JPH02227082A - イソペニシリンｎエピメラーゼ（ラセマーゼ）活性をコードする組換えｄｎａ発現ベクター、およびｄｎａ化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、イソペニシリンＮエピメラーゼ（ラセマーゼ
）活性をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターおよびＤ
ＮＡ化合物に関するものである。

［従来技術と発明が解決すべき課題］ 天然の硫黄含有β−ラクタム抗生物質は臨床１最も重要
であり、新規なβ−ラクタム化合物の単離はフレミング
（Ｆ　ｌｅｍｉｎｇ）のペニシリン発見以来はぼ６０年
にわたってなされてきた。ペニシリン類およびセファロ
スポリン類（セファマイシンを含む）に共通した構造上
の特徴はβ−ラクタム環である これらの抗生物質は種々の原核性生物および下等な真核
性生物によって産生される。ペニシリンＧ（ベンジルペ
ニシリン）またはペニシリンＶに代表されるペニシリン
類は主として線維状菌類、特にペニシリウム・クリソゲ
ヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕａ　Ｏｈｒｙｓｏｇｅｎｕ
ｓ）によって産生される。最初、下等真核性生物、セフ
１０スポリウム・アクレモニウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐ
ｏｒｉｕｍ　　ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍＸ同系、アクレモ
ニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｈｒ
ｙｓｏｇｅｎｕｍ）の生産物として単離されたセファロ
スポリン類は、多くの原核性微生物の代謝産物でもある
が、とりわけ、セファマイシン、およびオキシベナム（
カルブラン酸）やカルバペナム（チェナマイシン）等の
他のβ−ラクタム抗生物質を産生ずるストレプトマイセ
ス・クラブリゲルス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏ＊ｙｃｅｓ　ａ
ｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｇ）、ストレプトマイセス・リッ
プマニ（Ｓ、ｌｉｐ■ａｎｉｉ）およびストレプトマイ
セス・カドレア（Ｓ、ｃａｔｔｌｅｙａ）等の、多くの
原核性微生物の代謝産物である。

β−ラクタム産生生物の細胞不含系の開発によって含硫
黄β−ラクタム類（ペニシリンおよびセファロスポリン
）経路の生合成段階が確立された。

Ｓ雄状菌類、（例、Ｐ、クリソゲヌム）によるペニシリ
ン生成と、原核性微生物および低級真核性微生物による
セファロスポリンおよびセファマイシン生成の第１段階
は同じである。ＡＣＶシンターゼ（合成酵素）はアミノ
酸前駆体、Ｌ−α−アミノアジペート、Ｌ−システィン
、およびＬ−バリンが縮合してトリペプチド、ＬＬＤ−
ＡＣＶが形成される反応を触媒する。次の段階ではトリ
ペプチドが閉環して初めてβ−ラクタム環を形成し、あ
らゆるペニシリン類、セファロスポリン類およびセファ
マイシン類の前駆体であるイソペニシリンＮ（Ｉ　ＰＮ
）が生成する。

ＩＰＮ合成の後、セファロスポリン経路とペニシリン経
路は別れる。例えば、ペニシリウム、クリソゲヌムにお
いてはＩＰＮのα−アミノアジピル側鎖が、対応するア
シルＣｏＡから導かれる多くの（今日までほぼ１００）
疎水性側鎖の１つで置換され得る。最もよ（知られた例
は、フェニルアセチルＣｏＡとＩＰＮからペニシリンＧ
（ベンジルペニシリン）が生成する場合である。しかし
ながら、ω類Ｃ，アクレモニウムにおいてはα−アミノ
アジピル側鎖は異性化され、ペニシリンＮが産生される
。次いでペニシリンの５員環チオシリジン環は“拡張”
されてセファロスポリンの特徴である６員環のジヒドロ
チアジン環となる。この反応はデアセトキシセファロス
ポリンＣシンターゼ（ＤＡＯＣ３）によって触媒され、
経路において最初のセフ１０スポリンであるデアセトキ
シセファロスポリンＣ（ＤＡＯＣ）が生成される。セフ
ァロスポリウム・アクレモニウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐ
ｏｒｉｕＩＩｌａｃｒｅｓｏｎｉｕｍ）およびダラム陽
性菌、Ｓ、クラブリゲルスおよびＳ、ラクタムデニラン
ス（Ｓ　、　ｌａｃｔａｓａｄｕｒａｎｇ）由来のエキ
スパンダーゼＤＡＯＣ３活性は広範に特性化されている
が経路の後半はあまりよく分かっていない。

本発明は、β−ラクタム生合成経路活性、イソペニシリ
ンＮエピメラーゼをコードする遺伝子を提供するもので
ある。この活性はラセマーゼとしても知られている。本
発明はβ−ラクタム生合成酵素の宝庫を拡張するもので
あり、過剰生産することもできる。この能力により、基
質同族体の新規なβ−ラクタムへの生物学的変換および
遺伝子使用量の増加による株の改善が容易になる。

本発明はＳ、クラブリゲルス由来のイソペニシリンＮエ
ピメラーゼ活性をコードするＤＮＡ配列を包含する。イ
ソペニシリンＮエピメラーゼ（ラセマーゼ）はイソペニ
シリンＮからのペニシリンＮの生成反応を触媒し、ラセ
マーゼとも称される。

この酵素はイソペニシリンＮのＬ−アルファーアミノア
ジピル側鎖をＤ−アルファーアミノアジピル側鎖に変換
する。この酵素は、２つの型の平衡を達成すると思われ
るので、本明細書では、従来のエピメラーゼではなく、
ラセマーゼという語句を用いる。この酵素は極めて不安
定であるがそれによって触媒される反応は重要な抗生物
質、例えばセファロスポリン（セファロスポリウム・ア
クレモニウム）および７α−メトキシセフ１０スポリン
またはセファマイシン（ストレプトマイセス・クラブリ
ゲルスおよびＳ、リップマニ）などの生合成において大
切な段階である。従って、この活性を大量に製造するこ
とができることが非常に重要である。

［課題を解決するための手段］ 本発明のＤＮＡ化合物は単一の読み取り枠（オープン・
リーディング・フレーム）にラセマーゼをコードしてい
る。この読み取り枠を転写し、得られたｍＲＮＡを翻訳
することによってラセマーゼ活性を有する単一ポリペプ
チド鎖が生産される。

ラセマーゼ活性をコードしているＤＮＡ化合物をストレ
プトマイセス−クラブリゲルスのゲノムＤＮＡから単離
し、組換えＤＮＡ発現ベクターの構築に使用した。これ
らの発現ベクターのうち下記の４つの型が特に有用であ
り、その第１の型はニジエリ牛ア・コリ（Ｅ、ａｏｌｉ
）において、第２の型はセフ１０スポリウム（Ｃｅｐｈ
ａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）において、第３の型はペニシリ
ウム（Ｐｅｎｉａｉｌｌｉｕｍ）において、そして第４
の型はストレプトマイセスにおいて高レベルのラセマー
ゼ活性発現をもたらす。

ニジ墨り牛ア・コリ（Ｅ、コリ、大腸ｍｌ）が生産する
ラセマーゼ活性は、イソペニシリンＮからのペニシリン
Ｎの生産を触媒する。本発明によるこれら大腸菌形質転
換体の粗細胞抽出物はラセマーゼ活性を有する。これら
の大腸菌発現ベクターおよび形質転換体は活性ラセマー
ゼを多量に入手し得る有効な手段を提供する。ラセマー
ゼは単にペニシリンＮの生産に有用であるだけでな（、
特有の抗生物質の生産にも有用である。

本発明のセファロスポリウム・ベクター類は、製薬産業
で使用される株の構築の目的に有用である。セフ１０ス
ポリウムはセファロスポリン抗生物質の生産に使用され
る経済的に重要な微生物である。本発明の発現ベクター
でセファロスポリウムを形質転換すると、形質転換体内
の細胞内ラセマーゼ活性の濃度が高くなる。これらの形
質転換体は工業的発酵工程における効率および抗生物質
収量を増大するのに使用し得る。機能的なラセマーゼ遺
伝子を欠いたＣ・アクレモニウム株を本発明のベクター
で形質転換すると、ペニシリンＮを合成する形質転換体
が得られる。ペニシリンＮは経口的に吸収され、臨床上
重要な抗生物質の中間生産物として有用である。

本発明のペニシリウム・ベクターは、ペニシリンを高濃
度で生産するペニシリウム株に、セファロスポリン合成
活性を導入するのに最も有用である。ラセマーゼ活性は
、単独またはデアセチルセファロスポリンＣ合成酵素（
ＤＡＣＳ、本酵素はＤＡＯＣからデアセチルセファロス
ポリンＣを生成するヒドロキシル化反応を触媒する）等
の他の活性と組み合わせて、エキスパンダーゼによって
各種のペニシリン鎖をセファロスポリン類に変換させる
ための前駆体としてのペニシリンＮの生成に有用７ある
。例えば、ペニシリウムにイソペニシリンＮエピメラー
ゼ活性とラセマーゼ活性を同時に発現させると、これま
でペニシリウムでは未知の代謝産物であるＤＡＯＣを生
産するようになる。

ラセマーゼ活性をコードしているＤＮＡ化合物を修飾し
て、バエシロマイセス（Ｐａｅａｉｌｏｍｙｅｅａ）お
よびストレプトマイセス等、特にストレプトマイセス・
クラブリゲルス（Ｓ、クラブリゲルス）のような他の微
生物に関する発酵の効率および収量を増大させる発現ベ
クターを精製することは容易である。ラセマーゼ活性を
コードした本発明のＤＮＡはＳ、クラブリゲルスから単
離されたが、上記の大腸菌発現ベクターに例示されるよ
うに、このＤＮＡはさまざまな宿主細胞でラセマーゼ活
性を発現させるベクターの構築に使用できる。本発明の
大腸菌、セフ１０スポリウムおよびペニシリウムのベク
ターの構築に用いた方法に従い、要すれば、適当な調節
要素により類似ベクターを構築することができる。ラセ
マーゼをコードする本発明のＤＮＡ化合物は、ペニシリ
ンおよびセファロスポリン抗生物質を生産する各種微生
物に関連する発酵の効率および収量を改善するのに有用
な発現ベクターの構築に使用することができる。

以下、本発明に関してさら（ζ詳細に説明する。

本明細書の開示内容を明確にし、本発明の理解を深める
目的のため以下の事項に関して下記の通り定義する。

ａｓｄｓ−アセトアミダーゼ遺伝子。図面ではアスペル
ギルス・ニズランスυＩｐａｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕ
ｌａｎｔ）のアセトアミダーゼ遺伝子を示すのに用いる
。

ａａｄｓｐ−ａｄｄｓ遺伝子のプロモーターＡｍＲ−ア
ブラマイシン耐性を付与する遺伝子。

またアブラマイシン耐性表現型を示すのに用いる。

抗生物質−微生物によって生産され、天然のまま、また
は限定的に修飾されて、他の微生物または真核細胞の発
育を阻止し、あるいは殺減し得る物質。

抗生物質生合成遺伝子−一次代謝産物の抗生物質への変
換工程、または一つの抗生物質化合物の異なった抗生物
質化合物への変換工程における酵素反応に必要な活性を
コードしているＤＮＡセグメント。

抗生物質産生微生物−ストレプトマイセス、パシラス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖ。

ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、モノスポラ（Ｍｏｎｏｓｐｏｒ
ａ）、セファロスポリウム、バエシロマイセス、ボドス
ポラ（Ｐ。

ｄ□ａｐｏｒａ）、ペニシリウムおよびノカルジア（Ｎ
ｏｃａｒｄｉａ）等の微生物であって、抗生物質を産生
ずるか、あるいは、発現されたとき、抗生物質が生産さ
れるような遺伝子を含有している微生物を指すが、上記
に限定されない。

抗生物質耐性−付与遺伝子−ある抗生物質耐性を付与す
る活性をコードしているＤＮＡセグメント。

ＡｐＲ−アンピシリン耐性付与遺伝子。またアンピシリ
ン耐性表現型を示すのに用いる。

ｂＧＨ−ウシ成長ホルモン、まｈはそれをコードしてい
るＤＮＡ。

ｂｐ−２本鎖ＤＮＡの塩基対。

ＣＡＴ−クロラムフ品―コール耐性付与遺伝子であって
、アセチルトランスフェラーゼをコードしている。

ｅ１８５７−λｐＬプロモーターの温度感受性リプレッ
サーをコードしている遺伝子。

ａｌＰｓ−セファロスポリウム拳アクレモニウムに由来
するイソペニシリンＮ合成酵素またはイソペニシリンＮ
合成酵素をコードしているＤＮＡ。

クローニング−ＤＮＡ断片（セグメント）を組換えＤＮ
Ａクローニングベクターに組み込むプロセス。

暗号配列−遺伝子中、その遺伝子によって発現される蛋
白質のアミノ酸残基配列をコードしているＤＮＡ配列、
またはｒＲＮＡまたはｔＲＮＡ遺伝子の場合、その遺伝
子によって発現されるｒＲＮＡまたはｔＲＮＡのＲＮＡ
配列をコードしているＲＮＡ配列。

コスミドープラスミドと同様に宿主細胞内で複製可能で
あるが、ファージ頭部へのパフケージン°グ機構の利用
も可能な組換えＤＮＡクローニングベクター 遺伝子−蛋白質（および、必然的にｍＲＮＡ）、ｔＲＮ
ＡまたはｒＲＮＡのうちいずれかを遺伝子産物として発
現させるようプロモーター、翻訳活性化配列、暗号配列
および３°凋節配列が配列されているＤＮＡセグメント
。

ゲノム・ライブラリー−実質上、特定の微生物の完全な
ゲノムを表すＤＮＡセグメントがクローン化されている
１組の組換えＤＮＡクローニングベクター類。

ｈＧＨ−ヒト成長ホルモン、またはそれをコードしてい
るＤＮＡ。

ＨｓＲ−ハイグロマイシン耐性を付与する遺伝子。また
ハイグロマイシン耐性表現型を示すのに用いる。

ハイブリダイゼーシ謬ンー２個の１本鎖ＤＮＡ分子をア
ニーリングして完全に塩基対合した、または、していな
い２本鎖ＤＮＡ分子を生成するプロセス。

■ＰＳまたはＩ　ＰＭＳ−イソペニシリンＮ合成酵素。

イソペニシリンＮ− 式： で示される構造を有する。

イソペニシリンＮ合成酵素−シクラーゼとしても知られ
ているδ−（Ｌ−α−アミノアジピル）−Ｌ−システイ
ニル−Ｄ−バリンからのイソペニシリンＮの生成を触媒
する酵素。

ＫｍＲ−カナマイシン耐性を付与する遺伝子。

またカナマイシン耐性表現型を示すのに用いる。

１ａｃｌ−大腸菌の１ａｃｌ遺伝子。

１ａｃＺα−大腸菌のｌａｃオペロンから誘導されたプ
ロモーターおよびβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）α
−断片。

ｔｐｐ”ｒ−大腸菌のｌｐｐ遺伝子の転写ターミネータ
１ｐｐＰ−大腸■のｌｐｐ遺伝子のプロモーターＭ１３
０ＲＩ−ファージＭ１３の複製起点。

ｍｅｌ−タイロシナーゼ遺伝子。

ＭＣ８−多重クロー二ング部位。

ｍＲＮＡ−メツセンジャーリボ核酸。

０ＲＩ−プラスミドまたはベクターの複製起点であって
、ＤＮＡポリメラーゼの付着部位または開始部位として
働＜ＤＮＡ配列。

ＰｅｎＤＮＡ−ペニシリウム・クリソゲヌムに由来する
ＤＮＡ。

ペニシリンＮ− 式： で示される構造を有する。

ｐｌＰｓ−ペニシリウム；クリソゲヌムのＩＰＳ遺伝子
またはＩＰＳ暗号配列。

ｐｉ　ｐｓｐ−ペニシリウム・クリソゲヌムＩＰＳ遺伝
子のプロモーター ｐｌＰｓｔ−ペニシリウム・クリソゲヌムＩＰＳ遺伝子
の転写ターミネータ− ｐＬ−バクテリオファージ・ラムダの左側プロモーター プロモーター−ＤＮＡの転写の開始を指令するＤＮＡ配
列。

