JPH02225497A - ブタ上部小腸由来ペプチドのｎ端部アナログペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、安定化された三次元構造と向上した生理活性
を有する合成ペプチドに関するものであり、より詳細に
は、ブタ上部小腸由来のペプチドＹＹ（以下ＰＹＹとす
る）のＮ末端アミノ酸を置換したアナログペプチドに関
するものである。

（従来の技術） ＰＹＹは第１図に示すように３６個のアミノ酸残基より
成り、−次構造が一連のＰａｎＣｒｅａｔｌＣＰｏｌｙ
ｐｅｐｔｉｄｅ　（ＰＰ）類と高い相同性（５０％以上
）を示し、同一ファミリーに属するペプチドであると考
えられている。

このファミリーの最初のメンバーである＾ｖｉａｎＰａ
ｎｃｒｅａｔｉｃ　Ｐｏ１ｙｐｅｐｔｉｄｅ　（Ａ　Ｐ
　Ｐ　）はインシュリン精製の際の副産物としてニワト
リの膵臓から単離された（Ｊ、Ｒ，Ｋｉｍｇｉｅｌら、
ＪＯＬＩｒｎａｌ　ｏｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ、　　２５０巻、　９３６９−９３７ｆ３
頁（１９７５年））。続いて種々の同族ペプチドが多く
の咄乳類のランゲルハンス島に見い出された（Ｔ、１ｎ
Ｌｉｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　ｏｒ　ｔｈｅ
　Ｇｕｔ、　１４３−１４５頁（１９７４年）　Ｃ，Ｒ
，５Ｌａｃｋ、Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）。

また、Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ　　Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ
　Ｐｏ１ｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＶＩＰ）やｃｈｏｌｅｃｙ
ｓｔｏｋｉｎｉｎ　　（ＣＣＫ　）などの消化管由来の
ペプチドが脳内にも見い出されたため、ＡＰＲの抗血清
を用いて中枢神経系にＰＰ様ペプチドが存在するかどう
か免疫化学的に検索され、多くの神経組織にポジティブ
な反応が観察された。

そこで脳内のＰＰ様ペプチドを追及する研究が精力的に
行なわれるようになった。１９８０年になってＴａｔｅ
ｌＯｔＯらによってブタの脳と消化管が多量のＰＰ様ペ
プチドを含み、そのＮ端がＴｙｒ　、　Ｃ端がＴｙｒア
ミドであることが報告された（に、　ＴａｔｅｌＯｔＯ
ら、Ｎａｔｕｒｅ、　２８５巻、　４１７−４１８頁（
１９８０年））。１９８２年同じ＜　Ｔａｔｅｍｏｔｏ
らによってブタ上部小腸組織抽出物よりペプチドＹＹ　
（ＰＹＹ）が（に、　ＴａｔｅｌＯｔＯｌＰｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７９巻、２５１
４−２５１８頁（１９８２年））、またブタ脳組織抽出
物からニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）（に、Ｔａｔｅｌ
ＯｔＯ，Ｐｒｏｃ、Ｎａ口Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、１ＩＳＡ
、　　７９巻、　５４８５−５４８９頁（１９８２年）
）が単離され一次構造が決定された。

ＰＹＹは主として直腸、結腸、回腸等、消化管粘膜組織
中の内分泌細胞に存在しく　Ｊ、　Ｈ，１，ｕｎｄｂｅ
ｒｇら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ
Ａ、　　７９巻、　　４４７１−４４７５頁（１９８２
年））、ＮＰＹは中枢、末梢神経系に広く分布しティる
（Ｒｅｖｉｅｗ、Ｊ、Ｈ，Ａｌ１ｅｎら、ＮｅｕｒＯＣ
ｈｅｌＩｎｔ、、　　８巻、　１号、１−８頁（１９８
６年））。

生理作用としてはＰＹＹは膵外分泌抑制やインスリン及
びグルカゴン放出抑制が知られており、またその構造類
似性からＮＰＹのアゴニストとして中枢及び末梢神経系
に作用し、摂食行動の促進、心拍低下、血管収縮、及び
輸精管や子宮で平滑筋の電気刺激による収縮を抑υ１す
る（Ｔ、Ｌ、０°Ｄｏｎｏｈｕｅら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ
、　６巻、　７５５−７６８頁（１９８５年））。

このようにＰＹＹは内分泌系、中枢及び末梢神経系に顕
著な薬理活性を持つため、その構造と活性の相関を含め
て盛んに研究されている。従ってより活性を向上させた
アナログペプチドを合成すればその利用価値は極めて高
い。

