JPH022368A - ＦｎｕＤＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明のバックグラウンド 本発明は、制限エンドヌクレアーゼＦｎｕＤＩおよびそ
の修飾メチラーゼのクローンならびに該クローンからこ
れらの酵素を製造する方法に係る。

制限エンドヌクレアーゼは天然の細菌中にみられる酵素
の一群である。制限エンドヌクレアーゼは、夾雑する他
の細菌成分から精製すると、実験寮でＤＮＡ分子を切断
して各々相応する正確な断片を形成するのに使用するこ
とができる。この性質の故に、ＤＮＡ分子はひとつずつ
独自に同定することができ、また分画してその構成遺伝
子を単離することができる。制限エンドヌクレアーゼは
現代の遺伝子研究における不可欠の手段であることが立
証されている。これらの酵素は生化学的な「ハサミ」で
あり、これによって遺伝子の工学および解析が達成され
る。

制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子上の特定のヌク
レオチド配列（いわゆる「認識配列」）を認識してこれ
に結合することによって作用する。

これらの酵素はＤＮＡ分子に結合すると、その配列の内
部または一端でその分子を開裂する。異なる制限エンド
ヌクレアーゼはそれぞれ異なる認識配列に対して親和力
をもっている。今日までに調べられた幾百種もの細菌で
百を越える数の異なる制限エンドヌクレアーゼが同定さ
れている。

通常細菌は、その秒毎に、小数の制限エンドヌクレアー
ゼをもつのみである。これらのエンドヌクレアーゼはそ
れの由来となった細菌に因んで命名される。たとえば、
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　　ａｅｇｙｐｔｉｕｓはＨ３
Ｏ工、Ｈａｅ■および）−１ａｅ■とよばれる３つの異
なる制限エンドヌクレアーゼを合成する。これらの酵素
は、それぞれ（ＡＴ）ＧＧＣＣ（＾■）、ＰｕＧＣＧＣ
ＰｙおよびＧＧＣＣという配列を認識して開裂する。一
方、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＲＹ１
３は１種類の酵素ＥＣ０Ｒ１を合成するだけであり、こ
の酵素はＧＡＡＴＴＣという配列を認識する。

理論に縛られるつもりはないが、自然界でルリ限エンド
ヌクレアーゼは細菌細胞の繁殖に関して保護的な役割を
果たしていると考えられる。これらの酵素のおかげで、
細菌は、放っておくとこれらの細菌を破壊したりまたは
これらに寄生したりするウィルスやプラスミドのような
外来ＤＮＡ分子による感染に対して抵抗することが可能
になる。

制限エンドヌクレアーゼは、侵入して来るＤＮＡ分子に
結合し、認識配列に出会う度毎にそれらのＤＮＡ分子を
開裂することによって、細菌に抵抗性を付与する。こう
して生起する破壊の結果、侵入する遺伝子の多くは無能
となり、そのＤＮＡはエキソヌクレアーゼによってざら
に細かく分解されることになる。

細菌の防御系の第二の要素は修飾メチラーゼである。こ
れらの酵素は制限エンドヌクレアーゼと相補的であり、
これにＪ、って、細菌が外来の感染性ＤＮＡから自身の
ＤＮＡを防御し区別できるようにする手段が提供される
。修飾メチラーゼは対応する制限エンドヌクレアーゼと
同じヌクレオチド認識配列を認識してそれに結合するが
、このＤＮＡを破断する代わりに、メチル基を付加する
ことによってその配列内のヌクレオチドのいずれかを化
学的に修飾する。このメチル化が起こると、その認識配
列に制限エンドヌクレアーゼが結合することはなく、ま
た、その配列が制限エンドヌクレアーゼに開裂されるこ
ともない。細菌細、胞のＤＮＡはその修飾メチラーゼの
活性のおかげでいつも完全に修飾されており、したがっ
て自身の内因性制限エンドヌクレアーゼの存在に対して
完全に非感受性となっている。制限エンドヌクレアーゼ
の認識と攻撃に対して感受性のあるのは未修飾のＤＮＡ
、したがって外来のものであることが確認できるＤＮＡ
だけである。

遺伝子工学技術の出現によって、今では、遺伝子をクロ
ーニングし、その遺伝子がコードしているタンパク質や
酵素を従来の精製技術で入手可能な量より天吊に生産す
ることが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の
クローンを単離する際の鍵は、そのようなり「］−ンの
出現頻度が１０−３〜１０’程度に低い場合、複雑な「
ライブラリー」、ずなわち「ショットガン」法で得られ
るクローンの集団の中で目的とするクローンを同定する
ための簡単で信頼のおける方法を開発することである。