ラセマーゼ活性−本発明の遺伝子または本発明の遺伝子
をプローブとして用いて同定することができるＤＮＡに
コードされており、イソペニシリンＮからペニシリンＮ
への変換、またはその逆の変換を触媒する酵素活性。

組換えＤＮＡクローニングベクター−１またはそれ以上
の付加的なりＮＡ分子を付加し得る、もしくは付加した
ＤＮＡ分子からなる自律的に複製可能または組込み可能
な物質であって、プラスミドを含むがそれに限定されな
い。

組換えＤＮＡ発現ベクター−研究または経済的に重要な
ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントまたはＲＮ
Ａを発現させるような位置にプロモーターおよびその他
の調節配列を含有する自律的に複製可能または組込み可
能な物質であって、プラスミドを含むが、それだけに限
定されない。

組換えＤＮＡベクター−任意の組換えＤＮＡクローニン
グベクターまたは発現ベクター制限断片−１またはそれ
以上の酵素の作用によって生じた任意の直鎖状ＤＮＡ分
子。

ｒＲＮＡ−リポソーム性リボ核酸。

感受性宿主細胞−抗生物質の耐性を付与するＤＮＡ断片
の存在なしにはその抗生物質の存在下に増殖で、きない
宿主細胞。

ＴａＲ−テトラサイクリン耐性を付与する遺伝子。また
テトラサイクリン耐性表現型を示すのに用いる。

転写ターミネーター−ＲＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ
転写を終了させるシグナルを与えるＤＮＡ配列。

トランスフェクタントーファージＤＮＡまたはファージ
粒子に詰め込まれたＤＮＡによって形質転換をうけた受
容宿主細胞。

形質転換体−形質転換をうけた受容宿主細胞。

形質転換−遺伝子型を変化させ、それによって受容細胞
内に変化を起こさせるＤＮＡの受容宿主細胞への導入。

翻訳活性化配列−ｍＲＮＡへ転写されると、ｍＲＮＡの
蛋白質への翻訳を促進する５゛調節ＤＮＡ配列。

ｔＲＮＡ−トランスファーリボ核酸。

ｔｒｐ−大腸菌のトリプトファン・オペロンのプロモー
ターおよび翻訳活性化配列。

添付図面に示した制限酵素切断部位（制限部位）および
機能地図は本明細書で説明する組換えＤＮＮベクターの
概略を示したものである。制限部位に関する情報は限り
がな（、シたがってベクター上には実際に地図に示した
以上の特定型の制限部位があるかもしれない。

第１図はプラスミドｐＯＷ３９０（〜６．２ｋｂ）の制
限部位および機能地図を表す。

第２図はブ５Ｘ！　ドＰＣＺＲＩ　１１（６，３９５ｂ
ｐ）の制限部位および機能地図を表す。

第３図１ｔ２うＸ　！　Ｆｐｏｗａ　９２　（〜８．４
　ｋｂ）の制限部位および機能地図を表す。

第４図はベータラクタム生合成経路のダイアグラムであ
る。

第５ｒＭ４ｔｊ５ｘ　ミＦｐＰＳ　Ｊ　７８　（〜１４
．５ｋｂ）の制限部位および機能地図を表す。

第６図はプラスミドｐＬＣ２（７，０５ｋｂ）　の制限
部位および機能地図を表す。

第７図はプｙｘ　４１／ｐＰＳ　Ｊ　７７　（〜８．８
ｋｂ）の制限部位および機能地図を表す。

第８図Ｊ＊７’ラス！　ＦｐＰＳ　５１　　（７６６１
ｂｐ＞）制限部位および機能地図を表す。

ｊＦＩ９図Ｊ＊プ５ス！　ＦｐＭＬＣｌ　２　（２６７
１ｂｐ）の制限部位および機能地図を表す。

第１０図１！’７’５Ｘ！　）’ｐ３ＳＲ２（９３６２
ｂｐ）の制限部位および機能地図を表す。

本発明は、ストレプトマイセス・クラブリゲルスのラセ
マーゼ活性をコードするＤＮＡ化合物および組換えＤＮ
Ａクローニングベクターならびに発現ベクターを包含す
る。以下に、Ｓ、クラブリゲルスのラセマーゼ活性をコ
ードしたＤＮＡ配列をＳ、クラブリゲルスゲノム内の暗
号領域の３゛末端に接したＤＮＡ部分とともに示す。こ
こでは２本鎖ＤＮＡ分子の「センス」鎖、即ち暗号鎖だ
けを示し、ＤＮＡは５°→３′方向に左から右へ記載し
た。ヌクレオチド配列の番号をＤＮＡ配列の左に示シタ
。ＤＮＡ配列に続いて、ＤＮＡによってコードされてい
るラセマーゼのアミノ酸残基配列をアミノ末端からカル
ボ牛シ末端方向に、左から右へ示した。

ＣＧＧＧＣＴＧＡＴＣＣＴＧＣＣＣＧＣＣＧ　ＣＣＧＡ
ＡＣＴＧＴＧ　ＣＧＡＧＧＡＧＧＣＣＣＧＣＧＣＡＣＧ
ＧＧ５５１　　ＧＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＧＴＧＧＴＣＧ
ｋＣＧＧＣＧＣＣＣＡＣＧ　ＣＡＣＣＣＧＧＣＴＴ　Ｃ
ＣＴＣＧＡＣＣＴＣ（式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇ
はデオキシグアニル、Ｃはデオキシシチジル、Ｔはチミ
ジルを表す。

前記のＤＮＡ配列によってコードされているアミノ酸配
列を以下に示す。

ＮＩＩｇ−Ｍａｔ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓ１ｐ
　ＴｒｐＧｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　ＡｒｇＧｌｙ　Ａｒ
ｇ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ
　Ｖａｎ　ＶａｌＡｓｓｎ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　
Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　ＬｅｕＰｒ
ｏ　ｋｘｑ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｖａｌ
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Ｌａｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｍａｔ　Ａ
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ａ　Ａｒｑ　Ｇｌｕ　ｓａｒ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ａｒｑ
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Ａｓｎ　ＬｅｕＶａｌ　Ａｌａ　Ｓａｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅ
ｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｐｒ。

Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓａｒ　Ａ
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Ｘｑ　Ｉｌｅ　ＳＥＸにＬａ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ
　Ｔｈｒτ七Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ａｍｐ
　Ａｒｑ　ＴＡｕ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｌａシｕ　Ａ！
Ｉｐ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｅｎ
ｄ　Ｓａｒ　Ｐｒ。

Ａｒｑ　Ｔａ＠ｕ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｒｑ　Ｌ＠ｕ　
ｉ’ｒｏ　Ａｒｑ　Ａｌａ　ＶａｌＡｓｐ　Ｈｉｓ　Ｐ
ｒｏ　Ｖａｌ　Ｉｆｉｇ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ｇ
ｌｕ　ＡｇｐＧｌｎ−Ｃｏｏｌ （式中、Ａｌｍはアラニン残基、Ａｒｇはアルギニ”４
！４基、Ａｓｎはアスパラギン残基、Ａｓｐはアスパラ
ギン酸残基、Ｃｙｓはシスティン残基、Ｇｌｎはグルタ
ミン残基、Ｇｌｕはグルタミン酸残基、ＧＩｙはグリシ
ン残基、Ｈｉｓはヒスチジン残基、Ｉｌｅはインロイシ
ン残基、Ｌｅｕはロイシン残基、Ｌｙｓはリシン残基、
Ｍｅｔはメチオニン残基、Ｐｈｅは）Ｊ６二ルアラニン
残基、Ｐｒｏはプロリン残基、Ｓａｒはセリン残基、Ｔ
ｈｒはスレオニン残基、Ｔｒｐはトリプトファン残基、
Ｔｙｒはチロシン残基、Ｍａｌはバリン残基を表す。） 当業者ならば上記ＤＮＡ配列が本発明の重要な部分であ
ることを理解し得よう。上記の配列は、完全に保護され
たデオ牛ジヌクレオチド構築ブロックを使用する改良ホ
スホトリエステル法によって常法通り合成することがで
きる。そのような合成方法は当該技術分野で周知であり
、実質上、イタクラ（Ｉ　ｔａｋｕｒａ）ら［サイエン
ス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、１９８巻、１０５６頁（１９
７７年）］およびクフレアｃｒｅ烏）ら［プ四シーディ
ングズ・オプ・ザ・ナシ璽ナル・アカデミ−・イン・サ
イエンシズ・イン・Ｕ　Ｓ　Ａ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｋ、
　Ａｃａｄ、　Ｓ　ｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ）、７５巻、５
７６５頁（１９７８年）］の方法にしたがって実施し得
る。また特に好ましい方法が、フシラング（Ｈｓｉｕｎ
ｇ）ら［ヌクレイ・ツク・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄ　　Ｒｅ５ａａｒｃｈ）、１１巻
、３２２７頁（１９８３年）］およびナラング（Ｎａｒ
ａｎｇ）ら［メソッズ・イン・エンジモロジー（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　　ｉｎＥ　ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、６８＠、
９０頁（１９８０年）〕によって報告されている。また
上記の手動的な方法に加えて、シスチック（Ｓ　ｙｉｔ
ｅｃ）　１４５０　ＡまたはＡＢＳ［アプライド・バイ
オシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂ　ｉｏ＠ｙ＊ｔｅ
ｍｓ）　８５０、リンカーン・センター・ドライブ（Ｌ
ｉｎｃｏｌｎ　Ｃｅｎｔｒｅ　Ｄｒｉｖｅ）、ホスター
・シティ−（Ｆ　ｏｔｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ）、ＣＡ、９４
４０４コ３８０Ａ　　ＤＮＡシンセサイザーのような自
動ＤＮＡ合成装置を使用してＤＮＡ配列を合成すること
ができる。

上に掲げたラセマーゼ酵素のアミノ酸残基配列は、はと
んどのアミノ酸残基および翻訳停止信号に対応するコド
ンが１個以上存在することに由来する遺伝暗号の同義性
のため、多数の異なったＤＮＡ配列によってコードされ
得る。これらの他のＤＮＡ配列も本発明のアミノ酸残基
配列をコードしており、本発明はこれらの他の配列をも
包含する。

本発明はストレプトマイセス・クラブリゲルスのラセマ
ーゼ活性をコードするＤＮＡ化合物、および組換えＤＮ
Ａクローニングおよび発現ベクターを含む。

本発明のラセマーゼコードＤＮＡ化合物は、ストレプト
マイセス・クラブリゲルスの株から単離された。そのＳ
、クラブリゲルス株の全ゲノムＤＮＡのゲノムライブラ
リーを構築、デオキシリボオリゴヌクレオチド・プロー
ブと相同（ホモローガス）な配列の存在を検討した。こ
のプローブは該Ｓ、クラブリゲルスラセマーゼのアミノ
末端アミノ酸配列について得た情報と、遺伝暗号に関す
る知識およびストレプトマイセスのコドン利用優先度に
関する知識をもとにして構築した。ＤＮＡの配列決定を
行い、どのベクターがＳ、クラブリゲルスラセマーゼを
コードしているかを見出した。

ラセマーゼ遺伝子をコードしていると同定されたｐＯＷ
３７９と称するコスミドの〜３．８ｋｂＫｐｎｌ制限断
片を商業的に入手可能なプラスミドｐＵＣｌ　９（Ｋｐ
ｎｌで消化）に挿入してプラスミドｐＯＷ３９０を作成
し、ついでこれをＥ、コリに１２ＲＲＩΔＭ１５宿主細
胞に導入した。Ｅ、コリに１２ＲＲ１ΔＭ１５／ｐＯＷ
３９０形質転換体はザ番ノーザン・レジオナル・リサー
チ・ラボラトリーズ（Ｔｈｅ　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅ
ｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ（Ｎ　ＲＲＬ　）、ペオリア（Ｐｅｏｒｉａ）、
！Ｌ８１６０４）に寄託され、ＮＲＲＬ　Ｂ−１８２６
４の受託番号のもとにその保存株の一つとして貯蔵され
た（寄託臼、１９８８年１１月１５日）。

添付図面第１図にプラスミドｐＯＷ３９０の制限部位お
よび機能地図を示す。

プラスミドｐＯＷ３９０は本発明の他の発現ベクターの
有用な構築出発物質である。これらのベクターは、特に
（１）（ａ）プロモーターおよび翻訳活性化配列と、（
ｂ）そのプロモーターから発現されるよう配置されたラ
セマーゼ活性をコードしているＤＮＡとを含んでいる組
換えＤＮＡ発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、（２
）段階（１）で形質転換された宿主細胞がラセマーゼ活
性を発現し得る条件下で、該宿主細胞を培養することか
らなる、ラセマーゼ活性を組換え宿主細胞で生産する方
法に有用である。

実施例１に記載した方法により、Ｅ、コリに１２ＲＲ１
ΔＭ１　ｓ、、’ｐｏｗａ９０からプラスミドｐＯＷ３
９０を単離できる。プラスミドｐＯＷ３９０は完全なス
トレプトマイセス・クラブリゲルスラセマーゼ遺伝子を
含んでおり、それは、例えば〜３．６ｋｂＫｐｎｌ制限
酵素断片上にプラスミドから単離できる。Ｅ、コリで高
濃度にラセマーゼ活性を発現させるプラスミド（ｐＯＷ
３９２と命名）の構築出発物質としてプラスミドｐＯＷ
３９０を使用した。Ｓ、クラブリゲルスラセマーゼ暗号
配列の操作を容易にするため、制限酵素Ｎｃｏｌ認識配
列をＳ、クラブリゲルスラセマーゼをコードするＤＮＡ
配列の−２〜＋４の位置に創設した。

Ｎｃｏ１部位の作成はＭ１３部位特異的突然変異変異性
によって行い、ラセマーゼ遺伝子の開始コドン周辺のＤ
ＮＡ塩基をＡＣＡＴＧＧからＣＣＣＡＴＧＧに変化させ
る。当業者ならば、ＤＮＡ突然変異誘発法が制限酵素認
識部位をＤＮＡ配列に導入するのに一般に使用されてお
り、この場合、コードされているアミノ酸配列には変化
のないことを理解し得よう。実施例２で突然変異および
中間構築物についてさらに詳細に説明する。

ブラフ、ミｌ’ｐ（、ＺＲＩ　１１（うＡダルＬ（λｐ
Ｌ）プロモーターおよび翻訳活性化配列、ｃ１８５７ｆ
ｆ１度感受性リプレッサー遺伝子、テトラサイクリン耐
性付与遺伝子およびベクターの複製機能をコードしてい
るＤＮＡ配列を含有する発現ベクターであって、ＮＲＲ
Ｌから受託番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１８２４９の下で入手可
能、寄託臼：１９Ｂ７年８月１１日）にストレプトマイ
セス・クラブリゲルスのラセマーゼ暗号配列を挿入する
ことによって、プラスミドｐＯＷ３９２を組み立てるこ
とができる。詳細なｐＯＷ３９２の構築法は実施例２に
示されている。ラセマーゼ遺伝子を発現させるような位
置にプラスミドｐｃＺＲ１１１のλｐＬ−誘導プロモー
ターが配される。プラスミドｐｃＺＲ１１１またはその
誘導体にコードされたｃ１８５７蛋白質は約３０℃の低
温で活性であり、λｐＬプロモーター活性を抑制できる
が、温度が約４２℃に上昇するとｃ１８５７蛋白質は失
活し、λｐＬプロモーターは目的の遺伝子産物をコード
している多量のｍＲＮＡを転写をさせる。添付図面第２
図にプラスミドｐｃＺＲ１１１の制限部位および機能地
図を示す。

プラスミドｐＯＷ３９２は、プラスミドｐＣＺ　Ｒ１１
１と同様にｃ１８５７遺伝子、λｐｔ、プロモーター、
翻訳活性化配列を含んでいるが、さらにλｐＬプロモー
ターから構成される装置にプラスミドｐＯＷ３９０由来
のラセマーゼ遺伝子暗号配列を含んでいる。プラスミド
ｐＯＷ３９０の〜１．７ｋｂ　５ｔｙｌＴ　−ＢａｍＨ
Ｉ制限酵素断片はラセマーゼの完全な暗号配列を含んで
いる。プラスミドｐＯＷ３９２は、プラスミドｐｃＺＲ
１１１のλｐＬプロモーターおよび翻訳活性化配列を、
ラセマーゼ活性をコードするＤＮＡを発現させるように
配して構築された。添付図面第３図にプラスミドｐＯＷ
３９２の制限部位および機能地図を示す。