（発明が解決しようする課題） ＰＹＹまたはＮＰＹの構造と活性の相関研究は主として
Ｃ端部フラグメントについて行なわれ、それぞれのレセ
プターとの親和性がＣＧａ部に認められたという報告が
ある（　Ｈ，ＬａｂＵｒｔｈｅら、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ、１巻、３２−３５頁（１９８８年）　
、Ｈ，０゜Ｐｅｒｌｍａｎ　ら、ｒｎｔ、Ｊ、Ｐｅｐｔ
、Ｐｒｏｔ、Ｒｅｓ、、　　３０巻、　　１５３−１６
２頁（１９８７年））。しかし、親和性が２０分の１か
ら１０００分の１以下に低下し、しかも報告されている
Ｃ端部フラグメントはいずれもｉｎ　ＶｉｔｒＯでもｉ
ｎ　ｖｉｖｏでも生理活性を示さず、またアンタボニス
］〜としても働かない。特に血管に対する活性について
は全配列が必須であることが示されている。一方、輸精
管についてはＰＹＹの１３位から３６位のフラグメント
（以下（１３−３６）　Ｐ　Ｙ　Ｙと称す）がＰＹＹの
４分の１程度の活性を示すという報告がある（　Ｃ，Ｗ
ａｈｌｅｓｔｅｄｔら、Ｒｅｇｕｌ、Ｐｅｐｔ、、１３
巻、３０７−３１８頁（１９８６年））。これは、この
フラグメントが輸精管のレセプターに対して活性なコン
フォメーションをとりつることを示している。

本発明ではこの活性なコンフォメーションをより安定化
させるアナログを合成することにより生理活性の向上を
試みる。ＰＹＹの推定三次元構造では、Ｎ端部（１位か
ら８位）のポリプロリン■様ヘリックス内のｐｒｏ残基
とＣ端部（１４位から３２位）のα−へリツクス内疎水
性アミノ酸（たとえばｌｅｕやＴＶｒ）との間で疎水性
コアが形成され、このコアが活性発現に重要な役割を果
たすと言われている（Ｊ、Ａ１１ｅｎら、Ｐｒ０Ｃ，Ｎ
ａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ。

８４巻、　２５３２−２５３６頁（１９８７年））。本
発明者はこの疎水性コア構造の安定化が活性の向上につ
ながると考えた。そこで、ポリプロリン−■様へリツク
ス部のアナログとして、結晶構造が明らかにされている
Ａ　Ｐ　Ｐ　（１，ＧＩＯＶｅｒら、ａ＋ｏｐｏ＋ｙｍ
ｅｒｓ、　２２’ｌＪ　。

２９３−３０４頁（１９８３年））のＮ端部と結合させ
たアナログペプチド（以下（１−Ｇ、３−３，４−Ｑ、
６−Ｔ、７−Ｙ）ＰＹＹと称す）と、ＰＹＹの１位から
８位のアミノ酸のうち３位をＧＩＵ及び７位をＩ−ｙＳ
に置換してポリプロリン−■様ヘリックスの両親媒性を
増加させたアナログペプチド（以下（３−Ｅ、７−Ｋ）
Ｐ　Ｙ　Ｙと称す）とをデザインして合成し、水溶液中
での］ンフォメーションとラットの輸精管に対する活性
を、Ｐ　’Ｉ’　Ｙ及びＮ端部を欠いたフラグメントと
比較した。