好ましくは、この方法は、目的としない大多数のクロー
ンは破壊されるが珍にある望ましいクローンは生き残れ
るように、選択的なものであるべきである。

■型の制限−修飾系はクローニングされつつあり、その
数は次第に増加している。最初にクローニングされた系
は、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選択
する手段としてバクテリオファージによる感染を使用し
た［　ＨｈａＩＩ　二Ｈａｎｎｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎ
ｅ、　　３：　９７−１１２　（１９７８）　：　Ｅｃ
ｏＲＵ　：にｏｓｙｋｈ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｈｏ１ｅ
ｃ、　　ｇｅｎ、　　　Ｇｅｎｅｔ、　　　１７８　　
：　　７１７−７１９（１９８０）：　ＰｓｔＩ　：　
Ｗａｌｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ。

八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７８．１５０３−１
５０７　（１９８１）］　、細菌中に制限−修飾系が存
在すると細菌はバクチリオフ？−ジによる感染に対して
抵抗できるので、クローニングされた制限−修飾遺伝子
を担持する細胞は、原理的に、ファージに冥露されたラ
イブラリーから生えて来る（生き残る）株として選択的
に単離することができる。しかしこの方法は限られた価
値しかないことが判明した。特定的にいうと、クローニ
ングされた制限−修飾遺伝子は、選択的な生き残りを可
能にする程に充分なファージ耐性を常に発現するとは限
らないことが判明したのである。

もうひとつ別のクローニング法では、最初プラスミド由
来とされていた系をｌ：、Ｃ０１ｉクローニングプラス
ミド中に組み込んでいる［ＥｃｏＲＶ：Ｂｏｕａｕｅｌ
ｅｒｅｔ　　ｅｔ　　ａｔ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ
１ｄｓ　　Ｒｅｓ、、１２：３６５９−３６７６（１９
８４）；ＰａｅＲ７：Ｇｉｎａｅｒａｓ　　ａｎｄ　　
Ｂｒｏｏｋｓ。

Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、
　　ＵＳＡ、　　８０：４０２−４０６（１９８３）：
Ｔｈｅｒｉａｕｌｔ　　ａｎｄ　　Ｒｏｙ、Ｇｅｎｅ、
１９：３５５−３５９　　（１９８２）：Ｐｖｕｆｆ　
　：　Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ　　ｅｔ　　ａｔ、　　　
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ１１６４：　　５０１−５０９　
　（１９８５）］。

第三の方法、すなわち多くの系のクローニングに使用さ
れている方法では、本発明者らの特許出願第７０７０７
９号に関連する活性なメチラーゼ遺伝子について選択す
る［ＢｓｕＲＩ　：にｉｓｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ＾ｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ、、　１３：　６４０３−
６４２１　（１９８５）］。制限遺伝子と修飾遺伝子と
は近接して結合している傾向があるので、両省の遺伝子
を含有するクローンは一方の遺伝子について選択するだ
けで単離できることが多い。しかし、メチル化活性によ
る選択では常に完全な制限−修飾系が得られるわけでは
なく、逆に、メチラーゼ遺伝子のみが得られることもあ
るＵＲｓｐＲＩ　：　Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉ　ｅｔ　ａ
ｌ、、Ｇｅｎｅ、　１０：２１９−２２５　（１９８０
）；ＢＣｎＩ　：　Ｊａｎｕｌａｉｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ
、、Ｇｅｎｅ２０：１９７−２０４　　（１９８２）：
Ｂ　ｓｕＲＩ　　：　Ｋ１５ｓ　　ａｎｄ　　Ｂａ１ｄ
ａｕｆ。

Ｇｅｎｅ、　２１：１１１−１１９　（１９８３）：お
よびＭ　ｓｐＩ　：　Ｗａｌｄｅｒｅｔ　　ａｔ、、Ｊ
、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５８：１２３５−１２４１
（１９８３）］　　。

制限−修飾遺伝子のクローニングに対する潜在的な障害
は、＃ｌｌ！ｉｌｉによって保護されていない宿主中に
エンドヌクレアーゼ遺伝子を導入しようとすることにあ
る。メチラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とを
一緒に単一のクローンとして導入すると、エンドヌクレ
アーゼが宿主ＤＮＡを開裂する機会を得る前にメチラー
ゼがそのＤＮＡを隆飾して保護するはずである。したが
って、場合によっては、これらの遺伝子は順番（すなわ
ち、最初にメチラーゼ、次にエンドヌクレアーゼの順）
にのみクローニングが可能となるかもしれない。