約４２℃の温度でＥ、コリに１２ＪＭ１０９／ＰＯＷ３
９２は、総細胞蛋白質の〜５％に近い高濃度のラセマー
ゼ活性を発現する。これらのＥ、コリＫ　１２ＪＭ１０
９／ＰＯＷ３９２形質転換体から得た粗細胞抽出物はイ
ソペニシリンＮのペニシリンＮへの変換を触媒すること
ができるが、形質転換されていないＥ、コリに１２ＪＭ
１０９細胞から得た細胞抽出物はこの変換を触媒できな
い。

変換反応の分析方法および分析結果を実施例４に示す。

多数のＥ、コリに１２株は、恐ら（ａｍｐｃ遺伝子座に
コードされている内在性のベニシリナーゼ活性を含有す
る。したがって最適なラセマーゼ活性を観察し得るよう
、ラセマーゼポリペプチドを部分精製することが望まし
い。この目的のためには、酵素の精製を利用して内在性
Ｅ、コリ・ベニシリナーゼ活性を所望のラセマーゼ活性
から分離することができる。

プラスミドｐＯＷ３９２はＥ、コリで多量のラセマーゼ
を生産する効果的な手段を提供する。Ｅ。

コリの培養は、天然にラセマーゼを産生ずる微生物の培
養よりも複雑でないことから、Ｅ、コリ／ｐＯＷ３９２
形質転換体を用いて、非組換え体ないし「天然」ラセマ
ーゼ産生微生物よりも一層効率的で、−層経済的に組換
えラセマーゼを生産することができる。

実施例３に記載したように、ラセマーゼは細胞不含系で
イソペニシリンＮからペニシリンＮを生産するのに使用
できる。ペニシリンＮは有用な抗生物質であるばかりで
なく、セファレキシンやその他のセファロスポリン類等
の重要な抗生物質生産の出発物質として使用できる（米
国特許第４，３０７．１９２号参照）。恐らくラセマー
ゼの最も重要な用途は、酵素を用いてイソペニシリンＮ
以外のペニシリン類を新規な抗生物質誘導体に変換する
ことにあるだろう。例えば、セファマイシンＣをラセマ
ーゼの基質として用い、天然の生合成経路の逆方向の反
応を触媒することにより、半合成セファロスポリン類の
出発物質である７−アミノセファロスポラン酸形成の基
質となり得るし一アミノアジポイル誘導体を製造するこ
とができる。

ペニシリンおよびセファロスポリン産生微生物の細胞エ
キスを非天然型（天然に生産されない）βラクタムの合
成に使用することができる。本発明のＥ、コリ発現ベク
ターは、ペニシリンをイン・ビトロで改変して新規抗生
物質または抗生物質骨格構造を生成する上で有用なラセ
マーゼ活性を安価かつ効率よく得る方法を提供する。

Ｅ、コリでラセマーゼ活性を発現させるのにプラスミド
ｐＯＷ３９２が特に好ましいのは、このプラスミドの使
用によって高レベルの発現が達成されるからだけでなく
、グラスミ下が選択可能なマーカーを有するためでもあ
る。多数の組換えＤＮＡベクターはβ−ラクタマーゼを
コードしているので、そのベクターを含んだ細胞はアン
ピシリンのようなある種のβ−ラクタム抗生物質の存在
下で発育できる。しかしβ−ラクタムの組み立てを目的
としてラセマーゼ活性を含んだ細胞抽出物を使用する場
合には、β−ラクタマーゼ活性を含まない抽出物を必要
とする。従って、プラスミドｐＯＷ３９２は選択マーカ
ーとしてβ−ラクタマーゼではなくβ−ラクタムと反応
しない蛋白質をコードしている、テトラサイタリン耐性
付与遺伝子を使用する。

ただし本発明のラセマーゼ発現ベクターは特定の選択マ
ーカーに限定されるものではない。当業者ならば多数の
選択マーカーがラセマーゼ発現ベクターに使用するのに
好適であることを理解するであろう。そのような選択マ
ーカーとして、カナマイシン耐性を付与する遺伝子、ク
ロラムフェニコール耐性を付与する遺伝子またはその他
の抗生物質耐性を付与する遺伝子等が挙げられる。

ラセマーゼの基質として使用し得る非天然型ペニシリン
の探索は、他のペニシリンを基質として受は容れる突然
変異体ラセマーゼ酵素の探索によって補うことができる
。本発明はそのような突然変異体ラセマーゼ探索のため
の出発物質を提供し、ラセマーゼ暗号配列の突然変異誘
発によって誘導されたＤＮＡ化合物を包含する。Ｅ、コ
リは変異性クローニング実験の好ましい宿主であり、本
発明のＥ、コリ発現ベクターを、例えば放射線処理（Ｘ
線またはＵＶ）または化学的突然変異誘発剤（エチルメ
タンスルホナート、ニトロソグアニジン、またはメチル
メタンスルホナート等）または部位特異的突然変異のよ
うな当該技術周知の方法によって突然変異させ、非天然
型ペニシリンを基質として認識する突然変異酵素を得る
ことは容易である。

当業者ならば理解し得ることであるが、本発明によって
ラセマーゼ遺伝子のコドンを意のままに変化させること
ができる。ラセマーゼ遺伝子のＤＮＡ配列が与えられれ
ば当業者周知の方法を用いて天然のラセマーゼ酵素と、
任意の位置番号のアミノ酸残基が変化した突然変異体ラ
セマーゼ酵素を生成することができる。そのような突然
変異体酵素は、天然のラセマーゼ暗号配列からアミノ酸
コドンを欠失し、または挿入してなる配列を含む突然変
異体ラセマーゼ暗号配列によってコードされているであ
ろう。また特定の突然変異によって、コードされている
ラセマーゼ活性が破壊されるかどうかを完全に予知でき
ないとしても、ラセマーゼ活性に対する効果の確認に必
要なことは突然変異体配列の発現のみであることから、
そのような突然変異ラセマーゼ酵素も本発明範囲に含ま
れる。

本発明は本明細書に例示した特定のベクターに限定され
ない。本発明はストレプトマイセス・クラブリゲルスの
ラセマーゼ活性をコードしたＤＮＡ化合物を包含する。

本発明のＤＮＡ化合物は発現ベクターが複製し、または
組み込み可能であって、プロモーターおよび翻訳活性化
配列が機能する任意の宿主細胞内でラセマーゼ活性を発
現させるための発現ベクターの構築に使用できる。

従って、本発明はＥ、フリでラセマーゼ活性を発現させ
る任意のＥ、コリ発現プラスミドまたはベクターを包含
する。このように本発明は、ラセマーゼ活性を発現し、
例えばｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、Ｆ、Ｃｏ１Ｖ
−に９４、Ｒ１，Ｒ６−５、またはＲ１００のようなプ
ラスミド由来のレプリコンのようにＥ、コリで機能する
レプリコンを利用する発現ベクターを包含する。本発明
は単にプラスミドベクターだけに限らず、さらにラセマ
ーゼ活性を発現し、組込みまたはウィルス複製を利用し
て宿主細胞内で複製および維持される発現ベクターをも
包含する。

本発明はラセマーゼ活性をコードするＤＮＡの発現に特
定のプロモーターおよび翻訳活性化配列の使用に限定さ
れるものではない。本発明はＥ。

コリ内で機能し、Ｅ、コリ内でのラセマーゼの発現に使
用し得る任意のプロモーターおよび翻訳活性化配列の利
用を包含する。Ｅ、コリ内で機能する多数のプロモータ
ーおよび翻訳活性化配列が知られており、これらはラセ
マーゼ活性をＥ、コリで発現させるのに好適である。そ
のような転写活性化および翻訳活性化配列にはＩｐｐ、
Ｉａｃ、　ｔｒｐＳｔａｅ、λｐＬおよびλｐｒプロモ
ーターおよび翻訳活性化配列があるが、それだけに限定
されない。

また、他の微生物由来の転写活性化および翻訳活性化配
列を本発明のラセマーゼ活性をコードするＤＮＡ化合物
を結合させ、その活性化配列が機能する宿主細胞内でイ
ソペニシリンＮエピメラーゼ活性を発現させ得る発現ベ
ク、ターを形成することができる。ラセマーゼの生産お
よびそれに続くインビトロ使用のための精製にとってＥ
、コリは最適な宿主であるが、Ｅ、コリ以外の微生物で
イソペニシリンＮエピメラーゼ活性を発現させるベクタ
ーも、とりわけ、特定の微生物の抗生物質生産能および
効率を増大させる目的に有用である。

多数の微生物がβ−ラクタム抗生物質を生産する。下記
の表はβ−ラクタム抗生物質を生産する微生物の一部を
示したものである。

！±老：β−ラクタム抗生物質産生微生物微生物　　　
　　　　　抗生物質 （Ａ　ｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕ＋ａ）アラクツマイセ
スφ ミニムス （Ａ　ｒａｃｈｎｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｎｉｍｕｓ）ペニ
シリンおよび セファロスポリン アニクシオンシス・ ペルピアナ （Ａ　ｎ１ｘｉｏｐｓｉｓ　ｐｅｒｕｖｉａｎａ）ペニ
シリンおよび セファロスポリン セファロスポリウム （Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ） アクレモニウム （Ｃ、ａｃｒｅｍｏｎｉｕ＋ｓ） ペニシリンおよび セファロスポリン ププラノセンス （Ｃ，ｐｕｐｕｒａｓｃｅｎｓ） ポリアレウルム （Ｃ，ｐｏｌｙａｌｅｕｒｕｍ） クリソゲヌム （Ｃ，ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ） クルチペス （Ｃ，ｃｕｒｔｉｐｅｓ） クロモバクテリウム （Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ） エメリケロプシス （Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌｏｐｓｉｓ） テリコラ （Ｅ　、　　ｔｅｒｒｉｃｏｌａ） ミニマ （Ｅ、　ｍｉｎｉｍａ） シンネマチコラ （Ｅ、　５ｙｎｎｅｓａｔｉｃｏｌａ）グラブラ （Ｅ、　　ｇｌａｂｒａ） ミラビリス （Ｅ、　５ｉｒａｂｉｌｉｓ） サルモシンネマータ （Ｅ、　５ａｌｓｏｓｙｎｎｅｓａｔａ）各種のβ−ラ
クタム ペニシリンおよび セファロスポリン フラボバクテリウム （Ｆ　１ａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｓ） グルコノバクタ− （Ｇ　１ｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ） ノカルジア （Ｎｏｃａｒｄｉａ） ラクタマズランス （Ｎ、　ｌａｃｔａｍａｄｕｒａｎｓ）ユニホルミス （Ｎ、　ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ） バエシロマイセス （Ｐａｅａｉｌｏａｙｃｅｓ） カルネウス （Ｐ、　　ｃａｒｎｅｕｓ） ペルシキヌス （Ｐ、　　ｐｅｒｓｉｃｉｎｕｓ） ペニシリウム・ クリソゲヌム ＣＰ　、　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｓ） 各種のβ−ラクタム 各種のβ−ラクタム セファマイシンＣ ノカルジシン ペニシリンおよび セファロスポリン 各種のペニシリン およびβ−ラクタム セラチア （Ｓ　ｅｒａｔｉａ） スピロイジウム・フスクム （Ｓ　ｐｉｒｏｉｄｉｕｓ　ｆｕｓ＋ｃｕｓ）ストレプ
トマイセス （Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ） アンチビオチフス （Ｓ　、　　６ｎｔ　１ｂｉｏｔ　１ｃｕｓ）アルゲン
テオルス （Ｓ、　ａｒｇｅｎｔｅｏｌｕｓ） カットレヤ （Ｓ、　　ｃａｔｔｌｅｙａ） カルトレウシス （Ｓ、　ａｈａｒｔｒｅｕｓｉｇ） シンナモネンシス （３，６ｉ１Ｈ會ｏｎｅｎｓｉｓ） 各種のβ−ラクタム ペニシリンおよび セファロスポリン クラプラン酸 アスバレノマイシン Ａ、ＭＭ４５５０、 ＭＭ１３９０２ チェナマイシン ＳＦ　１６２３、セファ マイシンＡおよびＢ セファマイシンＡ およびＢ クラブリゲルス （Ｓ、　ｃｌｌｖｕｌｉｇｅｒｕｓ） フィムブリアツス （Ｓ、　ｆｉａ＋ｂｒｉａｔｕｓ） フラボビレンス （Ｓ、　Ｈａｖｏｖｉｒｅｎｓ） クラバス （Ｓ、　　ｆｌａｖｕｓ） フルボピリシス （Ｓ、　ｆｕｌｖｏｖｉｒｉｄｉｓ） グリセウス （Ｓ、　ｇｒｉｇｅｕｓ） ハルステジ （Ｓ、　ｈａｌｓｔｅｄｉ） ヘテロモルフス （Ｓ、　　ｈｅｔｅｒｏｍｏｒｐｈｕｓ）ＰＡ〜３２４
１３−１、 セファマイシンＣ１ Ａ１６８８８Ａ、ペ ニシジン、セフ１０ スポリン、クラプラ ン酸およびその他の フラバム セファマイシンＡ およびＢ ＭＭ４’５５０．ＭＭ ＭＭ４５５０、ＭＭ ＭＭ４５５０５ＭＭ セファマイシンＡお よびＢ１カルペチマ イシンＡおよびＢ セファマイシンＡ およびＢ Ｃ２０８１Ｘ、セファ マイシンＡおよびＢ ヒゲロスコピカス （Ｓ、　ｈｙｇｒｏ＠ｃｏｐｉｃｕｇ）デアセトキシセ
フ１ ０スポリンＣ リプマニイ （Ｓ、　１ｉｐｓａｎｉｉ） セファマイシン、ペ ニシリンＮ、？−メ トキシセファロスポ リンＣ，Ａ１６８８ ４、ＭＭ４５５０、 ＭＭ１３９０２ オリバケウス （Ｓ、　ｏｌｉｖａｃｅｕｓ） エビチェナマイシン Ｆ、ＭＭ４５５０、 ＭＭ１３９０２ パナエンシス （３，ｐ＠ｎａｙｅｎｓｉｓ） Ｃ２０８１Ｘ、セファ マイシンＡおよびＢ ブルラキドマイセチ力ス　プルラキドマイシンＡ（Ｓ、
　ｐｌｕｒａｃｉｄｏｓｙｃａｔｉｃｕｓ）ロケイ （Ｓ、ｒｏｃｈｅｉ） セファマイシンＡ およびＢ シオヤエンシス （Ｓ、　ｓｉｏｙａｅｎｓｉｓ） ＭＭ４５５０、ＭＭ ｇｐ、０Ａ−６１２９ ＯＡ−６１２９Ａ ｓｐ、ＫＣ−６６４３ カルペチマイシンＡ トクノメンシス （Ｓ、　　ｔｏｋｕｎｏｍｅｎｓｉｓ）アスパレノマイ
シンＡ ピリドクロモゲネス　　　セファマイシンＡ（Ｓ、　ｖ
ｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｇ）およびＢワダヤメ
ンシス　　　　　ＷＳ−３４４２−Ｄ（Ｓ、　ｗａｄａ
ｙａｓｅｎｓｉｓ） 以上列記したβ−ラクタム抗生物質産生微生物の幾つか
は製薬産業における抗生物質生産の目的に使用される。

これらの微生物の抗生物質産生能は、発酵中の抗生物質
生合成酵素の細胞内濃度を増大させることによって増大
し、−層効率を高めることができる。本発明のラセマー
ゼ活性をコードするＤＮＡ化合物を用いて発現ベクター
を構築し、ラセマーゼ活性が関与する中間反応を介して
β−ラクタム抗生物質を生産することを条件として適当
な宿主細胞に導入し、形質転換宿主細胞の細胞内ラセマ
ーゼ活性濃度を増大させ、それによって細胞の抗生物質
産生能および効率を増大することができる。

