JPH022367A - ＨｇｉＡＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法 - Google Patents
ＨｇｉＡＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法Info
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- JPH022367A JPH022367A JP63317572A JP31757288A JPH022367A JP H022367 A JPH022367 A JP H022367A JP 63317572 A JP63317572 A JP 63317572A JP 31757288 A JP31757288 A JP 31757288A JP H022367 A JPH022367 A JP H022367A
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- hgia
- gene
- dna
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明のバックグラウンド
本発明は、制限エンドヌクレアーゼ１ｌｉＡＩおよびそ
の修飾メチラーゼのクローンならびに該クローンからこ
れらの酵素を製造する方法に係る。
の修飾メチラーゼのクローンならびに該クローンからこ
れらの酵素を製造する方法に係る。
制限エンドヌクレアーゼは天然の細菌中にみられる酵素
の一群である。制限エンドヌクレアーぜは、夾雑する他
の細菌成分から精製すると、実験室でＤＮＡ分子を切断
して各々相応する正確な断片を形成するのに使用するこ
とができる。この性質の故に、ＤＮＡ分子はひとつずつ
独自に同定ザることができ、また分画してその構成遺伝
子を単離することができる。制限エンドヌクレアーゼは
現代の遺伝子研究における不可欠の手段であることが立
証されている。これらの酵素は住化学的な「ハザミ」で
あり、これによって遺伝子の工学および解析が達成され
る。
の一群である。制限エンドヌクレアーぜは、夾雑する他
の細菌成分から精製すると、実験室でＤＮＡ分子を切断
して各々相応する正確な断片を形成するのに使用するこ
とができる。この性質の故に、ＤＮＡ分子はひとつずつ
独自に同定ザることができ、また分画してその構成遺伝
子を単離することができる。制限エンドヌクレアーゼは
現代の遺伝子研究における不可欠の手段であることが立
証されている。これらの酵素は住化学的な「ハザミ」で
あり、これによって遺伝子の工学および解析が達成され
る。
制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子上の特定のヌク
レオチド配列（いわゆる「認識配列」）を認識してこれ
に結合することによって作用する。
レオチド配列（いわゆる「認識配列」）を認識してこれ
に結合することによって作用する。
これらの酵素はＤＮＡ分子に結合すると、その配列の内
部または一端でその分子を開裂する。異なる制限エンド
ヌクレアーゼはそれぞれ異なる認識配列に対して親和力
をもっている。今日までに調べられた幾百秤もの細菌で
白を越える数の異なる制限エンドヌクレアーゼが同定さ
れている。
部または一端でその分子を開裂する。異なる制限エンド
ヌクレアーゼはそれぞれ異なる認識配列に対して親和力
をもっている。今日までに調べられた幾百秤もの細菌で
白を越える数の異なる制限エンドヌクレアーゼが同定さ
れている。
通常細菌は、その種石に、小数の制限Ｊンドヌフレアー
ゼをもつのみである。これらのエンドヌクレアーゼはそ
れの由来となった細菌に因んで命名される。たとえば、
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｅｇｙｐｔｉｕｓはＨａ
ｅｌ 、ＨａｅｌＩおよびＨａｅｌ［ｌとよばれる３つ
の異なる制限エンドヌクレアーゼを合成する。これらの
Ｒ’ｔ ５Ｆ、は、それぞれ（ＡＴ ）ＧＧＣＣ（ＡＴ
）、ＰｕＧＣＧＣＰｙおよびＧＧＣＣという配列をｎ
Ｒして開裂覆る。一方、大腸菌［５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＲＹ１３は１種類の１ＷｉＥｃ。
ゼをもつのみである。これらのエンドヌクレアーゼはそ
れの由来となった細菌に因んで命名される。たとえば、
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｅｇｙｐｔｉｕｓはＨａ
ｅｌ 、ＨａｅｌＩおよびＨａｅｌ［ｌとよばれる３つ
の異なる制限エンドヌクレアーゼを合成する。これらの
Ｒ’ｔ ５Ｆ、は、それぞれ（ＡＴ ）ＧＧＣＣ（ＡＴ
）、ＰｕＧＣＧＣＰｙおよびＧＧＣＣという配列をｎ
Ｒして開裂覆る。一方、大腸菌［５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＲＹ１３は１種類の１ＷｉＥｃ。
Ｒ１を合成するだけであり、この酵素はＧＡＡＴＴＣと
いう配列を認識Ｖる。
いう配列を認識Ｖる。
理論に縛られるつもりはないが、自然界で制限エンドヌ
クレアーゼは細菌細胞の繁殖に関して保護的な役割を果
たしていると考えられる。これらの酵素のおかげで、細
菌は、放っておくとこれらの細菌を破壊したりまたはこ
れらに寄生したりするウィルスやプラスミドのような外
来ＤＮＡ分子による感染に対して抵抗することが可能に
なる。
クレアーゼは細菌細胞の繁殖に関して保護的な役割を果
たしていると考えられる。これらの酵素のおかげで、細
菌は、放っておくとこれらの細菌を破壊したりまたはこ
れらに寄生したりするウィルスやプラスミドのような外
来ＤＮＡ分子による感染に対して抵抗することが可能に
なる。
Ｉ１１限エンドヌクレアーゼは、侵入して来るＤＮＡ分
子に結合し、認識配列に出会う度毎にそれらのＤＮＡ分
子を開裂することによって、細菌に抵抗性を付与する。
子に結合し、認識配列に出会う度毎にそれらのＤＮＡ分
子を開裂することによって、細菌に抵抗性を付与する。
こうして生起する破壊の結果、侵入する遺伝子の多くは
無能となり、そのＤＮＡはエキソヌクレアーゼによって
さらに細かく分解されることになる。
無能となり、そのＤＮＡはエキソヌクレアーゼによって
さらに細かく分解されることになる。
細菌の防御系の第二の要素は修飾メチラーゼである。こ
れらの酵素は制限エンドヌクレアーゼと相補的であり、
これによって、細菌が外来の感染性ＤＮＡから自身のＤ
ＮＡを防御し区別できるようにする手段が提供される。
れらの酵素は制限エンドヌクレアーゼと相補的であり、
これによって、細菌が外来の感染性ＤＮＡから自身のＤ
ＮＡを防御し区別できるようにする手段が提供される。
修飾メチラーゼは対応する制限エンドヌクレアーゼと同
じヌクレオブト認識配列を認識してそれに結合するが、
このＤＮＡを破断する代わりに、メチル基を付加するこ
とによってその配列内のヌクレオブトのいずれかを化学
的に修飾する。このメチル化が起こると、その認識配列
に制限エンドヌクレアーゼが結合することはなく、また
、その配列が制限エンドヌクレアーゼに開裂されること
もない。細菌細胞のＤＮＡはその修飾メチラーゼの活性
のおかげでいつも完全に修飾されており、したがって自
身の内内角制限エンドヌクレアーゼの存在に対して完全
に非感受性となっている。制限エンドヌクレアーゼの認
識と攻撃に対して感受性のあるのは未修飾のＤＮＡ、し
たがって外来のものであることが確認できるＤＮＡだけ
である。
じヌクレオブト認識配列を認識してそれに結合するが、
このＤＮＡを破断する代わりに、メチル基を付加するこ
とによってその配列内のヌクレオブトのいずれかを化学
的に修飾する。このメチル化が起こると、その認識配列
に制限エンドヌクレアーゼが結合することはなく、また
、その配列が制限エンドヌクレアーゼに開裂されること
もない。細菌細胞のＤＮＡはその修飾メチラーゼの活性
のおかげでいつも完全に修飾されており、したがって自
身の内内角制限エンドヌクレアーゼの存在に対して完全
に非感受性となっている。制限エンドヌクレアーゼの認
識と攻撃に対して感受性のあるのは未修飾のＤＮＡ、し
たがって外来のものであることが確認できるＤＮＡだけ
である。
遺伝子工学技術の出現によって、今では、遺伝子をクロ
ーニングし、その遺伝子がコードしているタンパク質や
酵素を従来の精製技術で入手可能なｎより大和に生産す
ることが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の