（課題を解決するための手段） 本発明は、ブタ上部小腸由来のペプチドＹＹ（ＰＹＹ）
のアナログペプチドを提供する。このアナログペプチド
は、Ｎ端部の１位〜８位のアミノ酸が１個以上置換され
でおり、Ｐ　Ｙ　’ｌ’より安定化されたコンフォメー
ションを有しており、かつＰ　Ｙ　Ｙより向上した生理
活性を示づことを特徴とする。また、本発明のアナログ
ペプチドは、ＰＹＹの疎水性コア構造が安定化されてい
ることを特徴とする 特に、本発明は、アミノ酸配列式（Ｉ）Ｈ２Ｎ−ＧＩｙ
ＰｒｏＳｅｒＧｌｎＰｒｏＴｈｒＴｙｒＰｒｏＧｌｙＧ
ｌｕＡｓｐ−＾１ａＳｅｒＰｒＯＧＩＩＪＧｌｕＬＩＳ
ｅｒＡｒｌｌｌＴＶｒＴＶｒＡＩａＳｅｒＬｅｔｊ−Ａ
ｒｇＨｉｓＴｙｒＬｅｕＡｓｎＬｅｕＶａｌＴｈｒＡｒ
ｇＧＩｎＡｒｇＴｙｒＣＯＮＨ２及びアミノ酸配列式（
ＩＩ） Ｈ２Ｎ−ＴｙｒＰｒｏ−Ｘ４−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｖ−Ｐｒｏ
ＧＩｙＧｌｕＡｓｐ−ＡＩａＳｅｒＰｒｏＧｌｕＧｌｕ
ＬｅｕＳｅｒＡｒｇＴｙｒＴｙｒ＾ｌａＳｅｒ−Ｌｅｕ
ＡｒｇＨｉｓＴｙｒＬｅｕＡｓｎＬｅｕＶａｌＴｈｒＡ
ｒｇＧｌｎＡｒｇ−Ｔｙｒ　−Ｃ０ＭＢ２ （式中、ＸはＧｌｕ　、　”ｆはｌｙｓで代表される親
水性アミノ酸たとえばＳｅｒ、　Ｇ　ｌ　ｎ、　Ｔｈｒ
、　Ａｓｎ等を表わす）で表わされる新規合成ペプチド
を提供する。

本発明のペプチドはＰＹＹのＮ端部アナログペプチドで
あり、ラットの輸精管の電気刺激による一過性収縮を抑
制する作用を示す。ＰＹＹは内分泌系、心臓血管系、及
び中枢神経系に対して顕著な薬理作用を示すため、その
Ｎ端部アナログペプチドである本発明のペプチドはＰＹ
Ｙのアゴニスト又はアンタゴニストとして医薬又は種々
の試験用試薬としてその用途が期待されるものである。

上記ＰＹＹのＮ端部のアミノ酸を置換したアナログペプ
チドとして前記（１−Ｇ、３−８，４−Ｑ、６−Ｔ、？
−Ｙ）ＰＹＹ及び（３−Ｅ、　７−（４）ＰＹＹ、さら
に比較のためＰＹＹ及びＮ＠部を欠いたフラグメント（
，８−３６）ＰＹＹ及び（１３−３６）　Ｐ　Ｙ　Ｙを
合成し、これらの水溶液中でのフンフォメーションを円
二色性スペクトルを測定することにより検討した。また
、（１−Ｇ、　３−６．４−Ｑ、　６−Ｔ、　７−Ｙ）
　Ｐ　Ｙ　Ｙ及ヒ（３−Ｅ、　７−（４）ＰＹＹについ
て、ラットの輸精管を用いた生理活性の測定を行なった
ところ、ＰＹＹ及びフラグメント（１３−３６）　Ｐ　
Ｙ　Ｙに比べてより強い活性を認めた。

本発明のペプチド、たとえば（１−Ｇ、３−３，４−Ｑ
、６−Ｔ、７−Ｙ）Ｐ　Ｙ　Ｙは以下のようにして合成
することができる。Ｃ端がＴｙｒアミドであるため同相
法の担体としてｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂を
用いる。この樹脂にＣ端から順次保護アミノ酸をカップ
リングさせる。続いてＨＦ法により樹脂からペプチドを
切り出すと同時に全ての保護基を除去する。得られた粗
ペプチドを５ｅｌ）ｈａｄｅＸ　Ｇ−１５のような分子
ふるいクロマトグラフィーに付し、０．２Ｎ程度の酢酸
で溶出して小さな断片やｍ１生成物を除く。さらに＾速
液体クロマトグラフィーでたとえばＯＤＳやＣ４，（ブ
チル）等のカラムを用いて分取すれば目的とするペプチ
ドを単離することができる。ペプチドの純度は高速液体
クロマトグラフィー及びアミノ酸分析によって確認でき
る。

合成したアナログペプチド、並びに同様にして合成でき
る（　３−Ｅ、　７−（４）ＰＹＹｌＰＹＹ及びフラグ
メント（８−３６）　Ｐ　Ｙ　Ｙ及び（１３−３６）　
Ｐ　Ｙ　Ｙの円二色性スペクトルから各ペプチドのコン
フォメーションを検討する。溶媒として水、水−メタノ
ール、または水−トリフロロエタノールを用いる。メタ
ノールやトリフロロエタノールは誘電率が水より低いた
めペプチド分子と溶媒との相互作用（水素結合）よりも
ペプチド分子の分子内水素結合の形成を促進し、α−ヘ
リックスやβ−構造のような二次構造を安定化させる。

