JPH02227092A - 単クローン性抗体及びこれを用いるａｍｐデアミナーゼの測定法 - Google Patents
単クローン性抗体及びこれを用いるａｍｐデアミナーゼの測定法Info
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- JPH02227092A JPH02227092A JP1047151A JP4715189A JPH02227092A JP H02227092 A JPH02227092 A JP H02227092A JP 1047151 A JP1047151 A JP 1047151A JP 4715189 A JP4715189 A JP 4715189A JP H02227092 A JPH02227092 A JP H02227092A
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- monoclonal antibody
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- deaminase
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、ヒツジ脳由来ＡＭＰデアミナーゼに対する単
クローン性抗体、並びにこの単クローン性抗体を使用す
る組織、体液等の被検体中のＡＭＰデアミナーゼの測定
法に関する。
クローン性抗体、並びにこの単クローン性抗体を使用す
る組織、体液等の被検体中のＡＭＰデアミナーゼの測定
法に関する。
Ａ針デアミナーゼは典型的なアロステリック酵素として
の性質を示す。従来、この酵素に対する関心は、その多
彩な調節機構に集中し、その生理的役割の解明はほとん
ど行われていなかった。
の性質を示す。従来、この酵素に対する関心は、その多
彩な調節機構に集中し、その生理的役割の解明はほとん
ど行われていなかった。
一方、近年、免疫染色法を用いた、臓器あるいは細胞中
における生体内高分子の分布、局在性の検討を通して、
その生体内高分子の生理的役割の解明が盛んに行われて
いる。
における生体内高分子の分布、局在性の検討を通して、
その生体内高分子の生理的役割の解明が盛んに行われて
いる。
しかしながら、特異性の高いＡＭＰデアミナーゼに対す
る単クローン性抗体は現在までに得られておらず、酵素
の組織あるいは細胞中の分布、局在性、すなわち形態学
的側面からの本酵素の生理的意義の解明は未だなされて
いなかった。
る単クローン性抗体は現在までに得られておらず、酵素
の組織あるいは細胞中の分布、局在性、すなわち形態学
的側面からの本酵素の生理的意義の解明は未だなされて
いなかった。
斯かる実状において、本発明者らは、形態学的側面より
Ａ針デアミナーゼの生理的意義を解明すべく、種々検討
をおこなった結果、ヒツジ脳由来ＡＭＰデアーミナーゼ
に対する単クローン性抗体を新たに作製し、これを使用
することにより組織及び体液中のＡＭＰデアミナーゼを
特異的に測定することに成功し、本発明を完成した。
Ａ針デアミナーゼの生理的意義を解明すべく、種々検討
をおこなった結果、ヒツジ脳由来ＡＭＰデアーミナーゼ
に対する単クローン性抗体を新たに作製し、これを使用
することにより組織及び体液中のＡＭＰデアミナーゼを
特異的に測定することに成功し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は新規なヒツジ脳由来ＡＭＰデアミナ
ーゼ、及びこれを使用する被検体中のＡ針デアミナーゼ
の測定法を提供するものである。
ーゼ、及びこれを使用する被検体中のＡ針デアミナーゼ
の測定法を提供するものである。
本発明のヒツジ脳由来Ａ針デアミナーゼに対する単クロ
ーン性抗体は、例えば次のごとくして調製される。すな
