JPH02227080A - 新規な組換リンホトキシン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規な組換リンホトキシン誘導体とその生産に
係る遺伝子組換技術並びに該誘導体を含有する医薬組成
物に関する。従って、本発明は医療用医薬品の分野にお
いて利用することができる。

〔従来の技術〕

生体中には生体防禦機構に係わる種々の液性因子が存在
しており、これらは主として白血球、リンパ球、マクロ
ファージなどが刺激に反応して産生ずる微量生理活性物
質であって、例えばインターフェロン（ＩＦＮ−α、β
、Ｔ）、インターロイキン（ＩＬＬ、２，３．４）　、
リンホトキシン（ＬＴ）　、癌壊死因子（ＴＮＦ）、コ
ロニー刺激因子（Ｇ−、ＧＭ−Ｃ３Ｆ）を挙げることが
できる。

これらのうちリンホトキシン、ＴＮＦは新生細胞系統に
対し直接的な抗細胞活性を示すポリペプチドとして確認
されており、リンホトキシンはリンパ球から、またＴＮ
Ｐはマクロファージから、それぞれマイト−ジエンによ
る刺激により産生される。

さて、リンホトキシンおよびＴＮＦの遺伝子をクローニ
ングし、該遺伝子を組込んだベクターにより形質転換さ
れた大腸菌を培養することによって、リンホトキシンお
よびＴＮＦを生産することはすでに報告されている（ネ
イチャー、旦互７２１−７２４．１９８４　（Ｎａｔｕ
ｒｅ、　３１２．７２１−７２４．１９８４）。

そして大腸菌で生産されたリンホトキシンおよびＴＮＦ
はｉｎ　ｖｉｖｏの実験でも移植癌に対する壊死効果を
有することが証明されており、例えばマウスに移植した
Ｍｅｔｈ　Ａ　Ｓａｒｃｏｍａによる癌はリンホトキシ
ンあるいはＴＮＦの静脈内投与または局所投与により顕
著に治癒されることが認められている（Ｊ、Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ、　Ｍ、Ａ、ＰＡＬＬＡＤＩＮＯｅｔａｌ、
　　１３８４０２３　（１９８７））。

しかしこれらリンホトキシン右よびＴＮＦは全ての癌細
胞を特異的に傷害するわけではなく、まったく作用を受
けない癌細胞も多数存在することが明らかとなってきた
（Ｓｕｇａｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ　５ｃｉ−ｅｎｃｅ、
　２３０．９４３（１９８５）、　Ｗａｔａｎａｂｅ　
ｅｔ　ａｌ、　Ｊ。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　（Ｇａｎｎ）　７６１１１５
（１９８５））。例えばヒト膀胱癌Ｔ−２４，ヒト悪性
黒色腫Ｇ−３６１．結腸腺癌し５１７４−Ｔ、ヒト喉頭
癌ＨＥｐ２　、　　ヒト線維内腫ＨＴ１０８０などはｉ
ｎ　ｖｉｔｒｏでの実験では傷害作用を受けにくい。

ところでリンホトキシンおよびＴＮＦは抗腫瘍作用以外
にも広範な作用を示すことが明らかとなり、リボプロテ
ィンリパーゼ阻害作用、　ＩＬＩ誘発作用、プロスタグ
ランジン誘導作用、血液凝固促進作用等がこれまでに報
告されている。リンホトキシンあるいはＴＮＦを臨床で
使用する場合、これらの作用が副作用として露見してく
ることが予想され、事実ＴＮＦの臨床第−相試験では発
熱、悪寒、戦慄、血圧低下、ＧＯＴ／ＧＰＴ上昇、全身
倦怠感、ＡＬＰ上昇が認められている（癌と化学療法、
　１３．３４９１．１９８６）。

さて、リンホトキシンは分子量、荷電、耐熱性の違いか
らα（分子量７００００〜９００００）　、　β（分子
量２５０００〜５００００）　、　　−ｒ　（分子量１
００００〜２００００）、　　コンプレックス（分子量
２０００００　＜　）の４つのクラスに分けられており
（ポール　エフ。

トーレンス、バイオロジカル　リスポンス　モｆ　、ｒ
　７７　イ’ｒ　−ｘ　２９３．１９８５　（Ｐａｕｌ
　Ｆ、Ｔｏｒｒｅｎｃｅ。

Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　Ｍｏｄｉｆ
ｉｅｒｓ、　２９３．１９８５）、さらにα、βクラス
は電荷によってサブクラスに分類することができる。す
なわち、リンホトキシンは種々のヘテロな物質の総称と
して用いられている。

Ａｇｇａｒｗａｌらはリンホトキシンのアミノ酸構造を
報告しくジュー。ビー、シー、皿２３３４　（１９８５
）（Ｊ、Ｂ、Ｃ，２６０，２３３４（１９８５））、ま
たＧｒａｙらによってリンホトキシン遺伝子構造も報告
されるとともに、リンホトキシンのへテロの原因の一部
分は、同リンホトキシンのアミノ酸残基数および会合形
成の違いによって説明できると考えられている。

他方、Ｇｒａｎｇｅｒ　らはこのリンホトキシンと免疫
交差を示さないリンホトキシンが存在することを報告し
ており（ジェー、インムニノロジー１３７、１８７８．
１９８６　（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１３７．１
８７８゜１９８６）　、これはすでに構造解明されたリ
ンホトキシンとは抗細胞活性に関するスペクトラムが異
なるとしている。また、抗腫瘍細胞活性を有する因子と
して報告されているヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）はアミ
ノ酸構造においてヒト　リンホトキシンと２８％の類似
性を示し、腫瘍細胞表面上のレセプターが共通であるこ
とが報告されているにもかかわらず、抗腫瘍細胞活性ス
ペクトラムは多少異なると考えられている。

以上の知見を背景にして本発明者は当該リンホトキシン
より種々のポリペプチドを作り、抗腫瘍作用を示すｒｅ
ｇｉｏｎのアミノ酸配列を見出すことふよび抗腫瘍作用
の増強を課題として検討した。

〔課題を解決するための手段〕

種々の検討の結果、１３７個のアミノ酸残基からなるア
ミノ酸配列に抗腫瘍作用があることを見出し、該配列の
Ｎｔ１２側に任意のアミノ酸配列を連続するか、または
該配列中の特定のアミノ酸を変換することによってさら
に強い抗腫瘍作用のある、あるいはリンホトキシン抵抗
性癌細胞に対しても傷害作用のある新規ポリペプチドが
得られることを知り、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は抗腫瘍作用の増強および抗腫瘍作用
スペクトラムの拡大を目的として、１３７個のアミノ酸
残基から構成されるアミノ酸配列であって、該配列中の
特定のアミノ酸に数種のバリエーションがあるものを含
有する新規なリンホトキシン誘導体を開示する。しかる
に該誘導体は遺伝子組換技術の利用によって効果的に達
成されるので、本発明は上記アミノ酸配列を含有する組
換リンホトキシン誘導体の提供を要旨とするものである
。

以下に本発明を構成および方法の項に分けて詳細に説明
する。

構　　成 本発明組換リンホトキシン誘導体はその分子中に下記−
機構造式で示されるアミノ酸配列（以下本発明に係るア
ミノ酸配列と呼ぶ）を含有する。

Ｐｒｏ＾ｌａ　Ａｌａ＾、　Ｌｅｕ　Ａ２Ａ、　Ａｓｐ
　Ａ、＾、＾、　ＧｌｎＡｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａ？
＾ａ　Ａｓ　Ａｇｏ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｃｔ　Ａ＋ａ
＾１ａ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｐ
ｈｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ＾、、　Ａｓｎ　Ｓｅｒ
　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　
Ｇｌｙｌｌｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｓｅ
ｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｔ　Ｖａｌ　ＰｈｅＳｅｒ　Ａ、４＾
２．　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａ、、　Ｔｙ
ｒ　ＬｅｕＡｌａ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　
Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ＧｉｎＴｙｒ　Ｐｒ
ｏ　Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ
　Ｓｅｒ　５ｅｒＧｉｎ　Ａ２３　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｔ
ｙｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　ＧｌｕＰｒｏ
　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　
）ｌｉｓ　Ｇｌｙ　Ａｌａ＾１ａ　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　Ｌ
ｅｕ　Ｔｈｒ　Ａ２４　Ａｓｓ　Ａ２１１＾１７Ｌｅｕ
Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　）ｌｉｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　
ｌｉｅ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　ＬｅｕＶａｌ　Ｌｅｕ　Ａ２
ｓ　Ａｓｓ　Ａ３０　Ａ３１　Ｖａｌ　Ａ３２　Ｐｈｅ
　ＧｌｙＡｌａ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｌｅｕ （式中、＾ｌ”１４１　Ａ２１４３２はいずれかのアミ
ノ酸を表す） 特にＡ１はＨｉｓ、　Ａｓｎ、　　Ｌｅｕ、　Ａ２はｌ
ｉｅ、　Ｍｅｔ、　Ｇｌｙ。

Ａ３はＬｅｕ、　Ｇｉｎ、　　Ｈｉｓ、　　Ｃｙｓ、　
　Ｉｌｅ、　Ｐｒｏ、　　Ｖａｌ、　Ｓｅｒ。

Ｇｔｙ　ＳＡ、はＰｒｏ、　　Ａｒｇ、　　Ｌｅｕ、　
　Ｇｉｎ、　　Ｖａｌ　、＾、はＳｅｒ、　　Ｐｈｅ、
　　Ｃｙｓ　、Ａ６はＬｙｓ、　　Ａｓｎ、　　Ｇｉｎ
、　　Ｇｌｕ。

＾Ｓｐｓ：＾、はＬｅｕ、　Ａｌａ、　Ｇｉｎ　ＳＡ、
はＴｒｐ、　　Ｐｈｅ。

Ｌｅｕ　ＳＡ、はＡｒｇ、　　Ｌｅｕ、　　Ａ、、は＾
ｌａ、　　Ａｒｇ、　　Ｇｌｕ　。

Ａ口　は＾ｓｐ、　　Ａｓｎ、　　Ａｌａ、　　Ａｒｇ
、　　Ａｌ１は＾ｒｇ、　　Ａｓｎ。

Ｇｌｙ　５Ａ１３は＾ｓｎ、　　Ａｒｇ、　　Ａｓｐ、
　　Ａｌａ、　　Ｓｅｒ　、　　Ａ１４はＧｌｙ、　Ａ
ｒｇ、　　Ｌｙｓ、　Ｐｒｏ、　Ａｌａ、　　Ｓｅｔ、
　Ｔｈｒ　５Ａ２１はＡｌａ、　　Ｌｙｓ、　　Ｓｅｒ
、　　Ｇｌｕ、　　Ａ２２はＬｅｕ、　　Ｖａｌ、　　
Ａ２３はＬｙｓ、　　Ａｓｎ、　　＾２．はＧｌｎ、　
　Ｌｙｓ、　　Ａｒｇ、　　ＧｌｙＳＡ２ｓはＧｌｙ、
　　Ａｓｐ、　　Ｓｅｒ　、　　Ａ２＠はＡｓｐ、　　
Ｇｌｕ、　　Ｇｉｎ　。

Ａ２１　はＧｉｎ、　Ａｒｇ、　　Ｐｒｏ、　　５ｅｒ
ＳＡａｓはＳｅｒ、　Ｔｈｒ。

Ｇｌｕ、　　Ｐｈｅ、　Ｔｒｐ　５Ａ２１はＰｒｏ、　
Ｔｈｒ、　Ｔｒｐ、　Ｔｙｒ。

＾３ｏ　はＳｅｒ、　　Ｔｈｒ、　　Ｔｙｒ　、　　Ａ
３１はＴｈｒ、　　Ｖａｌ、　　Ｐｈｅ　。

Ａ３２はＰｈｅ、　Ｔｙｒのそれぞれいずれかを表す場
合に優れた抗腫瘍作用が示される。

いわゆるリンホトキシン前駆体に含まれるアミノ酸配列
と同一のアミノ酸配列であって、リンホトキシンの抗腫
瘍作用を示すのは上記にふいて、Ａ、が旧ｓＳＡ、が■
１ｅＳＡ３がｅｔｙ　ＳＡ４がＰｒ。