宿主細胞に導入されたとき細胞内ラセマーゼ活性の濃度
を増大させ得るベクターは、以下の要素、（１）本発明
のラセマーゼ活性をコードしているＤＮＡ化合物、およ
び（２）形質転換される宿主細胞内で機能するだけでな
く、ラセマーゼ活性をコードしているＤＮＡを発現させ
得る正しい方向および位置に配置されたプロモーターお
よび翻訳活性化配列を必要とする。安定な形質転換体は
、いうまでもなく宿主細胞でベクターが染色体外要素ま
たはゲノムＤＮＡへ組み込まれた要素のいずれかとして
複製された場合にのみ得られる。このように好ましいベ
クターは、宿主細胞でベクターの複製または組み込みを
特異的に指令する配列を含んでいる。しかしＤＮＡを宿
主細胞に導入すると、ときに非特異的な組み込みが起こ
ることがあるので、そのような特異的な複製または組み
込み配列の存在が絶対必要というわけではない。またラ
セマーゼ発現ベクターは、抗生物質耐性を付与する遺伝
子またはその他の、該ベクターを含んだ宿主細胞を選択
する手段を提供するなんらかの要素をも含んでいるが、
ベクターが宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれる場合
には、そのような選択可能な要素は必要な（、また望ま
しくない。

ストレプトマイセス・クラブリゲルスのラセマーゼ遺伝
子の暗号配列を提供することによって、本発明は形質転
換に感受性を有する任意の微生物のためのラセマーゼ発
現ベクターを提供する。上記のＥ、コリラセマーゼ発現
ベクターは本発明の広範囲に及ぶ発現ベクターを例示し
たものである。

ただし本発明の好ましいベクターの多くはζβ−ラクタ
ム抗生物質（ペニシリンおよびセファロスポリン等）を
生産する細胞内でラセマーゼを発現させるように設計さ
れている。

本発明のベニシリウムベグター類は、そのようなβ−ラ
クタム抗生物質産生細胞からの抗生物質生産量を増大さ
せ、あるいは細胞が正常に産生ず６抗生物質を変えるの
に使用可能な、本発明によって提供されるベクターを例
示したものである。そのような例示ベクターの一つであ
るｐＰＳＪ７８と命名されたベクターは、本発明のラセ
マーゼ暗号配列を発現させる位置にペニシリウムのイソ
ペニシリンＮ合成酵素（Ｉ　ＰＮＳ）遺伝子のプロモー
ターを含んでいる。添付図面第５図にプラスミドｐＰＳ
Ｊ７８の制限部位および機能地図を示す。

プラスミドｐＰＳＪ７８および種々の有用な中間体の構
築プロトコールは実施例４に記載されている。ｐＰＳＪ
７８構築の第１段階において、プラスミドｐＯＷ３９２
を、プラスミドを一回切断する制限酵素であるＥｃｏＲ
Ｉで切断する。次いで、得られた線状ＤＮＡを制限酵素
Ｎｃｏｌで部分消化し、ストレプトマイセス・クラブリ
ゲルスの天然のプロモーターおよび翻訳活性化配列を含
有する〜５００ｂｐＥｃｏＲＩ−ＮｃｏＩ断片を除去す
る。その箇所にプラスミドＩ）　Ｌ　Ｃ２［Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ　ＴｙｐｅＣｏ　ｌ　ｌｅｅ　ｔ　ｉｏｎからＡ
ＴＣＣ５３３３４（寄託臼＝１９８５年１１月２０日）
の下で入手可能］から得た、ペニシリウム・クリソゲヌ
ムのイソペニシリンＮ合成酵素のプロモーターと翻訳活
性化配列とを含有する〜９２５ｂｐＥｃｏＲＩ−Ｎｃｏ
ｌ断片を挿挿入する。得られたプラスミドをｐＰＳＪ７
７と命名した（第７図）。プラスミドｐＰＳＪ７Ｂ構築
の最終段階では、プラスミドｐＰｓ５１由来のアスペル
ギルス・ニズランスのアセトアミダーゼ遺伝子を含有す
る〜５．６５ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片をＥｃｏＲＩ　消化
ｐＰ　Ｓ　Ｊ　７７に挿入する。アセトアミ１−−１１
１’遺伝子は、ペニシリウムでの選択マーカーとして働
く。

ペニシリウム・クリソゲヌムはアセトアミドのみを窒素
供給源として成長することができないので、栄養要求株
のような特殊な受容株を構築する必要がないことから、
アセトアミダーゼ遺伝子を含有する発現ベクターはペニ
シリウム・クリソゲヌムに遺伝子を挿入するためのベク
ターとして特に有用である。形質転換用プラスミド内の
遺伝子によって栄養要求性マーカーを補充するという点
に基く形質転換系は、上記の利点を持たない。ペニシリ
ン産生のために高度に発展されたＰ、クリソゲヌム株へ
の栄養要求性マーカーの挿入には、しばしば多面発現突
然変異が伴う。そのような突然変異は、通常、ペニシリ
ン生産の低下を招（［マルトナルトら、Ｊ　、　Ｇｅｎ
、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　　３３　：　３６５−３７
４（１９６３）］。

上記のおよび以下に示す実施例に記載したベクター類は
、本発明によって提供される多くのラセマーゼ発現ベク
ターの例示にすぎない。欧州特許公開Ｎｏ、０２８１３
９１（１９８８年９月７日公開）には、セファロスポリ
ウム・アクレモニウムのエキスパンダーゼ−ヒドロキシ
ラーゼ遺伝子の５°および３°調節シグナルに関する記
載がある。

これらのシグナルと本発明のラセマーゼ暗号配列とを組
合わせて、特にセファロスポリウムでの使用に好適な本
発明のラセマーゼ発現ベクターを構築することができる
。欧州特許公開第０２００４２５号（１９８６年１２月
１０日公開）にはセファロスポリウム・アクレモニウム
Ｉ　ＰＮＳ遺伝子の転写および翻訳活性化配列が開示さ
れているが、これらの配列と本発明のストレプトマイセ
ス・クラブリゲルスのラセマーゼ暗号配列とを融合させ
て、セファロスポリウム内でＳ、クラブリゲルスラセマ
ーゼ暗号配列を発現させる（発現ベクターに挿入し、そ
のベクターでセファロスポリウムを形質転換したとき）
組換えラセマーゼ遺伝子を作り出すことができる。

本発明のラセマーゼ発現ベクターは、任意の細胞でラセ
マーゼ活性の細胞内濃度を増大させるのに有用であり、
特にβ−ラクタム抗生物質産生細胞において有用である
。プラスミドｐＯＷ３９０はストレプトマイセス働タラ
ブリゲルスのラセマーゼ遺伝子の暗号配列を含んでいる
ので、プラスミドｐＯＷ３９０はラセマーゼ遺伝子のコ
ピー数を増大させ、したがって該酵素の細胞内濃度を増
大させるベクターの構築に使用できる。本発明のラセマ
ーゼ暗号配列はストレプトマイセス宿主細胞から単離さ
れたので、ラセマーゼ暗号配列は、ストレプトマイセス
宿主細胞で高濃度のラセマーゼを発現させるよう設計さ
れた発現ベクターに使用するのに特に好都合である。文
献上、ストレプトマイセス発現ベクターの構築およびス
トレプトマイセス宿主細胞の形質転換技術については多
数の報告がある［例えばガルシアードミングエッツ（Ｇ
ａｒｃｉａ　−Ｄ　ｏｍｉｎｇｕｅｚ）ら、アプライド
・アンド−ｚンビロンメンタル・マイクロバイオ口’）
−（Ａｐｐｌｉｅｄ　　ａｎｄ　　Ｅｎｖｉｒｏｒｎｅ
ｎｔａｌ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｌｏｇｙ）、　５３巻（６
）、１３７６〜１３８１頁（１９８７年）参照］。

本発明のラセマーゼ暗号配列はストレプトマイセス・プ
ロモーターおよびレプリコンを含んだ発現ベクターに容
易に挿入でき、そのような用途のために多数の既知のス
トレプトマイセス・プロモーターおよびレプリコンが入
手できる。網羅的なものではないが、第■表にストレプ
トマイセス・レプリコンを得ることが可能なストレプト
マイセス・プラスミドの例を列挙した。当業者は、レプ
リフン機能が破壊されない限り、この表に列挙したプラ
スミドのすべてまたは一部が本発明のラセマーゼ遺伝子
を含んだベクター構築に利用できることを認めるであろ
う。また第■表にプラスミドを含有する宿主および受託
番号を示した。

第■表Ｃ ストレプトマイセス・プラスミド プラスミド　　　　ホスト 受託番号 ＳｅＦ２ ＳｅＦ６” ＥＬ７ Ｓ、コエリカラーＡ３（２） （ｃｏｅｌ　１ｃｏｌｏｒ） Ｓ、コエリカラー輩１１Ｇ （ｃｏｅｌ　１ｃｏｌｏｒ） Ｓ、アンボファシエンス／ＰＥＬ７ （ａｍ＋ｂｏｆａｃｉｅｎｓ） ＲＲＬ ＲＲＬ ＲＲＬ ｐｔ＋ｃａ Ｓ、ニスピノサス （ｅｇｐｉｎｏｓｕｓ） ＲＲＬ ＵＣ３ Ｓ　、　３０２２Ａ ＲＲＬ ＬＰＩ Ｓ、リビダンス （ｌｉｖｉｄａｎｓ） ｐＮＭｌｏｏ　　Ｓ、バージニアエ （ｖｉｒｇｉｎｉａｅ） ｐＥＬ１０３　　Ｓ、グラヌロルーバーＡ３９９１２．
１３／ｐＥＬ１０３ （ｇｒａｎｕｌｏｒｕｂｅｒ） １Ｊ７０２ Ｓ、リビダンス （ｌｉｖｉｄａｎｓ ＮＣＩＢ’　１１４１７ ＲＲＬ ＲＲＬ ＾ＴＣＣ”　３９１５５ １ナシ１ナル・コレクシ５ン・オン・インダストリアル
・バクテリア（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎｏｒ　　１　ｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｂａｃｔｅｒｉａ
）（ＮＣＩ　Ｂ）、トリー・リサーチ・ステーション（
Ｔｏｒｒｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５ｔａｔｉｏｎ）、ポ
スト・オフィス・ボックス（ＰｏｓｔＯｆｆｉｃｅ　Ｂ
ｏｘ）３１．１３５アベイ・ロード（Ａｂｂｅｙ　Ｒｏ
ａｄ）、アバディーン（Ａ　ｂｅｒｄｅｅｎ）　Ａ　Ｂ
　９８ＤＧ、スコツトランド（Ｓ　ｃｏｔｌａｎｄ）、
ユナイテ、ド、キングダム（Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄ
ｏｍ）。

”アメリカン・タイプ・カルチャー・フレクシ璽ン（Ａ
ｓｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎ）、Ｏツクビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、
ＭＤ２０８５２゜また本発明のストレプトマイセス・ク
ラブリゲルスラセマーゼ暗号配列を、ストレプトマイセ
スの他の株およびペニシリウム、セファロスポリウムま
たは任意の他の宿主細胞から誘導された転写および翻訳
活性化配列の制御下に置き、特定の微生物に使用するた
めの組換えラセマーゼ遺伝子を構築することができる。

以下に実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明する。

実施例は単に発明を説明するためのものであって、これ
によって発明の範囲を限定するもものではない。

寒塵烈１ Ａ、Ｅ、コリに１２ＲＲ１ΔＭ１５／ＰＯＷ３９０の培
養 Ｅ、＝ｌ！ＪＫ１２　　ＲＲ１１Ｍ１５／ｐＯＷ３９０
の凍結乾燥品はザ・ノーザン・レジオナル・リサーチ・
ラボラトリーズ（ＮＲＲＬＸペオリア、■Ｌ６１６０４
）から受託番号ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８４３１（寄託臼、
１９８７年１１月１５日）のもとに入手でき、これを下
記のプロセスに、「培養物」として直接使用する。

アンピシリン１００μ９７Ｒ（ｌを含有するＴＹブロス
（１リットル当り、トリプトファン８９、ＮａＣＱ５９
および酵母抽出物５９）１リツトルにＥ、フリに１２　
ＲＲＩΔＭ１５／ｐＯＷ３９０の培養物を接種し、３７
℃で通気しながら１夜インキニベートシた（１５〜１８
時間）。得られた培養をプラスミドｐＯＷ３９０の出発
物質として使用した。

Ｂ、プラスミド０Ｗ３９０の単離 実施例ＩＡで作成した培養を４℃、５２００ｒｐ鵬で１
０分間遠心して細胞をペレット化した。上清を棄てた。

細胞ベレットを、２５％スクロースおよび５０ａＭＥＤ
ＴＡからなる溶液２８１（Ｉに再浮遊した。５０％グリ
セリンおよび０．２５Ｍ）！ＪスーＨＣＱ（ｐＨ８，０
）中２０　ｍｙ／　ｚ（ｌリゾチーム溶液的１ｍｅおよ
び０．５Ｍ　ＥＤＴＡ約１　、５　ｍｅ（ｐＨ８，０）
を細胞浮遊液に添加し、混合した。得られた混合物を水
上で１５分間インキュベートした。

リゾチームで処理した細胞に溶解液（１０％トリトン−
Ｘ１００　３ｘＱ、０．２５Ｍ　　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，
０）７５ｉＱおよび水７ｉ１２から調製’）３ｘ（ｌを
静かに混合しながら添加した。得られた溶液を水上でさ
らに１５分間インキュベートした。

４℃、１７，０ＯＯｒｐ霧で約４５分間の遠心により細
胞残屑を溶液から除去した。〜３０酎の上清にＣ５ＣＱ
約２８．６９および５　ｍｙ／　ｚ（ｌの臭化エチジウ
ム溶液〜１ｘＱを添加した。ついで容量を水で４０ｇ＋
（ｌに調節し、溶液を超遠心用試験管にデカントした。

試験管を密閉し、４９５００　ｒｐｍで〜１８時間遠心
した。紫外線で観察して、生じたプラスミド・バンドを
単離し、塩飽和インプロパツールで抽出して臭化エチジ
ウムを除き、ＴＥ緩衝液（１０−Ｍ　トリス−ＨＣｌ！
（ｐＨ７，５）および１ｍＭＥＤＴＡ）〜２０容量で透
析し、透析液を３回とり替えて行った。透析物を集め、
ついでエタノール２容量および３Ｍ酢酸ナトリウム溶液
０，０５容量を添加した。エタノール混合物を一２０℃
に冷却し、−１０℃、１００００ｒｐａ＋で３０分間遠
心によりプラスミドＤＮＡをペレット化した。得られた
ベレットをＴＥ緩衝樹液Ｌｘ（ｌに再浮遊し、これを等
容量のフェノール：クロロホルム混合ｉ（ｔ：　１　％
ｖ／ｖ）で抽出した。３Ｍ　　Ｎａ０Ａｃ０．１容量お
よびエタノール２容量を添加することによって水層のＤ
ＮＡを回収し、これを−２０℃で〜３０３０分間インキ
ュベート１５０００ｒｐａ＋で２０分間遠心した。得ら
れたＤＮＡベレットをまず７０％のエタノール、ついで
１００％のエタノールで洗浄し乾燥した。

この方法によって得られたプラスミドｐＯＷ３９０　Ｄ
ＮＡ（７）　〜１．５ｕを０．ＩＸＴＥ緩衝液ｌ樹液Ｊ
ＩＱ１．ｌ：浮遊し、−２０℃で貯蔵した。添付図面第
１図にプラスミドｐＯＷ３９０の制限部位および機能地
図を示す。

実施例２　プラスミドｐＯＷ３９２の構築Ａ、＊０Ｗ３
９０の構築 種々の方法および遺伝子配列供給源を使用して同一のプ
ラスミドを構築することができる。下記Ｂ記載の如くに
して構築したプラスミドｐＯＷ３９０の〜０．９　ｋｂ
　Ｓ　ｔｙ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ制限断片と下記Ｃの如く
にして構築した。複製型（ＲＦ）Ｍ１３ベクターのＨｉ
ｎｃＩＩ−ＢａｍＨＩ消化物と結合させることによって
ファージｍ０Ｗ３９０を構築した。