わち、先ず、種々のカラムクロマトグラフィーを用いて
、ヒツジ脳よりＡＭＰデアミナーゼを電気泳動上、単一
になるまで精製操作を行い、これを免疫原として用い、
動物に免疫を行う。次にその動物の騨細胞を採取し、骨
髄腫細胞と融合することによりハイブリドーマを得る。
ーン性抗体は、例えば次のごとくして調製される。すな
わち、先ず、種々のカラムクロマトグラフィーを用いて
、ヒツジ脳よりＡＭＰデアミナーゼを電気泳動上、単一
になるまで精製操作を行い、これを免疫原として用い、
動物に免疫を行う。次にその動物の騨細胞を採取し、骨
髄腫細胞と融合することによりハイブリドーマを得る。
免疫動物としては、マウス、ラット等が挙げられる。細
胞融合にはポリエチレングリコールを用いる方法、セン
ダイウィルスを用いる方法、あるいは電気パルスによる
方法等の公知の方法を使用することができる。
胞融合にはポリエチレングリコールを用いる方法、セン
ダイウィルスを用いる方法、あるいは電気パルスによる
方法等の公知の方法を使用することができる。
ハイブリドーマのスクリーニングに当っては、確実にＡ
針デアミナーゼに対する単クローン性抗体産生細胞のみ
を得るための留意が必要である。
針デアミナーゼに対する単クローン性抗体産生細胞のみ
を得るための留意が必要である。
このためには、免疫厚志よびスクリーニング時、抗原と
して用いるヒツジ脳由来Ａ針デアミナーゼは、ともに電
気泳動上単一の純品であることが望ましい。
して用いるヒツジ脳由来Ａ針デアミナーゼは、ともに電
気泳動上単一の純品であることが望ましい。
次いで得られたハイブリドーマを培養してその培養上清
から、単クローン性抗体を採取するか、またはハイブリ
ドーマを動物体内に移植し、その腹水から単クローン性
抗体を採取すれば、本発明の単クローン性抗体が得られ
る。ここで、培養上清、または腹水から本発明単クロー
ン性抗体を分離するには硫安塩析等を用いれば良い。
から、単クローン性抗体を採取するか、またはハイブリ
ドーマを動物体内に移植し、その腹水から単クローン性
抗体を採取すれば、本発明の単クローン性抗体が得られ
る。ここで、培養上清、または腹水から本発明単クロー
ン性抗体を分離するには硫安塩析等を用いれば良い。
かくして得られる本発明の単クローン性抗体は次に示す
ごとき性質を有する。
ごとき性質を有する。
（ｉ） 抗体のクラス： ＩｇＭ
（ｉｉ ） 抗体価：２，０００倍
（ｉｉｉ ） 交差反応性：ヒト脳、ヒト脊髄、ヒト
心臓、ヒト肝臓及びラット脳中のＡＭＰデアミナーゼと
交差反応性を有する。
心臓、ヒト肝臓及びラット脳中のＡＭＰデアミナーゼと
交差反応性を有する。
叙上の如くして得られた本発明の単クローン性抗体を用
いて組織中のＡＭＰデアミナーゼを測定するには、被検
体にヒツジ脳由来ＡＭＰデアミナーゼに対する単クロー
ン性抗体を加えて免疫反応を行う。
いて組織中のＡＭＰデアミナーゼを測定するには、被検
体にヒツジ脳由来ＡＭＰデアミナーゼに対する単クロー
ン性抗体を加えて免疫反応を行う。
次いで、この反応液に酵素標識ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体
を反応させたのち、適当な発色剤を用いて発色操作を行
い光学顕微鏡を用いて検鏡すれば良い。
を反応させたのち、適当な発色剤を用いて発色操作を行
い光学顕微鏡を用いて検鏡すれば良い。
以上のように、本発明の単クローン性抗体を用いれば組
織中のＡＭＰデアミナーゼの分布、局在を免疫染色法に
より検出可能である。しかも、この単クローン性抗体を
用いればＢＬＩＳＡ 法により、体液あるいは組織抽出
液中のＡＭＰデアミナーゼの迅速な検出定量が可能であ
る。
織中のＡＭＰデアミナーゼの分布、局在を免疫染色法に
より検出可能である。しかも、この単クローン性抗体を