又はＶａｌ　、＾、がＳｅｒ　ＳＡｓがＬｙｓ　、＾、
がｌｅｕ　、　ＡｓがＴｒｐ　、　Ａ、がＡｒｇ　ｓ　
　ＡｇｏがＡｌａ　、　　ＡｃｔがＡｓｐ　。

Ａ、２がＡｒｇ　、　　Ａ＋ｓが＾ＳｎＳ　Ａ＋ｓがＧ
ｔｙ　５Ａ２１がＡｌａ　５Ａ２２がＬｅｕ　５Ａ２３
がＬｙｓ　、　　＾３．がＧｌｎ　。

Ａ、Ｓ　がＧｔｙ　、　　Ａ２６がＡｓｐ　１Ａ２ｔが
Ｇｌｎ　５Ａ２１１がＳｅｒ　、　　＾２．がＰｒｏ、
Ａ３１１がＳｅｒ　、＾、１がＴｈｒ　。

＾５．がＰｈｅである。

上記本発明に係るアミノ酸配列のＮＯ３側およびＣ０Ｏ
Ｈ側に連結する他のアミノ酸配列の選択は自由であり、
特に制限はない。ＮＯ３側に連結するアミノ酸として、
例えば次の■〜０を挙げることができる。

■　Ｍｅｔ ■　Ｍｅｔ　　Ｌｙｓ ■　Ｍｅｔ　　Ｔｈｒ　　Ｍｅｔ　　ｌｉｅ　　Ｔｈｒ
　　Ａｓｎ　　Ｓｅｒ　　ＡｓｐＬｅｕ　　Ｍｅｔ　　
Ａｒｇ　　Ａｒｇ　　Ａｒｇ　　Ｌｙｓ■　Ｍｅｔ　　
Ｔｈｒ　　Ｍｅｔ　　Ｉｌｅ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｎ　　
Ｓｅｒ　　Ｐｒ。

Ａｌａ　　Ｇｉｎ　　Ｔｈｒ　　Ａｌａ　　Ａｒｇ　　
Ｇｉｎ　　Ｈｉｓ　　Ｐｒ。

Ｌｙｓ　　Ｍｅｔ　　Ｈｉｓ　　Ｌｅｕ　　Ａｌａ　　
Ｈｉｓ　　Ｓｅｒ　　ＴｈｒＬｅｕ　　Ｌｙｓ ■　Ｍｅｔ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｙ　　Ｖａｌ
　　Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ　　ＴｂｒＰｒｏ　　Ｓｅｒ　　
Ａｌａ　　Ａｌａ　　Ｇｉｎ　　Ｔｈｒ　　Ａｌａ　　
ＡｒｇＧｌｎ　　Ｈｉｓ　　Ｐｒｏ　　Ｌｙｓ　　Ｍｅ
ｔ　　Ｈｉｓ　　Ｌｅｕ　　ＡｌａＨｉｓ　　Ｓｅｒ　
　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　　ＬｙｓＮｅｔ　　Ａｒｇ Ｎｅｔ　　Ｔｈｒ Ｎｅｔ　　５ｅｔ Ｎｅｔ　　Ｐｒ。

Ｍｅｔ　　Ｇｌｎ Ｍｅｔ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓなし Ｓｅｒ　’Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ本発明の最終目
的物質は遺伝子組換技術によって生産することができる
。従って本発明組換リンホトキシン誘導体をコードする
ｃＤＮ＾、該ｃＤＮ＾を外来遺伝子として含み、かつ選
択した宿主内で制禦および発現が可能となるように連続
して得られた発現プラスミドはいずれも本発明の最終目
的物質の生産のために必要な中間物質であり、同一の課
題を解決する意味において発明としては共に一体となる
ことができる。発現プラスミドの具体例として、ｐＥＨ
６０８４，ｐ８Ｈ７０８４゜ｐｔ！Ｈ８０８４，ｐＢＲ
Ｄ８Ｇ５Ｇ、　ｐＢＨ５０５０によって識別表示される
プラスミドを挙げることができ、これらはいずれも後記
実施例において示される。また発現プラスミドによって
形質転換された宿主もｃＤＮ＾および発現プラスミドと
同様に発明としては共に一体となることができ、宿主と
しては大腸菌や動物細胞、とりわけＢＨに細胞が使用さ
れる。形質転換した大腸菌の例として、ＪＭ８３−ｐＢ
Ｈ６０８４、ＪＭ８３−ｐＨ）１７０８４．　ＪＭ８３
−ｐＢＨ８０８４，ＲＲＩ−ｐＢＲＤ８０５０によって
識別表示される大腸菌を挙げることができ、これらはい
ずれもそれぞれ後記実施例において示され、かつそれぞ
れの表示をもって微工研に寄託されている。各受託番号
は上記順序に対応してＦＥＲＭ　Ｐ−１００４１，同Ｐ
−１００４０，同Ｐ−１００４２，同Ｐ−１０２５３で
ある。

最終目的物質である本発明組換リンホトキシン誘導体は
天然リンホトキシンが変異したものであるにもかかわら
ず、後記実験例によって示されるごとく天然リンホトキ
シンの活性、すなわち抗腫瘍活性を天然リンホトキシン
と同程度およびそれ以上に有している。従って天然リン
ホトキシンが医薬組成物の必須の有効成分となって、そ
の活性を利用する医療目的に提供されるのと同様に、本
発明組換リンホトキシン誘導体もその活性を利用する治
療目的のための医薬組成物の必須の有効成分となること
ができる。

後記実験例によって示されるごとく、本発明組換リンホ
トキシン誘導体の例えばヒト肺癌由来細胞（ＰＣ−１０
）に対する活性は天然リンホトキシンのそれに比べて５
０〜８０倍大きい。

この場合に該医薬組成物は主として注射剤であり、静脈
内投与される。注射剤として製造されるためには、微量
生理活性物質を注射剤とするときの常法に従っておこな
えばよい。従って例えば本発明組換リンホトキシン誘導
体を単独あるいは適当な賦形剤、溶解剤と共に水溶液と
し、無菌濾過して充填し、凍結乾燥し、他方溶解用水溶
液を添付して用時溶解型注射剤とすればよい。

方　　法 本発明物質の製造方法および測定方法について説明する
。

まず、本発明物質を製造するために必要なリンホカイン
のｃＤＮＡライブラリーは適当な細胞からｍＲＮＡを取
り出し、発現系においてリンホトキシン活性を示すもの
をスクリーニング、逆転写し、適当なプラスミドとして
大腸菌を形質転換して得られる（ネイチャー、Ｊムエ７
２１−７２４゜１９８４　（Ｎａｔｕｒｅ、　３１２．
７２１−７２４．１９８４））　、例えば後記実施例に
示されるごと（Ｄａｕｄｉ細胞からｍＲＮＡを分画し、
アフリカッメガエルの卵母細胞に注入し、その培養上清
についてリンホトキシン活盤を測定して、目的のｍＲＮ
Ａをスクリーニングし、得られたｍＲＮ＾を常法により
逆転写し、得られたＤＮＡから常法によりプラスミドを
調製し、大腸菌Ｘ１７７６株を形質転換すればよい。

なお、Ｄａｕｄ　ｉ細胞は人の８ｕｒｋｉｔｔ　ｌｙｍ
ｐｈｏｍａであり、ＡＴＣＣＣＣＬ　２１３として一般
に入手することができる（キャンサー　リヤ。且、　１
３００−１３１０゜１９６８　（Ｃａｎｃｅ　Ｒｅｓ、
　２８　、１３００−１３１０．１９６８）　）。

次にｃＤＮＡライブラリーからリンホトキシンをコード
するｃＤＮＡを含むプラスミドをコロニーハイブリダイ
ゼーションによって選別する。コロニーハイブリダイゼ
ーションはＷａｌｌａＣｅの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　９．８７９．１９８１）に準じ
て行い、プローブとしてリンホトキシンのＣ端の８個の
アミノ酸配列に対応する下記ＤＮＡを合成し、精製して
使用する。

ＧＴＣＴＴＣＴＴＴ　　　ＧＧＡ　　　ＧＣＣＴＴＣＧ
Ｃ丁　　ＣＴＧ陽性コロニーについてプラスミドを調製
し、塩基配列を決定し、リンホトキシンのｃＤＮＡを含
むプラスミドを選別すればよい。

次にリンホトキシンのｃＤＮＡを含むプラスミドから本
発明組換リンホトキシン誘導体をコードするＤＮＡを得
るには公知の遺伝子組換操作を適宜組み合わせて行えば
よい。本発明ではもっばら特定位置のアミノ酸配列を除
去および特定位置のアミノ酸の置換が行われる関係で特
にＺｏｌｌｅｒａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈの部位特異的変異誘
発（ｓｉｔｅ−ｄｉ−ｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅ
ｓｉｓ）を利用することができる。

すなわち、リンホトキシンのｃＤＮＡをＭ１３の如きフ
ァージベクターに組み込み、その結果得られる二本鎖Ｍ
１３　ＤＮＡで形質転換した大腸菌の培養液から一本鎖
ＤＮＡを用意し、これに所定の合成オリゴヌクレオチド
をブライマーとしてアニーニングし、変異を誘発すれば
よい。部位特異的変異誘発を行った後は、得られた反応
液で大腸菌を形質転換し、これを培養して得られるプラ
ークについて放射標識した合成オリゴヌクレオチドをハ
イブリッドしてスクリーニングすれば、目的物質をコー
ドする所定のｃＤＮＡを外来遺伝子として含む二本鎖Ｍ
１３ファージＤＮＡを得ることができる。必要により該
ファージＤＮＡから所定のｃＤＮＡを切り出し、これを
宿主に応じて使用される適当な発現ベクターに連結する
ことは常法に従って適宜行えばよい。

なお、発現ベクターとしては市販の発現ベクター、例え
ばＩ）ＫＫ　２３３−２．　ｐＵｃ　１２．　ｐＵｃ　
１ｇ（７ｙルマシ７）　、　ＰＵＧ　１３０．　ＰＩＧ
　１３１．　（Ｍ１３ｔｇ１３０．１３１のポリリンカ
一部位をｐｕｃ　１２．１３に置き換えたプラスミド）
を使用すればよいが、以下に示すように所要のプロモー
ター右よびターミネータ−を選定して連結し、特別の発
現ベクターを用意して、これを使用してもよい。すなわ
ち、一般に哺乳動物由来の遺伝子を大腸菌、酵母、動物
細胞の中で発現させるためには蛋白合成開始シグナルで
あるＡＴＧ　（Ｍｅｔ）の上流にプロモーターを配し、
蛋白合成終止コドン（ＴＡＡ。

ＴＧ＾、　ＴＡＧ）の下流にターミネータ−を連結させ
なげればならない。プロモーターとしては大腸菌ではｌ
ａｃ、　ｔｒｐ、　ｔａｃ、　ｔｒｃ、　ｓａｃ、　Ｐ
Ｌ等が、酵母ではａ　−ｆａｃｔｏｒ、　ＴＰｌ、　ｓ
ｕｃ、　ＧＡＬ、　ＰＧＩ等が、そして動物細胞ではメ
タロチオネイン、ＳＶ　４０ｅａｒｌｙ　５ＬＴＲ等が
通常使用される。特に大腸菌で効率よく遺伝子を発現さ
せるためにはプロモーター、シャインダルガーノ配列（
ＳＯ配列）およびＡＴＧを正確に連結し、しかもＳＯ配
列からＡＴＧに至るまでの塩基数を至適に選定する必要
がある。こうした点を配慮して、後記実施例では大腸菌
発現ベクターとしてｔｒｃプロモーター、ＳＤ配列およ
びＡＴＧをこの順序に連結し、しかもＳＯ配列から塩基
数で１１個だけ下流にＡＴＧが来るように調整し、さら
にＡＴＧの直前にＢｇｌ　ｌｌ５ｉｔｅが挿入されるよ
うに構築したものを用意し、これを使用している。

以上の製造プロセスの中間段階で利用される個々の遺伝
子組換操作はほとんどが公知であるので、文献あるいは
簡単な記述によって以下に説明する。

制限酵素によるプラスミドの切断および切断して得られ
るＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動またはポリアク
リルアミドゲル電気泳動による分離と回収と結合につい
ては、マニアナイス。