０、９ｋｂ　５ｔｙｌ　−ＢａｍＨＩ断片はラセマーゼ
遺伝子の大部分を含有しており、その５°末端をも含ん
でいるが３′末端は含まない。５ｔｙｔ末端を“充填”
して平滑末端化し、平滑末端化したＨｉｎｃ■末端と結
合し得るようにした。プラスミドｐＯＷ３９０クローン
は、ストレプトマイセス・クラブリゲルスのゲノムコス
ミド・ライブラリーから導かれたコスミドｐＯＷ３７９
クローンに由来する。

コスミドｐＯＷ３７９を、精製したＳ、クラブリゲルス
のラセマーゼのアミノ末端アミノ酸残基配列および種コ
ドンー利用偏りに基づいて設計された「ゲスマー（ｇｕ
ｅｓｓｍｅｒ）　Ｊ　Ｄ　Ｎ　Ａプローブを使用するハ
イブリダイゼーシヨンによって同定した。所望のファー
ジＭ１３クローンは「ゲスマー」プローブを使用するブ
ラークハイブリダイゼーシ璽ン法により、または制限酵
素分析によって同定できる。

しかしながら本発明によって、主としてプラスミドｐＯ
Ｗ３９０をＳ、クラブリゲルスラセマーゼ遺伝子の供給
源として使用し得るので、ａＯＷ３９０の構築が極めて
簡単となる。Ｍ１３で誘導されたファージ、０Ｗ３９０
は、Ｓ、クラブリゲルス・ラセマーゼ暗号配列の５°末
端にＮｃｏＩ制限酵素認識部位を作り出すため実施され
る部位特異的突然変異における際の有用な中間体である
。

実施例ＩＢで作成したプラスミドｐＯＷ３９０ＤＮＡ約
２５μｙの０．１ｘＴＥ緩衝液２５μ＆浮遊枝を１０Ｘ
Ｓｔｙｌ緩衝液（１，０Ｍ　ＮａＣ４，５００５Ｍトリ
ス−ＨＣｌ２（ｐＨ８，０）および１００５Ｍ　　Ｍｇ
Ｃｆｆ＊）　４０１１　Ｑ−ガラス蒸留水３３５μ１２
および制限酵素５ｔｙｌ　　５Ｍｇ（〜５０単位）に添
加して混合した。特に記載しない限り、制限酵素はニュ
ー・イングランド・バイオラブズ［（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ
ａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｇ）、３２トザー・ロード（Ｔｏ
ｚｅｒ　Ｒｏａｄ）、ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）、Ｍ
ＡＯ１９１５］から入手した。本明細書中、単位の定義
は各製造業者の単位の定義に対応する。得られた反応物
を３７℃で９０分間インキニベートした。次いで、マニ
アテイスら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　
Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２．ｐｐｌ　
１３〜１１４）の方法に従い、５ｔｙｔ末端を平滑化（
“充填”）した。次いでフェノールおよびクロロホルム
で反応混合物を抽出し、５ｔｙｌで消化したプラスミド
ｐＯＷ３９０　ＤＮＡを０．３Ｍ　Ｎａ０Ａｃおよびエ
タノールで沈澱させ、これをＩＸＢａｍＨＩ緩衝液（１
００ａＭＮａＣＩ２．１０＋Ｍ　　ト！ｊ　ス−ＨＣ（
１，ｐＨ＝７．５．１０ａＭＭｇＣ１２，）４５　ｕ　
（ｌに再懸濁した。制限酵素Ｂａ５Ｈ■　５μｅ（〜５
０単位）を加え、混合物を３７℃で９０分間インキニベ
ートした。次いで、反応混合物をフェ／−ルおよびクロ
ロホルムで抽出した後、０．３Ｍ　Ｎａ０Ａｃおよびエ
タノールでＢａ５ＨＩ−Ｓｔｙｌ（平滑）消化プラスミ
ドｐＯＷ３９０を抽出＼ し、Ｈ，０９μＱに再懸濁した。負荷緩衝液（２５％、
ｖ／ｖグリセリン、０．０５％ｗ／ｖブロムフェノール
ブルーおよび０．０５％キシレンシアツール）約１μＱ
をＤＮＡ溶液へ添加し、ついで所望の０、９ｋｂ　Ｂａ
ｍＨｌ−５ｔｙｌ制限断片が他の消化生産物から明らか
に分離されるまで１％アガロースゲル上で電気泳動する
。

ゲルを希臭化エチジウム溶液（０，５μｙ／ｍＱ）で染
色し、染色したゲルを長波長紫外線で照射することによ
って電気泳動されたＤＮＡを可視化した。

断片の位置を確かめたのち〜０．９ｋｂ断片の前でゲル
に小切り込みを作り、切り込みにシュライヒャ−（Ｓ　
ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ）およびシ１エノ喧５ｃｈｕｅｌｌ
）［キーン（Ｋ　ｅｅｎｅ）、ＮＨＯ３４３１］のＤＥ
ＡＥ膜を置いた。さらに電気泳動すると、ＤＮＡは非共
有結合的にＤＥＡＥ膜に結合した。所望の断片をＤＥＡ
Ｅ膜に結合させたのち、膜を取り、低塩緩衝液（１００
ｓＭＮａＣＩ２、　Ｏ，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、　　２０
ｍＭ　トリス−ＨＣ１２（ｐＨ８））で洗浄した。つぎ
に膜を小試験管に入れて、高塩緩衝液（ＩＭＮａＣ（！
。

０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２０量Ｍ　トリス−ＨＣ１２（
ｐＨ８））に浸漬させ、６５℃で１０分間インキ１ベー
トしてＤＮＡをＤＥＡＥペーパーから遊離させた。

６５℃でインキ−ベージ璽ン後、インキニベーシ冒ン緩
衝液を集め、膜を高塩緩衝液で洗浄した。所望のＤＮＡ
断片を採取する前に洗浄液とインキエベーシ１ン緩衝液
をプールした。

ＮａＣｌ２濃度が０．２５Ｍとなるように高塩−ＤＮＡ
溶液の容量を調節し、ついで冷無水エタノール３容量を
溶液に添加した。得られた溶液を混合し、氷上で１０〜
２０分間放置した。ついで溶液を１５００Ｏｒｐｍで１
５分間遠心した。もう−度沈澱させたのち、残りの塩を
除去し、ＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、
乾燥し、ＴＥ緩衝液２０μｅに再浮遊させて、所望の制
限酵素断片を構成した。〜０，９ｋｂの断片的０．２μ
９が得られた。

９０の構築 Ｍ１３麿ｐ１８ＲＦ　ＤＮＡ（二ニー・イングランド・
バイオラブズ（ＮＥＢ）から入手できる）約２゜５μ２
を、制限酵素ＢａｍＨＩ　１　μ１２（〜２０単位）に
よりＢａ５ＨＩ緩衝液１００μｅ中、３７℃で９０分間
消化した。反応混合物を上記の如く抽出して沈殿させ、
０．ＩＸＴＥ緩衝液２０μｅに再懸濁し、所望のＢａｍ
Ｈｌ−Ｈｌｎｃｌ［消化ベクター〜２μグを構成した。

他のＢａａＨ［−ＨｌｎｃＩ［断片は〜１０ｂｐにすぎ
ず沈殿しなかった。これはライゲージ茸ンの妨げとはな
らなかった。

上記Ｂで得たプラスミドｐＯＷ３９０の〜０．９ｋｂＢ
ａｍＨＩ−８ｔｙｌ制限酵素断片２ａ（ｌとＢａａＨｌ
−ＨｉｎｃＩ［消化ベクターＭ１３ｍｐ１８　１μ１２
を２０μＱの反応混合物［ＤＮＡ断片、ＩＯＸリガーゼ
緩樹液（０，５Ｍ　　）’ＪスーＨＣｆｆ１（ｐＨ７，
５）および１００ｓ＋Ｍ　ＭｇＣＱ＊　２ｘｉ２．５ｍ
Ｍ　ＡＴ　Ｐ　２　ｔｔ（１゜６Ｍｇ／μ１２ＢｓＡ　
　１μ（１，ガラス蒸留水１２ａＱおよびＴ４　ＤＮＡ
！Ｊガーゼ（ＮＥＢ）ｌμｅ（１’フイス単位）を含有
］中で結合させた。“充填”した５ｔｙｘ末端はＨｆｎ
ｃｎ平滑末端と結合し得る。反応混合物を１５℃で１８
時間インキュベートした。

結合したＤＮＡは他のライゲーション生産物と共に所望
のファージ＠０Ｗ３８０を構成していた。

コンピテントなＥ、コリに１２　　ＪＭ１０９（ｒエピ
キ１リアン・コ１バＥ　ｐｉｃｕｒｅａｎ　Ｃｏｌ　１
）Ｊ（商標））をストラタジーン社［Ｓ　ｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ、　３７７０タンシー・ストリート（Ｔａｎｓｙ
　５ｔｒｅｅｔ）、サン・ジエゴ（Ｓ　ａｎ　Ｄ　ｉｅ
ｇｏ）、ＣＡ９２１２１］から購入し、ＤＮＡの容量を
２０μｅとし、媒質の希釈や発現時間を必要としない以
外は、実質上、製造業者の指示通り、プラスミド麿０Ｗ
３９０を構成するライゲーシッン反応混合物で形質転換
した。形質転換後、対数増殖期にあるＥ、コリに１２　
　ＪＭＩＯ９を試験管１本当りに０．２５ｘＱずつ含有
する１３Ｘ１００酎の滅菌ガラス試験管に、細胞をそれ
ぞれ〜１，１０．２０．４０および５０μａずつ試料と
して分配した。これらの試験管にトップアガー（４５℃
で溶融維持させた０、８％寒天含有しグロス）　３　ｘ
Ｑずつを添加した。ついで細胞−ト。

プアガー混合物を５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ガル）４０ｕｇ／ｗ
（ｌおよび０．１Ｍ　イソプロピルチオ−β−ガラクト
シド（Ｉ　ＰＴＧ）を含有するし一寒天平板上に接種し
、平板を３７℃で１夜インキ晶ベートした。［Ｍ２Ｓ法
に関する一層詳細な記述および説明については、Ｍ２Ｓ
・クローニング／ジデオキシ・シーフェンシング・イン
ストラクション・マニユアル（Ｍ　１３　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ／　Ｄ　１ｄｅｏｘｙ　Ｓ　ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｉ
　ｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｍａｎｕａｌ）、ベセスダ・
リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ　Ｌａｂ。

ｒａＬｏｒｉｅｓ）　（Ｂ　ＲＬ　）、ライフ・チク／
Ｃｌシーズ・インコーホレーテッド（Ｌ　ｉｒｅ　Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｉ　ｎｃ、）、ゲイザースバ
ーグ（Ｇ　ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、ＭＤ２０８７７
、参照コ。形質転換体をβ−ガラクトシダーゼ活性（無
色のプラーク表現型）の挿入失活および複製型（ＲＦ）
ＤＮＡの制限酵素分析によって同定する。スクリーニン
グの目的のため、ギ板オーバーレイ（重層）の透明なプ
ラークで、プラークあたり３酎の初期対数増殖期のＥ、
コリに１２　　ＪＭｌ　０９をパスツール・ピペットで
充填する。培養物を通気しながら３７℃で６〜１８時間
インキュベートする。

インキ１ベーシツン後、培養１．５ｘ＆ずつを１゜５村
のエツペンドルフ試験管でベレット化する。

新しく用意した試験管へ上清をデカントして、これをフ
ァージ接種物の供給源とするため４℃で貯蔵する。下記
の例外を除き、実質上バーンボイムおよびドリーのアル
カリ性プラスミド調製法［ヌクレイツク・アシッドΦリ
サーチ（Ｎ　ｕａ、　Ａ　ｃｉｄ　Ｒｅｓ、　）、７巻
（６）、１５１３〜１５２３頁（１９７９年）］の教示
にしたがって、細胞ペレットから複製型ＤＮＡを作成す
る。！液、■液および■液を１．５倍量使用してスケー
ルアップし、透明な細胞溶解液を等量のＣＨＣｌ２．で
−度抽出する。ついでイソプロパツール０．４容量を添
加し、室温で２０分間インキュベートすることによって
ＤＮＡを沈澱させる。遠心によってＤＮＡを採取し、つ
いで０．３Ｍ　Ｎａ０Ａｃからエタノールで沈澱させる
。各プラークから単離したＤＮＡをＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ
ｄｌｌｌ制限酵素消化に付し、挿入体の存在を調べた。

断片の方向性は、末端の一致（ＢａｍＨＩ−ＢａｉＨＩ
、′充填”５ｔｙｌ−ＨｉｎａＩＩ）により、予め定め
ておいた。この方法によって、Ｅ、フリに１２　　Ｊ　
Ｍ　１０９／ｍ０Ｗ３９０細胞を同定した。ついでこれ
らの細胞を、以下に説明する部位特異的突然変位のため
のファージｍ０Ｗ３９０の供給源として使用した。

初期対数増殖期Ｅ、コリに１２　　ＪＭ１０９の培養物
１０１１２にファージストック（実施例２Ｃｒ調製）〜
２００μＱを接種し、３７℃で通気しなから〜１８時間
インキコベートした。培養を遠心して、得られた上清を
新しく用意した試験管へ移して再び遠心した。上清をも
う一度新しい試験管へデカントした。２５％ポリエチレ
ングリコール（分子量３３３５０）の３ＭＮａＣｌ２中
、溶液１ｘ（２を上清に添加し、これを室温で１５分間
インキュベートした。得られた混合物を１００００ｒｐ
−で３０分間遠心した。遠心によって得たペレットは１
本鎖プラスミドｍ０Ｗ３９０を含有しており、これをＴ
Ｅ緩衝液４００μｅに再浮遊した。溶液をまずＨＣ ｇ、で、ついでＴＥ飽和フェノールで抽出した。フェノ
ールを水層と接触させて１５分間静置した。ついで溶液
をＴＥ飽和フェノール：　ＣＨＣム（ｌ：１、ｖ／ｖ）
混合液で２回、さらにＣＨ（Ｊ、たけて２回抽出した。

ついでＤＮＡを０．３Ｍ　　Ｎａ０Ａｃから沈澱させ、
遠心によって採取し、得られたペレットを０．ＩＸＴＥ
緩衝液１００μＱに再浮遊した。

この溶液は１本鎖ファージｍ０Ｗ３９０　　ＤＮＡ−５
μｅを構成していた。

Ｅ、衷然交累誘３ 突然変異の誘発（および引き続き所望のファージを検出
するためのハイブリダイゼーシヨン）に使用した１本鎖
ＤＮＡ断片は、ＢＲＬ社から購入したＭ１３普遍ブライ
マー（１５ｆｆｉ体）以外は自動ＤＮＡ合成装置で合成
した。突然変異誘発用断片は、（１）ＲＡＣＥＡＴＧ：
　１個の塩基を除いてプラスミドｍ０Ｗ３９０のラセマ
ーゼ暗号配列と相同な４０ヌクレオチド長さの下記のＤ
ＮＡ配列：を有する１本鎖ＤＮＡ［その不対合部分く下
線で示す）はラセマーゼ暗号配列のおよそ１位の位置で
制限酵素Ｎｃｏｌ認識配列を作り出す］、および（２）
ＲＡＣＥ−１７：単にＲＡＣＥＡＴＧ断片の亜断片（サ
ブフラグメント）である下記のＤＮＡ配列：ｃｏ１ ５’−ＴＧＣＧＴＴＴＧＣＣＡＴＧＧＣＧＧ−３’を有
する１７ヌクレオチド長さの１本鎖ＤＮＡのように設計
されている。

ＲＡＣＥＡＴＧ約１００ピコモルの５゛末端を１ピコモ
ル／μｇ濃度の１本鎖ＤＮＡ、ＩＯＸリガーゼ緩衝液１
０μｍ２，０．１ａＭアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）１
０ａＱ％　０．ＬＭ　　ＤＴＴ　１０ａ（１゜ガラス蒸
留水６５μｇおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ１μ
ｍ２（１０リチヤ一ドソン単位耳ベーリンガー・マンハ
イム・バイオケミカルズ（Ｂ　ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍ
ａｎｈｅｉｍ　Ｂ　１ｏｃｈｅ＊ｉｃａ１ｇ）、（ＢＭ
Ｂ）、７９４１キヤツスルウエイ・ドライブ（Ｃａｓｔ
ｌｅｗａｙＤｒｉｖｅ）、Ｐ、０．ボックス５０８４１
、インデイアナポリス（Ｉ　ｎｄｉａｎａｐｏｌｆｓ）
、インデイアナ（夏ｎｄｉａｎａ）、４８２５０）］を
含有する反応混合物でリン酸化（キナーゼ化）した。反
応混合物を３７℃でインキュベートして３０分経過後、
酵素ｌμｇを追加した。ついで３７℃でさらに３０分間
インキュベートしたのち、６８℃で５分間インキュベー
トして反応を終結した。これと同量の酵素を含有する類
似の反応混合物４０μｌで、Ｍ１３普遍ブライマー約４
０ピコモルからなる５°末端をキナーゼ化した。