制限−修飾系のクローニングに対する別の障害は、旦、
製旦の株の中にはシトシンの修飾に対して逆の反応を示
すものがあるという発見にある。寸なわら、そのような
株は、メチル化シトシンを含有しているＤＮＡを破壊す
る系をもっているのである［Ｒａｌｅｉｇｈ　ａｎｄ　
Ｗｉｌｓｏｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　ＡｃａｄＳ
ｃｉ、　ＵＳＡ、　８３：　９０７０−９０７４　（１
９８６）］　。これらの株では、その自身の遺伝子上で
も、あるいはその対応するエンドヌクレアーゼ遺伝子と
共にでも、シトシン特異的メチラーゼ遺伝子を容易にク
ローニングすることができない。この問題を避けるため
に、これらの系を欠損しているＥ、ｃｏｌｉ変異株（Ｍ
　ＣｒＡ　　およびＭＣｒＢ　　）を使用する必要があ
る。

精製した制限エンドヌクレアーゼ、および重要性はそれ
より落ちるが修飾メチラーゼは、実験室でＤＮＡの特性
決定と再配列をするのにｈ用な道具であるから、これら
の酵素を大晴に合成する細菌株を組換えＤＮＡ技術によ
って得ることは商業的な魅力がある。そのような株が得
られれば、商業的に有用な量で生産づ−るだめの手段が
提供されるばかりでなく精製の作業も簡単になると思わ
れるので、これらの株は極めて有用なものとなろう。

発明の概要 本発明によって、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｎｕ
ｃｌｅａｔｕｍ　Ｄに由来するＦｎｌＪＤＩ制限エンド
ヌクレアーゼおよび修飾メチラーゼの遺伝子を含有する
クローン、ならびにこれらの酵素の生産方法が提供され
る。

より特定すると、本発明は、ＧＧＣＣというＤＮＡ配列
を認識してＧとＣの間で開裂する酵素である制限エンド
ヌクレアーゼＦｎｕＤＩを発現するクローンに係る。［
ｕｌ、Δ、Ｃ，Ｐ、、　ＨｃＢｒｉｄｅ　Ｂ、Ｃ，Ｖｏ
ｖｉｓ　Ｇ。

Ｆ、　ａｎｄ　　Ｓｍ１ｔｈ　Ｈ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　　６：　１−１５（１９７９）
参照（その開示内容は、ここで引用したことによって本
明細書中に含まれるものとする）、。

本発明に従って生産されるＦｎｕＤＩ制限エンドヌクレ
アーゼは、Ｆ、　ｎｕｃｌｅａｔｕＩｌｌＤ中に混在す
ルエンドヌクレアーゼのＦｎｕＤＩｒやＦｎｕＤＩＩｌ
−を含んでいない。

このＦ３索をクローニングする好ましい方法は、Ｆ、　
ｎｕｃｌｅａｔｕｍ　Ｄに由来するＤＮＡを含有するラ
イブラリーを形成し、ＦｎｕＤＩ修飾メチラーゼをコー
ドしているＤＮＡを含有するクローンを単離し、これら
をスクリーニングして、ＦｎｕＤＩｉり限エンドヌクレ
アーゼ遺伝子も共に含有しているクローンを同定するこ
とからなる。

発明の詳細な説明 本発明は、ＦｎｕＤＩ制限および修飾遺伝子のクローン
、ならびにそのようなり［１−ンによって生産される制
限エンドヌクレアーぜＦｎｌｌＤＩに係る。

これらのＦｎｕＤＩ遺伝子は、ＦｎｔｌＤＩ修飾メチラ
ーゼ遺伝子を含有し発現することに基づいて選択したあ
る種のクローンが同時にＦｎｕＤＩ制限遺伝子も含有し
ているという事実を利用する方法によってクローニング
される。そのようなりローンのＤＮＡＬ、ｔＦｎｕＤＩ
制限エンドヌクレアーゼおよびＨａｅｎｌ制限エンドヌ
クレアーゼによる消化に抵抗性である。この消化に対す
る抵抗性によって、ＦｎｕＤＩメチラーゼおよび制限エ
ンドヌクレアーゼをコードしているクローンを選択的に
単離するための手段が得られる。