ティー、エタール０．モレキニラークローニング、ア　
ラボラトリ−マニニアル、コールドスプリング　バーバ
ーラボラトリ−１９８２（Ｍａｎｉａｔｉｓ。

Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ
ｔｎｇ、　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、　
Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ　１９８２）の記述が参照される。

例えば天然リンホカインをコードするｃＤＮＡを含むプ
ラスミドおよびＭ１３ファージベクターを各々切断し、
断片を結合してｃＤＮＡの組込まれた二本鎖Ｍ１３　Ｄ
ＮＡを得る場合に応用される。

プラスミドの大腸菌への形質転換は、ＤＮＡクローニン
グ第１巻第６章デイ−、エム、グロバー編、アイアール
エル　　プレス１９８５　（ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇＶ
ａｔ、ｌ　、　Ｃｈａｐ、　　５．　ｅｄ、ＤｌＭ、Ｇ
ｌｏｖｅｒ　ＩＲＬ　ｐｒｅｓｓ１９８５）に従えばよ
い。

例えば天然リンホカインをコードするｃＤＮＡの組込ま
れた二本鎖Ｍ１３　ＤＮＡあるいは変異リンホカインを
コードするｃＤＮＡの組込まれた発現プラスミドを大腸
菌への形質転換に供するときに応用される。

変異誘発用およびスクリーニング用のオリゴヌクレオチ
ドのｐｈｏｓｐｈｏａｍ　ｉｄ　ｉｔｅ法による合成お
よび５”末端の標識はそれぞれ、ニス、エル、ビューケ
ージ、エタノール０．：テトラヘドロンレツ）、、　　
２２　１８５９．　　（１９８１）　　（Ｓ、Ｌ、Ｂｅ
ａｕｃａｇｅ、　　ｅｔａｌ、。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、、　　２２１８５
９　（１９８１））およびニー　マキサム　アンド　タ
フり也キルバード、メソッズ　イン　エンチモロジー、
６５巻４９９−５６０頁　アカデミツクプレス１９８０
　（Ａ。

Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｗ、Ｇ１１ｂｅｒｔ、　Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎ　Ｂｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。

Ｖｏｌ、６５　ｐ４９９−５６０　Ａｃａｄｅｍｉｃ　
Ｐｒｅｓｓ　１９８０）によればよい。

ＤＮＡ塩基配列の決定は、エフ、サンガー　エタール０
．ピー、エヌ、ニー、ニス、　　７４５４６３゜１９７
７　（Ｆ、　Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐ、Ｎ、
Ａ、Ｓ　７４５４６３゜１９７７）に従いｄｉｄｅｏｘ
ｙ法により行えばよい。

例えば変異誘発し、スクリーニングした一本鎖Ｍ１３　
ＤＮＡについて塩基配列を決定し、目的とする変異が誘
発されているか否かを確認する場合に応用される。

二本鎖および一本鎖のＭ１３　ファージ［］ＮＡは以下
のように調製される。

すなわち、形質転換した大腸菌を、ジエーメッシング、
メソッズ　イン　エンチモロジ−１０１、２０−７８１
９８３（ＪｏＭｅｓｓｉｎｇ、　Ｍｅｔｈｏｄ　ｒｎＥ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１０１．２０−７８１９８３）に
記載の方法により培養し、さらに振盪培養し、遠心分離
する。

沈澱部の大腸菌からは、マニアテイス、ティーエタール
０．モレキュラークローニンク、アラポラトリーマニュ
アル、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−１９８
２（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ｅｔ　ａｌ、。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９８２）に
記載の方法により二本鎖Ｍ１３　ＤＮＡを得る。また上
澄液からは、その１．３ｍｊ！に２６０　ｕｅの２．５
Ｍ　ＮａＣ１−２０％ＰＢＧ６０００混合溶液を加え、
混合物をエツペンドルフミクロチューブで遠心分離し、
得られるペレットを１２０７７１の１０ｍＭ　）リス塩
酸緩衝液（ｐＨ７，９，０，１ｍＭ　ＢＤＴＡ）に懸濁
し、フェノール抽出し、エタノールで沈澱させ、７０％
エタノールで洗浄し０、乾燥後３０ｉｉｅのｌＱｍＭ　
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，９，０，１ｍＭ　ＢＤＴＡ
）に再び懸濁して一本鎖Ｍ１３　ＤＮＡを得る。

部位特異的変異誘発反応は、シラー　アンドスミス、メ
ンツズ　インエンチモロシ−１００４６８−５００，１
９８３（Ｚｏｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｍｅｔ
ｈｏｄｓｉｎ　　Ｂｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１０ｔ）　
　４６８−５００．１９８３）に従って行われる。

すなわち非放射性リン酸で末端標識した変異誘発用合成
オリゴヌクレオチド（ブライマー）２Ｑｐ　ｍｏｌ　に
−本領Ｍ１３　ＤＮＡ　ｌμｇ、アニーリング用緩衝液
（５ＱｍＭ　）リス塩酸、　ｐ）１８．０．０．２５ｍ
ＭＭｇＣ１，）　２μｅ、　Ｂ緩衝液（０，２Ｍ　）リ
ス塩酸、ｐＨ７，５，０，ＩＭ　ＭｇＣｌ□、０．１Ｍ
ジチオスレイトール）８／ｊｆ、　ｄＡＴＰ、　ｄＧＴ
Ｐ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰ各２．５ｍＭずつの混合物
４ｐｅ、　　５ｍＭ　ｒＡＴＰ　２ｔｔｌ、蒸溜水１μ
ｇ、Ｔ＊ＤＮＡ　リガーゼ５単位、ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ　Ｋｌｅｎｏｗフラグメント５単位を加え、最終全液
量を２０μｅとして１４℃３時間反応させる。

次に反応混合液を用いて変異誘発を受けたＤＮＡで大腸
菌を形質転換するためには、クレーマー　二タール、、
セル３８８７９−８８７．１９８４（にｒａｍｅｒｅｔ
　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　３８８７９−８８７．１９８４
　）に従って行い、さらにグルンスタイン　アンドホグ
ネス。

ビー、エヌ、ニー、ニス、ニーニスニー　７２３９６１
、１９７５　（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｈｏｇｎ
ｅｓｓ、Ｐ、Ｎ、＾、Ｓ。

ＵＳＡ　７２３９６１．１９７５）に従って形質転換し
た大腸菌を大腸菌ＪＭ　１０３とまぜて寒天培地上に拡
げ、３７℃で一夜培養し、形成するプラークをニトロセ
ルロースフィルター上に写シトる。

ニトロセルロースフィルター上に写しとったプラークに
ついてのスクリーニングは以下のように行う。

ニトロセルロースフィルター上６　倍（７）ＳＳＣ（１
倍のＳＳＣは１５０ｍＭ　ＮａＣ１，１５ｍＭクエン酸
ナトリウム）、１０倍のＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　（１倍
のＤｅｎｈａｒｄｔ’　ｓは０．０２％ポリビニルピロ
リドン、０．０２％フィコール、０．０２％ウシ血清ア
ルブミン）、５０μｇ超音波処理サケ精子ＤＮＡの中に
加えて６５℃３時間処理し、予備ハイブリッドを形成さ
せる。次いでフィルターを放射標識した変異誘発用合成
オリゴヌクレオチドと同一゛緩衝液条件下で混合し６５
℃で一夜放匿してハイブリッドを形成させる。

フィルターを６倍のＳＳＣで洗浄し、水分をきった後、
増感スクリーンを重ね、Ｘ線フィルムに露出して目的の
プラークを選串する。

変異リンホカインをコードするｃＤＮＡを二重鎖Ｍ１３
０ＮＡから切り出し、これを発現ベクターに連結して得
られる発現プラスミドは宿主に応じてそれぞれ形質転換
に使用すればよいが、例えばＢＨＫ細胞の形質転換のた
めには、ロイターエタール。ｌピー　エヌ、ニー、ニス
、ニーニスニー、　７９４２２．１９８２　（Ｌｏｙｔ
ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ。

ＵＳＡ、　７９４２２．１９８２）に従ってＬｏｙｔｅ
ｒらの方法により行えばよい。すなわち、得られた発現
プラスミドを例えばｐＳＶ２−ｄｈｆｒと共にａｕＫｓ
？Ｇ細胞株（ｔｓ、　ｔｋ−）に形質転換する。なおｐ
ＳＶ２−ｄｈｆｒについては、サブラマニ、エタール：
モル、セル、バイオｏ、　　１８５４−８６４．　　（
１９８１）　　（Ｓａｂｒａｍａｎｉ。

ｅｔ　ａｌ：　Ｍｏｌ、　Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　１８
５４−８６４．　　（１９８１））が参照される。

クローニングは限界希釈法（ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ｄｉｌ
ｕｔｌｏｎ法）を利用して以下のごとく行うことができ
る。

形質転換の数日後より２００ｎＭ　Ａｍｅｔｈｏｐｔｅ
ｒｉｎ含有ダルベコ変法イーグル培地（ダルベコ変法イ
ーグル培地、ブドウ糖３．５％、炭酸水素ナトリウム７
．５％、牛胎児血清（ＦＣＳ）　５％、トラネキサム酸
３ｍＭ、グルタミン２ｍＭ、　（＋）　−Ａｍｅｔｈｏ
ｐｔｅｒｉｎ２００ｎＭ）で２〜３日毎に１〜２週培地
交換しながら限界希釈して産生株を得る。次に産生株を
ローラーボトルに用意した２００ｎＭ　Ａｍｅｔｈｏｐ
ｔｅｒｉｎ含有ダブルベコ変法イーグル培地３００ｄに
接種し、３７℃で培養し、培養開始より３〜４日後より
毎日３〜４週間同量の培地で培地交換し、培養上清を集
めればよい。

後記実施例では大腸菌ＪＷ８３を使用し、振盪培養した
後に菌体を破砕し、上滑両分を集めた。

精製はゲル濾過、色素吸着クロマトグラフィー、高速液
体クロマトグラフィー等を適宜組み合わせ、分画しリン
ホトキシン活性によって所要の両分を得ればよい。

リンホトキシン活性、すなわちリンホトキシンの抗腫瘍
作用活性は次の如（行う。

インジケーター細胞として例えばマウス線維芽細胞株Ｌ
　ｃｅｌｌの亜株であってリンホトキシンに対する感受
性の高いＬＰ３Ｐ２Ｏ３用し、これに試料ふよび最終濃
度１μｇ／ｗｄｌのアクチノマイシンＤを加え、Ｃ（ｂ
気流下で３７℃１２−１８時間培養する。ここで培地は
１０％非働化中胎児血清を含むＲＰＭＩ　１６４０を使
用する。培養終了後死細胞を洗浄除去し、付着残存して
いる生細胞を０．５％クリスタルバイオレット（メタノ
ール：水＝１＝４）液で固定染色する。染色された細胞
より色素を抽出し、その吸光値を測定して生細胞の数を
判定する。タイターはＬＰ３Ｐ２Ｏ３０％１ｙｓｉｓを
与えるときの試料希釈度によって表示する。なお、この
値は試料を加えたときのＬＰ３Ｐ２Ｏ３殖相によって変
化するので、常にリンホトキシン標準力価試料を対照に
用いて、補正をする必要がある。

無血清培地（ＤＭ−１５３培地）で継代している対数増
殖期のＬＰ３細胞を用いて上記のアッセイを行うとき２
４時間後に５０％１ｙｓｉｓを起こすＬＴの活性濃度を
１０／ｍｌと定義する。

ヒト悪性腫瘍細胞株に対するＬＴの細胞障害、増殖抑制
試験は以下の如く行う。

各種ヒト癌細胞株を０．５〜ｌ　ｘｌＱ’ｗｅｌｌの密
度で９５ｗｅｌｌミクロタイタープレートに添加しミ１
晩培養後、ＬＴ試料を含む培地を添加する。その後約−
週間湿潤、ＣＯ□存在下で培養する。生存細胞は前記の
方法と同様Ｃｒｙｓｔａｌ　　ｖｉｏｌｅｔの抽出によ
り判定する。