この二次構造またはより高次の構造が生理活性ペプチド
の活性発現に重要な役割を果すと考えられるため、メタ
ノールまたはトリフロロエタノールの吊を変化させてコ
ンフォメーションの変化を検討すれば生理活性ペプチド
の活性コンフォメーションを推定できる。

それぞれのペプチドについてラットの輸精管の電気刺激
による一過性収縮の抑制作用を測定することによって各
々の生理活性を検討する。

！１ａｈｌｅｓｔｅｄｔらの方法（Ｃ，Ｗａｈｌｅｓｔ
ｅｄｔら、　Ｒｅｇｕ　Ｉ　。

Ｐｅｐｔ、、１３巻、　３０７−３１８頁（１９Ｊ６年
））に従ッテ調製したＫｒｅｂｓ液中にｓｐｒａｇｕｅ
−ｔ＋ａｗ＋ｅｙラットから摘出した輸精管をつるし、
電気刺激を加える。この時生ずる一過性の収縮を記録し
、ペプチドの一定濃度の溶液を加える。収縮の抑υ１の
程度を％として用量−反応曲線を作成する。ペプチド濃
度Ｏの時の収縮を５０％に抑制するペプチド濃度をＩＣ
５゜とする。

以下の実施例で本発明を例示する。

各ペプチドを、１％ジビニルベンゼン−ｐ−メチルベン
ズヒドリルアミンポリスチレン樹脂を担体として、ｙａ
ｍａ　Ｓｈ　ｉ　ｒｏらの方法（Ｄ、Ｙａｓａｓｈｉｒ
ｏら、Ｊ、Ａｓ、Ｃｈｅ＋ｇ、Ｓｏｃ、、１００巻、　
５１７４−５１７８頁（１９７８年））を応用した固相
法により合成した。使用したアミノ酸誘導体は以下のも
のである。

Ｂｏｃ−Ａｌａ、　Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｎζ−Ｔｏｓｓ、
　Ｂｏｃ−Ａｓｎ、　Ｂｏｃ−＾５ｐ（ＯＢｚｌ）、　
Ｂｏｃ−Ｇｉｎ、　Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）、　Ｂ
ｏｃ−Ｇｌｙ、　Ｂｏｃｉｓ　　　　　　　　　　　　
　　　　　ε−１ｌｉｓ（Ｎ　　−Ｂｏｗ）、　Ｂｏｃ
−Ｌｅｕ−Ｎ２０　　Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｎ２ｃｌ−Ｚ）
、　Ｂｏｃ−Ｐｒｏ、　Ｂｏｃ−３ｅｒ（ＯＢｚｌ）、
Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（ＯＢｚｌ）。

ＢＯＣ−ＴＩ／ｒ（２８ｒ−Ｚ） 但し、ＢＯＣ＝ｔ−プチルオ主ジカルボニル、Ｈζ−Ｔ
Ｏ８・Ｎζ−トシル、　０ＢＺｌ＝ベンジルエステル　
、ｉｓＢｏｍ＝　Ｎ　　−ベンジルオキシメチル、　　
Ｎ’−２ｃｌ〜Ｚ−Ｎ６−２−クロロベンジルオキシカ
ルボニル−７＝２−ブロモベンジルオキシカルボニルで
ある。

Ｃ端アミノＭＢｏｃ〜Ｔｙｒ（２Ｂｒ−、？）を対称無
水物法で樹脂に導入した。樹脂の置換の度合をＧｉｓｉ
ｎ法（Ｂ．Ｆ．Ｇｉｓｉｎ，Ａｎａｌ．ｃｈｉｍ．Ａｃ
ｔａ，　　５８巻，　　２４Ｂ−２４９頁（　１９７：
ｌ：　）　）　ニに　ッテ０．２−０．２５　ａｓｏｆ
／９　ａ４脂ト算出した。対称無水物法によって３ｏｃ
−アミノ酸誘導体のカップリングを行なった。但し３ｏ
ｃ−Ａｓｎ及び３ｏｃ−Ｇｌｎはヒドロキシベンゾトリ
アゾールエステルとして反応させた。樹脂からの切り出
し及び保護基の除去をＨＦ法によって行なった。粗ペプ
チドを２Ｎの酢酸で抽出し、抽出液をエーテルで洗浄し
た。水層を凍結乾燥し白色粉末を得た。

