JPH02227098A - マレイミド基を測定する方法および測定剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、マレイミド基を測定する方法および測定剤、
特に蛋白質（酵素、抗原、抗体）に結合する反応性マレ
イミド基を測定する方法および測定剤に関するものであ
る。

７０年代なかばから、種々の反応性基例えばアミノ基、
カルボキシル基、ｂドロキシル基およびチオール基を介
して蛋白質を一緒に共有的に結合させる目的に対して、
多数のいわゆるペテロクロスリンカーが開発されている
。これらのへテロクロスリンカ−は、免疫検定試薬の分
野において特に重要となっている。マレイミド基を有す
るヘテロクロスリンカ−は、特異的にチオール基と反応
する性質を有するために、特に選抜される。すなわち、
遊離チオール基を含有する抗体フラグメント例えばｔａ
ｂ’フラグメントを、他蛋白質例えば酵素に選択的に結
合させることができる。

マレイミド基を有するこのようなりロスリンカ−および
ペテロクロスリンカーの例は、ザクシンイミジルｍ−マ
レイミドベンゾエート（ＳＯＢ）　、スルホザクシンイ
ミジルｍ−マレイミドベンゾエート（スルホ−５８Ｂ　
）　、サクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）
シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓｔ４ＣＣ）
　、スルホサクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−
３ＨＣＣ）　、サクシンイミジル４−（ｐ−マレイミド
フェニル）ブチレート（ＳＮＰ８）、スルホサクシンイ
ミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ス
ルホ−５ＨＰ８）　、とスーマレイミドヘキサン（８Ｍ
Ｎ）、Ｎ−く４−ジアゾフェニル）マレイミドおよびＮ
−（β−シア・ｆ　フェニルエチル）マレイミドである
。

チオール基は、これらのへテロクロスリンカ−の助けに
よってアミノ基に結合することができる。更に、Ｎ−（
４−ジアゾフェニル）マレイミドおよびＮ−（β−ジア
ゾフェニルエチル）マレイミドは、チオール基をイミダ
ゾール、フェノール、インドールおよび他の基に結合す
ることを可能にする。

原理的に、これらの結合は、次の図式によって行われる
。

Ｒ−ＮＨ２＋　５ｕｃｃ−０−ＣＯ−χ−ｍａｌ−Ｒ−
ＮＨ−ＣＯ−Ｘ−ｍａｌ　＋５ｕｃｃ−ＯＨ（第１工程
）（Ｉ） Ｒ−ＮＨ−Ｃｏ−Ｘ−ｍａ　ｌ　＋　８３−Ｒ”−Ｒ−
ＮＨ−ＣＯ−Ｘ−ｗａｌｌ−３−８’　　　　（第２工
程）（ＩＩ） 上記式において、Ｒ−ＮＨ２は、第１級アミノ基を有す
る蛋白質であり、ｎａＪはマレイミド基であり、５ｕｃ
ｃはサクシンイミジル基であり、ＲＴ−５Ｈはチオール
基を有する蛋白質であり、そして、Ｘはスペーサーであ
る。

驚くべきことには、有効な免疫試験法（検定）試薬を製
造するなめには、例えば抗体フラグメントとの反応が行
われる前の上記式の中間体重のスペーサーに結合したマ
レイミド基の数および官能性を知ることが、決定的であ
るということを見出した。このことは、有効でない生成
物を費用をかけて製造することが避けられることを可能
にする。

本発明の目的は、上記中間体Ｉ中の官能反応性マレイミ
ド基の数を検出することを可能にする方法および測定剤
を提供せんとするものである。

本発明は、マレイミド基を含有する試料を、チオール基
を含有する試薬と反応させそして次いで千オール基と反
応する色原体（ＣｈｒＯＩＯｇｅｎ）または蛍光発生素
（ｆ　＋ｕｏｒｏｇｅｎ　”）と反応させそして強度の
変化を測定することを特徴とするマレイミド基を測定す
る方法に関するものである。

更に、本発明は、チオール基を含有する試薬およびチオ
ール基と反応する色原体または蛍光発生素からなるマレ
イミド基を測定する測定剤に関するものである。

蛋白質に結合したマレイミド基の色原体または蛍光発生
素による直接的な測定はミクロマドグラフィー分離を必
要とする。他方、本発明の方法は、均質な手順即ち１−
相の操作で行われる。

マレイミド基は、例えばマレイミド基を有する蛋白質の
溶液をメルカプトアルカノールの溶液で処理しそして混
合物を保温することによって測定される。それから、チ
オール基と反応する色原体または蛍光発生素の溶液を加
える。過剰のメルカプトアルカノール即ちマレイミド基
により結合されないメルカプトアルカノールは染料の形
成または蛍光の変化をもたらす、この強度を測定する。