クローンを単ｍ１−ｄる際の鍵は、そのようなりローン
の出現頻度が１０−３〜１０−４程度に低い場合、複雑
な「ライブラリー」、すなわち「ショットガン」法で得
られるクローンの集団の中で目的と覆るクローンを同定
するための簡単で信頼のおける方法を開発することであ
る。
ーニングし、その遺伝子がコードしているタンパク質や
酵素を従来の精製技術で入手可能なｎより大和に生産す
ることが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の
クローンを単ｍ１−ｄる際の鍵は、そのようなりローン
の出現頻度が１０−３〜１０−４程度に低い場合、複雑
な「ライブラリー」、すなわち「ショットガン」法で得
られるクローンの集団の中で目的と覆るクローンを同定
するための簡単で信頼のおける方法を開発することであ
る。
好ましくは、この方法は、目的としない大多数のクロー
ンは破壊されるが珍にある望ましいクローンは生き残れ
るように、選択的なものであるべきである。
ンは破壊されるが珍にある望ましいクローンは生き残れ
るように、選択的なものであるべきである。
■型の制限−修飾系はクローニングされつつあり、その
数は次第に増加している。最初にクローニングされた系
は、制限エンドヌクレアービクローンを同定または選択
する手段としてバタアリオファージによる感染を使用し
た［ ＨｈａＴ［： Ｈａｎｎｅｔ ａｌ、 Ｇｅｎ
ｅ、 ３： ９７−１１２ （１９７８） ： Ｅｃ
ｏＲＩＩ ：にｏｓｙｋｈ ｅｔ ａｌ、、Ｈｏ１ｅｃ
、 ｇｅｎ、 Ｇｅｎｃｔ、、 １７８ ： ７１７
−７１９（１９８０）； ＰｓｔＩ ： Ｗａｌｄｅｒ
ｅｔ ａ！、、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ八ｃへｄ、 Ｓｃ
ｉ、 ＵＳ＾ ７８ １５０３−１５０７ （１９８１
）］ 、細菌中に制限−修飾系が存在するとｍ菌はバク
テリオファージによる感染に対して抵抗できるので、ク
ローニングされた制限−修飾遺伝子を担持する細胞は、
原理的に、ファージに暴露されたライブラリーから生え
て来る（生き残る）株として選択的に単離することがで
きる。しかしこの方法は限られた価値しかないことが判
明した。特定的にいうと、クローニングされた制限−修
飾遺伝子は、選択的な生き残りを可能にする程に充分な
ファージ耐性を常に発現するとは限らないことが判明し
たのである。
数は次第に増加している。最初にクローニングされた系
は、制限エンドヌクレアービクローンを同定または選択
する手段としてバタアリオファージによる感染を使用し
た［ ＨｈａＴ［： Ｈａｎｎｅｔ ａｌ、 Ｇｅｎ
ｅ、 ３： ９７−１１２ （１９７８） ： Ｅｃ
ｏＲＩＩ ：にｏｓｙｋｈ ｅｔ ａｌ、、Ｈｏ１ｅｃ
、 ｇｅｎ、 Ｇｅｎｃｔ、、 １７８ ： ７１７
−７１９（１９８０）； ＰｓｔＩ ： Ｗａｌｄｅｒ
ｅｔ ａ！、、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ八ｃへｄ、 Ｓｃ
ｉ、 ＵＳ＾ ７８ １５０３−１５０７ （１９８１
）］ 、細菌中に制限−修飾系が存在するとｍ菌はバク
テリオファージによる感染に対して抵抗できるので、ク
ローニングされた制限−修飾遺伝子を担持する細胞は、
原理的に、ファージに暴露されたライブラリーから生え
て来る（生き残る）株として選択的に単離することがで
きる。しかしこの方法は限られた価値しかないことが判
明した。特定的にいうと、クローニングされた制限−修
飾遺伝子は、選択的な生き残りを可能にする程に充分な
ファージ耐性を常に発現するとは限らないことが判明し
たのである。
もうひとつ別のクローニング法では、最初プラスミド由
来とされていた系を旦、延クローニングプラスミド中に
組み込んでいる［ＥｃｏＲＶ：Ｂｏｕｇｕｃｌｅｒｅｔ
ｅｔ ａｌ、、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ
ｓ Ｒｅｓ、、 １２：３６５９−３６７６（１９
８４）；ＰａｅＲ７：Ｇｉｎｇｅｒａｓ ａｎｄ Ｂｒ
ｏｏｋｓ。
来とされていた系を旦、延クローニングプラスミド中に
組み込んでいる［ＥｃｏＲＶ：Ｂｏｕｇｕｃｌｅｒｅｔ
ｅｔ ａｌ、、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ
ｓ Ｒｅｓ、、 １２：３６５９−３６７６（１９
８４）；ＰａｅＲ７：Ｇｉｎｇｅｒａｓ ａｎｄ Ｂｒ
ｏｏｋｓ。
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
ＵＳＡ、 ８０：４０２−４０６（１９８３）：
丁ｈｅｒｉａｕｌｔ ａｎｄ Ｒｏｙ Ｇｅ
ｎｅ、 １９：３５５−３５９ （１９８２）Ｐｖ
ｕｌ ： Ｂｌｕｍｃｎｔｈａｌ ａｔ ａｌ、
、 Ｊ、 Ｂａｃｔｃｒ＋。
ＵＳＡ、 ８０：４０２−４０６（１９８３）：
丁ｈｅｒｉａｕｌｔ ａｎｄ Ｒｏｙ Ｇｅ
ｎｅ、 １９：３５５−３５９ （１９８２）Ｐｖ
ｕｌ ： Ｂｌｕｍｃｎｔｈａｌ ａｔ ａｌ、
、 Ｊ、 Ｂａｃｔｃｒ＋。
１６４・ ５０１−５０９ （１９８５）］。
第三の方法、すなわち多くの系のクローニングに使用さ
れている方法では、本発明音らの特許出願第７０７０７
９号に関連する活性なメチラーゼ遺伝子についで選択す
る［ＢｓｕＲＩ ： Ｋ１５ｓ ｅｔ ａｌ、、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ、 １３： ６４０３
−６４２１ （１９８５）］。制限遺伝子と修飾遺伝子
とは近接して結合している傾向があるので、両者の遺伝
子を含イ１するクローンは一方の遺伝子について選択す
るだ【プで１！離できることが多い。しかし、メチル化
活性による選択では常に完全な制限−修飾系が得られる
わけではなく、逆に、メチラーぜ遺伝子のみが得られる
こともある［ ［３ｓｐＲ■： Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉ
ｅｔ ａｌ、、Ｇｅｎｅ、 １０：２１９−２２５
（１９８０）；３ｃｎ工： Ｊａｎｕｌａｉｔｉｓ ｅ
ｔ ａｌ、、Ｇｅｎｅ２０：１９７−２０４ （１９８
２）：Ｂ ｓｕＲＩ ：にｉｓｓ ａｎｄ Ｂａ１ｄａ
ｕｒ。
れている方法では、本発明音らの特許出願第７０７０７
９号に関連する活性なメチラーゼ遺伝子についで選択す
る［ＢｓｕＲＩ ： Ｋ１５ｓ ｅｔ ａｌ、、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ、 １３： ６４０３
−６４２１ （１９８５）］。制限遺伝子と修飾遺伝子
とは近接して結合している傾向があるので、両者の遺伝
子を含イ１するクローンは一方の遺伝子について選択す
るだ【プで１！離できることが多い。しかし、メチル化
活性による選択では常に完全な制限−修飾系が得られる
わけではなく、逆に、メチラーぜ遺伝子のみが得られる
こともある［ ［３ｓｐＲ■： Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉ
ｅｔ ａｌ、、Ｇｅｎｅ、 １０：２１９−２２５
（１９８０）；３ｃｎ工： Ｊａｎｕｌａｉｔｉｓ ｅ
ｔ ａｌ、、Ｇｅｎｅ２０：１９７−２０４ （１９８
２）：Ｂ ｓｕＲＩ ：にｉｓｓ ａｎｄ Ｂａ１ｄａ
ｕｒ。
Ｇｅｎｅ、 ２１：１１１−１１９ （１９８３）；お
よびＭ ｓｐＩ ： Ｗａｌｄｅｒｅｔ ａｌ、、Ｊ
、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５８：１２３５−１２４１
（１９８３）］ 。
よびＭ ｓｐＩ ： Ｗａｌｄｅｒｅｔ ａｌ、、Ｊ
、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５８：１２３５−１２４１
（１９８３）］ 。
制限−修飾遺伝子のクローニングに対する潜在的な障害
は、修飾によって保護されていない宿主中にエンドヌク
レアーゼ遺伝子を導入しようとすることにある。メチラ
ーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とを一緒に単一
のクローンとして導入すると、エンドヌクレアーゼが宿
主ＤＮＡを開裂する償金を得る前にメチラーゼがそのＤ
ＮＡを修飾して保護するはずである。したがって、場合
によっては、これらの遺伝子は順番（すなわち、最初に
メチラーゼ、次にエンドヌクレアーゼの順）にのみクロ
ーニングが可能となるかもしれない。