この粉末をＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１５カラムクロマト
グラフイー（２．５ｘ　Ｓｏｕ　＞に付し、０、２Ｎの
酢酸で溶出した。ペプチドを含むフラクションを合し、
凍結乾燥した後、さらに高速液体クロマトグラフィーに
より精製した。カラムに山村化学０４カラムＹＨＣ−Ａ
−８２３−５−３０　（　１０ｘ　２５０　ｍ　）を用
い、次の方法で展開した。Ａｇｏ、１．％トリフロロ酢
酸−水、Ｂ：０、１％トリフロロ酢Ｍー６０％７セトニ
トリルー水。

Ｂ：４０〜６５％／２５分直線勾配、流速４−７分。情
報したペプチドは上記と同一の条件で展開すると単一の
対称なピークを示した。（　１−Ｇ，３−Ｓ，　４−Ｑ
，　６−丁，　７−Ｙ）　Ｐ　Ｙ　ＹのＧ−１５カラム
溶出後及び高速液体クロマトグラフィー分取後のチャー
トを第２図及び第３図に示した。また、（３−Ｅ，？−
Ｋ）ＰＹＹの６−１５カラム溶出後及び高速液体クロマ
トグラフィー分取後のチャートを第４図及び第５図に示
す。

合成したペプチドを０．１％フェノール−６Ｎ塩酸中で
２４時間１１０℃に加熱して加水分解し、アミノ酸分析
を行なった。

（　１−Ｇ，　３−Ｓ，　４−Ｑ，　６−Ｔ，　７−Ｙ
）　Ｐ　Ｙ　Ｙ＾ｓｘ（２）、　１．８１　：　Ｔｈｒ
（２）、　１．７１　：　Ｓｅｒ（４）、　３．７２　
：Ｇｌｘ（５）、　４．９２：　Ｐｒｏ（４）、　３．
８６：　Ｇｌｙ（２）、　１．９７：Ａｌａ（２Ｊ，　
２．００：　Ｖａｌ（１）、　０．９２：　Ｌｅｕ（４
）、　３．９４：Ｔｙｒ（５）、　５．４０：　Ｈｉｓ
（ｔ）、　１．０２：　Ａｒｏ（４）、　４．１７同様
にして（３−Ｅ，７−Ｋ）　Ｐ　Ｙ　Ｙ　１Ｐ　Ｙ　Ｙ
　、フラグメント（８−３６）Ｐ　Ｙ　Ｙ及び（１３−
３６）　Ｐ　Ｙ　Ｙを合成し、アミノ酸分析に付した。