１木調ブ５７．　ミＦｍ０Ｗ３９０　ＤＮＡを、実質上
、アデルマン（Ａｄｅｌｍａｎ）ら［ＤＮＡ、２巻（３
）、１８３〜１９３頁（１９８３年）］の教示にしたが
い下記のように突然変異した。ＩＯＸアニーリング緩衝
液８μｍ２（１００膿Ｍトリス−ＨＣｌ２（ｐＨ７゜５
）、１＋ＭＥＤＴＡおよび５００ｓ＋Ｍ　　ＮａＣＱ）
、キナーゼ化したＲＡＣＥＡＴＧ　　４μｍ２（４ピコ
モル）、キナーゼ化したＭ１３普遍配列決定プライマー
４μｌ２（４ピコモル）および水５０μａに１本鎖プラ
スミド−〇Ｗ３９０　　ＤＮＡ〜５００ナノグラム（０
，ＩＸＴＥ緩衝液１５μｅ中溶液）を添加し、混合物を
８０℃で２分間、５５°Ｃで５分間、最後に室温で５分
間インキュベートすることによりアニーリング反応を実
施した。

１０Ｘクレノー・リガーゼ緩衝液２０μｅ（１００ｍＭ
）リス−ＨＣｌ２（ＰＨ７，５）、１ｍＭＥＤＴＡ、５
００ｓ＋Ｍ　ＮａＣ（り、０．１Ｍ　ＤＴＴ　　２０ａ
ｉｆ、ｄＧＴＰｌｄＡＴＰ、ＴＴＰおよびｄＣＴＰのそ
れぞれ６．２５ａＭずつの溶液２０μｍ２．５鵬ＭＡＴ
Ｐ２０μぐ、水１２０μｉ１　リガーゼ３μ＆（３智ｅ
ｉｓｓ単位、ＢＭＢ）およびクレノー酵素（ＢＭＢ）２
．６μｆ（１２，５単位ンからなる混合物１２０μ＆を
、アニーリングしたＤＮＡ溶液に添加して伸長反応を実
施した。伸長反応混合物を室温で１時間、３７℃で４時
間、最後に１４℃で〜１８時間インキエベートした。

伸長反応混合物をＣＨＣｅ、で−回抽出し、エタノール
およびＮａｏＡｃでＤＮＡを沈澱させ、遠心により採取
した。ＤＮＡペレットを、ｌＸ５ＩＩＩ衝液（０，３Ｍ
　ＮａＣＱおよび３ＭＭ　Ｚｎ（ＯＡｃ）＊）４００μ
ｅに再浮遊させた。このＤＮＡ溶液の半分は一２０℃で
保存し、残りの半分を分け、５本の１．５ｇ１２試験管
に分配した。１μＱ当り２００（３０−ミニット）単位
に希釈したＳｌヌクレアーゼ（ＢＭＢ）１Ｍｇをこれら
の試験管４本へ添加した。反応混合物を室温で、それぞ
れ５分、１０分、１６分および２０分インキエベートし
た。まずｔＲＮＡ５〜１０μ９を反応混合物に添加して
キャリ中−として作用させ、ついでＴＥ飽和フェノール
−ＣＨＣｆ５混合物（１：Ｌｖ／ｖ）で抽出することに
よって反応を停止させた。Ｓｌで処理しなかった試料（
負対照）も同様に抽出した。水層に含まれるＤＮＡをエ
タノール沈澱により濃縮し、遠心によつて採取した。Ｄ
ＮＡベレットをそれぞれ２０μＱの水に再浮遊させた。

Ｓｌで処理して得られたＤＮＡ溶液各１０μａを、実質
上、実施例２Ｂに記載した方法で、ただし各平板にＸ−
ガルまたはＩ　ＰＴＯのどちらかをも含ませず、Ｅ、コ
リに１２　　ＪＭ１０９の形質転換に使用した。以下の
記載のように、放射能標識したオリゴヌクレオチドＲＡ
ＣＥ−１７をニトロセルロースフィルターにプロットし
たプラスミドＤＮＡとのハイブリダイゼーシ１ンにより
、所望の突然変異体を同定した。

プラーク形成後、平板を４℃で〜１時間インキュベート
してトップアガーを固化させた。負対照、１０分間Ｓ１
−処理系および２０分間Ｓ１−処理系からそれぞれ〜５
０〜２００プラークを含んだ２枚ずつの平板細菌叢の上
方にニトロセルロースフィルターを置いた。フィルター
と細１ＩＩｊＩ表面の接触を〜１分間保ったのち、直ち
にニトロセルローフ、７４）’ターを、０．１Ｎ　Ｎａ
ＯＨ−１，５ＭＮａＣ１２で５分間、ついで０．５Ｍ）
リス−ＨＣ１２（ｐＨ７，０）−３Ｍ　　Ｎａ（Ｊｔ’
５分間飽和した３ＭＭＣｈｒフィルターペーパー［ワッ
トマン会うブーセールズ・インコーホレーテッド（Ｗａ
ｔ厘ａｎＬａｂ−３ａｌｅｇ　Ｉｎｃ、）、Ｐ、Ｏ，ボ
ックス１３５９、ヒルスポロ（Ｈｉｌｌ＠ｂｏｒｏ）、
オレゴン（Ｏｒｅｇｏｎ）、９７１２３−１３５９１を
使用して処理した。ニトロセルロースフィルターを風乾
し、真空で８０℃、３０分間焼成した。

（以下余白） ニトロセルロースフィルターを６ＸＳＳＣ溶１（２０Ｘ
ＳＳＣは３ＭＮａＣｆおよび０．３Ｍクエン酸Ｎａ）、
ＩＯＸデンハート（Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ）溶液（水１０
０１Ｉ＋ｉ２当りポリビニルピロリドン　０．２９、つ
、シ血清アルブミン０．２ｆおよびフィコール０゜２９
）、０．１％ＮａＰ　Ｐｉｓ　０．１％ＳＤＳおよびｌ
Ｏμ９／１ａ変性Ｅ、コリ変性体ＤＮＡからなる溶液で
室温で約５分間、予備ハイブリッド化（プレハイブリダ
イゼーシ璽ン）を行った。ついで６ｘＳＳＣ，ＩＯＸデ
ンハート溶液、０．１％ＮａＰ　Ｐｉオヨヒ”Ｐ−ＲＡ
ＣＥ　−１７１ピコモル１５ｚｅの溶液中でフィルター
をハイブリダイズした。

”Ｐ−ＲＡＣＥ−１７は、本実施例で先に記載した方法
と実質上同様に、ただし非放射性ＡＴＰの代わりにγ−
”Ｐ−ＡＴＰ（二ニー・イングランドａヌクレア（Ｎｅ
ｗ　Ｅ　ｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）（Ｎ　Ｅ　Ｎ
）、５４９アルパニー・ストリー）　（Ａｌｂａｎｙ　
５ｔｒｅｅｔ）、ボストン（Ｂ　ｏｓｔｏｎ）、ＭＡ、
０２１１８、カタログ＃ＮＥＧ−００２Ａ）〜７０ピコ
モルを使用してＲＡＣＥ−１７１００ピコモルの５°末
端をリン酸化することにより作成した。ハイブリダイゼ
ーシ■ン後、室温で過剰の６ＸＳＳＣで１回当り５分間
ずつ２回、次いで５２℃で過剰の８ｘＳＳＣで１回当り
２０分間ずつ２回洗浄した。フィルターを空気乾燥し、
クアンタ（Ｑｕａｎｔａ）ＩＩＩ（商標）増感紙（デュ
ポン（ＤｕＰｏｎｔ）、インスツルメント・プロダクツ
（Ｉ　ｎｓＩｔｒｕｍｅｎｔ　Ｐ　ｒｏｄｕｃｔｓ）、
バイオメジカル・デイビジョン（Ｂ　１ｏｓｅｄｉｃａ
ｌ　Ｄ　１ｖｉｓｉｏｎ）、二ニータウン（Ｎｅｗｔｏ
ｗｎ）、ＣＮ０１３４７０）で−７０℃で２時間オート
ラジオグラフィーを行った。

フィルターと結合したプラスミドＤＮＡによって放射能
標識オリゴマーが結合するために、ＲＡＣＥ−１７配列
と相捕的な配列を含有する所望の突然変異体がフィルム
に感光した。実質上実施例２Ｃ記載の方法によって作成
したそのＲＦＤＮＡの制限酵素分析により、正確な突然
変異体を同定し、プラスミド−０Ｗ３９１と命名した。

Ｆ、プラスミドｐＯＷ３９２の最終構築プラスミド鵬０
Ｗ３９１のＲＦ　ＤＮＡはＥ、コリ発現プラスミドｐＯ
Ｗ３９２の構築に利用するＮｃｏｌ−ＢａｍＨＩ制限断
片上にラセマーゼ暗号配列を含んでいる。

実質上、実施例２Ｃ記載の方法によってプラスミド−〇
Ｗ３９１に感染させたＥ、コリに１２ＪＭ１０９から複
製型ＤＮＡを単離した。プラスミド５ＯＷ３９１　ＤＮ
ＡのＲＦ　ＤＮＡ約１０μｓを、ＤＮＡ含有ＩＸＲｅａ
ｃｔ・３緩衝液（５００ａＭ）リス−ＨＣＱ、　　ｐＨ
＝８．０、１００霞Ｍ　　ＭｇＣら、　ＩＭ　ＮａＣ１
２、ベセスダーリサーチｅラボラトリ−Ｐ、０．　Ｂｏ
ｘ　６００９、ゲティスバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕ
ｒｇ）、ＭＤ　２０８７７）反応溶液中で、制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ（〜ｌＯ単位）により消化した。３７℃で〜９
０分間インキニベーション後、反応混合物をアガロース
ゲル電気泳動に掛け、実質上、実施例２Ｂに従い〜０．
９ｋｂ　Ｂａ５ＨＩ−Ｎｃｏｌ断片を単離した。

プラスミドｐｃＺＲ１１１はＮＲＲＬから受託番号Ｂ−
１８２４９（寄託臼：１９８７年８月１１日）の下で入
手可能な大腸１１に１２ＪＭ１０９から得られる。培養
培地に１００ｕｆ／−アンピシリンではな（，１５μ９
／ｄテトラサイクリンを含有させる外は実質上、実施例
１記載の方法に従ってプラスミドを単離することができ
る。ｐｃｚＲｌ、１１の制限部位および機能地図を第２
図に示す。

ベクターはプラスミドｐｃＺＲ１１１のＸｂａ［および
ＢａｍＨＩによる消化によって生成した。プラスミドｐ
ＣＺＲ１１１（１０ｕＱ、　〜ｌ　Ｏｕ９＞および１０
ｘＸｂａＩ緩衝液（５００ｓＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（
ｐＨ８，０）、１００　ａＭ　　ＭｇＣＩｍ、５００曽
Ｍ　　ＮａＣ１）５ｕＱにＸｂａＩ約１ｕｌ！（〜１０
単位）を加えた。３７℃で９０分間インキュベートした
後、５Ｍ　　ＮａＣｌ　　０．５＃Ｉ２およびＢａａＨ
ｆｌμｆ（〜１０単位）を加え、３７℃でさらに９０分
間インキュベートした。次いで、実質上、実施例２Ｂ記
載の方法に従い、反応混合物をアガロースゲル電気泳動
にかけて〜５．７５ｋｂ　Ｘｂａｌ　−ＢａｓＨＩベク
ター断片を単離した。

中間体プラスミドはｍ０Ｗ３９１の〜０．９ｋｂＢａｓ
ＨＩ−Ｎｃｏｌ断片、ｐｃＺＲｌ　１１の〜５，７５ｋ
ｂＸｂａｌ−ＢａｓＨＩベクター断片および〜６．７ｋ
ｂ中間体プラスミドが得られるようにホスホトリエステ
ル法で合成された２木調Ｘｂａｌ−Ｎｃｏｌ制限断片を
結合させることにより、作製するこができる。２本鎖Ｄ
ＮＡ断片は以下の配列をイイする。

ライゲーション反応の混合物を用い、実質上、実施例２
Ｃ記載の方法に従い、大腸９Ｋ１２ＪＭ１０９を形質転
換し、形質転換体から単離したプラスミドＤＮＡを制限
酵素消化により分析し、正しい挿入体の存在を確認した
。

発現ベクターを完成するために実質上、実施例２Ｂ記載
の方法に従い、プラスミドｐＯＷ３９０から〜２ｋｂＢ
ａｓＨＩ断片を単離した。この〜２ｋｂＢａ＠ＨＩ断片
はラセマーゼ遺伝子の３°暗号領域を含有している。完
成されたベクターは、従って、ラセマーゼ遺伝子の全暗
号領域を含有している。

実質上、実施例２Ｃの記載に従い、〜２　ｋｂＢ　ａｔ
ｌＨ！断片（２，５μｑ１〜０８５μｇ）とＢａｍＨＩ
消化中間体ベクタープラスミドとを結合させて所望のプ
ラスミドｐＯＷ３９２を構築した。その制限部位および
機能地図を第３図に示す。

所望のプラスミドｐＯＷ３９２を構成するライゲーシッ
ン反応混合物をコンピテント大腸菌に１２ＲＲ１ΔＭ１
５　（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５４４０゜寄託臼：１９８３
年５月２７日）に導入した。形質転換混合物の一部をと
リテトラサイクリン（１５μｇ／ａｔり含有し一寒天プ
レート上で平板培養した。プレートを３７℃で〜１８時
間インキニベートした。テトラサイクリン耐性形質転換
体を、そのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によりスク
リーニングし所望のプラスミドｐＯＷ３９２を同定した
。実質上、上記のファージＭ１３感染大腸菌に１２ＪＭ
１０９細胞ペレットからのＲＦ　　ＤＮＡの調製に関す
るバーンボイムおよびドー９−の方法に従い、プラスミ
ドＤＮＡを３１１１！の培養物から調製した。実質上、
実施例１記載の方法に従い、以後の構築のために１個の
形質転換体からプラスミドｐＯＷ３９２ＤＮＡを調製し
た。次いで、このプラスミドをストラタジーンから購入
した大腸１ｍｌＫ１２ＪＭ１０９に導入した。

回旋振とう機中、Ｅ、フリに１２　　ＪＭ１０９／ｐＯ
Ｗ３９２形質転換体をＬブロス（テトラサイクリン１５
ｕ９／ＩＩＱを含有）５００ｘ９中で３０℃で１夜培養
した。１夜培養物１００ｘＱを２．８リツトルのＦ　ｅ
ｒｎｂａｃｈフラスコ中の新たに調製したテトラサイク
リン１５μ２／舷含有培地９９０ｘ（ｌに加えることに
よって１０倍希釈し、前記と同一培養条件下で３０℃で
さらに１時間インキュベートした。ついで回旋振とう機
の温度を４２℃に上げ、さらに６．５時間インキ１ベー
トを続けた。プラスミドｐＯＷ３９２のラセマーゼ暗号
配列を発現させるよう配置されたラムダｐＬプロモータ
ーのＣｌ８５７温度感受性リプレッサーは４２℃で失活
するために、宿主細胞内でのラセマーゼの発現が起きる
。誘導後、遠心によって細胞を回収し、Ｅ。

コリ産生ラセマーゼ活性の好ましい供給源として使用し
た。

誘導された、ベレット化大腸ｖＩｉ５９をブレーキング
（Ｂ　ｒｅａｋｉｎｇ）緩衝液（５Ｍ尿素中、１０ｍＭ
ピロりん酸ナトリウム−ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０．２０％
グリセリン、０．１ａＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）
］　１０７！と混合した。遠心後の細胞数が５９以下で
あれば細胞の緩衝液に対する割合を維持するようにした
。