別法として、０．１μｇ　／ｍｌのアクチノマイシンＤ
を共存させて＾５ｓａｙすることも可能である。

その場合、細胞株を２〜５　Ｘ　１０’／ｗｅｌｌの密
度で添加し、ＬＴ試料およびアクチノマイシンＤを添加
し、１２〜１５時間で生細胞数を判定する。

エンザイム　イムノアッセイ　（ＢＩＡ）による比活性
の推定は以下のように行う。ＬＴを免疫して得られたウ
サギ抗ヒトＬＴ抗体、もしくは免疫マウスの牌細胞より
細胞融合法により得られたハイブリドーマの産生ずるモ
ノクローナル、抗ヒ）ＬＴ抗体を用い、サンドイツチ法
により試料中のＬＴＯ量を推定する。すなわち、プラス
チック製ｗｅｌｌに抗ヒトＬＴ抗体（モノクローナルあ
るいはポリクローナル）を吸着させた後、ＬＴを添加し
結合させる。更に一次抗体とは認識部位の異なるモノク
ローナル抗体もしくはポリクローナル抗体を添加する。

この二次抗体は予めビチオンを結合させておいたものを
用いる。これにより、その後、西洋ワサビペルオキシダ
ーゼを結合したアビジンを添加すればアビジンと二次抗
体のビオチンの特異的反応により、ＬＴと結合した二次
抗体の量に比例してペルオキシダーゼがｗｅｌｌに固定
される。ここに、例えばオルトフェニレンジアミン及び
過酸化水素の如き、基質を添加すれば、ペルオキシダー
ゼにより定量的に発色がみられ、その吸光度より試料中
のＬＴ濃度を推定できる。すなわち、未知量のＬＴを含
む試料と、予め精製しアミノ酸分析により決定した含有
濃度既知のＬＴのＢＩＡ値を比較すればよい。

また、前者の抗腫瘍活性をＬ−Ｐ３細胞をインジケータ
ーとして前記の如く調べれば、その比活性が求まる。

〔実　施　例〕

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。

実施例１ ｍＲＮＡの調整 Ｄａｕｄ　ｉ細胞２　ＸＩＯ’個を４Ｍグアニジウムチ
オシアネー）、０．５％Ｎ−ラウロイルザルコシンナト
リウム、　２５ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ７，０，０
，１Ｍメルカプトエタノール、０．１％アンチホルム（
シグマ）溶液１０ｍ１に懸濁させ、ポリトロンによりホ
モジナイズした。このホモジネートを０、　ＩＭ　ＢＤ
ＴＡを含む５．７Ｍセシウムクロライド水溶液上に重層
し、超遠心分離機（ＳＲＰ２８Ａローター日立）を用い
２６００Ｏｒｐｍで２０℃下２３ｈｒ遠心分離した。沈
澱したＲＮＡを１０ｍＭ　）リス塩酸ｐＨ７，４１０−
に溶解した後２．５倍量のエタノールを加え、−７０℃
下１時間放置した。次に、遠心により沈澱させたＲＮＡ
を１０ｍＭ　）リス塩酸ｐＨ７，４１４１ｎｌに溶解し
、４Ｍ塩化カリウム２１ｎｌをさらに加えた。このＲＮ
Ａ溶液をオリゴ（Ｔ）セルロースカラム（φ２ｘ１５ｃ
ｍ）に付し、０．５Ｍ塩化カリウム、１０ｍＭ　）リス
塩酸ｐ）１７．４で十分に洗浄後、１０ｍＭ　）リス塩
酸ｐＨ７，４水溶液でｍＲＮＡを溶出させた。

ｍＲＮＡの精製 口ａｕｄ　ｉ細胞由来ｍＲＮＡ　５００μｇを５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ）ＩｃＩ　ｐＨ７，４、０，２ＭＮａＣ１，１
ｍＭ　ＩＥＤＴＡを含む１０％から２８％５ｕｃｒｏｓ
ｅ濃度勾配を形成させた溶液１５ｍ１に重層し、超遠心
分離機（ＳＲＰ２８Ａローター、日立）を用い２６００
Ｏｒｐｍで２０℃下１（３ｈｒ遠心した。次に５００μ
εずつ分画し各分画にエタノールを加えｍＲＮＡを沈澱
させた。各分画ｍＲＮＡは滅菌水で溶解し、ｍＲＮＡ濃
度１μｇ／μ２に調整した。

ｍＲＮＡのスクリーニング アフリカッメガエルの雌（生後１年以上のもの）に血清
性性腺刺激ホルモン（ビーメックス：三共）を２００ｕ
注射した。−晩経過後、卵母細胞を取り出し、ｍｏｄｉ
ｆｉｅｄ　ｂａｒｔｈ　５ａｌｉｎｅ　ｍｅｄｉｕｍ（
ＭＢＳ）中に保存した。次に先のｍＲＮＡの各分画５０
〜１１００ｎ／ｅｇｇを卵に注入し、１ｍＭ　ｐｈｅｎ
ｙｌ　ｍｅｔｈ−ｙｌ　５ｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒ
ｉｄｅ　（ＰＭＳＦ）を含むＭＢＳ中で２５℃、　３６
ｈｒ培養した。上清を除去した後、卵母細胞をホモジネ
ートし、１ｍＭＰＭＳＦ含有ＭＢＳで抽出し、ｍＲＮＡ
の各両分ごとの試料とした。各試料についてリンホトキ
シン活性を測定し、リンホトキシン活性を示すｍＲＮＡ
の両分をスクリーニングした。

ｃＤＮＡライブラリーの作成 アフリカッメガエルの卵母細胞によるｍＲＮＡ発現系に
おいてリンホトキシン活性を示したｍＲＮＡ画分の５μ
ｇを５ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ　＋）８８．３７μｅに溶
解し、６５℃５分間１ｎｃｕｂａｔｅ　した後、ｐｃＤ
ＶＩ　ＤＮＡ　　（ファルマシア）１．４μｇを加え、
次の条件で反応を行った。５０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ　
ｐＨ８，３，８ｍＭ　ＭｇＣ１□、　３０ｍＭＫＣｌ、
Ｑ、３ｍＭ　ＤＴＴ、２ｍＭ　ｄＮＴＰ、　ｒｅｖｅｒ
ｓｅｔｒａｎｓｃｒｌｐｔｅａｓｅ５１、反応液量２０
μｅ０ ３７℃で６０分間反応を行った後、０．２５Ｍ　ＥＤＴ
Ａ　２μｉを加え反応を止めた。フェノールクロロホル
ム処理を行った後、４Ｍ　ＮＨ，ＯＡｃ　２０μｍ、　
１ＥｔＯＨ８０μ２を加え、−７０℃で放置し、次に遠
心して上清を除いた後、同様の操作を繰り返した。７５
％ＥｔＯ）１水で沈澱を洗浄し乾燥した後、ｌＱｍＭ　
ｓｏｄｉｕｍｃａｃｏｄｙｌａｔｅ、　２．５ｍＭ　Ｈ
３ＰＢ５　ｐＨ７，６、０，１ｍＭ　ｄＣＴＰ。

ｐｏｌｙ（Ａ）　０．２　ｐｇ／ｐ（ｌの反応液に調整
し、ｔｅｒｍｉｎａｌｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙ
ｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　（ＴｄＴ）１００を加え
、最終的に２０μｌとした。３７℃で１０分間反応を行
った後、０．２５Ｍ　ＢＤＴＡ　１μｅを加え反応を止
め、以下常法に従い後処理を行った。

得られたＤＮＡの沈澱を８ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、　　６ｍ
ＭメＪｌ／カプトエタノール、　）ｌｉｎｄＩＩｌｌｏ
Ｕを含有する１０ｍＭＴｒｉｓ　ＨＣＩ　ｐＨ７，４溶
液１１μ２に溶解し、３７℃で２ｈｒ反応させた。０．
２５Ｍ　ＢＤＴＡ　１μｌを加え、反応を止めた後、常
法に従い後処理を行い、１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣＩ　ｐ
）１７．４．１ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液１ｉｐｅおよびＢｔ
Ｏ）１３／Ｊｆの混合溶液に溶解させた。

次に、ＤＮＡ含有溶液１１μ２にｐＬ−ＩＤＮＡ（ファ
ルマシア）　７７ｎｇを加え１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ
　ｐＨ７，４，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．１Ｍ　ＮａＣ
１溶液１２０　ｐｅとした。６５℃で５分間、４２℃で
３０分間放置した後、水冷下、次の成分を加え液量を１
．２ｍＭとした。２０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣＩ　ｐ）！７
．５　、　４ｍＭ　ＭｇＣ１ｇ、　１０ｍＭ（ＮＨａ）
２ｓＯ＊、　０．１ＭＫＣｌ、　０．１ｍＭβ−ＮＡ０
．５ＯＡ１ｇ／ｍ１Ｂｏｖｉｎｅ　ＳｅｒｕｍＡｌｂｕ
ｍｉｎ　、　Ｉｌ！、ｃｏｌｉ　ｌｉｇａｓｅ　　１ｇ
ｇ１２℃で一晩反応を行った後、４ｍＭ　ｄＮＴＰ　１
０．ｃ＋Ｌ２０ｍＭβ−ＮＡＤ　ｌ０ｐｅ、　Ｂ、ｃｏ
ｌｉ　Ｉｉｇａｓｅ　ｌ　ｐｇ、　Ｂ。

ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　　Ｉ　　１
７．５［１，ＲＮａｓｅ　Ｈ１２００を加え、１２℃で
ｌｈｒ、２５℃でさらにｌｈｒ反応を行った後、この溶
液を用いε、ｃｏｌｉχ１７７６株を形質転換させた。

すなわち、ε、ｃｏｌｉ　ｚ　１７７６株をｚ１７７６
　ｍｅｄｉｕｍ（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ）中、３７℃で吸光
度（５５０ｎｍ）が０．２となるまで培養した後、集菌
し以下Ｍａｎｉａｔｉｓ等の方法でｃｏｍｐｉｔｅｎｔ
ｃｅｌｌを調整した。このｃｏｍｐｉｔｅｎｔ　ｃｅｌ
ｌに先のＤＮＡを加えた後、Ｅ、ｃｏｌ　ｉ　Ｚ　１７
７６株をｔｒａｎｓｆｏｒｍ　Ｌ／てｃＤＮＡライブラ
リーを作成した。

ｃＤＮＡのスクリーニング 前項で得られたｃＤＮＡライブラリーの中、から、リン
ホトキシンをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを選
別するため、リンホトキシンのＣ端８アミノ酸に対応す
るＤＮＡを合成しこれをプローブとしてコロニーハイブ
リダイゼーションを行った。

合成プローブの構造はＧＴＣＴＴＣＴＴＴ　ＧＧＡ　Ｇ
ＣＣＴＴＣＧＣＴ　ＣＴＧであり、自動固相合成機（ア
プライドバイオシステムズ社）により合成した後、ＨＰ
ＬＣにより精製した。ハイブリダイゼーションはＷａｌ
ｌａｃｅ等の方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
ｓ、　９８７９、　１９８１）に準じて行った。ｃＤＮ
Ａライブラリーの約ｌＯ万個のうち６０個が陽性コロニ
ーであり、その中の３コロニーのプラスミドを調整し、
塩基配列を決定したところ、１個がリンホトキシンｃＤ
Ｎ＾を含むプラスミドであった。得られたリンホトキシ
ンｃＤＮＡのアミノ酸コーディング領域の塩基配列を図
１に示す。

発現ベクターの構築 前項で得たリンホトキシンｃＤＮＡを含むプラスミドを
ＢａｍＨｌで消化し、リンホトキシンＣ口ＮＡを含む約
１．１ｋｂｐのフラグメントをｐ［ｌＧ１３１　（ｐｔ
ｌｃ１３（７７ルアシア）のｐｏｌｙ　ｌｌｎｋｅｒ部
分をＭ１３ｔｇ１３１（アマジャム）のｐｏｌｙ　ｌｌ
ｎｋｅｒ部分と入れ換えたプラスミド）のＢａｍＨＩ　
５ｉｔｅへ挿入した後（プラスミド番号ｐＭＬＴ２００
０）　、ＨｉｎｃｆｆおよびＢａＩＩで消化して約１１
ＫｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。次に、ｐＫＫ２３
３−２　　（ファルマシア）をＮｃ。