（３−Ｅ，７−（４）Ｐ　Ｙ　Ｙ 八ｓｘ（２）、　　１．８９　：　Ｔｈｒ（１）。

ＧＩＸ（６）、６．０４　：　Ｐｒｏ（４）。

Ａｌａ（２）、　　１．７４：Ｖａｌ（１）。

丁’／ｒ（５）、　　４．９９：　　旧ｓ（１）。

Ａｒｇ（４）　　３．９８ ＰＹＹ Ａｓｘ（２）、　　１．９６　：　Ｔｈｒ（１）。

Ｇｌｘ（５）、５．０４：　Ｐｒｏ（４）。

Ａｌａ（４）、　　３．７３：Ｖａｌ（１）。

Ｔｙｒ（５）、　４．、９７　：旧ｓ（１）Ａｒｇ（４
）、　　４．２３ （８−３６）Ｐ　Ｙ　Ｙ Ａｓｘ（２）、　　１．９９　：　Ｔｈｒ（１）。

Ｇｌｘ（４）、　　４．０７：　Ｐｒｏ（２）Ａｌａ（
２）、　　２．００　：　Ｖａｌ（１）。

Ｔｙｒ（４）、　４．０５　：　Ｈｉｓ（１）０、８１
　：　Ｓｅｒ（３） ３、８２　：　Ｇｌｙ（１）。

０、９１　：　Ｌｅｕ（４） １、００　：　Ｌｙｓ（２）。

０、８１： ３、９０： ０、８９： ０　９８： Ｓｅｒ（３） Ｇｌｙ（１） Ｌｅｕ（４） Ｌｙｓ（１）。

０、９１　：　Ｓｅｒ（３） １、７３　：　Ｇｌｙ（１） ０、９２　：　Ｌｅｕ（４）。

１、０４　：　Ａｒｇ（４） ２、６９： ０、９９＋ ４、００： １、９２： ２、７１： ０、９４： ４、００： １、０１　＋ ２、８６： １、０１　： ３、８２： ４、２７ （１３−３６）Ｐ　Ｙ　Ｙ Ａｓｘ（１）、　　１．０１　：　Ｔｈｒ（１）、０．
７８：　５ｅｒ（３）、２．７５：Ｇｌｘ（３）、２．
８３：　Ｐｒｏ（１）、１．０６：　Ａｌａｆｌ）、０
．９７：Ｖａ［ｔ）、　　０．８５：　　Ｌｅｕ（４）
、　　４．００：　　ＴＶｒ（４）、　　４．３７：Ｉ
ｔｓ（１）、０．９７：　＾ｒｇ（４）、　　３．９６
実施例２ 円二色性スベク１〜ル（ＣＤ）の測 （１−Ｇ、３−３，４−Ｑ、６−Ｔ、？−Ｙ）Ｐ　Ｙ　
Ｙ　、　（３−Ｅ、７−（４）Ｐ￥Ｙ、ＰＹＹ、及びフ
ラグメント（１３−３６）Ｐ　Ｙ　Ｙ及び（８−３６）
　Ｐ　Ｙ　ＹのＣＤを日本分光Ｊ　−２０Ｃ自記旋光分
散計にて測定した。各ペプチドを約１００μＭの濃度に
なるよ・うに水、水−メタノール、または水−１〜リフ
ロロエタノール（比率をに〇から５＝５まで変化させた
）に溶かした。セルは光路長０５履のものを用い、２０
０から２６０ｎｍまで測定した。

第６図から第１１図に示すようにそれぞれのペプチドの
ＣＤは典型的なα−ヘリックスの存在を小した。（１３
−３６）　Ｐ　Ｙ　Ｙに関してはα−へワックスと不規
則構造のみから成ると考えられるため２２２ｎｍにおけ
る平均残基分子楕円率［θ］２２２を求め、下記式（１
）からα−へリツクス含ｉｔ（％）を粋出し、（８−３
６）　ＰＹＹ、　ＰＹＹｌ（１−Ｇ、３−３，４−Ｑ、
６−７７−Ｙ）Ｐ　Ｙ　Ｙ及び（３−Ｅ、７−Ｋ）ＰＹ
Ｙはβ−構造を含む可能性があるため［θ］　　を求め
、下記式（２）よりα−へリツクス含ｍ（％）を算出し
た。

Ｈ，Ｇｒｅｅｎ４ｉｅｌｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ、　　８巻、　　４１０Ｂ−４１１６頁（１９６９年
）参照。算出したα−ヘリックス含量（％）を下記表１
に示す。

α（％Ｍ［θ］　　　−３０００）／（−３６０００−
３０００）Ｘ１００　　（１） α（％）＝（［θ］　　　　−（−４０００））／（−
３３０００−（−４０００））Ｘ１００　　　（２） 表 表１及び第６図、第７図からフラグメン１−（１３−３
６）ＰＹＹのコンフォメーションは、水だけでは不規則
構造の寄与が大きいが、メタ、ノールまたはトリフロロ
エタノールを加えるとα−へワックスの寄与が大幅に増
加することが判った。特に水−トリフロロエタノール（
４：６）以上ではα−へワックスの含量が７９％という
一定の値に落ち着く。

この時、フラグメント（１３−３６）　Ｐ　Ｙ　Ｙのフ
ンフォメーションが、ＰＹＹの推定三次元構造に見られ
るように、１４位のｐｒｏから３２位のＴｈｒまでがα
−ヘリックス、そして他が不規則構造とすれば、１９÷
２４Ｘ　１００　＝　７９％となって実測値と一致し、
ＰＹＹの推定三次元構造のうちに存在するのと同じコン
フォメーションであることを示唆している。

従って％−ａｈｔｅｓｔｅｄｔらの結果から、ラットの
輸精管に対するフラグメント（１３−３６）　Ｐ　Ｙ　
Ｙの活性コンフォメーションは、１４位から３２位で形
成されるα−へワックスと不規則構造であることが十分
に考えられる。フラグメント（１３−３６）Ｐ　Ｙ　Ｙ
の活性がＰＹＹの４分の１程度であることは、ペプチド
全体としての疎水性の程度またはα−へリツクスの安定
性の程度の差として説明できる。