ＦｎｕＤＩ制限遺伝子およびメチラーゼ遺伝子をクロー
ニングして発現させるだめの本発明の好ましい方法を第
１図に示すが、これには以下のステップが含まれる。

（１）　　　Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｎｕｃｌ
ｅａｔｕｍ　ＤのＤＮＡを精製する。Ｆ、　　ｎｕｃ＋
ｅａｔｕｍ　ＤはＬｕｉ　ｅｔ　ａｌ、、　　５ｕｐｒ
ａに記載されており、Ｄｒ、Ｈｉｃｈａｅｌ　Ｓｍ１ｔ
ｈ、　Ｄｅｐｔ、　ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　
　Ｆａｃｕｌｔｙ　　ｏｒ　　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　　Ｔ
ｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｂｒ１ｔｉｓｈ　　
Ｃｏｌｕｍｂｉａ、　ＶａｎｃｏｕｖｅｒＣａｎａｄａ
から提供された。

（２）　　このＤＮＡを＠　ｉｎｄ　ｍのような制限エ
ンドヌクレアーゼで消化する。

（３）　　消化したＤＮＡを、１個以ＦのＦｎｔｌＤＩ
部位を含有するｐＢ　Ｒ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）
のようなりＯ−ニングベクターに連結する。連結したＤ
ＮＡをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　　Ｒ１１株
（ＡＴＣＣ３１３４３）のような適当な宿主に形質転換
する。

（４）　　形質転換した混合物を、形質転換細胞を選択
するためのアンピシリンのような抗生物質を含有する培
地（Ａｍｐ　ｐｌａｔｅｓ）に接種する。培Ｎ後形質転
換体コロニーをひとつに集めてセルライブラリーとする
。

（５）　　このセルライブラリーから組換えプラスミド
全部をそっくり精製してプラスミドライブラリーを作成
する。

（６）　　このプラスミドライブラリーを、ＦｎｕＤＩ
制限エンドヌクレアーゼ、またはＨａｅｍｏｐｈｉ　ｌ
ｕｓｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓに由来する＋−＋ａｅｍ
などのような等価なエンドヌクレアーゼで完全に消化す
る。ＦｎｕＤＩ（またはＨａｅＩＩｌ）消化により、メ
チラーゼを含イ１しない未修飾クローンが特異的に破壊
され、Ｆｎｕ［）Ｉメチラーぜクローンの相対頻度が増
大する。

（７）　　消化したプラスミドライブラリーをＥ。

ＣＯ１＋　Ｒｌｔｌのような適当な宿主に形質転換し、
選択培地に接種して形質転換体を回収する。これらのコ
ロニーを採取し、そのＤＮＡをＦｎｕ［）丁Ｉ！飾遺伝
子の存在について分析する。すなわち、コロニーが担持
するプラスミドを精製し、ＦｎｕＤＩ（またはｌ−１ａ
ｅＩｆｆ）制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベー
トして消化に対して低抗性か否かを決定する。また、細
胞の全ＤＮＡ（染色体およびプラスミド）も精ＩＩ、、
ＦｎｕＤＩ　（またはＨａｅＩ［Ｉ）制限エンドヌクレ
アーゼと共にインキュベートする。

ＦｎＬＩＤＩ修Ｓ遺伝子全Ｓ遺伝子クローンのＤＮＡは
充分に修飾されているはずであり、プラスミドＤＮＡと
全ＤＮＡは両方とも消化に対して実質的に抵抗性である
はずである。

（８）ステップ（７）テ同定されたＦｎｕＩ）Ｉメチラ
ーゼクローンの細胞抽出物を調製し、この抽出物のＦｎ
ｕＤＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を検定することによ
って、ＦｎＬＩＤＩ制限エンドヌクレアーＣを担持する
クローンを同定する。

（９）　　コピー数の多いベクターを使用して遺伝子量
を高めることによって、また活性の高い外因性プロモー
ターを使用して転写速度を上げることによって、クロー
ンのＦｎｕＤＩ制限エンドヌクレアーゼ産生酢を増大さ
せることができる。

（１０）　　Ｆ　ｎｕＤ　Ｉ制限および修飾遺伝子を担
持しているクローンを８！酵槽内のアンピシリン含有富
化培地中で増殖させることによって、ＦｎｕＤＩ制限エ
ンドヌクレアーゼを生産することができる。

細胞を遠心して集め、音波処理で破砕すると、ＦｎＬＩ
ＤＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を含有する粗細胞抽出
物が生成する。

（１１）　　Ｆ　ｎｕＤ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ活
性を含有する粗細胞抽出物を、アフィニティークロマト
グラフィーやイオン交換クロマトグラフィーのように標
準的なタンパク質精製技術によって精製する。