ｎ消化した後にＫｌｅｎｏｗ酵素処理したベクターへ先
の１．　ＩＫｂｐフラグメントを挿入した（プラスミド
番号ｐＭＬＴ２１００）　、　ｐＫＫ２３３−２はｔｒ
ｃプロモーター（ｔａｃプロモーターを改良したもの）
を有し、ＩＰＴＧにより誘導発現が可能である。次にｐ
ＨＬＴ２１００をＢｃｏＲｌおよび旧ｎｄｒｆｌで消化
し、リンホトキシンｃＤＮＡを含む約１．５ｋｂｐフラ
グメントをＡ１１３ｍｐ１０二本鎖ＤＮＡ　　（ファル
マシア）へ挿入した。

次に、ε、　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０３にｔｒａｎｓｆｅｃ
ｔｉｏｎ　Ｉ、た後、−本鎖ＤＮＡを常法に従って調整
し、以下に示す合成オリゴヌクレオチドを用いてｉｎ　
ｖｉｔｒ。

ｍｕｔａｇｅｎｅｓＩｓを行った。

合成ＯＮ＾　：　ＧＣＴ　ＴＧＣＴＧＧ　ＧＡＴ　Ｃｌ
１ｌ’Ａ　ＴＧＡ　ＧＡＴ　［”ＴＧＴＴＴ　ＣＣＴ 部位特異的な変異誘発反応は基本的にＺｏｌ　ｌｅｒ等
の方法（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｂｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　
１００４６８．１９８３）に従って行った。すなわち、
非放射性リン酸で末端標識した前記合成オリゴヌクレオ
チド２０ｐｍｏｌ　に１　ｐｇの鋳型ＤＮＡ　　（−木
調ＤＮＡ）、　　２／ｊ／の５ｘａｎｎｅａｌｉｎｇ　
ｂｕｆｆｅｒ　（５０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ、　ｐ）１
８．０　。

２５ｍＭ　ＭｇＣｌｇ）　、８ｐｌのＢ　ｂｕｆｆｅｒ
　（０，２Ｍ　ＴｒｉｓｆｌＣ１ｐＨ７，５，０，１Ｍ
　ＭｇＣｌ２．　０．１Ｍ　ＤＴＴ）　　、４ｐｅの２
．５ｍＭ　ｄＮＴＰ　、　２ｐＨの５ｍＭ　ＡＴＰｌｌ
ｐｅの蒸留水、５υのＴ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ　、
　　５１　の口ＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ＩＫｌｅ
ｎｏｗフラグメントを加え全量を２０ｐｇとした。

１４℃で３ｈｒ反応を行った後、Ｂ、　ｃｏｌｉ　ＪＭ
１０３をｔｒａｎｓｆｏｒｍ　シた（にｒａｍｅｒ等、
Ｃｅ１ｌ　３８８７９．１９８４＞。

形質転換した細菌をＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０３とまぜ寒
天培地上に広げ３７℃で一晩培養し、形成されたプラー
クをニトロセルロース上に写しとった（Ｇｒｕｎｓｔｅ
ｉｎ　ｅｔ　ａｌ　ＰＮＡＳ　７２３９６１．１９７５
）。次に３２ｐでラベルした合成オリゴヌクレオチドと
ハイブリダイゼーション試験を行い変異を誘発されたフ
ァージプラークを選別した。以上のようにして選びだし
たファージプラークより二本鎖ＤＮＡを調整し、Ｂｃｏ
Ｒｌおよび旧ｎｄＩＩＩで消化して得たＤＮＡフラグメ
ントをｐＫＫ２３３−２のｆＥｃｏＲｌおよびＨｉｎｄ
ｌｌｌ消化で調整したプラスミドへ挿入したくプラスミ
ド番号ｐＭＬＴ３０２０　）。

ｐＭＬＴ３０２０は、ｔｒｃプロモーターの５ｈｉｎｅ
　−Ｄａｒｇａｒｏ配列より１１ヌクレオチド下流のＡ
ＴＧより蛋白合成が開始するとともに、ＢｇＩ　　ｎ消
化によりプロモーターの下流に任意の遺伝子を挿入可能
であり、ＢａｍＨＩ消化すれば開始コドンであるＡＴＧ
の下流に遺伝子が挿入可能となる発現ベクターである。

ｐＭＬＴ３０２０は本発明ポリペプチドのＮ１（２末端
より７アミノ酸残基を欠失したポリペプチドをコードし
ており、ＮＨ２末端周辺のＯＮ＾配列を示すと次の如く
になる。

なお、ｐＭＬＴ３０２０の構築工程図を図２に示す。

ｐＭＬＴ３０２０をＢａｍ）１１および旧ｎｄｎＩで消
化し約５００ｂｐのＤＮＡフラグメントをアガロースゲ
ル電気泳動で回収した。また、下記に示すオリゴヌクレ
オチドを合成し、ポリヌクレオチド　キナーゼ（ＮＥＢ
）、ＡＴＰにより５”末端をリン酸化した後、先の５０
０ｂｐ　ＤＮＡフラグメントと共にｐＵＧ１３０をＢｃ
ｏＲｌおよび旧ｎｄＩ［ｎ消化して得たベクターと酵素
的に連結させた（プラスミド番号ｐｔｌＧ５００１）。

５°　＾＾ＴＴＣＡＧＡＴＣＴＣＡＴＧＡＡＡ　　　　
　３’ＮＬＴ−５３°　　　ＧＴＣＴＡＧＡＧＴＡＣＴ
ＴＴＧＧＧＣＧＣ５°ＮＬＴ−６５°　ＣＣＣＧＣＧＧ
ＣＴＣＡＴＣＴＧＡＴ［：ＧＧＧ　　　３°ＮＬＴ−１
３°　　　　ＣＧＡＧＴＡＧＡＣＴＡＧＣＣＣＣＴＡＧ
　５’　ＮＬＴ−２反応停止後、常法に従いＥ、ｃｏｌ
ｉ　ＪＭ８３を形質転換し、Ｘ−Ｇａ１入り寒天プレー
上で白色コロニ−を選別した。次に、プラスミドｐＵＧ
５００１をＢｇｌ■および旧ｎｄＩＩＩで消化した後、
約５ｏｏｂｐ　ＤＮＡフラグメントをアガロース電気泳
動より回収し、ｐＭＬＴ３０２０をＢｇｌ　ＩＩおよび
ＨｉｎｄＩＩＩで消化して得た約４．１３ｋｂｐ　ＤＮ
Ａと合わせ酵素的に連結させた（プラスミド番号ｐＭＬ
Ｔ５００１＾）。

構築工程図を図３に示す。

プラスミドｐＵｃ１２をＢａｍＨｌおよびＰｓｔ　Ｉで
消化し約２．８ｋｂｐ　ＤＮＡフラグメントを得、５′
末端をリン酸化した下記合成りＮＡを酵素的に連結して
プラスミドｐＵｃ７６９２を得た。

ＢａｍＨＩ　　　　　　　　　　　　　　　Ａｃｃ　ｍ
５’　ＧＡＴＣＣＧＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＧＴ
ＴＴＴＣＴ　　　　　　３゜３’　　　ＧＣＡＧＡＴＧ
ＡＧＧＧＴＣＣＡＣＣＡＡＡＡＧＡＧＧＣＣ５“Ａｃｃ
　ｍ　　　　　　　　　　　　　　　　ｘｈｏ１５°Ｃ
ＣＧＧＡＡＡＡＧＣＴＴＡＣＴＣＴＣＣＧＡＡＣＧＣＴ
ＡＣＣ３’３°　　ＴＴＴＴＣＧＡＡＴＧＡＧＡＧＧＣ
ＴＴＧｒ：ＧＡＴＧＧＡＧＣＴ　　　５’ｘｈｏｌ　　
　　　　　　　　　　　　　　　Ｐｓｔ　Ｉ５’　ＴＣ
ＧＡＧＣＣＣＧＣＴＧＴＡＣＣＴＧＧＣＴＣＡＣＧＡＧ
ＧＴＣＣＴＧＣＡ　　３”３”　　ＣＧＧＧＣＧＡＣＡ
ＴＧＧＡＣＣＧＡＧＴＧＣＴＣＣＡＧＧ　　　　５゜プ
ラスミドｐＵｃ７６９２をＡ″ｃｃＩおよびＡｖａ　■
で消化後、７％ポリアクリルアミド電気泳動で約１００
ｂｐ　ＤＮＡフラグメントを回収し、プラスミドｐＭＬ
Ｔ５００１＾をＢｃｏＲｌおよびＡｃｃ　Ｉ消化、Ａｖ
ａ　ＩｆおよびＨｉｎｄＩ［［消化して得た各々約４５
０ｂｐ　、約３００ｂｐロＮＡ７５グメントとプラＸ　
ミ）’ｐＬＩＧ１３０ヲＢｃｏＲ１およびＨｉｎｄｌｎ
消化して得た約２．３ｋｂｐフラグメントと酵素的に連
結した（プラスミドｐε８５１２３）。

構築工程図を図４に示す。

プラスミドｐＥＨ５１２３を制限酵素Ａｃｃ　ｆｆｌ及
びＸｈｏ　１で切断した後、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ａ’
１ｋａｌｉｎ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅにより５°末端
脱リン酸基の除去を行った。次に、０．８％アガロース
ゲル電気泳動により約３．５ｋｂｐフラグメントを回収
し、５°末端のリン酸化した下記合成りＮＡと酵素的に
連結させた（プラスミド番号ｐＥ８６０８４）。

５°　ＣＣＧＧＡＧＣＴＡＣＣ３’ ３°　　　ＴＣＧ＾ＴＧＧＡＧＣＴ　　　　　　５”構
築工程図を図７に示す。

プラスミドｐＥＨ６０８４を制限酵素ＥｃｏＲ１及びＢ
ｇｌ　ＩＩで切断して得た約３００ｂｐフラグメントと
、５ａｃｌｌ及び旧ｎｄＩＩＩで切断して得た約５００
ｂｐフラグメントと、５°末端のリン酸化された下記合
成りＮＡとをプラスミドｐＵＧ１３０のＥｃｏＲｌ及び
ＨｉｎｄＩ［［サイトへ酵素的に挿入した（プラスミド
番号ｐＢＨ７０８４）。

５”　ＧＡＴＣＴＣＡＴＧＡＧＣＡＣＣＣＴＣＡＡＡＣ
ＣＣＧＣ３゜３“　　　＾ＧＴＡＣＴＣＧＴＧＧＧＡＧ
ＴＴＴＧＧＧ　　　５゜構築工程図を図８に示す。

実施例３ ｐＭＬＴ３０２０を［３ａｍＨＩおよび旧ｎｄＩ［［で
消化して得た約５００ｂｐのＤＮＡフラグメントを５°
末端をリン酸化した下記合成オリゴヌクレオチド並びに
ｐＵＧ１３０をＢｃｏＲｌおよび旧ｎｄｌＩＩ消化して
得たベクターと酵素的に連結させた（プラスミド番号ｐ
ＨＧ５００４）。

構築工程図を図５に示す。

５°　ＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴＣＡＴＧＣＧＴＣＧＴＣ
ＧＴＡＡＡ　　３゜ＮＬＴ−３ ３°　　　ＧＴＣＴＡＧＡＧＴＡＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡ
ＴＴＴＧＧＧＣＧｆ　　５゜ＮＬＴ−４ ５”　ＣＣＣＧＣＧＧＣＴＣＡＴＣＴＧＡＴＣＧＧＧ　
　　　３’ＮＬＴ−１３”　　　　　ＣＧＡＧＴＡＧＡ
ＣＴＡＧＣＣＣＣＴＡＧ　５’　　ＮＬＴ−２プラスミ
ドｐｕＧｓｏｏ４をＳａｃ　ＩＩおよび旧ｎｄＩＩＩテ
消化して得た約５４０ｂｐのＤＮＡフラグメント、５”
末端をリン酸化した下記合成オリゴヌクレオチド、プラ
スミドｐ［ＪＧ１３０をＢｃｏＲｌ　および旧ｎｄＩＩ
Ｉで消化して得た約２．３ｋｂｐのＤＮＡフラグメント
を酵素的に連結させた（プラスミド番号ｐＵＧ５０１１
）。