第８図からフラグメント（８−３６）Ｐ　Ｙ　Ｙも同様
にメタノール添加に伴い、α−へリックス含量が大幅に
増加し、α−ヘリックスを安定化させる因子、たとえば
Ｎ端部とα−へリックスの分子内疎水性相互作用を持た
ないことが分った。

一方、ＰＹＹ、　　（１−Ｇ、３−３，４−Ｑ、６−Ｔ
、７−Ｙ）ＰＹＹ及び（３−Ｅ、７−Ｋ）ＰＹＹでは、
水中でもかなり安定なα−へリックスが形成された。Ｐ
ＹＹの推定三次元構造によると、ポリプロリン−■様へ
リックス内の２．５．８位のＰｒｏとα−ヘリックス内
の１７、２４及び３０位のｌｅｕ、さらに２０及び２７
位のＴｙｒが空間的に接近し、疎水性コアを形成して、
安定なコンフォメーションをとっている。このことから
、溶液中でのＰＹＹ、　　（１−Ｇ、３−３，４−Ｑ、
６−Ｔ、？−Ｙ）ＰＹＹ及び（３−Ｅ、７−（４）Ｐ　
Ｙ　Ｙのα−へリックス構造が、Ｎ端部の寄与によって
安定化されていることが示唆される。第９図〜第１１図
かられかるように、メタノールを増加させた時のＣＤの
変化が（１−Ｇ、　３−３．４−Ｑ、　６−Ｔ、　７−
Ｙ）　Ｐ　Ｙ　Ｙ及び（３−Ｅ、　７−Ｋ）ＰＹＹの方
がＰＹＹより小さいことから、これらのα−へリックス
の方がより安定化されていると考えられる。

宋Ｊ１４旦 ラット輸精管アッセイ オスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（７週令、
体重２００−２５０９　）を所領し、開腹して輸精管を
摘出した。結合組織を除き、Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔらに
従って調製したＫｒｅｂｓ液（Ｃ，１１ａｈｌｅｓｔｅ
ｄｔら、Ｒｅｇｕｌ、Ｐｅｐｔ、　、　１３巻、　３０
７−３１８頁（１９８７年））中９５％酸素〜５％二酸
化炭素を通じ３７℃に保温したマグヌス管内につるした
。輸精管に１９の張力を加え、電気パルス（０，１Ｈｚ
、　２ｇ１ｓｅｃ、　９０Ｖ）で刺激した。生ずる一過
性収縮を記録し、一定濃度のペプチド溶液を加えた時の
収縮抑制の度合を％で表わし、用量−反応曲線を作成し
た（第１２図）。ペプチド濃度Ｏの時表　　　　２ ＩＣ５ｏｘ１０　　Ｍ ＰＹＹ　　　　　　　　　　　　　　　５．２±１．２
（１３−３６）ＰＹＹ　　　　　　　　　　　　　４０
±２．５（１−Ｇ、３−３，４−Ｑ、６−丁、７−Ｙ）
ＰＹＹ　　　　　　２．８±０．５（３−Ｅ、７−Ｋ）
ＰＹＹ　　　　　　　　　　　１．６±０．４表２のよ
うに（１−Ｇ、３−３，４−Ｑ、６−Ｔ、７−Ｋ）Ｐ　
Ｙ　Ｙ及び（３−Ｅ、　７−（４）ＰＹＹｌ、ｔＰＹＹ
と同等またはそれ以上の活性を示し、フラグメント（１
３−３６）　Ｐ　Ｙ　Ｙの１０倍以上の活性を示した。

この活性の向上は、ＣＤから得られたα−へリックスの
安定化を反映している。従って、Ｎ端部のアミノ酸を置
換してα−へリックス構造をより安定化させることによ
って、より活性の強いアナログペプチドを合成すること
ができると考えられる。