用いればＢＬＩＳＡ 法により、体液あるいは組織抽出
液中のＡＭＰデアミナーゼの迅速な検出定量が可能であ
る。
次に実施例を挙げ、本発明を説明する。
実施例１
（１） 免疫原の調製
ヒツジ脳より、ＡＭＰデアミナーゼを種々のカラムクロ
マトグラフィーにより電気泳動上、単一の純品に精製し
た。すなわち、凍結したヒツジ脳を解凍し、これを０．
６５Ｍ塩化カリウムを含むリン酸緩衝液でホモジナイズ
したものを遠心操作に付し、粗抽出液を得た。次いで粗
抽出液を順にホスホセルロース、ＡＨ−セファロース、
マトリックスゲルグリーンＡを用いた各カラムクロマト
グラフィーに付し、それぞれ塩化カリウムの直線濃度勾
配法によりＡ針デアミナーゼ活性画分の溶出操作を行い
、酵素活性画分を得た。最後にファルマシア社製のＦＰ
ＬＣシステムスーパーロース１２！舅を用いり分子ふる
いに付し、電気泳動上純品のＡ針デアミナーゼを得た。
マトグラフィーにより電気泳動上、単一の純品に精製し
た。すなわち、凍結したヒツジ脳を解凍し、これを０．
６５Ｍ塩化カリウムを含むリン酸緩衝液でホモジナイズ
したものを遠心操作に付し、粗抽出液を得た。次いで粗
抽出液を順にホスホセルロース、ＡＨ−セファロース、
マトリックスゲルグリーンＡを用いた各カラムクロマト
グラフィーに付し、それぞれ塩化カリウムの直線濃度勾
配法によりＡ針デアミナーゼ活性画分の溶出操作を行い
、酵素活性画分を得た。最後にファルマシア社製のＦＰ
ＬＣシステムスーパーロース１２！舅を用いり分子ふる
いに付し、電気泳動上純品のＡ針デアミナーゼを得た。
ω）単クローン性抗体の作製
（＋）（１）で得た純品のＡＭＰデアミナーゼをフロイ
ントの完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ ｓ ｃｏｍｐ
ｌｅｔｅａｄｊｕｖａｎｔ）と等量混合し、エマルジョ
ンとしたのち、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に一匹あた
り１０μｇＪ２週間間隔で３回にわたり投与した。
ントの完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ ｓ ｃｏｍｐ
ｌｅｔｅａｄｊｕｖａｎｔ）と等量混合し、エマルジョ
ンとしたのち、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に一匹あた
り１０μｇＪ２週間間隔で３回にわたり投与した。
（ｉｉ ） 最終免疫の３日後に過免疫マウスから採
取した牌細胞とＢＡＬＢ／ｃマウス由来ミエローマ細胞
株５Ｐ２１０−＾ｇ１４をポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ） ４０００を用いて融合した。細胞は９６穴プレ
ートに１００μｌ／穴ずつ加え、２４時間後に、培地の
半量をハラ） （ＨＡＴ）培地に交換し、２日おきに培
地交換した。７〜１０日後にハツト耐性のハイブリドー
マの成長がみられてくる。
取した牌細胞とＢＡＬＢ／ｃマウス由来ミエローマ細胞
株５Ｐ２１０−＾ｇ１４をポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ） ４０００を用いて融合した。細胞は９６穴プレ
ートに１００μｌ／穴ずつ加え、２４時間後に、培地の
半量をハラ） （ＨＡＴ）培地に交換し、２日おきに培
地交換した。７〜１０日後にハツト耐性のハイブリドー
マの成長がみられてくる。
この時期に培地をＨＴに変え、約１０日間培養すたのち
に、ハイブリドーマ生育培地に変えた。
に、ハイブリドーマ生育培地に変えた。
（ｉｉｉ ） 抗体産生細胞のスクリーニングは免疫
原として用いた純品のへＵＰデアミナーゼを抗原として
用い、２抗体エライザ（ＩＩＬＩＳ＾）法により行った
。この方法により、ヒツジ脳由来ＡＭＰデアミナーゼと