は、修飾によって保護されていない宿主中にエンドヌク
レアーゼ遺伝子を導入しようとすることにある。メチラ
ーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とを一緒に単一
のクローンとして導入すると、エンドヌクレアーゼが宿
主ＤＮＡを開裂する償金を得る前にメチラーゼがそのＤ
ＮＡを修飾して保護するはずである。したがって、場合
によっては、これらの遺伝子は順番（すなわち、最初に
メチラーゼ、次にエンドヌクレアーゼの順）にのみクロ
ーニングが可能となるかもしれない。
制限−修飾系のクローニングに対する別の障害は、Ｅ、
（１０）Ｉｉの株の中にはシトシンの修飾に対して逆の
反応を示すものがあるという発見にある。
（１０）Ｉｉの株の中にはシトシンの修飾に対して逆の
反応を示すものがあるという発見にある。
ずなわら、そのような株は、メチル化シトシンを含有し
ているＤＮＡを破壊する系をもっているのである［Ｒａ
ｌｅｉｇｈ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎ
ａ口、Ａｃａｄｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ８３： ９０７０
−９０７４ （１９８６）］ 、 ；Ｘれらの株では、
その自身の遺伝子上でも、あるいはその対応するエンド
ヌクレアーぜ遺伝子と共にでも、シトシン特異的メチラ
ーゼ遺伝子を容易にクローニングすることができない。
ているＤＮＡを破壊する系をもっているのである［Ｒａ
ｌｅｉｇｈ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎ
ａ口、Ａｃａｄｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ８３： ９０７０
−９０７４ （１９８６）］ 、 ；Ｘれらの株では、
その自身の遺伝子上でも、あるいはその対応するエンド
ヌクレアーぜ遺伝子と共にでも、シトシン特異的メチラ
ーゼ遺伝子を容易にクローニングすることができない。
この問題を避けるために、これらの系を欠損り、でいる
旦、 ｃｏｌｉ変異株（Ｍ ＣｒＡ およびＭＣｒＢ
’）を使用する必要がある。
旦、 ｃｏｌｉ変異株（Ｍ ＣｒＡ およびＭＣｒＢ
’）を使用する必要がある。
精製した制限エンドヌクレアーゼ、および重要性はそれ
より落らるが修飾メチラーゼは、実験室でＤＮＡの特性
決定と再配列をするのに有用な遊具であるから、これら
の醇素を大量に合成する細菌株を組換えＤＮＡ技術によ
って得ることは商業的な魅力がある。そのような株が得
られれば、商業的に有用な吊で生産するための手段が提
供されるばかりでなく精製の作業も簡単になると思われ
るので、これらの株は極めて有用なものとなろう。
より落らるが修飾メチラーゼは、実験室でＤＮＡの特性
決定と再配列をするのに有用な遊具であるから、これら
の醇素を大量に合成する細菌株を組換えＤＮＡ技術によ
って得ることは商業的な魅力がある。そのような株が得
られれば、商業的に有用な吊で生産するための手段が提
供されるばかりでなく精製の作業も簡単になると思われ
るので、これらの株は極めて有用なものとなろう。
発明の概要
本発明によって、ＨｅｒｐｅｔＯ３ｉｐｈＯｎ （ｌ
ｉ（ｌａｎｔｅｌＪｓに由来するＨ（ＪＩＡＩ制限エン
ドヌクレアーゼおよび修飾メチラーゼの遺伝子を含有す
るクローン、ならびにこれらの酵素の生産方法が提供さ
れる。より特定すると、本発明は、Ｇ（Ｔ／Ａ）ＧＣ（
丁／Ａ）ＣというＤＮＡ配列を認識して３′末端のＣの
直前で開裂する酵素である制限エンドヌクレアーゼＨ（
１１八工を発現するクローンに係る。Ｂｒｏｗｎ、 Ｈ
ｃＣＩｅｌｌａｎｄａｎｄ Ｗｈ已ｅｈｅａｄ、 Ｇ
ｅｎｅ、 ９． ４９−６８ （１９８０）参照（そ
の開示内容は、ここで引用したことによって本明細書中
に含まれるものとする）。本発明に従って生産されるＨ
９ＩＡ工制限エンドヌクレアーゼは、ＩＩＱｒｐｅｔＯ
ＳｉＤｈＯｎ ｇｌｇａｎｔｅｕｓから％Ｊ造された
ＨａｉＡＩ調製物中に見られる夾雑物を含んでいない。
ｉ（ｌａｎｔｅｌＪｓに由来するＨ（ＪＩＡＩ制限エン
ドヌクレアーゼおよび修飾メチラーゼの遺伝子を含有す
るクローン、ならびにこれらの酵素の生産方法が提供さ
れる。より特定すると、本発明は、Ｇ（Ｔ／Ａ）ＧＣ（
丁／Ａ）ＣというＤＮＡ配列を認識して３′末端のＣの
直前で開裂する酵素である制限エンドヌクレアーゼＨ（
１１八工を発現するクローンに係る。Ｂｒｏｗｎ、 Ｈ
ｃＣＩｅｌｌａｎｄａｎｄ Ｗｈ已ｅｈｅａｄ、 Ｇ
ｅｎｅ、 ９． ４９−６８ （１９８０）参照（そ
の開示内容は、ここで引用したことによって本明細書中
に含まれるものとする）。本発明に従って生産されるＨ
９ＩＡ工制限エンドヌクレアーゼは、ＩＩＱｒｐｅｔＯ
ＳｉＤｈＯｎ ｇｌｇａｎｔｅｕｓから％Ｊ造された
ＨａｉＡＩ調製物中に見られる夾雑物を含んでいない。
この酵素をクローニングする好ましい方法は、１−１
、 （ｌｉ（ＪａｎｔＱｔｌｓに由来するＤＮＡを含
有するライブラリーを形成し、Ｈｇ１Ａ■修飾メチラー
ゼをコードしているＤＮＡを含有するクローンを単離し
、これらをスクリーニングして、Ｈｇ１ＡＩ制限エンド
ヌクレアーゼ遺伝子も共に含有しているクローンを同定
することからなる。
、 （ｌｉ（ＪａｎｔＱｔｌｓに由来するＤＮＡを含
有するライブラリーを形成し、Ｈｇ１Ａ■修飾メチラー
ゼをコードしているＤＮＡを含有するクローンを単離し
、これらをスクリーニングして、Ｈｇ１ＡＩ制限エンド
ヌクレアーゼ遺伝子も共に含有しているクローンを同定
することからなる。
発明の詳細な説明
本発明は、Ｈｇｉ△■制限および修飾遺伝子のクローン
、ならびにそのようなりローンによって生産される制限
エンドヌクレアーゼＨｇｉ△■に係る。
、ならびにそのようなりローンによって生産される制限
エンドヌクレアーゼＨｇｉ△■に係る。
これらのＨｇｉＡＩｍ伝子は、ＨｇＩＡ■修飾メチラー
ピ遺伝子を含有し発現することに基づいて選択したある
種のクローンが同時に）−１ａｉＡＩ制限遺伝子も含有
しているという事実を利用する方法によってクローニン
グされる。そのようなりローンのＤＮＡはＨａｔΔ■制
限エンドヌクレアーゼによる消化に低抗性である。この
消化に対する抵抗性によって、ＨｑｉＡ’Ｉメチラーゼ
および制限エンドヌクレアーゼをコードしているクロー
ンを選択的に単１１１ｔするための手段が得られる。
ピ遺伝子を含有し発現することに基づいて選択したある
種のクローンが同時に）−１ａｉＡＩ制限遺伝子も含有
しているという事実を利用する方法によってクローニン
グされる。そのようなりローンのＤＮＡはＨａｔΔ■制
限エンドヌクレアーゼによる消化に低抗性である。この
消化に対する抵抗性によって、ＨｑｉＡ’Ｉメチラーゼ
および制限エンドヌクレアーゼをコードしているクロー
ンを選択的に単１１１ｔするための手段が得られる。
ＨＱｉＡＩ制限遺伝子およびメチラーゼ遺伝子をクロー
ニングして発現さゼるための本発明の好ましい方法を第
１図に示すが、これには以下のステップが含まれる。
ニングして発現さゼるための本発明の好ましい方法を第
１図に示すが、これには以下のステップが含まれる。
（１） １ｌｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ ｇｉｇａ
ｎｔｅｕｓのＤＮＡを精製する。ｎ、 ｇｉｇａｎｔ
ｅｕｓは Ｂｒｏｗｎ ａｔ ａｌ、、 ５ｕｐｒａ
に記載されている。この細菌のサンプルはＴｈｅ八ｍ
へｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ＣＩＪＩｔＵｒｅ Ｃｏ
１１ｅｃｔｉｏｎから ＡＴＣＣ５３７５６として入手
可能である。
ｎｔｅｕｓのＤＮＡを精製する。ｎ、 ｇｉｇａｎｔ
ｅｕｓは Ｂｒｏｗｎ ａｔ ａｌ、、 ５ｕｐｒａ
に記載されている。この細菌のサンプルはＴｈｅ八ｍ
へｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ＣＩＪＩｔＵｒｅ Ｃｏ
１１ｅｃｔｉｏｎから ＡＴＣＣ５３７５６として入手
可能である。
（２） このＤＮＡをＢＱＩＩＩのような制限エンド
ヌクレアー１で部分消化する。
ヌクレアー１で部分消化する。
（３） 消化したＤＮＡを、１個以上のＨｇｌＡｌ部
位を含有するｐＵ Ｃ１９（＾ＴＣＣ３７２５４）のよ
うなり［１−ニングベクターに連結する。連結したＤＮ
ＡをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｒ８１株（