方法は、終点法としてまたは動力学的法（この場合にお
いては、染料の形成の速度または蛍光の変化の速度を測
定する）として行われる。

チオール基を含有する適当な試薬は、メルカプトアルカ
ノール例えばメルカプトエタノールおよびメルカプトプ
ロパツール、メルカプトアルキルアミン例えばシステア
ミンおよびメルカプトプロピルアミン、メルカプトアミ
ノ酸例えばシスティンおよびメルカプトカルボン酸例え
ばメルカプト酢酸、メルカプトコハク酸および２−チオ
安息香酸である。メルカプトエタノールが好ましい、チ
オール基を含有する試薬は、マレイミド基を有する蛋白
質に関して、２倍〜１０倍モル過剰、好ましくは４倍〜
６倍過剰でなければならない。

チオール基と反応する適当な色原体の例は、２．２′−
ジニトロ−５，５＋−ジチオジ安息香酸、ビス（ｐ−ニ
トロフェニル）ジサルファイドおよび２，２°−ジピリ
ジルジサルファイドである。エルマン試薬として長い間
知られている２、２′−ジニトｏ−５．５’−ジチオジ
安息香酸［Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ、８ｉｏｐｈ
ｙｓ、　８２．７Ｇ（１９５９）　］が好ましい０弱塩
基性媒質（ｐＨ８−９）において、深黄色の２ニトロ−
５−チオベンゾエートが、ジサルファイドブリッジの還
元的開裂によってエルマン試薬により形成されるそして
４００〜４５０ｒ＋ｎ領域におけるその色強度がチオー
ル基の数の測定値である０色原体の濃度は０．１〜１ｉ
Ｈの範囲、好ましくは０．２ｍＭでなければならない。

適当な蛍光発生物質の例は、（０−二重ロアニリンーＮ
−エチルジチオ）−２−ピリジル−５−チオウレイド−
Ｎ’−（５−フルオレスセイン）および４−ヨードアセ
チルアミド−１−ナフトール、好ましくは（０−ニトロ
アニリン−Ｎ−エチルジチオ）−２−ピリジル−５−チ
オウレイド−Ｎ’−（５−フルオレスセイン）である、
原理的に、この方法は、エルマンにより記載された方法
と同様に進行する。このフルオレスセイン誘導体とチオ
ール基を含有する化合物との反応は、非常にフルオレス
セイン誘導体の蛍光を増大する。標準に対比した蛍光発
生は、チオール基の数の測定値である。蛍光発生素の濃
度は、０．１〜１ｉＨの範囲、好ましくは０．２ｉＨで
なければならない。

上述した方法および測定剤は、一般に、マレイミドまた
はマレイミド基を含有する化合物の測定に適している。

これらは、好ましくは、マレイミド基を含有する免疫検
定試薬の感受性を測定するのに即ちこのような試薬の品
質管理に適している。

例　　１ 蛋白質に結合するマレイミド基の測定 マレイミド基を有する西洋ワサビペルオキシダーゼの溶
液（０，０６２ｉＮ　）をメルカプトエタノールの溶液
で処理する。１０分の保温時間の後に、エルマン試薬（
２，２’−ジニトロ−５，５′−ジチオジ安息香酸）の
溶液を加える。過剰のメルカプトエタノール即ちマレイ
ミド基により結合されないメルカプトエタノールは、オ
レンジ−イエローの染料２−ニトロ−５−チオベンゾエ
ートの形成をもたらす。

色強度は、４３６ｔｖおよび室温で光度計で測定する０
反応後の溶液の色は、少なくとも１時間安定であり、そ
の結果、測定は終点測定として行うことができる０選定
された染料は、蛋白質が非常に妨害しそうもない波長に
おける吸収の利点を有している０分析ブランク値は、次
のピペット形式によって測定される。

標準　　　分析 標準　ブランク値　分析　ブランク値 溶液１　　１００　　１５０　　　　　　　　５Ｇ溶液
２　　−　　　　　　　　１００　　　１００溶液３　
　５０　　　　　　　　５０ ３７℃で１０分保温 溶液４　２５００　　２５００　　　２５００　　２５
００１０分の保温後の水に対する４３６ｎｍにおける測
定吸光度 Ｓｔ　　　ＳｔＢ　　　　　Ａ　　　　ＡＢ計算は、次
式によって行われる。

