社）０
．１ｏ＋βを密封されたプレート中の各付着ウェルと一
緒に３７℃で１時間インキュベートした。複合体溶液を
捨て、空のウェルを０．０５％ツイーン２０１１含有Ｐ
ＢＳ溶液０．２５ｎ／！で３回洗浄し、緩衝液を除去し
た。４個すべてのウェルに、０．０２％（ｗｔ／ｖｏｌ
　）　　ＨｇＣ１ｔ　・６ＨｚＯ含有０．５４％（讐（
／ｖｏｌ　）　　ＮａｇＣＯｓ緩衝液、ｐＨ９−８に溶
解されたｐ−ニトロフェニルホスフェート１■／ｖｇｌ
からなる基質溶液０．１ｍｊを加えた。この混合物を２
２℃で４５分間インキエベートした。この酵素−基質反
応をＩＮ水酸化ナトリウム０．０５＋Ｊ！の添加により
停止させ、光学密度（Ａ）を４０５ｎｍで測定した。下
記の結果が得られた： “レクチン′調製物はほぼ等モル量のｇＡ。

ｇＢ及びｇＣを含有しているため、Ａ（レクチン）値は
ある程度Ａ　（ｇＡ）　、Ａ　（ｇＢ）及びＡ　ＣｇＣ
＞値のおおよその量的平均値を表わしている。

実施例１２ ＥＬＩＳＡ法におけるＶＺＶ［タンパク質に対するネズ
ミモノクロー　ル　　の 実施例１１の操作を、２つの変更を加えて繰返した。最
初に、実施例１で産生されたｇＡ、ｇＢ及びｇＣｖｚｖ
糖タンパク質に対してそれぞれ特異的なネズミモノクロ
ーナル抗体Ａ１、Ｂ１及びＣ１を、“グロブリン欠乏”
ヤギ血清で１：ｉｏ、ｏｏｏに希釈された抗体源として
使用した。

第二に、酵素複合体はアルカリホスファターゼに結合し
たヤギ抗マウス免疫グロブリンＩｇＧ（カリフォルニア
州、バーリンガム、タボ社）からなっていることである
、ネズミモノクローナル抗体ＡＩ　（ＶＺＶｇＡに対し
特異的）に関し、下記結果が得られた： ウェル　　　非［Δ！！１工（治１」四　　ｍｍ）　　
　　Ａｈｊｉ）　　　　ＡｈＨ）　　−Ａ（ｙ久ｆ＞Σ
１　　　　１：１０．０００　　０．８４　　０．０　
　　０．０　　　α、０３２　（陰性コント　　ｏ、ｏ
　　　ｏ、ｏ　　　ｏ、ｏ　、　　ｏ、。

ロール） ３　　（陽性コント　　１．５０　　０．６０　　２．
５０　２．６０ロール） ネズミモノクローナル抗体Ｂｌ　（ＶＺＶｇＢに対し特
異的）に関し、下記結果が得られた：’ｉｘｘ　　　　
１１２Ｋ」ηづｖし任’、９．　　　Ａ工星Δ）　　　
　Ａ工五旦）　　　　八人Ｌｑ）　　　Ａ（レクｆン）
１　　　　１：１０，０００　　　ｏ、ｏ　　　　Ｏ，
７Ｂ　　　０．０　　０．２４２　（陰性：２ン）　　
　０．０　　０．０　　０．０　　０．０ロール） ３　（陽性コント　　１，５０　　０，６０　　２，５
０　２．６０ロール） ネズミモノクローナル抗体Ｃ１（ＶＺＶｇＣに対し特異
的）に関し、下記結果が得られた：ウエル　　　、！Ｉ
ＩＩ■Ｉ支１ミ ｉ　　　　　１：ＩＱ、０ＱＱ ２　（陰性コント ロール） ３　（陽性コント ロール） Ａ（且Ａ）　　　　ｐ−片）ｌΩ）　　　Ａ（レクヂン
）０．０　　　０．０　　　０．８４　　０．０８ｏ、
ｏ　　　　ｏ、ｏ　　　　ｏ、ｏ　　　ｏ、。

１．５０　　　０．６０　　　２．５０　　２．６０こ
れらの結果は、試験法が各々のｇＡ、ｇＢ又はｇｃ糖タ
ンパク賞と反応する抗体に対し特異的であることを示し
ている。

【図面の簡単な説明】

図１は、ｇＡＳｇＢ及びｇｃ　　ｖｚｖポリペプチドと
Ａ１、Ｂ１及びＣ１モノクローナル抗体との免疫沈降物
の電気泳動分析について示す写真である。 図２は、Ｃ５モノクローナル抗体とｖＺｖポリペプチド
との反応性に関するウェスターン法分析について示す写
真である。 図３は、交差除去免疫沈降法で証明された場合は同様の
ｇＡ、ｇＢ及びｇＣＶＺＶ糖タンパク質間の抗原性の差
異を示すＳＤＳポリアクリルアトゲルフルオログラフを
表す写真である。 図面の浄書（′内容（、゛変更訳、）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、精製され未変性である血清学的活性型の、ｇｐ１０
   ５又はｇｐ１１８又はｇｐ１糖タンパク質としても分類
   される、ＶＺＶｇＡ糖タンパク質。 ２、精製され未変性である血清学的活性型の、ｇｐ１１
   ５−ｇｐ６２−ｇｐ５７もしくはｇｐ２−ｇｐ５もしく
   はｇｐ１４０−ｇｐ６６、又は１２０Ｋ−１１８Ｋ−６
   ４、６５Ｋ糖タンパク質、又は“ジスルフィド結合二量
   体”としても分類される、ＶＺＶｇＢ糖タンパク質。 ３、精製され未変性である血清学的活性型の、ｇｐ９２
   −ｇｐ８３−ｇｐ５２−ｇｐ４５もしくはｇｐ９８−ｇ
   ｐ６３もしくはｇｐ３−ｇｐ４−ｇｐ６又は９０Ｋ−８
   ０Ｋ−６０Ｋ糖タンパク質としても分類される、ＶＺＶ
   ｇＣ糖タンパク質。 ４、精製され未変性である血清学的活性型の未感染細胞
   タンパク質であって、 免疫アフィニティークロマトグラフィーにより、ＶＺＶ
   感染細胞溶解物由来の、特許請求の範囲第１項〜第３項
   において同様に分類されるようなＶＺＶｇＡ、ｇＢ又は
   ｇＣと一緒に共精製されたものである未感染細胞タンパ
   ク質。 ５、レクチンアフィニティークロマトグラフィーにより
   精製され、しかも、特許請求の範囲第１項〜第３項にお
   いて同様に分類されるようなｇＡ及び／又はｇＢ及び／
   又はｇＣ糖タンパク質を含有している、精製済感染細胞
   ＶＺＶ糖タンパク質。 ６、レクチンアフィニティークロマトグラフィーにより
   精製された、精製済未感染細胞糖タンパク質。