八ＴＣＣ３１３４３）のような適当な宿主に形質転換す
る。
位を含有するｐＵ Ｃ１９（＾ＴＣＣ３７２５４）のよ
うなり［１−ニングベクターに連結する。連結したＤＮ
ＡをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｒ８１株（
八ＴＣＣ３１３４３）のような適当な宿主に形質転換す
る。
（４） 形質転換した混合物を、形質転換細胞を選択
するためのアンピシリンのような抗生物質を含有する培
地（Ａｍｐ ｐｌａｔｅｓ）に接種する。培養後形質転
換体］ロニーをひとつに集めてセルライブラリーとする
。
するためのアンピシリンのような抗生物質を含有する培
地（Ａｍｐ ｐｌａｔｅｓ）に接種する。培養後形質転
換体］ロニーをひとつに集めてセルライブラリーとする
。
（５） このセルライブラリーから組換えプラスミド
全部をそっくり精製してプラスミドライブラリーを作成
する。
全部をそっくり精製してプラスミドライブラリーを作成
する。
（６） このプラスミドライブラリーを、Ｈ３ｇｉｇ
ａｎｔｅｕｓから調製したＨｇ１ＡＩ制限エンドヌクレ
アーゼで完全に消化する。Ｈｇ１Ａ■消化により、メチ
ラーゼを含有しない未修飾クローンが特異的に破壊され
、）−１ｏｉΔ■メチラーゼクローンの相対頻度が増大
する。
ａｎｔｅｕｓから調製したＨｇ１ＡＩ制限エンドヌクレ
アーゼで完全に消化する。Ｈｇ１Ａ■消化により、メチ
ラーゼを含有しない未修飾クローンが特異的に破壊され
、）−１ｏｉΔ■メチラーゼクローンの相対頻度が増大
する。
（７） 消化したプラスミドライブラリーをＦｃｏｌ
ｉ ＲＲＩのような適当な宿主に形質転換し、選択培地
に接種して形質転換体を回収する。これらのコロニーを
採取し、そのＤＮＡをｌ−（ｇｉＡＩ峰飾遺伝子の存在
について分析する。ゴなわら、コロニーが１１持するプ
ラスミドを精製し、ｌ−１ｏｉＡＩ制限エンドヌクレア
ーゼと共にインキュベートして消化に対して抵抗性か否
かを決定する。また、細胞の全ＤＮＡ（染色体およびプ
ラスミド）も精製し、ＨｇｉＡＩ制限エンドヌクレアー
ゼと共にインキュベ−１・する。ＨＱ１Δ■修篩遺伝子
を担持するり［１−ンのＤＮＡは充分に修飾されている
はずであり。
ｉ ＲＲＩのような適当な宿主に形質転換し、選択培地
に接種して形質転換体を回収する。これらのコロニーを
採取し、そのＤＮＡをｌ−（ｇｉＡＩ峰飾遺伝子の存在
について分析する。ゴなわら、コロニーが１１持するプ
ラスミドを精製し、ｌ−１ｏｉＡＩ制限エンドヌクレア
ーゼと共にインキュベートして消化に対して抵抗性か否
かを決定する。また、細胞の全ＤＮＡ（染色体およびプ
ラスミド）も精製し、ＨｇｉＡＩ制限エンドヌクレアー
ゼと共にインキュベ−１・する。ＨＱ１Δ■修篩遺伝子
を担持するり［１−ンのＤＮＡは充分に修飾されている
はずであり。
プラスミドＯＮΔと全ＤＮＡは両方とも消化に対して実
質的に抵抗性であるはずである。
質的に抵抗性であるはずである。
（８） ステップ（７）で同定されたＨｑｉＡＩメチ
ラーゼクローンの細胞抽出物を調製し、この抽出物のｌ
−１ｏｉＡＩ制限エンドヌクレアーゼ活牲を検定するこ
とによって、Ｈｇ１Δ■制限エンドヌクレアーゼを担持
するクローンを同定する。
ラーゼクローンの細胞抽出物を調製し、この抽出物のｌ
−１ｏｉＡＩ制限エンドヌクレアーゼ活牲を検定するこ
とによって、Ｈｇ１Δ■制限エンドヌクレアーゼを担持
するクローンを同定する。
（９） Ｈ（ｌｉＡＩ制限および修飾遺伝子を担持し
ているクローンを醗′Ｍ槽内のアンピシリン含有富化培
地中で増殖させることによって、１ｌｉＡＩ制限エンド
ヌクレアーゼを生産することができる。
ているクローンを醗′Ｍ槽内のアンピシリン含有富化培
地中で増殖させることによって、１ｌｉＡＩ制限エンド
ヌクレアーゼを生産することができる。
細胞を遠心して集め、音波処理で破砕すると、ＨＯｉＡ
丁制限エンドヌクレアーゼ活性を含有する粗細胞抽出物
が生成する。
丁制限エンドヌクレアーゼ活性を含有する粗細胞抽出物
が生成する。
（１０） ＨＵｉＡ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ活性
を含りする粗細胞抽出物を、アフィニティーク［］７１
へグラフィーやイオン交換クロマトグラフィーのように
標準的なタンパク質精製技術によって精製する。
を含りする粗細胞抽出物を、アフィニティーク［］７１
へグラフィーやイオン交換クロマトグラフィーのように
標準的なタンパク質精製技術によって精製する。
十に概略を記載した手順は本発明の好ましい実施態様で
あるが、上記の手順を業界で公知の技術によって変える
ことができるということは当業者には明らかであろう。
あるが、上記の手順を業界で公知の技術によって変える
ことができるということは当業者には明らかであろう。
以下に現状で好ましい具体例を挙げて本発明を例示する
が、これらの実施例は単なる例示であって特許請求の範
囲で指摘されない限り本発明がこれらの実施例に限定さ
れることはないものと考えられたい。
が、これらの実施例は単なる例示であって特許請求の範
囲で指摘されない限り本発明がこれらの実施例に限定さ
れることはないものと考えられたい。
実施例
ＨａｉＡＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニン
グ （１） ＤＮＡの精製： 凍結した１ｌｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ ｇｉｇａｎ
ｔｃｕｓ （八ＴＣＣ５３７５６）のａｌｌ胞１０ｇ
を氷上で１時間Ｗ１．？！Ｉシた後２０ｄの２５％スク
ロース、 ５０ｍＨＴｒｉｓ ｐＨａ、ｏ中に再懸濁さ
せた。１０ｄの０．２５ＨＥＤＴ八ｐへ ８．０および
６ｄの１０ｎｙ ／ ｄリゾチーム（０，２５Ｈ丁ｒｉ
ｓ ｐＨ８，０中）を加えた。この懸濁液を２時間氷上
に保った後、２４−の １％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
，５０ｍＨＴｒｉｓ ＯＨ８，０，６７ｍＨＥＤＴＡお
よび５ｄの１０％ＳＤＳを加えて溶菌ざした。得られた
溶液を、（前もって０．５８ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ８，０
で平衡化した）フェノール７０ｄおよびクロロホルム６
０−で抽出した。（Ｈられた乳濁液を１１０Ｋｒ１）で
３０分遠心して相を分離した。粘稠なト相を新しいびん
に移してもう一度７１ノールおよびクロロホルムで抽出
した。得られた乳濁液を再度遠心した後、その上相をＤ
ＮＡ緩衝液（１０ｍＨＴｒｉｓ ｐＨ８，０，１ｍＨＥ
ＤＴ＾）に対しこの緩衝液を四回交換１ノで透析した。
グ （１） ＤＮＡの精製： 凍結した１ｌｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ ｇｉｇａｎ
ｔｃｕｓ （八ＴＣＣ５３７５６）のａｌｌ胞１０ｇ
を氷上で１時間Ｗ１．？！Ｉシた後２０ｄの２５％スク
ロース、 ５０ｍＨＴｒｉｓ ｐＨａ、ｏ中に再懸濁さ
せた。１０ｄの０．２５ＨＥＤＴ八ｐへ ８．０および
６ｄの１０ｎｙ ／ ｄリゾチーム（０，２５Ｈ丁ｒｉ
ｓ ｐＨ８，０中）を加えた。この懸濁液を２時間氷上
に保った後、２４−の １％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
，５０ｍＨＴｒｉｓ ＯＨ８，０，６７ｍＨＥＤＴＡお
よび５ｄの１０％ＳＤＳを加えて溶菌ざした。得られた
溶液を、（前もって０．５８ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ８，０
で平衡化した）フェノール７０ｄおよびクロロホルム６
０−で抽出した。（Ｈられた乳濁液を１１０Ｋｒ１）で
３０分遠心して相を分離した。粘稠なト相を新しいびん
に移してもう一度７１ノールおよびクロロホルムで抽出
した。得られた乳濁液を再度遠心した後、その上相をＤ
ＮＡ緩衝液（１０ｍＨＴｒｉｓ ｐＨ８，０，１ｍＨＥ
ＤＴ＾）に対しこの緩衝液を四回交換１ノで透析した。
次に、透析した溶液を最終濃度２００埒／戴のＲＮａｓ
ｅにより３７℃で１時間消化した後、５ＨＮａＣρを最
Ｎ濃度０．４Ｈまで加え、かつ０５５倍容量のイソプロ
ピルアルコールを添加してＤＮＡを沈澱させた。沈澱し
たＤＮＡをガラス捧に巻き付けて取り出し、風乾した後
ＤＮＡ緩衝液に溶解させて４℃で貯蔵した。
ｅにより３７℃で１時間消化した後、５ＨＮａＣρを最