次に、プラスミドｐＵＧ５０１１をＢｇｌＩＩおよびＨ
ｉｎｄ■で消化して得た約５７０ｂｐのＤＮＡフラグメ
ントとプラスミドｐＭＬＴ３０２０をＢｇｌＩＩおよび
）ｌｉｎｄＩＩ［テ消化して得た約４．６ｋｈｐのＤＮ
Ａフラグメントを酵素的に連結させたくプラスミド番号
ｐＭＬＴ５０１１）。

構築工程図を図６に示す。

５°　ＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴＣＡＴＧＣＣＣＧＣ３’
ＮＬＴ−１５３°　　　ＧＴＣＴＡＧＡＧＴＡＣＧＧＧ
　　　　５’ＮＬＴ−１６プラスミドｐＥ！８７０８４
を制限酵素Ａｃｃ　Ｉ及びＨｉｎｄ■で切断した後、１
％アガロースゲル電気泳動により約４５０ｂｐのＤＮＡ
フラグメントを分取した。

同様にプラスミドｐＭＬＴ５０１１を制限酵素ＢｃｏＲ
１及びＡｃｃｌで切断して得た約４５０ｂｐ　ＤＮＡフ
ラグメントと前記フラグメントをプラスミドｐＵＧ１３
０のＢｃｏＲｌ及び旧ｎｄＩＩＩサイトへ酵素的に挿入
した（プラスミド番号ｐＢＨ８０８４）。

構築工程図を図９に示す。

実施例４ プラスミドｐＨ）１６０８４をＢｃｏＲｌ及びＰｓｔＩ
で切断して得た約５８０ｂｐ　ＤＮＡ断片、ｐＴＴ５０
０１をＰｓｔｌ及びＰｖｕｌで切断して得た約１７００
ｂｐ　ＤＮＡ断片、ｐＢＲ３２２ｄ−ｒｏｐをｔ！ｃｏ
Ｒ１及びｐｖｕｌで切断して得た約３１００ｈｐ　ＤＮ
Ａ断片の三者を酵素的に連結した（プラスミド番号ｐＢ
Ｒ０６０８４）。

次に、ｐＢＲＤ６０８４をＢｃｏＲｌ、　Ａｃｃｌ及び
ｐｖｕｌで切断して得た約１１００ｂｐ　ＤＮＡ断片と
ＰＢＨ８０３７をＢＣＯＲＩ及びＡＣＣＩで切断して得
た約４５０ｂｐ　ＤＮＡ断片、ｐＢＲ３２２ｄ−ｒｏｐ
を８ｃｏＲ１及びｐｖｕｌで切断して得た約３１００ｂ
ｐ　ＤＮＡ断片の三者を酵素的に連結した（プラスミド
番号ｐＢＲＤ８０５０）。

構築工程図を図１０に示す。

プラスミドｐＢ８７０８４を制限酵素＾ｃｃｌ及び旧ｎ
ｄｌ［［で切断し、約３００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。

またプラスミドｐＢＨ５０３７をＢｃｏＲｌ及びＡｃｃ
ｌで切断して約４５０ｂｐ　ＤＮＡ断片を得、先のＤＮ
Ａ断片と共に酵素的にプラスミドｐＵＧ１３０のＥ！ｃ
ｏＲ１，）ＩｉｎｄＩＩ［部位へ挿入したくプラスミド
番号ｐＢ）１５０５０）。

構築工程図を図１１に示す。

実施例６ プラスミドｐＥ）１６０８４で形質転換した大腸菌ｗａ
ｉｉｏをアンピシリン１００ｍｇ／　ｌを含むＬＢ培地
２０１に接種し、３７℃下２０時間の撹拌培養を行った
。

次に遠心分離により菌体を集めＰＢＳで洗浄後、１０（
ｌｄのＰＢＳに懸濁した。この菌体液を超音波発生装置
で破砕した後、遠心分離（トミー精工：ＲＢ２０ＢＨ，
１５，０００回転、３０分間）により菌体抽出液１２５
ｍ１！を得た。この粗抽出液のリンホトキシン活性は４
．４Ｘ１０”Ｕ／−であった。次に、予め０．２ＭＩＪ
ン酸緩衝波緩衝液に平衡化したゲル濾過担体である５ｅ
ｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００（ファルマシア）φ１１３
　Ｘ　９００ｍｍに付した。

リンホトキシン活性を示す両分を集めた後、一部を抗リ
ンホトキシンマウスモノクローナル抗体カラム３０−に
付した。同抗体カラムは組換リンホトキシンをマウスに
免疫して作成したモノクローナル抗体を５ｅｐｈａｒｏ
ｓｅ　４Ｂ（ファルマシア）に結合して作成した。同カ
ラムを０．２Ｍリン酸緩衝液で十分に平衡化し、先の部
分精製したリンホトキシン誘導体を吸着させた後に同緩
衝液で洗浄し、３Ｍ　ＫＳＣＮを含む０．２ＭＩＪン酸
緩衝波緩衝液させた。次に５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５
（ファルマシア）で脱塩を行い、５Ｏ８−ポリアクリル
アミド電気泳動で純度検定を行ったところ、分子量的１
６、０００の単一バンドであった。また、ＮＨ，末端配
列を調べたところ、その構造はＭｅｔ　Ｌｙｓ　Ｐｒ。

Ａｌａ　Ａｌａ　）ｌｉｓ　Ｌｅｕ　ｌｉｅ　Ｇｌｙ　
Ａｓｐであった。

実施例７ プラスミドｐＢ８７０８４で形質転換した大腸菌ＪＭ８
３をアンピシリン１００ｍｇ／　１２を含むＬＢ培地２
００ｍ１に接種し、３７℃下１８時間の振とう培養を行
った。

次に遠心分離により菌体を集めＰＢＳ（Ｄａｌｂｅｃｃ
ｏ）で洗浄後、２ｍｌ！のＰＢＳに懸濁した。この菌体
液を超音波発生装置で破砕した後、遠心分離により菌体
抽出液を得た。この粗抽出液を無菌濾過（０，２２μｍ
）した後、濾液を抗リンホトキシンマウスモノクローナ
ル抗体カラム２Ｗｄｌに付した。

同カラムは５ＱｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ　ｐＨ８，０緩
衝液で十分に平衡化し、先のリンホトキシン誘導体を吸
着させた後に同緩衝液で洗浄を行った。次に罪ＫＳＣＮ
を含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ　ｐＨ８，０緩衝液
で溶出させた。溶出液は直ちにＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃ
ｏ）緩衝液に透析した。

実施例８ プラスミドｐＥＨ８０８４で形質転換した大腸菌ＪＭ８
３をアンピシリン１００ｍｇ／　１を含むＬＢ培地２０
０ｍ１に接種し、３７℃下１８時間の振とう培養を行っ
た。

次に遠心分離により菌体を集めＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃ
ｏ）で洗浄後、２艷のＰＢＳに懸濁した。この菌体液を
超音波発生装置で破砕した後、遠心分離により菌体抽出
液を得た。この粗抽出液のリンホトキシン活性は６．６
　Ｘ　１０’Ｕ／ｍｌであった。次に、同抽出液を無菌
濾過（０，２２μｍ）した後、抗リンホトキシンマウス
モノクローナル抗体力うＡ２ｍ７！に付した。前記と同
様の方法で溶出させ、ＰＢＳに透析して２．９　Ｘ　１
０’Ｕ／１ｎｌの活性を含む２Ｗｄｌ溶液を得た。５Ｏ
８−ポリアクリルアミド電気泳動では分子量的１６．０
００の単一バンドを与え、ＮＨ２末端配列はＰｒｏ　Ａ
ｌａ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ａｓ
ｐであった。

〔発明の効果〕

実験例をもって本発明の詳細な説明する。

実験例１ く試　料〉 プラスミドｐＢ８６０８４を発現し、精製し、最終目的
物質Ａを得て、これを検体試料とした。

別に対照試料として天然リンホトキシンを用意した。

く方　法〉 インジケータ細胞としてヒト肺癌細胞（ｐｃ−１０）、
ヒト結腸腺癌細胞（ＷｉＤｒ）及びヒト繊維肉腫細胞（
ＨＴ１０８０）を使用した。各細胞株を２〜５　Ｘ１０
’／Ｗａｌｌの密度で９６Ｗａｌｌミクロタイタープレ
ートに添加し、各試料を含む培地及びアクチノマイシン
Ｄ　（ＰＣ−１０の場合には０．１μｇ／ｍ１ＳＷｉ叶
及びＨ７１０８０の場合には０．５　ｐｇ／　ｍｊりを
添加した。湿潤ＣＯ□存在下で１２〜１５時間培養し、
生存細胞をＣｒｙｓｔａｌ　ｖｉｏｌｅｔで固定染色し
、染色された細胞より色素を抽出し、その吸光値を測定
した。試料添加前の生存値を１００％として、試料添加
による生存率を求めた。

く結　果〉 結果を図１２〜図１４に示す。図１２〜図１４はそれぞ
れインジケーター細胞としてＰＣ−ＩＱ、　ＷｉＤｒ、
　ＨＴ１０８０を使用した場合の結果であり、図中、Δ
印線は天然リンホトキシン、Ｏ印線は目的物質Ａをそれ
ぞれ試料としたときのリンホトキシン活性と生存率の関
係を示すグラフである。

図１２〜図１４より、本発明で示される１３７個のアミ
ノ酸配列にリンホトキシンの抗腫瘍活性があることが知
られる。

実験例２ く試　料〉 プラスミドｐＥ）１６０８４．　ｐＥＨ７０８４，ｐＨ
１Ｈ８０８４をそれぞれ発現し、精製し、最終目的物質
Ｂ。

Ｃ，Ｄを得て、これを検体試料とした。別に対照試料と
して天然リンホトキシンを用意した。

く方 法〉 インジケータ細胞としてヒト肺癌細胞（ＰＣ−１０）、
ヒト結腸腺癌細胞（ＷｉＤｒ）及びヒト繊維肉腫細胞（
ＨＴ１０８０）を使用した。各細胞株を２〜５　Ｘ１０
’／Ｗｅｌｌの密度で９５Ｗａｌｌミクロタイタープレ
ートに添加し、各試料を含む培地及びアクチノマイシン
Ｄ　（ＰＣ−１０の場合には０．１μｇ／ｒｎ１１ｗｉ
叶及びＨＴ１０８０の場合には０１．５μｇ／−）を添
加した。湿潤Ｃ０２存在下で２０時間培養し、生存細胞
をＣｒｙｓｔａｌ　ｖｉｏｌｅｔで固定染色し、染色さ
れた細胞より色素を抽出し、その吸光値を測定した。試
料添加前の生存値を１００％として、試料添加による生
存率を求めた。

く結　果〉 結果を図１５に示す。図１５の（ａ）、　（ｂ）、　（
Ｃ）はそれぞれインジケーター細胞としてＰＣ−１０゜
ＷｉＤｒ、　ＨＴ１０８０を使用した場合の結果であり
、図中、・印線、Δ印線、目印線、印線はそれぞれ天然
リンホトキシン、目的物質Ｂ、　Ｃ。

Ｄを試料としたときのリンホトキシン活性と生存率の関
係を示すグラフである。

図１５（ａ）、（６）、（Ｃ）より、本発明で示される
１３７個のアミノ酸配列にリンホトキシンの抗腫瘍活性
があることが知られる。

実験例３ 実験例２の試料Ｂ、Ｃ，Ｄについてエンザイムイムノア
ッセイ法により、マウスＬ−Ｐ３細胞に対する活性を求
め、天然リンホトキシンの活性（０，５〜Ｉ　Ｘ　１０
”Ｕ／ｍｇ蛋白）を標準にして、各試料の生物活性を算
出した。

１ｎｄｅｘ 天然リンホトキシン　　　　１．０ Ｂ７．３ ０５．６ Ｄ６．２ 上記結果より、本発明リンホトキシン誘導体の活性は天
然リンホトキシンよりも５〜８倍大きいことが知られる
。