次いで、細胞懸濁液を氷−エタノー、ル浴で２℃に冷却
し、全出力で２０秒間音波処理した。冷却と音波処理と
を３回繰り返した。

４７．０００ｘｇで２０分間遠心して細胞残屑を除去し
た。次いで、上清をグラスウールで濾過し、粗酵素とし
てろ液を得た。

この酵素はイソペニシリンＮからペニシリンＮ１および
その逆の変換反応を触媒し２分子の平衡状態をもたらす
。従って、活性は２つの方法で測定され、あるときは、
初期基質としてイソペニシリンＮを用い、あるときは、
ペニシリンＮを出発基質として用いる。全タンパク質量
はローリ−ら［ＬＯＷｒ７ＳＪ　、　　Ｂ　ｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｗ、　１９３．２６５　（１９５１）］の方法に従
って測定された。細胞抽出物を最終容量０゜５−とじて
、１．４ｍＭイソペニシリンＮまたはペニシリンＮＳ０
．２＋ｓＭジチオスレイトール、０゜１ｍＭピリドキサ
ル５゛−ホスフェート［ヒドラジン法（Ｗａｄａ、　Ｈ
，および５ｎｅ１１．　Ｅ、　Ｊ、　、　Ｂ　ｉｏｌ、
　Ｃｈｅｗ、　２３６、２０８９（１９６１）で測定し
た場合］、５０−Ｍピロりん酸−ＭＣＩ、ｐＨ８，３と
混合した。次いで、反応混合物を３７℃で２０分間イン
キュベートした。

１０分間沸騰させて反応を終止した。次いで、この反応
混合物を０．４５μｍフィルターに通した。

ペニシリンＮとイソペニシリンＮとをＨＰＬＣで分離す
ることは困難である。アスワド［Ａ　ｓｗａｄ。

Ｄ、　１．　、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｔ　１３７．
４０５（１９８４）］およびウウラシャーＵ　５ｈｅｒ
＋　Ｊ、　Ｌｗｅｗｉｇ、　Ｍ、　Ｈｕｇｈｅｓ、　Ｄ
、　Ｉｌ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏａｈｅｍ。

１４９、　ｔｏｓ（４ｏｓ）ｌノ方法に従いｏ−フター
ルジアルデヒドで誘導体化しなければならなかった。ろ
液２０μｅを誘導体化溶液［メタノール３００μｉに溶
かしたＯ−フタールジアルデヒド（Ｓ　ｉｇｍａ　Ｃｈ
ｅｓｉｃａｌ　Ｃｏ、　、　Ｐ、　Ｑ、Ｂｏｘ　１４５
０８．　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ６３１７８）４＠９
．０．４Ｍはう酸ナトリウム、ｐＨ＝９．４．２５０μ
ｇ１水３９０μｇおよびＩＭ　　Ｎ−アセチル−し−シ
スティ７６０ｕＱ、ＮａＯＨでＰＨ５−６に調節］５μ
Ｑと混合した。室温で２分間反応を進行させた後５０ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ＝５．０．２００μｅを加えて
反応を止めた。５０ｕＱをとり、ＨＰＬＣにより流速１
ｍＩＩ／分で分析し、蛍光を３８Ｏｎ−で測定した。反
応混合物中にイソペニシリンＮが含有されている場合に
は、ラセマーゼ活性を発現する細胞抽出物はイソペニシ
リンＮの一部をペニシリンＮに変換した。同様に、これ
らの細胞抽出物の存在下、ペニシリンＮはイソペニシリ
ンＮに変換された。混合物に細胞抽出物を加えないと、
変化は起きなかった。しかも、精製ラセマーゼに対する
抗体はウェスターンプロットにおいて〜５０，０００ダ
ルトンのバッドと反応した。

これらの結果をまとめると、クローン化遺伝子はラセマ
ーゼ活性を有するタンパク質であって、精製ラセマーゼ
酵素と同じ大きさのタンパク質を与えた。

実施例４　プラスミドｐＰＳＪ７８の構築この実施例で
は、本発明のラセマーゼ暗号配列を発現させるために配
置したペニシリウムＩＰＮＳ遺伝子プロモーターを含ん
でいる本発明のラセマーゼ発現ベクター、プラスミドｐ
ＰＳＪ７８の構築法を説明する。ペニシリウムＩ　ＰＮ
Ｓ遺伝子のプロモーターは、アメリカン・タイプ・カル
チャーφコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　
Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　　Ｒｏｃｋ
ｖｉｌｌｅ、　ＭＤ　２０８５２）から受託番号ＡＴＣ
Ｃ５３３４（寄託臼：１９８５年１１月２０日）の下で
入手可能なプラスミドｐＬＣ２から単離できる。添付図
面第６図にプラスミドｐＬＣ２の制限部位および機能地
図を示す。

Ａ、中間体プラスミドｐＰＳＪ７７の構築増殖培地に１
００μｇ／ＩＩＱアンピシリンではなく１５μｇ／ｘｌ
テトラサイクリンを含有する外は実質上、実施例１に従
ってプラスミドｐＯＷ３９２（実施例２で構築）を単離
した。０．１ＸＴＥバツフアー２５μａ中のプラスミド
ｐＯＷ３９２ＤＮＡ約２５μｇを１０　Ｘ　ＲＥ　ａｃ
ｔ”３バッフｙ−（ＢＲＬ）ｌ　０１ｌ（１、Ｈｔｏ　
　６０１１Ｑ、および制限酵素ＥａｏＲＩ　　５μａ　
（〜５ｏ単位）に加えて混合した。この反応混合物を３
７℃で９０分間インキニベートした。次いで、この混合
物に制限酵素Ｎａｏｌ約１０μぐ　（〜１００単位）を
加えて反応混合物をさらに３７℃で３分間インキユヘー
トシた。次いで、反応混合物をフェノールで１回、フェ
ノール−クロロホルム（フェノール：クロロホルム＝１
　：　１、クロロホルムハ実際１ｔ、クロロホルム：イ
ンアミルアルコールの２３：１混合物）で１回、さらに
クロロホルムで１回抽出した。ＥｃｏＲＩ消化したＮｃ
ｏ１部分消化プラスミドｐＯＷ３９２をｌ／１０倍容量
の２．５Ｍ　　Ｎａ０Ａｃ（ｐＨ−５，２）および２倍
容量のエタノールで沈殿させた。混合物を一２０℃で２
０分間冷却した後、エッペンドルフ遠心機で１０分間ヘ
レット化した。ＤＮＡをＨｔ　０　１８　ｔａＩ２に再
懸濁した。

負荷バッフｙ−（２５ｖ／ｖ％グリセリン、０゜０５Ｖ
／Ｖ％ブロモフェノールブルー、および０゜０５％キシ
レンシアツール）約２μｍ７　をＤＮＡ溶液に加え、所
望の〜７．　９ｋｂＥｃｏＲＩ−Ｎａｏｌ制限酵素断片
が他の消、化産物から明確に分かれるまでアガロースゲ
ル電気泳動にかけた。

〜７．　９ｋｂバンドを実質上、実施例２Ｂ記載のごと
くにして観察し、ゲルから単離した。

プラスミドｐＬＣ２はＡＴＣＣから受託番号５３３３４
　（寄託臼：１９Ｂ５年１１月２０日）の下で入手可能
であり、実質上、実施例１記載の方法に従って単離され
た。このプラスミドをもＥｃ。

Ｒ１およびＮａｏｌで消化した。得られた消化産物から
〜９２５ｂｐＥｃｏＲＩ−Ｎｃｏｌ断片を単離した。

この〜９２５ｂｐＥｃｏＲＩ−Ｎａｏｌ断片はペニシリ
ウム由来のＩ　ＰＮＳプロモーターを含有している。

この断片とプラスミドｐＯＷ３９２の〜７．９ｋｂＥｃ
ｏＲＩ−Ｎｃｏｌ断片とを実質上、実施例２Ｃ記載の方
法に従って結合させると、ラセマーゼを発現させる位置
にペニシリウムＩ　ＰＮＳプロモーターを含有している
プラスミドｐＰｓＪ７７が得られる。

Ｂ、中間体プラスミドｐＰｓ５１の構築プラスミドｐＭ
ＬＣ１２ＤＮＡ（第９図、ＮＲＲＬ　Ｂ−１８０９７Ｘ
寄託日、１９８６年８月８日）約１５μ２を１０ＸＥｃ
ｏＲＩ緩衝液５ａＱおよび水４０μｇに溶解した。増殖
培地に１００μ９／Ｒ１！アンピシリンではなく、２５
μ９／蛙クロラムフエニコールを含有させる以外は、実
質上、実施例１記載の方法でプラスミドを単離すること
ができる。制限酵素ＥａｏＲＩ約５μｇ（〜５０単位）
をＤＮＡ溶液に添加し、得られた反応混合物を３７℃で
３分間インキエベートして部分消化を行った。緩衝液で
飽和したフェノールで抽出することにより反応を停止し
、ついでクロロホルムで抽出した。プラスミドＰＭＬＣ
１２は２つのＥｃｏＲＩ制限部位を含んでおり、それは
Ｅ、コリ　１ａｃＺα断片、およびクロラムフェニコー
ル耐性遺伝子（ＣＡＴ）内である。所望のＥａｏＡＩ部
分切断は１ａｃＺα断片内で起こるものであり、ＣＡＴ
遺伝子内で起こるのではない。このＥｃｏＲＩ−消化に
より、プラスミドｐＭＬｃ１２ＤＮＡ分子の、切断され
ないもの、望ましくない位置で切断されたもの、所望の
位置で切断されたもの、双方の位置でともに切断された
〜２．７ｋｂの完全鎖長分子より短い断片からなる混合
物が生成した。ＥｃｏＲＩ−消化プラスミドｐＭＬＣ１
２ＤＮＡを沈澱させ、遠心によって採取し、ＴＥ緩衝樹
液０μｇに溶解し、０．８％調製用アガロースゲルに掛
けた。完全鎖長の直鎖状分子（即ち〜２．７ｋｂ）を単
離した。

部分的にＥｃｏＲＩ−消化したプラスミドｐＭＬＣ１２
ＤＮＡを１０ＸＳａｌＩ緩衝液５μｅおよび水４０μＱ
に溶解した。ＥｃｏＲＩで直鎖にしたプラスミドｐＭＬ
ｃ１２ＤＮＡに制限酵素５ａｉｌ約５μＩ２（〜５０単
位）を添加し、得られた反応混合物を３７℃で２時間イ
ンキエベートした。プラスミドｐＭＬｃ１２中、唯一の
５ａｉｌ制限部位はプラスミドｐＭＬｃ１２の１ａｃＺ
ｃｒ断片内のＥｃｏＲＩ部位から２４塩基対に位置して
いる。したがって部分的にＥｃｏＲｌ−消化したプラス
ミドｐＭＬＣ１２ＤＮＡの完全な５ａｌｌ消化により４
つのＤＮＡ断片、〜２．７ｋｂ断片（所望の分子）、〜
２４ｂＰ鎖長の断片、〜０．６ｋｂの断片および〜１　
、９　ｋｂの断片が生産された。これらのＤＮＡ分子を
０．８％アガロースゲルでサイズ分画した。はぼ完全鎖
長に近い〜２．７ｋｂ７）直鎖状分子を単離した。

アスペルギルス・ニズランスのアセトアミダーゼ遺伝子
はプラスミドｐ３ＳＲ２（第１Ｏ図、ＮＲＲＬ　Ｂ−１
８１８２、寄託臼：１９Ｂ７年２月２６日）の〜５．Ｏ
ｋｂのＥｃｏＲＩ−３ａｌＩ制限酵制限酵素率離できる
。プラスミドル３ｓＲ２約１０μ９を１０ＸＥｃｏＲ１
緩衝液５ａ（ｌおよび水４０μｅに溶解した。このＤＮ
Ａ溶液に制限酵素ＥａｏＲＩ約５μｅ（〜５０単位）を
加え、得られた反応溶液を３７℃で２時間インキエベー
トした。緩衝化ベノールを加えて反応を停止した後、ク
ロロホルムで抽出した。ＥｃｏＲＩ消化ｐ３　Ｓ　Ｒ２
のプラスミドＤＮＡが析出し、それを遠心して収集し１
０ＸＳａｌｌ緩衝液５μａと水４０μＱに再懸濁した。

制限酵素５ａｌＩ約５μＩ２（〜５０単位）をＤＮＡ溶
液に加え、得られた反応混合物を３７℃で２時間インキ
エベートした。これらの消化で生成した２つのＤＮＡ断
片を０．８％調製用アガロースゲルでサイズ分画に掛け
た。〜４．３ｋｂの１断片はｐＢＲ３２２ＤＮＡを含ん
でおり、〜５．Ｏｋｂの他の１断片はアスペルギルス・
ニズランスに由来するアセ、ト、アミダーゼ（ａｍｄｓ
）を含んでいた。〜５．ＯｋｂのＥｃｏＲＩ−３ａｉｌ
断片を単離した。〜５．ＯｋｂのＥａｏＲＩ−８ａｉｌ
断片約３μ２を回収し、これを水５μＱに溶解した。

ＥｃｏＲＩ−３ａｉｌ−消化プラスミドｐＭＬｃ１２Ｄ
ＮＡ１ｇＮを、ＩＯＸ！Ｊガーゼ緩衝液２ａＱ。

Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ２μｇおよび水１１μｇととも
にプラスミドｐａ　Ｓ　Ｒ２の〜５．　Ｏｋｂ　Ｅｃｏ
Ｒｌ−５ａｉｌ制限酵素断片約４μｅに添加した。得ら
れたライゲージロン反応混合物を１５℃で１夜インキユ
ベートした。ライゲージロンしたＤＮＡは所望のプラス
ミドｐＰｓ５１および他の近縁のうイゲーシッン生産物
を構成していた。

このライゲージ１ン混合物をＥ、コリに１２Ｃ６００（
ＡＴＣＣ３３５２５，）の形質転換に使用した。形質転
換した細胞混合物の一部を２５μ９／翼Ｑクロラムフェ
ニコール含有し一寒天平板に接種した。平板を３７℃で
１夜インキユベートした。

挿入体を有するＥ、コリＫ１２　Ｃ６００／ｐＰＳ５１
のようなプラスミドを含んだコロニーから挿入体を有し
ないＥ、コリに１２　Ｃ６００／ｐＭＬＣ１２のような
プラスミドを含んだコロニーを制限分析により識別した
。コロニー挿入体を有するプラスミドを含んでいるコロ
ニーを同定した。このコロニーから得たプラスミドＤＮ
Ａを、制限酵素分析によってアスペルギルス・ニズラン
スａｎｄＳ遺伝子を含んだ〜５．ＯｋｂのＥｃｏＲＩ　
−３ａｌ　Ｉ制限断片の存在についてスクリーニングし
たところ、所望のプラスミドｐＰｓ５１の正しい構造を
有することが判明した。プラスミドｐＰｓ５１の大規模
なプラスミド製造は実質上、実施例１の記載に従って行
われた。添付図面第８図にプラスミドｐＰｓ５１の制限
部位および機能地図を示す。

Ｃ，プラスミドＰＳＪ７Ｂの最終　築 次いで、ａＩｌｄ　Ｓ遺伝子をｐＰｓ５１から〜５゜６
５　ｋｂＥ　ａｏＲＩ断片として単離し、ｐＰＳＪ７７
（実施例４）に挿入しペニシリウムおよび他の微生物で
選択可能なマーカーを与えた。プラスミドｐＰｓ５１を
含有する形質転換体は増殖培地に１００μｇ／ｘ（ｌア
ンピシリンではなく、２５μｇ／Ｉ（クロラムフェニコ
ールを含有させる外は実質上、実施例１記載の方法で単
離する。プラスミドｐＰｓ５１約２５μｇを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ〜５０単位で消化し、得られた〜５．６５　ｋ
ｂＥ　ｃｏＲＩ断片を実質上、実施例２Ｂ記載の方法で
単離する。