Ｎ濃度０．４Ｈまで加え、かつ０５５倍容量のイソプロ
ピルアルコールを添加してＤＮＡを沈澱させた。沈澱し
たＤＮＡをガラス捧に巻き付けて取り出し、風乾した後
ＤＮＡ緩衝液に溶解させて４℃で貯蔵した。
（２） ＤＮＡの消化：
Ｉｆ、 ｇ＋ｇａｎｔｅｕｓのＤ Ｎ Ａ ３ＯＮを、
３００成の制限エンドヌクレアーゼ消化用Ｍ！ｔｉ液（
１０ｍＨＴｒｉｓ Ｄｌ１７．５．１０ｍ）ｌ ＨａＣ
ｌ、、 、 １０ｍＨメルカ７１〜エタノール。
３００成の制限エンドヌクレアーゼ消化用Ｍ！ｔｉ液（
１０ｍＨＴｒｉｓ Ｄｌ１７．５．１０ｍ）ｌ ＨａＣ
ｌ、、 、 １０ｍＨメルカ７１〜エタノール。
１５０ｍＨＮａＣ！！ ）中に希釈した。得られた溶液
を１００成ずつ３つに分けた。最初のものにはＢｇｌＩ
［制限エンドヌクレアーゼを５ ｕｎｉｔ加え、２番目
のものには２．５ ｕｎｉｔ、 ３番目のものには１Ｕ
ｎｉｔ加えた。得られた溶液を１時間３７℃にインキュ
ベートした後、１０分間７２℃に加熱して消化を停止さ
せた。
を１００成ずつ３つに分けた。最初のものにはＢｇｌＩ
［制限エンドヌクレアーゼを５ ｕｎｉｔ加え、２番目
のものには２．５ ｕｎｉｔ、 ３番目のものには１Ｕ
ｎｉｔ加えた。得られた溶液を１時間３７℃にインキュ
ベートした後、１０分間７２℃に加熱して消化を停止さ
せた。
３つの溶液を一緒にした。
（３） 連結および形質転換：
１３ａｌｌｌで部分消化したＩｆ、 ｇｉｇａｎｔｅｕ
ｓ ＤＮＡ３埒（３０度）を、Ｂａ１ｎＨＩで開裂し
脱リン酸化した１ｌＵｃ１９（ＡＴＣＣ３７２５４）
１．５埒（８ＩＩｉ）と混合した。ｉｏｘ連結用ＩＩ
液（５００ｎ＋ＨＴｒｉｓ ｐＨ７，５，１００ｍＨＨ
（＋（Ｊ２． ＋ＯＯｍＨＤＴＴ、 ５ｍＨＡＴＰ）を
１０ρ力口え、さらに滅菌蒸溜水を５２成加えて容積を
１００庫とした。
ｓ ＤＮＡ３埒（３０度）を、Ｂａ１ｎＨＩで開裂し
脱リン酸化した１ｌＵｃ１９（ＡＴＣＣ３７２５４）
１．５埒（８ＩＩｉ）と混合した。ｉｏｘ連結用ＩＩ
液（５００ｎ＋ＨＴｒｉｓ ｐＨ７，５，１００ｍＨＨ
（＋（Ｊ２． ＋ＯＯｍＨＤＴＴ、 ５ｍＨＡＴＰ）を
１０ρ力口え、さらに滅菌蒸溜水を５２成加えて容積を
１００庫とした。
Ｔ４ ＤＮΔリガーゼを４成加え、得られた溶液を４時
間１７℃にインキュベートした。この溶液をクロロホル
ム１０Ｉ１１で抽出して滅菌した後、１５秒間軽く遠心
（ｖｃｒｏｃｅｎｔｒＨｕｇａｔｉｏｎ）して清澄化し
た。
間１７℃にインキュベートした。この溶液をクロロホル
ム１０Ｉ１１で抽出して滅菌した後、１５秒間軽く遠心
（ｖｃｒｏｃｅｎｔｒＨｕｇａｔｉｏｎ）して清澄化し
た。
連結溶液８０ｄを１戒のＳＳＣ／Ｃａａ！２（５０ｍＨ
ＮａＣ１５ｍＨクエンＭＮａ 、 ６７ｍＨＣａＣ
１２）と混合し、氷冷した旦 ｃｏｌ ｉ ＲＲｌ
（ＡＴＣＣ３１３４３）コンピテント細胞を２１ｎ１
加えた。得られた溶液を５分間４２°Ｃにインキュベー
トした後、８ｄの １ｕｒｉａ−ブロス（Ｌ−−ｂｒｏ
ｔｈ）を添加して３７℃で４時間インキュベーションを
続行した。
ＮａＣ１５ｍＨクエンＭＮａ 、 ６７ｍＨＣａＣ
１２）と混合し、氷冷した旦 ｃｏｌ ｉ ＲＲｌ
（ＡＴＣＣ３１３４３）コンピテント細胞を２１ｎ１
加えた。得られた溶液を５分間４２°Ｃにインキュベー
トした後、８ｄの １ｕｒｉａ−ブロス（Ｌ−−ｂｒｏ
ｔｈ）を添加して３７℃で４時間インキュベーションを
続行した。
（４） セルライブラリー二
形質転換した培養液を穏やかに遠心した後、上清を捨て
、細胞を１１ｄの１−ｂｒｏｔｈに再懸濁させた。再懸
濁した細胞のうち２００ｄを、アンピシリンを１００ｉ
／ｄ含有するＬｕｒｉａ−寒天（Ｌ−ａｇａｒ）プレー
ト上に接種した。このプレートを一晩３７℃にインキュ
ベートした。プレートの表面上に生えてきた形質転換細
胞をまとめて回収するために、各プレート１．： ２．
５ｄの１０ｍＨＴｒｉｓ ｐＨ７，５，１０ｍＨＨｃ＋
（ｌｊ！２を満たし、コロニーを全部掻ぎ集め、得られ
た懸濁液を１本のチューブ内にプールした。
、細胞を１１ｄの１−ｂｒｏｔｈに再懸濁させた。再懸
濁した細胞のうち２００ｄを、アンピシリンを１００ｉ
／ｄ含有するＬｕｒｉａ−寒天（Ｌ−ａｇａｒ）プレー
ト上に接種した。このプレートを一晩３７℃にインキュ
ベートした。プレートの表面上に生えてきた形質転換細
胞をまとめて回収するために、各プレート１．： ２．
５ｄの１０ｍＨＴｒｉｓ ｐＨ７，５，１０ｍＨＨｃ＋
（ｌｊ！２を満たし、コロニーを全部掻ぎ集め、得られ
た懸濁液を１本のチューブ内にプールした。
（５） プラスミドライブラリー二
２．５ｄのセルライブラリーを、アンピシリンを＋００
ＩＪ９／ｄ含有する Ｌ−ｂｒｏｔｈ ５００７中に接
種した。
ＩＪ９／ｄ含有する Ｌ−ｂｒｏｔｈ ５００７中に接
種した。
３７℃で一晩振盪培養した模、４にｒｐｍで５分遠心し
た。ト清を捨て、細胞ベレットを１０１＋ｌｉ！の２５
％スクロース、 ５０ｍＨＴｒｙｓ ｐＨ８，０ｋ１．
ｉ温テ再懸濁すｔ！ タ。
た。ト清を捨て、細胞ベレットを１０１＋ｌｉ！の２５
％スクロース、 ５０ｍＨＴｒｙｓ ｐＨ８，０ｋ１．
ｉ温テ再懸濁すｔ！ タ。
０．２５８ ＥＤＴＡ、 ｐＨ８，０を５ｄ、および
１０ＩＩｔ９／威リゾチーム（Ｏ３２５）４ Ｔｒｉｓ
、 ｐＨ８，０中）を３１ｎ１．加えた。
１０ＩＩｔ９／威リゾチーム（Ｏ３２５）４ Ｔｒｉｓ
、 ｐＨ８，０中）を３１ｎ１．加えた。
得られた溶液を氷上に１時間放置した曵、１２ｍ１の１
％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，５０ｍＨＴｒｙｓ ｐｔ
ｌ ８．０．６７ｍＨＥＤＴＡを添加し、この懸濁液に
穏やかに渦を巻かせて細胞の溶菌を誘導した。
％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，５０ｍＨＴｒｙｓ ｐｔ
ｌ ８．０．６７ｍＨＥＤＴＡを添加し、この懸濁液に
穏やかに渦を巻かせて細胞の溶菌を誘導した。
溶菌した混合物を５Ｍのチューブに移して１７Ｋｐｐｍ
、 ４℃で４５分間遠心した。ピペットで上清を取り
出した。固体のｃｓｃｐを２ｏ、ｏｇ秤間して５０ｍ１
のプラスチック製ネジブタ付きチューブに入れ、このデ
ユープ中に上清２２．０９をピペットで入れて混合した
。５η／ｄのエチジウムプロミド（１０ｍＨＴｒｉｓ
ｐｔｌ ８．０． １００ｍＨＮａＣ１，１ｍＨＥＤＴ
Ａ中）を ｉ、。
、 ４℃で４５分間遠心した。ピペットで上清を取り
出した。固体のｃｓｃｐを２ｏ、ｏｇ秤間して５０ｍ１
のプラスチック製ネジブタ付きチューブに入れ、このデ
ユープ中に上清２２．０９をピペットで入れて混合した
。５η／ｄのエチジウムプロミド（１０ｍＨＴｒｉｓ
ｐｔｌ ８．０． １００ｍＨＮａＣ１，１ｍＨＥＤＴ
Ａ中）を ｉ、。
ｄ加えた。この溶液を、５／８１ｎｘ３ ｉｎの遠心管
２本に移し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｔ ｉ ７０ロ一ター中
４４ＫｒＤｍ。
２本に移し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｔ ｉ ７０ロ一ター中
４４ＫｒＤｍ。
１７℃で４２時間回転させた。プラスミドを集めるため
に、これらのチューブを聞き、紫外光を照射して２木の
ケイ光バンドの下側の方を注ＤＩ ！で集めた。各チュ
ーブから得た下側のバンドを合わせ、等８最の、水で飽
和した水冷ｎ−ブタノールで四回抽出することによって
エチジウムプロミドを除去した。
に、これらのチューブを聞き、紫外光を照射して２木の
ケイ光バンドの下側の方を注ＤＩ ！で集めた。各チュ
ーブから得た下側のバンドを合わせ、等８最の、水で飽
和した水冷ｎ−ブタノールで四回抽出することによって
エチジウムプロミドを除去した。
抽出された溶液をＤＮＡ緩衝液を四回交換しながらこの
緩衝液に対して透析した後、２倍容最のイソプロパツー
ルと最終濃度が０．４Ｈとなるのに充分な５８ Ｈａ（
Ｊを添加して核酸を沈澱させた。得られた溶液を一晩−
２０℃で保存した模１５Ｋｒｏｍ、Ｏ℃で１５分遠心し
た。上清を捨て、ペレットを１５分間風乾した後、５０
０屑の１０ｍＨＴｒｉｓ ｐＨ７，５，１ｍＨＥＤＴＡ
に溶かして一２０℃で貯蔵した。プラスミドＤＮＡの濃
度は約１５０埒／ｄであった。
緩衝液に対して透析した後、２倍容最のイソプロパツー
ルと最終濃度が０．４Ｈとなるのに充分な５８ Ｈａ（
Ｊを添加して核酸を沈澱させた。得られた溶液を一晩−
２０℃で保存した模１５Ｋｒｏｍ、Ｏ℃で１５分遠心し
た。上清を捨て、ペレットを１５分間風乾した後、５０