Ｉ（Ｓｔ−３ｔＢ）−（Ａ−ＡＢ）］　ｘ　５ｍＮ／（
Ｓｔ−３ｔＢ）　ｘ　２溶液の組成： 溶液１＝水 溶液２＝分析（マレイミド基を有する物質）溶液３＝標
準（メルカプトエタノール、脱ガス水中５１１８） 溶液４＝色試薬（エルマン試薬、０．０５ＭＴＭ酸ナト
リウム＋０．１％アスコルビン酸 中０．２ｍＨ、ｐＨ＝８．０　） 例　　２ 種々のクロスリンカ−中の反応性マレイミド基の数（ま
たは濃度）の測定および種々の稀釈における検出 多くのクロスリンカ−は水に難溶性であるか、あるいは
、前記のサクシンイミジル基が水によって急速に加水分
解されるので、物質はすべてジオキサンに溶解する。

試料１：サクシンイミジル４−（Ｐ−マレイミドフェニ
ル）ブチレート８．６０ＩＩＩｒをジオキサン９．６５
−に溶解する（２．５１１Ｎ　）　。

試料２：ザクシンイミジルｍ−マレイミドベンゾエート
３．３４Ｉ１１ｒをジオキサン４．２５■ｅに溶解する
（２．５ｍＭ　）　。

試料３：とスーマレイミドヘキサン３．８０■をジオキ
サン５．５−に溶解する（２．５ｍＭ　）　。

この試験は、例１のピペット形式により行われる。

結　果（ｍＨ１検出％）： 試料１ 試料２ 試料３ ０．５　　　Ｇ、５６５　１１３ １．０　　１．０２５　１０３ １．５　　１．５１５　１０１ ２．０　　２．００５　１０Ｇ ２．５　　２．４７５　　９９ ０．５　　０．６０５　１２１　　０．５　　０．５４
０　１Ｇ８１．０　　１．１５５　１１６　　１．０　
　１．０９５　１１０１．５　　１．６２５　１０８ ２．０　２．１３５　１Ｇ？　　　消費したＳＨ基２．
５　　２．４９０　１００ この表の結果は、種々のクロスリンカ−のマレイミド基
さえも、正確に測定されることを示す、この試験は、十
分に広い濃度範囲にわたって線状である。

例　　３ 西洋ワサビペルオキシダーゼのマレイミド基の数（また
は濃度）の測定 マレイミド基を有する西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰ）５．３７Ｍを、脱ガスした水１−に溶解する。　
４５．０００の分子量を仮定した場合、これは０．１１
９ｎＨの濃度を与える。この貯蔵溶液を、数段階＝１＋
４．２＋３．３＋２．４＋１において、脱ガスした水で
うすめる０例１に示したピペット形式と同様にして測定
を行う。

結　果： 算出したＨＲＰ　　測定しなマ　　酵素当りのママレイ
ミＦ、ｍＨレイミド基、ｌＨレイミド基の数０．０２３
８　　　　　　　　０．１９６５　　　　　　　　　　
８．２６０．０４７６　　　　　　　　　Ｇ、４７６０
　　　　　　　　　１０．０Ｇ０．０？１４　　　　　
　　　０．７６００　　　　　　　　　１０．６４０．
０９５２　　　　　　　　　Ｇ、８０００　　　　　　
　　　　８．４００．１１９０　　　　　　　　１．０
１５Ｇ　　　　　　　　　　　８．５３この結果は、明
らかに、蛋白質の存在が測定を妨害しないことを示す、
この測定は、十分に広い濃度範囲にわたって線状である
。結果の精度は、ペテロクロスリンカーの反応の前後の
第１級アミノ基の数を測定することによってチエツクさ
れる。ペテロクロスリンカーとの結合に対して、平均し
て１０個のアミノ基が使用される。

すなわち、２つの方法により与えられる数値は、非常に
良く一致する。しかしながら、後智の方法が、第１級ア
ミノ基の骨の折れる二重測定によって結合したマレイミ
ド基を計算することを可能にするのに反して、この新規
な方法は、短時間で同じ結果を与える。更に、この新規
な方法は、活性なマレイミド基即ちチオール基と結合す
ることのできる基をもっばら測定するので、特にすぐれ
ている。

特許出願人　　メルク・パテント・ゲゼルシャフト・ミ
ツト・ベシュ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）マレイミド基を含有する試料をチオール基を含有
   する試薬と反応させそして次いで、チオール基と反応す
   る色原体または蛍光発生素と反応させそして強度の変化
   を測定することを特徴とするマレイミド基の測定方法。
2. （２）前記のチオール基を含有する試薬としてメルカプ
   トアルカノールを使用することを特徴とする請求項１記
   載の方法。
3. （３）前記の色原体として２，２’−ジニトロ−５，５
   ’−ジチオジ安息香酸を使用することを特徴とする請求
   項１および２に記載の方法。
4. （４）チオール基を含有する試薬およびチオール基と反
   応する色原体または蛍光発生素からなるマレイミド基測
   定剤。
5. （５）請求項４記載の測定剤を使用するマレイミド基を
   含有する免疫試験法試薬の感受性を測定する方法。