【図面の簡単な説明】

図１はリンホトキシンｃＤＮＡのアミノ酸コーディング
領域の塩基配列の図である。 図２はｐＭＬＴ３０２０の構築工程図である。 図３はｐ［ｌＧ５００１およびｐＭＬＴ５００１Ａの各
構築工程図である。 図４はｐＥＨ５１２３の構築工程図である。 図５はｐＵＧ５００４の構築工程図である。 図６はｐＭＬＴ５０１１の構築工程図である。 図７はＪ）ＢＨ６０８４の構築工程図である。 図８はｐｌＥＨ７０８４の構築工程図である。 図９はｐＢＨ８０８４の構築工程図である。 図１０はｐＢＲＤ８０５０の構築工程図である。 図１１はｐＥＨ５０５０の構築工程図である。 図１２．１３．１４はそれぞれ実験例１の結果を示すグ
ラフ、図１５は実験例２の結果を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　分子中に下記一次構造式で示されるアミノ酸配列を
   含有する新規な組換リンホトキシン誘導体。 【遺伝子配列があります】 （式中、Ａ＿１＿〜＿１＿４、Ａ＿２＿１＿〜＿３＿２
   はいずれかのアミノ酸を表す） ２　Ａ＿１はＨｉｓ，Ａｓｎ，Ｌｅｕ、Ａ＿２はＩｌｅ
   ，Ｍｅｔ，Ｇｌｙ、Ａ＿３はＬｅｕ，Ｇｌｎ，Ｈｉｓ，
   Ｃｙｓ，Ｉｌｅ，Ｐｒｏ，Ｖａｌ，Ｓｅｒ，Ｇ１ｙ、Ａ
   ＿４はＰｒｏ，Ａｒｇ，Ｌｅｕ，Ｇｌｎ，Ｖａｌ、Ａ＿
   ５はＳｅｒ，Ｐｈｅ，Ｃｙｓ、Ａ＿６はＬｙｓ，Ａｓｎ
   ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ、Ａ＿７はＬｅｕ，Ａｌａ，
   Ｇｌｎ、Ａ＿８はＴｒｐ，Ｐｈｅ，Ｌｅｕ、Ａ＿９はＡ
   ｒｇ，Ｌｅｕ、Ａ＿１＿０はＡｌａ，Ａｒｇ，Ｇｌｕ、
   Ａ＿１＿１はＡｓｐ，Ａｓｎ，Ａｌａ，Ａｒｇ、Ａ＿１
   ＿２はＡｒｇ，Ａｓｎ，Ｇｌｙ、Ａ＿１＿３はＡｓｎ，
   Ａｒｇ，Ａｓｐ，Ａｌａ，Ｓｅｒ、Ａ＿１＿４はＧｌｙ
   ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｐｒｏ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ、
   Ａ＿２＿１はＡｌａ，Ｌｙｓ，Ｓｅｒ，Ｇｌｕ、Ａ＿２
   ＿２はＬｅｕ，Ｖａｌ、Ａ＿２＿３はＬｙｓ，Ａｓｎ、
   Ａ＿２＿４はＧｌｎ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｇｌｙ、Ａ＿２
   ＿５はＧｌｙ，Ａｓｐ，Ｓｅｒ、Ａ＿２＿６はＡｓｐ，
   Ｇｌｕ，Ｇｌｎ、Ａ＿２＿７はＧｌｎ，Ａｒｇ，Ｐｒｏ
   ，Ｓｅｒ、Ａ＿２＿８はＳｅｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｕ，Ｐｈ
   ｅ，Ｔｒｐ、Ａ＿２＿９はＰｒｏ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔ
   ｙｒ、Ａ＿３＿０はＳｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｙｒ、Ａ＿３＿
   １はＴｈｒ，Ｖａｌ，Ｐｈｅ、Ａ＿３＿２はＰｈｅ，Ｔ
   ｙｒのそれぞれいずれかを表す請求項１記載の組換リン
   ホトキシン誘導体。 ３　Ａ＿１がＨｉｓ、Ａ＿２がＩｌｅ、Ａ＿３がＧｌｙ
   、Ａ＿４がＰｒｏ又はＶａｌ、Ａ＿５がＳｅｒ、Ａ＿６
   がＬｙｓ、Ａ＿７がＬｅｕ、Ａ＿８がＴｒｐ、Ａ＿９が
   Ａｒｇ、Ａ＿１＿０がＡｌａ、Ａ＿１＿１がＡｓｐ、Ａ
   ＿１＿２がＡｒｇ、Ａ＿１＿３がＡｓｎ、Ａ＿１＿４が
   Ｇｌｙ、Ａ＿２＿１がＡｌａ、Ａ＿２＿２がＬｅｕ、Ａ
   ＿２＿３がＬｙｓ、Ａ＿２＿４がＧｌｎ、Ａ＿２＿５が
   Ｇｌｙ、Ａ＿２＿６がＡｓｐ、Ａ＿２＿７がＧｌｎ、Ａ
   ＿２＿８がＳｅｒ、Ａ＿２＿９がＰｒｏ、Ａ＿３＿０が
   Ｓｅｒ、Ａ＿３＿１がＴｈｒ、Ａ＿３＿２がＰｈｅであ
   る請求項１又は２記載の組換リンホトキシン誘導体。 ４　アミノ酸配列のＮＨ＿２末端に連結するポリペプチ
   ドが１〜２８個のアミノ酸残基からなる請求項１ないし
   ３のいずれか一項に記載の組換リンホトキシン誘導体。 ５　分子中に下記一次構造式で示されるアミノ酸配列を
   含有する組換リンホトキシン誘導体をコードするｃＤＮ
   Ａ。 【遺伝子配列があります】 （式中、Ａ＿１＿〜＿１＿４、Ａ＿２＿１＿〜＿３＿２
   はいずれかのアミノ酸を表す） ６　Ａ＿１はＨｉｓ，Ａｓｎ，Ｌｅｕ、Ａ＿２はＩｌｅ
   ，Ｍｅｔ，Ｇｌｙ、Ａ＿３はＬｅｕ，Ｇｌｎ，Ｈｉｓ，
   Ｃｙｓ，Ｉｌｅ，Ｐｒｏ，Ｖａｌ，Ｓｅｒ，Ｇｌｙ、Ａ
   ＿４はＰｒｏ，Ａｒｇ，Ｌｅｕ，Ｇｌｎ，Ｖａｌ、Ａ＿
   ５はＳｅｒ，Ｐｈｅ，Ｃｙｓ、Ａ＿６はＬｙｓ，Ａｓｎ
   ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ、Ａ＿７はＬｅｕ，Ａｌａ，
   Ｇｌｎ、Ａ＿８はＴｒｐ，Ｐｈｅ，Ｌｅｕ、Ａ＿９はＡ
   ｒｇ，Ｌｅｕ、Ａ＿１＿０はＡｌａ，Ａｒｇ，Ｇｌｕ、
   Ａ＿１＿１はＡｓｐ，Ａｓｎ，Ａｌａ，Ａｒｇ、Ａ＿１
   ＿２はＡｒｇ，Ａｓｎ，Ｇｌｙ、Ａ＿１＿３はＡｓｎ，
   Ａｒｇ，Ａｓｐ，Ａｌａ，Ｓｅｒ、Ａ＿１＿４はＧｌｙ
   ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｐｒｏ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ、
   Ａ＿２＿１はＡｌａ，Ｌｙｓ，Ｓｅｒ，Ｇｌｕ、Ａ＿２
   ＿２はＬｅｕ，Ｖａｌ、Ａ＿２＿３はＬｙｓ，Ａｓｎ、
   Ａ＿２＿４はＧｌｎ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｇｌｙ、Ａ＿２
   ＿５はＧｌｙ，Ａｓｐ，Ｓｅｒ、Ａ＿２＿６はＡｓｐ，
   Ｇｌｕ，Ｇｌｎ、Ａ＿２＿７はＧｌｎ，Ａｒｇ，Ｐｒｏ
   ，Ｓｅｒ、Ａ＿２＿８はＳｅｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｕ，Ｐｈ
   ｅ，Ｔｒｐ、Ａ＿２＿９はＰｒｏ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔ
   ｙｒ、Ａ＿３＿０はＳｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｙｒ、Ａ＿３＿
   １はＴｈｒ，Ｖａｌ，Ｐｈｅ、Ａ＿３＿２はＰｈｅ，Ｔ
   ｙｒのそれぞれいずれかを表す請求項５記載のｃＤＮＡ
   。 ７　Ａ＿１がＨｉｓ、Ａ＿２がＩｌｅ、Ａ３がＧｌｙ、
   Ａ＿４がＰｒｏ又はＶａｌ、Ａ＿５がＳｅｒ、Ａ＿６が
   Ｌｙｓ、Ａ＿７がＬｅｕ、Ａ＿８がＴｒｐ、Ａ＿９がＡ
   ｒｇ、Ａ＿１＿０がＡｌａ、Ａ＿１＿１がＡｓｐ、Ａ＿
   １＿２がＡｒｇ、Ａ＿１＿３がＡｓｎ、Ａ＿１＿４がＧ
   ｌｙ、Ａ＿２＿１がＡｌａ、Ａ＿２＿２がＬｅｕ、Ａ＿
   ２＿３がＬｙｓ、Ａ＿２＿４がＧｌｎ、Ａ＿２＿５がＧ
   ｌｙ、Ａ＿２＿６がＡｓｐ、Ａ＿２＿７がＧｌｎ、Ａ＿
   ２＿８がＳｅｒ、Ａ＿２＿９がＰｒｏ、Ａ＿３＿０がＳ
   ｅｒ、Ａ＿３＿１がＴｈｒ、Ａ＿３＿２がＰｈｅである
   請求項５又は６記載のｃＤＮＡ。 ８　アミノ酸配列のＮＨ＿２末端に連結するポリペプチ
   ドが１〜２８個のアミノ酸残基からなる請求項５〜７の
   いずれか一項に記載のｃＤＮＡ。 ９　分子中に下記一次構造式で示されるアミノ酸配列を
   含有する組換リンホトキシン誘導体をコードするｃＤＮ
   Ａを外来遺伝子として含み、かつ、選択した宿主内で制
   御および発現が可能となるように連結して得られた発現
   プラスミド。 【遺伝子配列があります】 （式中、Ａ＿１＿〜＿１＿４、Ａ＿２＿１＿〜＿３＿２
   はいずれかのアミノ酸を表す） １０　Ａ＿１はＨｉｓ，Ａｓｎ，Ｌｅｕ、Ａ＿２はＩｌ
   ｅ，Ｍｅｔ，Ｇｌｙ、Ａ＿３はＬｅｕ，Ｇｌｎ，Ｈｉｓ
   ，Ｃｙｓ，Ｉｌｅ，Ｐｒｏ，Ｖａｌ，Ｓｅｒ，Ｇｌｙ、
   Ａ＿４はＰｒｏ，Ａｒｇ，Ｌｅｕ，Ｇｌｎ，Ｖａｌ、Ａ
   ＿５はＳｅｒ，Ｐｈｅ，Ｃｙｓ、Ａ＿６はＬｙｓ，Ａｓ
   ｎ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ、Ａ＿７はＬｅｕ，Ａｌａ
   ，Ｇｌｎ、Ａ＿８はＴｒｐ，Ｐｈｅ，Ｌｅｕ、Ａ＿９は
   Ａｒｇ，Ｌｅｕ、Ａ＿１＿０はＡｌａ，Ａｒｇ，Ｇｌｕ
   、Ａ＿１＿１はＡｓｐ，Ａｓｎ，Ａｌａ，Ａｒｇ、Ａ＿
   １＿２はＡｒｇ，Ａｓｎ，Ｇｌｙ、Ａ＿１＿３はＡｓｎ
   ，Ａｒｇ，Ａｓｐ，Ａｌａ，Ｓｅｒ、Ａ＿１＿４はＧｌ
   ｙ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｐｒｏ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ
   、Ａ＿２＿１はＡｌａ，Ｌｙｓ，Ｓｅｒ，Ｇｌｕ、Ａ＿
   ２＿２はＬｅｕ，Ｖａｌ、Ａ＿２＿３はＬｙｓ，Ａｓｎ
   、Ａ＿２＿４はＧｌｎ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｇｌｙ、Ａ＿