０屑の１０ｍＨＴｒｉｓ ｐＨ７，５，１ｍＨＥＤＴＡ
に溶かして一２０℃で貯蔵した。プラスミドＤＮＡの濃
度は約１５０埒／ｄであった。
（６） プラスミドライブラリーの消化：４．５乃（
３０ｍ ）のプラスミドライブラリーを１５０屑の制限
エンドヌクレアーゼ消化用緩衝液（トー記第２項）に希
釈した。３６ ｕｎｉｔの１ｌｉＡＩ制限エンドヌクレ
アーゼを加え、チューブを１時間３７℃にインキュベー
トした後、１２分間７２℃に加熱して反応を停止させた
。
３０ｍ ）のプラスミドライブラリーを１５０屑の制限
エンドヌクレアーゼ消化用緩衝液（トー記第２項）に希
釈した。３６ ｕｎｉｔの１ｌｉＡＩ制限エンドヌクレ
アーゼを加え、チューブを１時間３７℃にインキュベー
トした後、１２分間７２℃に加熱して反応を停止させた
。
（７） 形質転換：
１２．５成（０，３埒）の消化したライブラリーを１０
０屑のＳＳＣ／ＣａＣ１！２（上記第３項）および２０
０成の水冷したコンビテンｔ−Ｅ、 ｃｏｌｉ ＲＲ
Ｉと混合した。
０屑のＳＳＣ／ＣａＣ１！２（上記第３項）および２０
０成の水冷したコンビテンｔ−Ｅ、 ｃｏｌｉ ＲＲ
Ｉと混合した。
得られた混合物を３分間４２℃に暖めた後、７ンビシリ
ンを１００Ａ９／ｄ含有する１−ａｇａｒプレートに接
種した。このプレートを一晩３７℃にインキュベートし
た。１−ＨＪｉＡＩ消化によって、未消化のプラスミド
による形質転換の場合と比較して、形質転換体の数は１
／１０３に減少した。このＨ（ｌｉＡＩ消化で生き残っ
たもののうちから１４個のコロニーを採り、それぞれ、
１０ｒｄのアンピシリン含有１−ｂｒｏｔｈ中に（３種
してミニカルチャー（小培養物）を：！！製し、アンピ
シリンを含有するＬ −ａｇａｒプレート上に画線して
マスターストックを調製した。
ンを１００Ａ９／ｄ含有する１−ａｇａｒプレートに接
種した。このプレートを一晩３７℃にインキュベートし
た。１−ＨＪｉＡＩ消化によって、未消化のプラスミド
による形質転換の場合と比較して、形質転換体の数は１
／１０３に減少した。このＨ（ｌｉＡＩ消化で生き残っ
たもののうちから１４個のコロニーを採り、それぞれ、
１０ｒｄのアンピシリン含有１−ｂｒｏｔｈ中に（３種
してミニカルチャー（小培養物）を：！！製し、アンピ
シリンを含有するＬ −ａｇａｒプレート上に画線して
マスターストックを調製した。
（８） 生き残った個体の解析：
上記第７項で得られた１４個の生き残りのコロニーを１
０戒になるまで増殖させ、これらが担持するプラスミド
を、Ｂｉｒｎｂｏｉｎ ａｎｄ Ｄｏｌｙ、 Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ、、 ７ ： １５１３
（１９７９）の方法を応用した以下のｍ１ｎｉｐｒｅｐ
精製法によって調製した。
０戒になるまで増殖させ、これらが担持するプラスミド
を、Ｂｉｒｎｂｏｉｎ ａｎｄ Ｄｏｌｙ、 Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ、、 ７ ： １５１３
（１９７９）の方法を応用した以下のｍ１ｎｉｐｒｅｐ
精製法によって調製した。
ｍ１ｎｉｐｒｅｐ法：
各培養物を８Ｋｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てて１
ｑられた細胞ペレットを、１η／ｄリゾチームを含有す
る１、Ｏｄの２５ｍＨＴｒｉｓ １０ｍＨ［ＤＴＡ
５０１１１８グルコース、 ｐＨ８，０中に再懸濁さ
せた。室温に１０分間装いた少、各チューブに２．Ｏｄ
の０．２ＨＮａ０ｔ１１χＳＯ３を加え、チューブを振
ｉ！ＡＩ、て細胞を溶解し、次いで水土に置いた。溶液
が透明になってから各々３Ｍ酢酸ナトリウムＨ）１１４
．８）を１．５ｒｄ、ずつ加えて振盪した。生じた沈澱
を１５Ｋｒｏｍ、 ４℃で１０分間遠心して沈ませた。
ｑられた細胞ペレットを、１η／ｄリゾチームを含有す
る１、Ｏｄの２５ｍＨＴｒｉｓ １０ｍＨ［ＤＴＡ
５０１１１８グルコース、 ｐＨ８，０中に再懸濁さ
せた。室温に１０分間装いた少、各チューブに２．Ｏｄ
の０．２ＨＮａ０ｔ１１χＳＯ３を加え、チューブを振
ｉ！ＡＩ、て細胞を溶解し、次いで水土に置いた。溶液
が透明になってから各々３Ｍ酢酸ナトリウムＨ）１１４
．８）を１．５ｒｄ、ずつ加えて振盪した。生じた沈澱
を１５Ｋｒｏｍ、 ４℃で１０分間遠心して沈ませた。
得られた上清を各々、イソプロパツールを３１Ｒｐ、含
有する遠心管に流し入れて混合した。室温で１０分経っ
た後遠心管を１５にｐｐｍで１０分間遠心して沈殿した
核酸をペレット化した。
有する遠心管に流し入れて混合した。室温で１０分経っ
た後遠心管を１５にｐｐｍで１０分間遠心して沈殿した
核酸をペレット化した。
上清を捨て、ペレットを室温で３０分風乾した。
乾燥シタ後ヘレッ１−を８５０ＩＪ１の１０ｍ）ｌ Ｔ
ｒｌＳ、 １ｍＨＥＤＴＡ、 ｐＨ８，０に再懸濁させ
た。５ＨＮａｃｉ！を７５成ずつ加え、得られた溶液を
、５７５成のイソプロパツールを含有するｃｐＤｅｎｃ
ｌｏｒｒチューブに移し、室温で１０分かけて再度沈澱
させた。次に、チューブをｍｉｃｒｏｒｕｇｅ中で４５
秒間回転し、上清を捨ててペレットを風乾した。このペ
レットを、次いで、ＲＮａＳＱを１１００ｐ／ｒｆｄｌ
含有する５００屑の１０ｍＨＴｒｉｓｌｍＨＥＤＴＡ、
ｐＨ８，０に溶解し、１時間３７℃にイン＝１：ユベ
ートしてＲＮＡを消化した。５０／Ｉ１１の５ＨＮａＣ
１、次いで３５０［のイソプロパツールを添加してＤＮ
Ａをもう一度沈澱させた。室温で１０分後、４５秒間遠
心してＤＮＡを沈ませ、−Ｆ清を捨て、得られたペレッ
を１５０成の１０ｍＨＴｒｉｓ、 Ｉｎ＋ＨＥＤＴＡ、
ｐＨ８，０に再溶解した。次いで、プラスミドｍ１ｎ
ｉｐｒｃＤ （小調製物）をＨＯｉΔ王とＥ（１０）Ｒ
Ｉで消化して解析した。
ｒｌＳ、 １ｍＨＥＤＴＡ、 ｐＨ８，０に再懸濁させ
た。５ＨＮａｃｉ！を７５成ずつ加え、得られた溶液を
、５７５成のイソプロパツールを含有するｃｐＤｅｎｃ
ｌｏｒｒチューブに移し、室温で１０分かけて再度沈澱
させた。次に、チューブをｍｉｃｒｏｒｕｇｅ中で４５
秒間回転し、上清を捨ててペレットを風乾した。このペ
レットを、次いで、ＲＮａＳＱを１１００ｐ／ｒｆｄｌ
含有する５００屑の１０ｍＨＴｒｉｓｌｍＨＥＤＴＡ、
ｐＨ８，０に溶解し、１時間３７℃にイン＝１：ユベ
ートしてＲＮＡを消化した。５０／Ｉ１１の５ＨＮａＣ
１、次いで３５０［のイソプロパツールを添加してＤＮ
Ａをもう一度沈澱させた。室温で１０分後、４５秒間遠
心してＤＮＡを沈ませ、−Ｆ清を捨て、得られたペレッ
を１５０成の１０ｍＨＴｒｉｓ、 Ｉｎ＋ＨＥＤＴＡ、
ｐＨ８，０に再溶解した。次いで、プラスミドｍ１ｎ
ｉｐｒｃＤ （小調製物）をＨＯｉΔ王とＥ（１０）Ｒ
Ｉで消化して解析した。
（９）ｌ−１ｏｉＡＩメチラーぜ遺伝子クローン：解析
した１４個のプラスミドのうち１０個が、ＨＩＩＪＡＩ
浦化に対して感受性でありさまざまな構造をイイしてい
ることが判明した。これらのプラスミドはにせものであ
るので捨てた。残りの４個のプラスミドは、ＨｇｉΔ工
消化に対して抵抗性であり、５．４Ｋｂと１．５Ｋｂの
２個のＢ（ｌｌＩ［断片を担持していることが判明した
（第２図）。これらのプラスミドは同一であるように思
われた。これらのうちのひとつｐにし１７０８Ｈ１１１
−１４は、Ｈｇ１ＡＩ修飾メチラーピを］−ドしている
ばかりでなく、Ｈ（１１ＡＩ制限エンドヌクレアーゼも
コードしていることがボされた。
した１４個のプラスミドのうち１０個が、ＨＩＩＪＡＩ
浦化に対して感受性でありさまざまな構造をイイしてい
ることが判明した。これらのプラスミドはにせものであ
るので捨てた。残りの４個のプラスミドは、ＨｇｉΔ工
消化に対して抵抗性であり、５．４Ｋｂと１．５Ｋｂの
２個のＢ（ｌｌＩ［断片を担持していることが判明した
（第２図）。これらのプラスミドは同一であるように思
われた。これらのうちのひとつｐにし１７０８Ｈ１１１
−１４は、Ｈｇ１ＡＩ修飾メチラーピを］−ドしている
ばかりでなく、Ｈ（１１ＡＩ制限エンドヌクレアーゼも
コードしていることがボされた。
ｎｏ）ＨｇｉＡ Ｉ制限遺伝子クローン：１）ＫＬ１７
０１１Ｈ１１１−１４は、このプラスミドを担持してい
るＥ、 ｃｏｌｉ ＲＲＩの抽出物を検定することに
より、ｌｌｉ△■制限エンドヌクレアーゼをコードして
いて発現することが判明した。
０１１Ｈ１１１−１４は、このプラスミドを担持してい
るＥ、 ｃｏｌｉ ＲＲＩの抽出物を検定することに
より、ｌｌｉ△■制限エンドヌクレアーゼをコードして