特異的に反応する単クローン性抗体を産生ずるハイブリ
ドーマを選択した。ここで選択された細胞株を軟寒天法
によりクローン化し、単クローン性抗体産生ハイブリド
ーマクローンを樹立した。なお、組織におけるＡＭＰデ
アミナーゼの検出には、ハイブリドーマをマウス腹腔内
に移植し、１０〜１５日目に採取した腹水を硫安塩析に
より精製した単クローン性抗体を用いた。
原として用いた純品のへＵＰデアミナーゼを抗原として
用い、２抗体エライザ（ＩＩＬＩＳ＾）法により行った
。この方法により、ヒツジ脳由来ＡＭＰデアミナーゼと
特異的に反応する単クローン性抗体を産生ずるハイブリ
ドーマを選択した。ここで選択された細胞株を軟寒天法
によりクローン化し、単クローン性抗体産生ハイブリド
ーマクローンを樹立した。なお、組織におけるＡＭＰデ
アミナーゼの検出には、ハイブリドーマをマウス腹腔内
に移植し、１０〜１５日目に採取した腹水を硫安塩析に
より精製した単クローン性抗体を用いた。
（３）単クローン性抗体の性質
ヒツジ脳由来ＡＭＰデアミナーゼに対する単クローン性
抗体は４種類得られ、抗体のクラスはいずれもＩｇＭで
あった。抗体価は、２．０００倍（マウス腹水から精製
した抗体を２段階希釈し、それぞれと、ヒツジ脳由来Ａ
ＭＰデアミナーゼを反応させるＢＬＩＳＡを行った時、
最も高い吸光度の持続する希釈倍率を抗体価とした）で
あった。交差反応性を検討したところ、ヒト脳、ヒト脊
髄、ヒト心臓、ヒト肝臓、ラット脳と反応性を示し、こ
れらの組織中、あるいは、組織抽出液中のＡＭＰデアミ
ナーゼの検出が可能であることが判明した。
抗体は４種類得られ、抗体のクラスはいずれもＩｇＭで
あった。抗体価は、２．０００倍（マウス腹水から精製
した抗体を２段階希釈し、それぞれと、ヒツジ脳由来Ａ
ＭＰデアミナーゼを反応させるＢＬＩＳＡを行った時、
最も高い吸光度の持続する希釈倍率を抗体価とした）で
あった。交差反応性を検討したところ、ヒト脳、ヒト脊
髄、ヒト心臓、ヒト肝臓、ラット脳と反応性を示し、こ
れらの組織中、あるいは、組織抽出液中のＡＭＰデアミ
ナーゼの検出が可能であることが判明した。
実施例２
アセトンで固定操作を行ったヒト脊髄組織切片を０．１
％過酸化水素水に浸けることにより、組織内存性ペルオ
キシダーゼを不活化せしめる。次いで組織切片面に１％
牛血清アルブミン（Ｏ３＾）を含むリン酸緩衝生理食塩
水（ＰＢＳ）を添加し、室温で１時間放置することによ
り抗体その他のタンパク質の非特異的吸着を防止する。
％過酸化水素水に浸けることにより、組織内存性ペルオ
キシダーゼを不活化せしめる。次いで組織切片面に１％
牛血清アルブミン（Ｏ３＾）を含むリン酸緩衝生理食塩
水（ＰＢＳ）を添加し、室温で１時間放置することによ
り抗体その他のタンパク質の非特異的吸着を防止する。
さらに、ヒツジ脳由来ＡＭＰデアミナーゼに対する単ク
ローン性抗体（５００倍希釈液）を切片面上に滴下し、
４℃で２４時間放置する。切片をＰＢＳでよく洗浄した
後に、ビオチン化抗マウスＩｇＭ抗体の４００倍希釈液
を切片面上に適当量滴下し、４℃で２時間反応させたの
ちにＰＢＳでよく洗浄する。その後、４℃で２時間アビ
チン−ビオチン化ベルオキシターゼ複合体と反応させる
。ＰＢＳでよく洗浄後０．０５％の３．３′−ジアミノ
ペンチジン４塩酸塩、０．０１％・過酸化水素水を含む
ＰＢＳ中で発色操作後検鏡する。
ローン性抗体（５００倍希釈液）を切片面上に滴下し、
４℃で２４時間放置する。切片をＰＢＳでよく洗浄した
後に、ビオチン化抗マウスＩｇＭ抗体の４００倍希釈液
を切片面上に適当量滴下し、４℃で２時間反応させたの
ちにＰＢＳでよく洗浄する。その後、４℃で２時間アビ
チン−ビオチン化ベルオキシターゼ複合体と反応させる
。ＰＢＳでよく洗浄後０．０５％の３．３′−ジアミノ