   ２＿５はＧｌｙ，Ａｓｐ，Ｓｅｒ、Ａ＿２＿６はＡｓｐ
   ，Ｇｌｕ，Ｇｌｎ、Ａ＿２＿７はＧｌｎ，Ａｒｇ，Ｐｒ
   ｏ，Ｓｅｒ、Ａ＿２＿８はＳｅｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｕ，Ｐ
   ｈｅ，Ｔｒｐ、Ａ＿２＿９はＰｒｏ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，
   Ｔｙｒ、Ａ＿３＿０はＳｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｙｒ、Ａ＿３
   ＿１はＴｈｒ，Ｖａｌ，Ｐｈｅ、Ａ＿３＿２はＰｈｅ，
   Ｔｙｒのそれぞれいずれかを表す請求項９記載の発現プ
   ラスミド。 １１　Ａ＿１がＨｉｓ、Ａ＿２がＩｌｅ、Ａ＿３がＧｌ
   ｙ、Ａ＿４がＰｒｏ又はＶａｌ、Ａ＿５がＳｅｒ、Ａ＿
   ６がＬｙｓ、Ａ＿７がＬｅｕ、Ａ＿８がＴｒｐ、Ａ＿９
   がＡｒｇ、Ａ＿１＿０がＡｌａ、Ａ＿１＿１がＡｓｐ、
   Ａ＿１＿２がＡｒｇ、Ａ＿１＿３がＡｓｎ、Ａ＿１＿４
   がＧｌｙ、Ａ＿２＿１がＡｌａ、Ａ＿２＿２がＬｅｕ、
   Ａ＿２＿３がＬｙｓ、Ａ＿２＿４がＧｌｎ、Ａ＿２＿５
   がＧｌｙ、Ａ＿２＿６がＡｓｐ、Ａ＿２＿７がＧｌｎ、
   Ａ＿２＿８がＳｅｒ、Ａ＿２＿９がＰｒｏ、Ａ＿３＿０
   がＳｅｒ、Ａ＿３＿１がＴｈｒ、Ａ＿３＿２がＰｈｅで
   ある請求項９又は１０記載の発現プラスミド。 １２　アミノ酸配列のＮＨ＿２末端に連結するポリペプ
   チドが１〜２８個のアミノ酸残基からなる請求項９ない
   し１１のいずれか一項に記載の発現プラスミド。 １３　発現プラスミドが下記によって識別表示される請
   求項９記載の発現プラスミド。 ｐＥＨ６０８４，ｐＥＨ７０８４，ｐＥＨ８０８４，ｐ
   ＢＲＤ８０５０，ｐＥＨ５０５０ １４　分子中に下記一次構造式で示されるアミノ酸配列
   を含有する組換リンホトキシン誘導体をコードするｃＤ
   ＮＡを外来遺伝子として含み、かつ選択した宿主内で制
   禦および発現が可能となるように連結して得られた発現
   プラスミドにより形質転換される宿主。 【遺伝子配列があります】 （式中、Ａ＿１＿〜＿１＿４、Ａ＿２＿１＿〜＿３＿２
   はいずれかのアミノ酸を表す） １５　Ａ＿１はＨｉｓ，Ａｓｎ，Ｌｅｕ、Ａ＿２はＩｌ
   ｅ，Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ａ＿２はＬｅｕ，Ｇｌｎ，Ｈｉｓ
   ，Ｃｙｓ，Ｉｌｅ，Ｐｒｏ，Ｖａｌ，Ｓｅｒ，Ｇｌｙ、
   Ａ＿４はＰｒｏ，Ａｒｇ，Ｌｅｕ，Ｇｌｎ，Ｖａｌ、Ａ
   ＿５はＳｅｒ，Ｐｈｅ，Ｃｙｓ、Ａ＿６はＬｙｓ，Ａｓ
   ｎ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ、Ａ＿７はＬｅｕ，Ａｌａ
   ，Ｇｌｎ、Ａ＿８はＴｒｐ，Ｐｈｅ，Ｌｅｕ、Ａ＿９は
   Ａｒｇ，Ｌｅｕ、Ａ＿１＿０はＡｌａ，Ａｒｇ，Ｇｌｕ
   、Ａ＿１＿１はＡｓｐ，Ａｓｎ，Ａｌａ，Ａｒｇ、Ａ＿
   １＿２はＡｒｇ，Ａｓｎ，Ｇｌｙ、Ａ＿１＿３はＡｓｎ
   ，Ａｒｇ，Ａｓｐ，Ａｌａ，Ｓｅｒ、Ａ＿１＿４はＧｌ
   ｙ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｐｒｏ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ
   、Ａ＿２＿１はＡｌａ，Ｌｙｓ，Ｓｅｒ，Ｇ１ｕ、Ａ＿
   ２＿２はＬｅｕ，Ｖａｌ、Ａ＿２＿３はＬｙｓ，Ａｓｎ
   、Ａ＿２＿４はＧｌｎ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｇｌｙ、Ａ＿
   ２＿５はＧｌｙ，Ａｓｐ，Ｓｅｒ、Ａ＿２＿６はＡｓｐ
   ，Ｇｌｕ，Ｇｌｎ、Ａ＿２＿７はＧｌｎ，Ａｒｇ，ｐｒ
   ｏ，Ｓｅｒ、Ａ＿２＿８はＳｅｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｕ，Ｐ
   ｈｅ，Ｔｒｐ、Ａ＿２＿９はＰｒｏ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，
   Ｔｙｒ、Ａ＿３＿０はＳｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｙｒ、Ａ＿３
   ＿１はＴｈｒ，Ｖａｌ，Ｐｈｅ、Ａ＿３＿２はＰｈｅ，
   Ｔｙｒのそれぞれいずれかを表す請求項１４記載の宿主
   。 １６　Ａ＿１がＨｉｓ、Ａ＿２がＩｌｅ、Ａ＿３がＧｌ
   ｙ、Ａ＿４がＰｒｏ又はＶａｌ、Ａ＿５がＳｅｒ、Ａ＿
   ６がＬｙｓ、Ａ＿７がＬｅｕ、Ａ＿８がＴｒｐ、Ａ＿９
   がＡｒｇ、Ａ＿１＿０がＡｌａ、Ａ＿１＿１がＡｓｐ、
   Ａ＿１＿２がＡｒｇ、Ａ＿１＿３がＡｓｎ、Ａ＿１＿４
   がＧｌｙ、Ａ＿２＿１がＡｌａ、Ａ＿２＿２がＬｅｕ、
   Ａ＿２＿３がＬｙｓ、Ａ＿２＿４がＧｌｎ、Ａ＿２＿５
   がＧｌｙ、Ａ＿２＿６がＡｓｐ、Ａ＿２＿７がＧｌｎ、
   Ａ＿２＿８がＳｅｒ、Ａ＿２＿９がＰｒｏ、Ａ＿３＿０
   がＳｅｒ、Ａ＿３＿１がＴｈｒ、Ａ＿３＿２がＰｈｅで
   ある請求項１４又は１５記載の宿主。 １７　アミノ酸配列のＮＨ＿２末端に連結するポリペプ
   チドが１〜２８個のアミノ酸残基からなる請求項１４な
   いし１６のいずれか一項に記載の宿主。 １８　発現プラスミドが下記によって識別表示される請
   求項１４記載の宿主。 ｐＥＨ６０８４，ｐＥＨ７０８４，ｐＥＨ８０８４，ｐ
   ＢＲＤ８０５０，ｐＥＨ５０５０ １９　分子中に下記一次構造式で示されるアミノ酸配列
   を含有する組換リンホトキシン誘導体を有効成分として
   含有する医薬組成物。 【遺伝子配列があります】 （式中、Ａ＿１＿〜＿１＿４、Ａ＿２＿１＿〜＿３＿２
   はいずれかのアミノ酸を表す） ２０　Ａ＿１はＨｉｓ，Ａｓｎ，Ｌｅｕ、Ａ＿２はＩｌ
   ｅ，Ｍｅｔ，Ｇｌｙ、Ａ＿３はＬｅｕ，Ｇｌｎ，Ｈｉｓ
   ，Ｃｙｓ，Ｉｌｅ，Ｐｒｏ，Ｖａｌ，Ｓｅｒ，Ｇｌｙ、
   Ａ＿４はＰｒｏ，Ａｒｇ，Ｌｅｕ，Ｇｌｎ，Ｖａｌ、Ａ
   ＿５はＳｅｒ，Ｐｈｅ，Ｃｙｓ、Ａ＿６はＬｙｓ，Ａｓ
   ｎ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ、Ａ＿７はＬｅｕ，Ａｌａ
   ，Ｇｌｎ、Ａ＿８はＴｒｐ，Ｐｈｅ，Ｌｅｕ、Ａ＿９は
   Ａｒｇ，Ｌｅｕ、Ａ＿１＿０はＡｌａ，Ａｒｇ，Ｇｌｕ
   、Ａ＿１＿１はＡｓｐ，Ａｓｎ，Ａｌａ，Ａｒｇ，Ａ＿
   １＿２はＡｒｇ，Ａｓｎ，Ｇｌｙ、Ａ＿１＿３はＡｓｎ
   ，Ａｒｇ，Ａｓｐ，Ａｌａ，Ｓｅｒ、Ａ＿１＿４はＧｌ
   ｙ、Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｐｒｏ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ
   、Ａ＿２＿１はＡｌａ，Ｌｙｓ，Ｓｅｒ，Ｇｌｕ、Ａ＿
   ２＿２はＬｅｕ，Ｖａｌ、Ａ＿２＿３はＬｙｓ，Ａｓｎ
   、Ａ＿２＿４はＧｌｎ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｇｌｙ、Ａ＿
   ２＿５はＧｌｙ，Ａｓｐ，Ｓｅｒ、Ａ＿２＿６はＡｓｐ
   ，Ｇｌｕ，Ｇｌｎ、Ａ＿２＿７はＧｌｎ，Ａｒｇ，Ｐｒ
   ｏ，Ｓｅｒ、Ａ＿２＿８はＳｅｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｕ，Ｐ
   ｈｅ，Ｔｒｐ、Ａ＿２＿９はＰｒｏ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，
   Ｔｙｒ、Ａ＿３＿０はＳｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｙｒ、Ａ＿３
   ＿１はＴｈｒ，Ｖａｌ，Ｐｈｅ、Ａ＿３＿２はＰｈｅ，
   Ｔｙｒのそれぞれいずれかを表す請求項１９記載の医薬
   組成物。 ２１　Ａ＿１がＨｉｓ、Ａ＿２がＩｌｅ、Ａ＿３がＧｌ
   ｙ、Ａ＿４がＰｒｏ又はＶａｌ、Ａ＿５がＳｅｒ、Ａ＿
   ６がＬｙｓ、Ａ＿７がＬｅｕ、Ａ＿８がＴｒｐ、Ａ＿９
   がＡｒｇ、Ａ＿１＿０がＡｌａ、Ａ＿１＿１がＡｓｐ、
   Ａ＿１＿２がＡｒｇ、Ａ＿１＿３がＡｓｎ、Ａ＿１＿４
   がＧｌｙ、Ａ＿２＿１がＡｌａ、Ａ＿２＿２がＬｅｕ、
   Ａ＿２＿３がＬｙｓ、Ａ＿２＿４がＧｌｎ、Ａ＿２＿５
   がＧｌｙ、Ａ＿２＿６がＡｓｐ、Ａ＿２＿７がＧｌｎ、
   Ａ＿２＿８がＳｅｒ、Ａ＿２＿９がＰｒｏ、Ａ＿３＿０
   がＳｅｒ、Ａ＿３＿１がＴｈｒ、Ａ＿３＿２がＰｈｅで
   ある請求項１９又は２０記載の医薬組成物。 ２２　アミノ酸配列のＮＨ＿２末端に連結するポリペプ
   チドが１〜２８個のアミノ酸残基からなる請求項１９な
   いし２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。 ２３　医薬組成物が抗腫瘍剤である請求項１９ないし２
   ２のいずれか一項に記載の医薬組成物。