いて発現することが判明した。
エンドヌクレアーゼアッセイ：
１）ＫＬ１７０ＩｔＨ１１１−１４を担持しているＥ、
ｃｏｌｉ ＲＲＩの培養物１００ｄを、１００μｙ／
ｍ１．アンピシリンを含有するＬ−ｂｒｏｔｈ中３０℃
中足０℃殖させた。培養物を４にｒｐｍで５分間遠心し
、得られた細胞ペレットを３ｄの１０ｍＨＫＰＯ４ｐＨ
７，５，１０ｍＨメルメルトエタノール、 ０．１ｍＨ
Ｅ［］ＴＡ中に再懸濁させた。同じ緩衝液中に１０／ｒ
ｔｇ／ ｄのリゾチームを含有する液を０．３戒加え、
得られた懸濁液を１時間氷上に放置した。この懸濁液１
．０戒を、１０秒ずつ三回穏やかに音波処理して細胞を
破砕した。音波処理した抽出物を５分間軽く遠心して細
胞の破片を除去し、上清のエンドヌクレアーゼ活性を以
下のようにして検定した。
ｃｏｌｉ ＲＲＩの培養物１００ｄを、１００μｙ／
ｍ１．アンピシリンを含有するＬ−ｂｒｏｔｈ中３０℃
中足０℃殖させた。培養物を４にｒｐｍで５分間遠心し
、得られた細胞ペレットを３ｄの１０ｍＨＫＰＯ４ｐＨ
７，５，１０ｍＨメルメルトエタノール、 ０．１ｍＨ
Ｅ［］ＴＡ中に再懸濁させた。同じ緩衝液中に１０／ｒ
ｔｇ／ ｄのリゾチームを含有する液を０．３戒加え、
得られた懸濁液を１時間氷上に放置した。この懸濁液１
．０戒を、１０秒ずつ三回穏やかに音波処理して細胞を
破砕した。音波処理した抽出物を５分間軽く遠心して細
胞の破片を除去し、上清のエンドヌクレアーゼ活性を以
下のようにして検定した。
精製したλフ？−ジＤ Ｎ Ａ３０ｍ （４３麿）を、
６００成の制限エンドヌクレアーゼ消化用緩衝液（十記
第２項）中に希釈した。この溶液を５本のチューブに、
最初の１本は１５０成、残りの４本は＋ｏｏ ｌｌＩ！
ずつ分注した。最初のチューブに抽出物７５成を入れて
ＤＮＡ１埒当たり抽出物１成とした。次に、最初のチュ
ーブから５０１１Ｉ！を取り出して第二のデユープに移
して０．３９ｆｌ／埒とした。続は又ブユーブ３．４．
５にも順次５０ＩＪ１ずつ移して、チューブ３（０１成
／ｐ３＞ ’＋ ４ （０，０３ＩＩｉ／埒）および５
（０，０１／ｎ／４９＞とした。これらのチューブを
１時間３７℃にインキュベートシた後、各チューブのサ
ンプル２０成をゲル電気泳動によって分析した。
６００成の制限エンドヌクレアーゼ消化用緩衝液（十記
第２項）中に希釈した。この溶液を５本のチューブに、
最初の１本は１５０成、残りの４本は＋ｏｏ ｌｌＩ！
ずつ分注した。最初のチューブに抽出物７５成を入れて
ＤＮＡ１埒当たり抽出物１成とした。次に、最初のチュ
ーブから５０１１Ｉ！を取り出して第二のデユープに移
して０．３９ｆｌ／埒とした。続は又ブユーブ３．４．
５にも順次５０ＩＪ１ずつ移して、チューブ３（０１成
／ｐ３＞ ’＋ ４ （０，０３ＩＩｉ／埒）および５
（０，０１／ｎ／４９＞とした。これらのチューブを
１時間３７℃にインキュベートシた後、各チューブのサ
ンプル２０成をゲル電気泳動によって分析した。
これらの抽出物は、１ｄに付き約１０００ ｕｎｉｔの
１」ｇｉＡＩ制限エンドヌクレアーゼを含有しているこ
とが判明した。これは、細胞１ｇ当たり約１０４ｕｎｉ
ｔに相当する。
１」ｇｉＡＩ制限エンドヌクレアーゼを含有しているこ
とが判明した。これは、細胞１ｇ当たり約１０４ｕｎｉ
ｔに相当する。
ｐにＬ１７０ＲＨ１１１−１４を担持するＥ、 ｃｏｌ
ｉ ＲＲｌは、Ｈｇ１ＡＩ制限エンドヌクレアーゼを精
製する際の好ましい宿主として使用することができる。
ｉ ＲＲｌは、Ｈｇ１ＡＩ制限エンドヌクレアーゼを精
製する際の好ましい宿主として使用することができる。
この株を、醗酵槽のアンピシリン含有Ｌ −ｂｒｏｔｈ
中３０℃中足０℃まで増殖させた後、遠心して細胞を集
め、直ぐに破砕して抽出物を調製してもよいし、使用片
まで一７０℃で凍結保存してもよい。
中３０℃中足０℃まで増殖させた後、遠心して細胞を集
め、直ぐに破砕して抽出物を調製してもよいし、使用片
まで一７０℃で凍結保存してもよい。
第１図は、ｆ−（ｏｉＡＩ制限エンドヌクレアーゼをク
ローニングして生産する方法の概略をボす。 第２図は、ＨａｉＡＩυ１限エンドヌクレアーゼおよび
修飾メチラーゼをコードしているト１゜ｇｉｇａｎｔｅ
ｕｓ Ｄ Ｎ Ａの６．７Ｋｂ ８１Ｊｌｆｆ ？ルチ
フラグメント（大所片）の制限地図であり、この断片を
ｐＨｃ１９（八ＴＣＣ３７２５４）のＢａｍＨＩ部位に
クローニングしてｐにＬ１７０ＲＨ１１１−１４を創作
した。 第３図は、Ｆ）ＫＬ１７０ＲＨ１１１−１４を担持する
Ｅｃｏｌｉ Ｒ１１ｔ（ＡＴＣＣ３１３４３）の細胞抽
出物中のＨａｉＡＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を小す
アガロースゲルの写真である。 Ｋ１１ｏｂａｓｅ ｐａｉｒｓ ＦＩＧ、２
ローニングして生産する方法の概略をボす。 第２図は、ＨａｉＡＩυ１限エンドヌクレアーゼおよび
修飾メチラーゼをコードしているト１゜ｇｉｇａｎｔｅ
ｕｓ Ｄ Ｎ Ａの６．７Ｋｂ ８１Ｊｌｆｆ ？ルチ
フラグメント（大所片）の制限地図であり、この断片を
ｐＨｃ１９（八ＴＣＣ３７２５４）のＢａｍＨＩ部位に
クローニングしてｐにＬ１７０ＲＨ１１１−１４を創作
した。 第３図は、Ｆ）ＫＬ１７０ＲＨ１１１−１４を担持する
Ｅｃｏｌｉ Ｒ１１ｔ（ＡＴＣＣ３１３４３）の細胞抽
出物中のＨａｉＡＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を小す
アガロースゲルの写真である。 Ｋ１１ｏｂａｓｅ ｐａｉｒｓ ＦＩＧ、２
Claims (13)
- （１）ＨｇｉＡ I 制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含
むクローニングベクター。 - （２）請求項１に記載のクローニングベクターを含有す
る形質転換された宿主。 - （３）ＨｇｉＡ I 遺伝子が、￥Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐ
ｈｏｎｇｉｇａｎｔｅ−￥￥ｕｓ￥ＡＴＣＣ５３７５６
から切り出されたものである、請求項１に記載のクロー
ニングベクター。 - （４）ＨｇｉＡ I 修飾遺伝子を含むクローニングベク
ター。 - （５）請求項４に記載のクローニングベクターを含有す
る形質転換された宿主。 - （６）（ａ）￥Ｈｅｒｐｏｔｏｓｉｐｈｏｎｇｉｇａｎ
ｔｅｕｓ￥に由来するＤＮＡからライブラリーを形成し
、 （６）ＨｇｉＡ I 修飾遺伝子を含有するクローンを単
離し、 （ｃ）修飾遺伝子を含有するクローンをスクリーニング
し、 （ｄ）ＨｇｉＡ I 制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を同
時に含有しているクローンを単離する ことからなる、ＨｇｉＡ I 制限エンドヌクレアーゼ遺
伝子のクローニング方法。 - （７）前記ライブラリーを、 （ａ）￥Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎｇｉｇａｎｔｅｕ
ｓ￥ＡＴＣＣ５３７５６に由来するＤＮＡを精製するス
テップ、 （ｂ）精製したＤＮＡを消化してＤＮＡ断片を形成する
ステップ、 （ｃ）この断片をクローニングベクターに連結するステ
ップ、 （ｄ）ステップ（ｃ）のクローニングベクターで宿主細
胞を形質転換してセルライブラリーを形成するステップ
、 （ｅ）このセルライブラリーから組換えベクターを精製
してプラスミドライブラリーを形成するステップ によつて形成する、請求項６に記載の方法。 - （８）クローニングベクターがｐＵＣ１９である、請求
項７に記載の方法。 - （９）宿主細胞が￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥のｍｃｒＢ＾−およ
びｈｓｄＲ＾−株である、請求項７に記載の方法。 - （１０）プラスミドライブラリーをＨｇｉＡ I で消化
して消化プールを形成し、この消化プールを宿主細胞中
に形質転換し、修飾遺伝子を含有するクローンを選択す
ることによつて、ＨｇｉＡ I 修飾遺伝子を含有するク
ローンを単離する、請求項７に記載の方法。 - （１１）（ａ）￥Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎｇｉｇａ
ｎｔｅｕｓ￥に由来するＤＮＡを精製し、 （ｂ）精製したＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼ
で消化してＤＮＡ断片を形成し、（ｃ）この断片をクロ