ペンチジン４塩酸塩、０．０１％・過酸化水素水を含む
ＰＢＳ中で発色操作後検鏡する。
その結果は第１図のとおりである。
実施例３
ヒツジ脳粗抽出液の１０．５．２．５Ｇ、１．２５．０
．６３．０．３２．０．１５およびＱ、 ０７ｍｇ ／
ｍｌ！溶液を抗原として用い、更に実施例１で得た単
クローン性抗体の２０００倍希釈液を５０μｌずつ加え
てＢＬＩＳＡをおこなった。その結果、第２図に示すご
とく、抗原量に比例して抗原−抗体結合量が増加するこ
とが明らかになった。
．６３．０．３２．０．１５およびＱ、 ０７ｍｇ ／
ｍｌ！溶液を抗原として用い、更に実施例１で得た単
クローン性抗体の２０００倍希釈液を５０μｌずつ加え
てＢＬＩＳＡをおこなった。その結果、第２図に示すご
とく、抗原量に比例して抗原−抗体結合量が増加するこ
とが明らかになった。
第１図は、ヒツジ脳由来ＡＭＰデアミナーゼに対する単
クローン性抗体を用いて、ヒト脊髄切片を３．３′−ジ
アミノベンチジンにより染色操作を行った時の写真であ
る。 第２図は、単クローン性抗体の量を一定にした時点で、
ヒツジ脳粗抽出液中の蛋白量を変化させた場合に得られ
る吸光度と抗原量との関係を示す図面である。 以 上 第１図 第２図 Ｏ 蛋白量（η／−）
クローン性抗体を用いて、ヒト脊髄切片を３．３′−ジ
アミノベンチジンにより染色操作を行った時の写真であ
る。 第２図は、単クローン性抗体の量を一定にした時点で、
ヒツジ脳粗抽出液中の蛋白量を変化させた場合に得られ
る吸光度と抗原量との関係を示す図面である。 以 上 第１図 第２図 Ｏ 蛋白量（η／−）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ヒツジ脳由来ＡＭＰデアミナーゼに対する単クロー
ン性抗体。 ２ 次の性質、（１）抗体のクラスＩｇＭ、（２）抗体
価２，０００倍、（３）ヒト脳、ヒト脊髄、ヒト心臓、
ヒト肝臓及びラット脳中のＡＭＰデアミナーゼと交差反
応性を有する、を有する請求項１記載の単クローン性抗
体。 ３ 被検体にヒツジ脳由来ＡＭＰデアミナーゼに対する
単クローン性抗体を加えて免疫反応を行うことを特徴と
するＡＭＰデアミナーゼの測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1047151A JPH02227092A (ja) | 1989-02-28 | 1989-02-28 | 単クローン性抗体及びこれを用いるａｍｐデアミナーゼの測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1047151A JPH02227092A (ja) | 1989-02-28 | 1989-02-28 | 単クローン性抗体及びこれを用いるａｍｐデアミナーゼの測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02227092A true JPH02227092A (ja) | 1990-09-10 |
Family
ID=12767093
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1047151A Pending JPH02227092A (ja) | 1989-02-28 | 1989-02-28 | 単クローン性抗体及びこれを用いるａｍｐデアミナーゼの測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02227092A (ja) |
-
1989
- 1989-02-28 JP JP1047151A patent/JPH02227092A/ja active Pending
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