（発明の効果） ＰＹＹはを椎動物に広く分布し、消化管ホルモンとして
内分泌系に、またＮＰＹのアゴニストとして中枢及び末
梢神経系に対して顕著な薬理活性を示すことが明らかに
されている。本発明では、ＰＹＹのＮ端部のアナログを
合成してそのフンフォメーションと生理活性を検討し、
天然のＰＹＹより同等あるいはそれ以上の活性を持つこ
とを明らかにした。ペプチドのフンフォメーションやそ
の安定化を考慮してアミノ酸を置換する本発明のような
アプローチによって薬理活性の向上、レセプターの選択
性等、医薬品開発にむけての研究を行なうことができる
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｐａｎｃｒｅａｔｔｃ　Ｐｏ１ｙｐｅｐｔｉ
ｄｅフアミリーのアミノ酸配列を示す。 八ＰＰ＝Ａｖｉａｎ　　Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　　Ｐｏ
１ｙｐｅｐｔｉｄｅｈｐｐ＝＋＋ｕｍａｎ ＢＰＰ＝Ｂｏｖ　＋　ｎｅ ＰＰＰ＝Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｐ’＋’Ｙ＝Ｐｅｐｔｉｄｅ　ＹＹ、　　１４ＰＹ＝Ｎ
ｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ　Ｙ第２図は、アナログペプチ
ド（１−Ｇ、３−３，４−０．６−Ｔ、７−Ｙ）ＰＹＹ
を高速液体クロマトグラフィーに付した時のアセトニト
リル濃度勾配による溶出の紫外吸収（△　　）クロマト
グラムであり、同相法合成後の粗ペプチドを５ｅｐｈａ
ｄｅｘ　Ｇ−１５カラムクロマトグラフイーに付して溶
出した後のものである。 第３図は、アナログペプチド（１−Ｇ、　３−８．４−
Ｑ、　６−■、７−Ｙ）ＰＹＹを高速液体クロマトグラ
フィーで分取した後のクロマトグラム＜Ａ　　　）であ
る。 第４図は、固相法合成後の粗アナログベブブド（３−Ｅ
、　？−Ｋ）ＰＹＹを５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１５カラ
ムクロマトグラフイーに付して溶出した後高速液体クロ
マトグラフィーに付した時の７セトニｊ−リル濃度勾配
による溶出の紫外吸収（Ａ　　　）クロマトグラムであ
る。 第５図は、アナログペプチド（３−Ｅ、　７−（４）Ｐ
ＹＹを高速クロマトグラフィー分取した後のクロマトグ
ラム（Ａ　　　）である。 第６図は、フラグメント（１３−３６）　ＰＹＹの水溶
液中での円二色性スペクトラムで、メタノールを添加し
た場合である。 第７図は、フラグメント（１３−３６）　Ｐ　Ｙ　Ｙの
水溶液中での円二色性スペクトラムで、トリフロロエタ
ノールを添加した場合である。 第８図は、フラグメント（８−３６）Ｐ　Ｙ　Ｙの水溶
液中での円二色性スペクトラムで、メタノールを添加し
た場合である。 第９図はＰＹＹの水溶液中での円二色性スペクトラムで
、メタノールを添加した場合である。 第１０図は、アナログペプチド（１−Ｇ、　３−３．４
−Ｑ、　６−ｒ、　７−Ｙ）　Ｐ　Ｙ　Ｙの水溶液中で
の円二色性スペクトラムで、メタノールを添加した場合
である。 第１１図は、アナログペプチド（３−Ｅ、γ−Ｋ）ＰＹ
Ｙの水溶液中での円二色性スペクトラムで、メタノール
を添加した場合である。 第１２図は、ラット輸精管アッセイにおける用量−反応
曲線である。 ・−・　（１−Ｇ、３−３，４−Ｑ、６−Ｔ、７−Ｙ）
　Ｐ　Ｙ　Ｙ−一■　ＰＹＹ ムーム　（１３−３６）　Ｐ　’ｆ　Ｙ縦棒は標準偏差
を表わす。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）ブタ上部小腸由来のペプチドＹＹのアナログペプ
   チドであって、 Ｎ端部のアミノ酸が１個以上置換されており、前記ペプ
   チドＹＹより安定化されたコンフォメーションを有して
   おり、かつ前記ペプチドＹＹより向上した生理活性を示
   すことを特徴とする前記アナログペプチド。
2. （２）Ｎ端部の１位〜８位のアミノ酸が１個以上置換さ
   れていることを特徴とする請求項１記載のアナログペプ
   チド。
3. （３）前記ペプチドＹＹの疎水性コア構造が安定化され
   ていることを特徴とする請求項１または２記載のアナロ
   グペプチド。
4. （４）アミノ酸配列式 【遺伝子配列があります】 で表わされることを特徴とする請求項１〜３のいずれか
   に記載のアナログペプチド。
5. （５）アミノ酸配列式 【遺伝子配列があります】 （式中、Ｘ、Ｙは親水性アミノ酸、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｓ
   ｅｒ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ等を表わす）で表わされ
   ることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のア
   ナログペプチド。
6. （６）アミノ酸配列式 【遺伝子配列があります】 で表わされることを特徴とする請求項５記載のアナログ
   ペプチド。