ーニングベクターに連結してＤＮＡ混合物を形成し、 （ｄ）ステップ（ｃ）のＤＮＡ混合物で宿主細胞を形質
転換してライブラリーを形成し、（ｅ）ＨｇｉＡ I 修
飾メチラーゼ遺伝子を含有するクローンを単離し、 （ｆ）ＨｇｉＡ I 修飾メチラーゼ遺伝子を含有するク
ローンをスクリーニングし、ＨｇｉＡ I 制限エンドヌ
クレアーゼ遺伝子を同時に含有しているクローンを単離
し、 （ｇ）ステップ（ｆ）のクローンを含有する宿主細胞を
培養し、 （ｈ）この培養物からＨｇｉＡ I 制限エンドヌクレア
ーゼを回収する ことからなる、ＨｇｉＡ I 制限エンドヌクレアーゼの
製造方法。 - （１２）クローニングベクターがプラスミドまたはウィ
ルスのＤＮＡ分子である、請求項１１に記載の方法。 - （１３）プラスミドがｐＵＣ１９である、請求項１２に
記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/134,001 US4987074A (en) | 1987-12-17 | 1987-12-17 | Method for producing the HgiAI restriction endonuclease and methylase |
| US134,001 | 1987-12-17 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH022367A true JPH022367A (ja) | 1990-01-08 |
Family
ID=22461309
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63317572A Pending JPH022367A (ja) | 1987-12-17 | 1988-12-15 | ＨｇｉＡＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4987074A (ja) |
| EP (1) | EP0321271B1 (ja) |
| JP (1) | JPH022367A (ja) |
| AT (1) | ATE103329T1 (ja) |
| DE (1) | DE3888648T2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0849285A (ja) * | 1994-08-04 | 1996-02-20 | Takashi Matsushima | 側溝用ダクト |
| JPH08165670A (ja) * | 1994-12-14 | 1996-06-25 | Asahi Concrete Works Co Ltd | ケーブル共同溝 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5491060A (en) * | 1989-05-01 | 1996-02-13 | The University Of Maryland | Mutant strain of E. coli for detection of methyltransferase clones |
| US5298404A (en) * | 1989-10-13 | 1994-03-29 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the Hpa I restriction endonuclease and methylase |
| US5202248A (en) * | 1990-11-02 | 1993-04-13 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning and producing the nco i restriction endonuclease and methylase |
| US5192676A (en) * | 1991-02-05 | 1993-03-09 | New England Biolabs, Inc. | Type ii restriction endonuclease, asci, obtainable from arthrobacter species and a process for producing the same |
| US5200337A (en) * | 1991-10-25 | 1993-04-06 | New England Biolabs, Inc. | Type ii restriction endonuclease, apo i, obtainable from arthrobacter protophormiae and a process for producing the same |
| WO2008076922A1 (en) * | 2006-12-15 | 2008-06-26 | Ceres, Inc. | Modulation of plant protein levels |
| EP2548953A1 (en) | 2005-08-04 | 2013-01-23 | New England Biolabs, Inc. | Novel restriction endonucleases, DNA encoding these endonucleases and methods for identifying new endonucleases with the same or varied specificity |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IN166864B (ja) * | 1985-03-01 | 1990-07-28 | New England Biolabs Inc | |
| ATE113653T1 (de) * | 1986-06-06 | 1994-11-15 | New England Biolabs Inc | Verfahren zur klonierung eines restriktionsmodifizierungssystems. |
-
1987
- 1987-12-17 US US07/134,001 patent/US4987074A/en not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-12-15 JP JP63317572A patent/JPH022367A/ja active Pending
- 1988-12-16 AT AT88311923T patent/ATE103329T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-12-16 DE DE3888648T patent/DE3888648T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-12-16 EP EP88311923A patent/EP0321271B1/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0849285A (ja) * | 1994-08-04 | 1996-02-20 | Takashi Matsushima | 側溝用ダクト |
| JPH08165670A (ja) * | 1994-12-14 | 1996-06-25 | Asahi Concrete Works Co Ltd | ケーブル共同溝 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0321271B1 (en) | 1994-03-23 |
| EP0321271A2 (en) | 1989-06-21 |
| DE3888648D1 (de) | 1994-04-28 |
| ATE103329T1 (de) | 1994-04-15 |
| DE3888648T2 (de) | 1994-09-29 |
| US4987074A (en) | 1991-01-22 |
| EP0321271A3 (en) | 1990-03-21 |
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| ENDONUCLEASE | Barsomian et al.[45] Date of Patent: Mar. 12, 1991 | |
| ENDONUCLEASE | Chen et al. |