プラスミドｐＰＳＪ７７　（実施例４Ａで構築）を含有
する単一の形質転換体を増殖させ、増殖培地に１００μ
ｇ／ｌアンピシリンではなく１５μｇ／ｚ（ｌテトラサ
イクリンを含有させる外は実質上、実施例１の方法に従
ってプラスミドを単離する。プラスミドｐＰＳＪ７７約
２５μｇ（〜５０単位）を１０　Ｘ　ＲＥ　ａｃｔ”３
バッフｙ−（ＢＲＬ）　　１０μ（２、Ｈ，０６０ｔｔ
Ｑ　、および制限酵素ＥｃｏＲＩ　　５μａ　（〜５ｏ
単位）に加えて混合する。この反応混合物を３７℃で９
０分間インキユヘートシタ後、フェノール、フェノール
−クロロホルム、およびクロロホルムで連続的に抽出す
る。

アスペルギルス・ニブ１ランスのａｌｌｄＳ遺伝子を含
んでいるプラスミドｐＰｓ５１の〜５．８５ｋｂＥｃｏ
ＲＩ断片をＥｃｏＲＩ消化プラスミドｐｐｓＪ７７と混
合し、実質上、実施例４Ａ記載の方法でＪＭＩ　０９に
導入する。形質転換体を１５μｇ／ｘ（ｌ含有プレート
上で選択する。得られたプラスミＦをｐＰＳＪ７８と命
名した。プラスミドｐＰＳＪ７８の制限部位および機能
地図を第５図に示す。逆方向に−ｄＳ遺伝子を含有して
いる〜５゜６５ｋｂＥｃｏＲＩ断片が位置することは全
く同等に起こり得ることであり、それもまた、本発明範
囲に包含される。断片の方向性は５ａｌｌによる制限分
析によって決定される（第５図参照）。逆方向にａｍｄ
ｓ遺伝子を含有するプラスミドはｐＰＳＪ７８Ａと命名
された。本発明のベクターによるペニシリウムの形質転
換を実施例５で説明する。

形質転換に用いるペニシリウム株はジ・アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクシ冒ン（Ｔ　ｈｅＡｍｅｒｉ
ｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉ
ｏｎ）（口・ツクピル、ＭＤ２０８５２）から受託番号
ＡＴＣＣ９４８０のもとに入手した。またその他のペニ
シリウム・クリソゲヌム株、またはペニシリンＧまたは
ペニシリンＶの生産を改良する目的で、ＡＴＣＣ９４８
０から突然変異、選択または遺伝的交配によって誘導さ
れた任意の商業的な株も、本発明のベクターおよびプラ
スミドで形質転換体を生産する用途に好適である。

Ｂ、細胞培養のための均一接種物の調製ペニシリウム・
クリソゲヌム細胞を効率的に形質転換するには、細胞壁
を除去して安定プロトプラストを作成することが必要で
ある。そのようなプロトプラストの作成に際しては均一
な接種物によって始めるのが都合よい。そうでないと培
養中の細胞調製に再現性がなく、不適当ないし不十分な
量の細胞からＰ、クリソゲヌム・プロトプラストを調製
しようと試みることになり時間の浪費になる。

凍結品または液体窒素貯蔵品から取り出して室温で融解
した１アンプルの栄養細胞（保存溶媒１゜ＯｘＱ中、〜
１０°コロニー形成単位、５％ラクトース、１０％グリ
セリンおよび０．１％Ｔ　５ｅｅｎ８０）を滅菌食塩水
１０ｚＱで希釈する。この浮遊液約０．１ｊＩＱを使用
して、約２０個の胞子形成用斜面培地（ラクトース、１
５．０９／Ｑ：コーンステイープリカー、２．５９／ｆ
！；ペプトン、５．０９／ｅ；ＮａＣＱ−４，０９／Ｑ
：ＭｇＳＯ４・７ＨｔＯ１０，５９／Ｑ：　ＫＨ，ＰＯ
，，０，６９／Ｑ：　ＦｅＣＱｓ・６Ｈ−０゜０、００
５９／Ｑ　；　ＣｕＳ　Ｏ−・５　Ｈｔｏｌｏ、　００
２９／Ｑ　；　ｐＨ７，０１，：調節、寒天、３０．０
９／４．オートクレーブで２０分間１２０ｐｓｉで加熱
）のそれぞれに接種した。

各斜面［１５ｃｘＸ２．５　ｃｍ］は固体培地２５舷を
含有する。接種物を寒天斜面表面へ均等に広げ、菌糸の
集密的菌叢が存在し胞子化するまで（大抵の株で１週間
）２５℃で培養する。１斜面の増殖物を滅菌水性培地１
０・村に浮遊させ、浮遊液を水性培地１０６ｘＱへ移す
。浮遊細胞を含有するフラスコを回旋振とう機に掛け、
１インチの偏心距離をもって２８５　ｒｐｍで２５℃で
１８時間インキュベートした。

水性培地は下記のように調製した。Ａ液１００Ｗａ＜ス
クロース、３６ｇ／ｉ！；−アスパラギン、７゜５９／
Ｎ；　ＫＨ，ＰＯ，，１５ｉＪ／１２；　Ｋ、ＨＰＯ，
，２１９／　Ｑ　；　Ｎａ、Ｓ　Ｏ，，０，７５９／１
２；　Ｍｇ５Ｏ，−７ＨｔＯ−、０，１Ｂ９／　Ｑ　：
　ＣａＣＱ＊、０．０６９／１２；塩溶液、１ｘＱ／Ｑ
、自然ｐＨ）を５００１１２振とうフラスコに入れる。

フラスコを市販の蓋で被い、オートクレーブで１２１℃
で２０分間加熱した。ついでＢ液２１１Ｑ（グルコース
、１０８ｇ／１２）およびＣ液４ｘＱ（スクロース、２
５ｇ／＋２；コーンステイープリカー（４％（ｗ／ｖ）
窒素）、１２．５酎；酢酸アンモニウム、５．５９／Ｑ
：ＣａＣ０，，５９／１２：ＫＯＨでｐＨを６．５に調
節し、オートクレーブで１２１℃で２０分間加熱）をＡ
液に添加して水性培地を調製する。

Ｃ，ペニシリウム・プロトプラストの作成２４時間培養
から得た細胞を吸引濾過しくワットマン（Ｗｈａｔａａ
ｎ）　＃　１濾紙、ブフナー漏斗）、緩衝液（０，０１
Ｍ塩酸トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．
ＯＬＭ　Ｍｇ５Ｏ，，０，０１Ｍジチオトレイトール、
１．ＯＯＭ　ＫＣ＆（ＨＣｌ２”Ｃ”ｐＨ７，０に調節
））に浮遊させる。緩衝液５０ｘ（ｌ当り細胞量が１ｇ
の最終細胞濃度となるように十分量の緩衝液を追加する
。２５０３１１２の振とうフラスコに細胞浮遊液を加え
て水浴式回旋振とう機へ掛け、１インチの振り巾をもっ
て４Ｏｒｐｍで２９〜３０℃で１０分間インキュベート
する。ジチオトレイトールで処理した細胞を遠心により
採取し、ついで２５０ｘＱ振とうフラスコ中で、酵素溶
液５０ｍ１２（１０１９／　１１２ノボチーム（Ｎｏｖ
ｏｚｙ＋ａ）（ノボ・インダストリ（Ｎｏｖｏ　１ｎｄ
ｕｓｔｒＤＡ／　Ｂ、バグスバード（Ｂ　ａｇｓｖａｅ
ｒｄ）、デンマーク（Ｄ　ｅｎｓａｒｋ）、０．０１Ｍ
塩酸トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン、０、Ｏ
ＬＭ　Ｍｇ５Ｏ，，０，ＯＩＭ　ジチオトレイトール、
１．ＯＯＭ　ＫＣｌ２（ＨＣｌ２でｐＨ５，ａに５節）
）に再浮遊させた。この細胞浮遊液を水浴式回旋振とう
機に掛け、１インチの振り巾をもって１４０ｒｐＩ１１
で２９〜３０℃で１５分間インキュベートした。酵素処
理した細胞を１２４０Ｘｆで６分間遠心し、得られたペ
レットを緩衝液（０，０１Ｍ塩酸トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノエタン、０゜０１ＭＭｇＳＯ４，１，ＯＯ
Ｍ　ＫＣ（！（ＨＣ（２でｐＨ７，０に調節））に再浮
遊させた。浮遊液をまず９５０Ｘｇで６分間遠心した。

得られたペレットをこれと同じ緩衝液に再浮遊させ、浮
遊液を７００×９で６分間遠心した。得られたペレット
を同じ緩衝液５ｚｅに再浮遊させた。この浮遊液は主と
して大きいプロトプラストおよび若干の細胞壁が残って
いる浸透圧的に壊れ易い細胞を含んでいる。細胞壁を再
生し得るプロトプラストの比率および生存可能な浸透圧
的に安定な細胞の比率は、上記の方法で除去した小さい
プロトプラストよりも、最終浮遊液中の大きいプロトプ
ラストおよび浸透圧的に壊れ易い細胞の方が高い。緩衝
液で細胞浮遊液を〜２Ｘ１０＠細胞／ＩＩ（濃度まで希
釈する。

Ｄ、形質転換方法 各形質転換プラスミドにつき、浸透圧的に壊れ易いペニ
シリウム・クリソゲヌム細胞の〜０．１１Ｑ浮遊液（約
２Ｘ遊枝’細胞）を５０ｍＭ　ＣａＣｌ２＊　　１０μ
（！、ＴＥ緩衝液５〜１５μＱ溶液中プラスミドＤＮＡ
　２５μｅ１新しく溶解したポリエチレングリコール４
０００溶液（ベーカ−（Ｂ　ａｋｅｒ）、浸透圧的に安
定化させた緩衝液中４０％（重量／容量））０．９ｘ（
ｌで補充する。混合物を逆転撹拌したのち、室思で１０
分間静置し、７００　Ｘｇで２分間遠心し、もう−度撹
拌する。ついで各０．５１１２の２部分を浸透圧的に安
定化させたアセトアミド培地（アミノ酸および硫酸アン
モニウムを含有しない酵母窒素塩基、１．７９／ｉ２；
スクロース、１２５９／＆；アセトアミド、０．７３８
９／Ｑ：ＣａＣｌ＊１１　、２７９／（１：ノープル（
Ｎｏｂｌｅ）アガー２２９／１りの表面に広げる。形質
転換混合物内に存在する生存可能な細胞総数を数えるた
め、アセトアミドを等モル量の硫酸アンモニウムで置き
代えた培地に形質転換混合物の一部を接種する。形質転
換から７〜１０日後、継代培養に十分な大きさの形質転
換体コロニーがアセトアミド培地上に出現する。不全形
質転換体は新たに調製したアセトアミド培地で継代培養
すると発育し得ないので、安定な形質転換体と不全形質
転換体とを容易に区別できる。アセトアミダーゼ遺伝子
を含んでいるプラスミドで形質転換した細胞は、形質転
換後４〜５日で肉眼で見えるコロニーを形成する。

Ｅ、ペニシリウム形質転換体の分析 ａｌｌｄＳ遺伝子を含んだ本発明のベクターで形質転換
したペニシリウム形質転換体は、形質転換していない受
容体Ｐ、クリソゲヌム株（例えばＡＴＣＣ９４８０）の
抽出物中には検出されないアセトアミダーゼ活性（ａｉ
ｎｄＳ遺伝子生産物）を発現する。

この活性により、形質転換株は他の窒素供給源が入手し
得ない場合にはアセトアミドの加水分解により遊離され
るアンモニアを利用して増殖することができる。本発明
のペニシリウム形質転換体はラセマーゼ活性を発現する
。

安定な形質転換体はその高分子ｆｉＤＮＡ内に形質転換
するＤＮＡを保持している。例えばアセトアミダーゼ遺
伝子を含んでいるラセマーゼ暗号配列またはアスペルギ
ルスＤＮＡ断片のようなプローブは、非選択的培地（ア
ンモニアを窒素供給源とする）で複数の継代培養の後で
も、これらの形質転換体由来の高分子量ＤＮＡとノ＼イ
ブリザイズする。形質転換表現型（ラセマーゼ生産、ａ
ｎｄ　Ｓベクターを使用した場合はアセトアミドを唯一
の窒素供給源とする増殖）は非選択培地で数世代を経た
後も形質転換体によって保持される。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＯＷ３９０の制限部位および機能
地図、第２図はプラスミドｐｃＺＲ１１１の制限部位お
よび機能地図、第３図はプラスミドｐＯＷ３９２の制限
部位および機能地図、第４図はベータラクタム生合成経
路のダイアグラム、第５図はプラスミドｐＰＳＪ７Ｂの
制限部位および機能地図、第６図はプラスミドｐＬＣ２
の制限部位および機能地図、第７図はプラスミドｐＰＳ
Ｊ７７の制限部位および機能地図、第８図はプラスミド
ｐＰｓ５１の制限部位および機能地図、第９図はプラス
ミドｐＭＬｃ１２の制限部位および機能地図、第１０図
はプラスミドｐ３　Ｓ　Ｒ２の制限部位および機能地図
である。 特許出願人　イーライ・リリー・アンド・カンパニー代
理人弁理士青山　葆（外２名） ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、２ ａｍＨＩ ＦＩＧ、４ ／？−ラフ７ら工４ソ戊゛ 七１１１２ス不°リレＣ セーフｒτイシ％ｙＣ ５ａｌＩ ＦＩＧ、７ ＦＩＧ、６ ＦＩＧ、９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ストレプトマイセス・クラブリゲルスのイソペニシ
   リンＮエピメラーゼ（ラセマーゼ）活性をコードするＤ
   ＮＡ配列を含んでいる構築されたＤＮＡ化合物。 ２、式： 【遺伝子配列があります】 （式中、Ａｌａはアラニン残基、Ａｒｇはアルギニン残
   基、Ａｓｎはアスパラギン残基、Ａｓｐはアスパラギン
   酸残基、Ｃｙｓはシステイン残基、Ｇｌｎはグルタミン
   残基、Ｇｌｕはグルタミン酸残基、Ｇｌｙはグリシン残
   基、−Ｈ＿２Ｎはアミノ末端、Ｈｉｓはヒスチジン残基
   、Ｉｌｅはイソロイシン残基、Ｌｅｕはロイシン残基、
   Ｌｙｓはリシン残基、Ｍｅｔはメチオニン残基、Ｐｈｅ
   はフェニルアラニン残基、Ｐｒｏはプロリン残基、Ｓｅ
   ｒはセリン残基、Ｔｈｒはスレオニン残基、Ｔｒｐはト
   リプトファン残基、Ｔｙｒはチロシン残基、Ｖａｌはバ
   リン残基を表す） で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードす
   る請求項１記載の構築されたＤＮＡ化合物。 ３、式： 【遺伝子配列があります】 （式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニル
   、Ｃはデオキシシチジル、Ｔはチミジルを表す） で示されるＤＮＡ配列を含んでいる請求項１または２記
   載の構築されたＤＮＡ化合物。 ４、プラスミドｐＯＷ３９０の〜２．０ｋｂＣｌａ I
   −Ｓｔｙ I 制限断片。 ５、請求項１、２または３記載のＤＮＡ配列を含有する
   組換えＤＮＡベクター。 ６、プラスミドｐＯＷ３９２、ｐＰＳＪ７７、ｐＰＳＪ
   ７８、ｐＰＳＪ７８Ａ、ｐＯＷ３９０、ｍＯＷ３９０ま
   たはｍＯＷ３９１である請求項５記載の組換えＤＮＡベ
   クター。 ７、請求項５記載の組換えＤＮＡベクターで形質転換さ
   れた組換え宿主細胞。 ８、大腸菌に１２、ペニシリウム、セファロスポリウム
   、アスペルギルスまたはストレプトマイセスである請求
   項７記載の形質転換宿主細胞。 ９、大腸菌Ｋ１２　ＲＲ１ΔＭ１５／ｐＯＷ３９０また
   は大腸菌Ｋ１２　ＪＭ１０９／ｐＯＷ３９２である請求
   項８記載の形質転換宿主細胞。 １０、ペニシリウム・クリソゲヌム／ｐＰＳＪ７８であ
   る請求項８記載の形質転換宿主細胞。 １１、ラセマーゼ活性をコードしており、請求項１記載
   のＤＮＡ配列をプローブとして用いて同定することがで
   きる組換えＤＮＡ配列。