上に環路を記載した手順は本発明の好ましい実施態様で
あるが、上記の手順を業界で公知の技術によって変える
ことができるということは当業者には明らかであろう。

以五に現状で好ましい具体例を挙げて本発明を例示する
が、これらの実施例は単なる例示であって特許請求の範
囲で指摘されない限り本発明がこれらの実施例に限定さ
れることはないものと考えられたい。

実施例 ＦｎｕＤＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニン
グ （１）　　ＤＮＡの精製： 凍結したＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｎｕｃ＋ｅａ
ｔｕｍ　Ｄの細胞１０Ｊを氷上で１時間解凍したｌ　２
０ｄの２５％スクロース、　５０ｍＨＴｒｉｓ　ｐｌ＋
　８．０中に再懸濁させた。１０ｍ１の０．２５Ｈ［［
ｌＴΔｐＨ８，０Ｉｌ１３よび６ｄのｌ０ＩＱ／Ｉｎｌ
リゾチーム（０，２５ＨＴｒｉＳ　ＤＨ８，０中）を加
えた。この懸濁液を２時間氷上に保った後、２４戒の１
％ＴｒｉｔＯｎＸ−１００，５０１１１８丁ｒｉｓ　ｐ
Ｈ８，０，６７ｍＨＥＤＴＡおよび５ｍｌの１０％ＳＤ
Ｓを加えて溶菌させた。得られた溶液を、（前もって０
．５８　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，０で平衡化した）フェノ
ール７０ｄおよびり［１０ホルム６０ｍ１で抽出した。

得られた乳濁液を１０Ｋｐｐｍで３０分遠心１）で相を
分離した。粘稠な上相を新しいびんに移してもう−度フ
エノールおよびクロロホルムで抽出した。

得られた乳濁液を再度遠心した後、そのＦ相をＤＮＡ緩
衝液（１０ｍＨＴｒｉｓ　ｐｔｌ　８．０．１ｍＨＥＤ
ＴＡ）に対しこの緩衝液を四回交換して透析した。次に
、透析した溶液を最終濃度２００埒／ｄのＲＮａＳｅに
より３７℃で１時間消化した侵、５８　ＮａＣρを最終
濃度０．４８まで加え、かつ０５５倍容量のイソプロピ
ルアルコールを添加してＤＮＡを沈澱させた。沈澱した
ＤＮＡをガラス棒に巻き付けて取り出し、出乾した後約
３００ｓ／ｄの濃度でＤＮＡ緩衝液に溶解させて４℃で
貯蔵した。

（２）　　ＤＮＡの消化： Ｆ、　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ　ＤのＤ　Ｎ　Ａ　３０／４
７を、３００μの制限エンドヌクレアーゼ消化用緩衝液
（１０ｍＨＴｒｉｓ　０１１７．５．１０ｍＨＨａＧ！
２．１０ｍＨメルメルトエタノール。

５０ｍＨＮａＣ１！　）中に希釈した。）（ｉｎｄ　ｍ
制限エンドヌクレアーゼを６０　ｕｎｉｔ加え、得られ
た溶液を２時間３７℃にインヤニベートした。１２分間
７２℃に加熱して消化を停止させた。

（３）　　連結および形質転換： Ｈｉｎｄ　ｍで消化したＦ、　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ　Ｄ
のＤＮＡ６埒（６０μ）を、Ｈｉｎｄ　ｍで開裂し脱リ
ン酸化したｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）　　３
Ｉｉｇ（３０１ｊ１）と混合した。

１０×連結用緩衝液（５００ｍＨＴｒｉｓ　　ｐｉｔ　
７．５．１００＋ｎＨＨ（ＩＣｉ！２．１００ｍＨＤＴ
Ｔ、　５ｆｆｌＨＡＴＰ）を２０１ｉｉ加え、ざらに滅
菌蒸溜水を９０７Ｊ加えて容積を２００成とした。

Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを７．５ρ加え、得られた溶液を
４時間１７℃にインキュベートした。この溶液をクロロ
ホルム２０ハで抽出して滅菌した後、１５秒間軽く遠心
（ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉ４ｕｇａｔｉｏｎ）　Ｌ／て
清澄化した。

連結溶液１００成を８００１１１のＳＳＣ／ＣａＧ！２
（５０ｍＨＮａＱ！。

５ｍ）ｌクエン酸Ｈａ　　、　　６７ｆｆｌＨＣａＱ！
２）と混合し、氷冷した旦、　ｃｏｌｉ　ＲＲｌ（ＡＴ
ＣＣ３１３４３）　Ｄンピテント細胞を１．７ｄ加えた
。得られた溶液を４分間４４℃にインキュベートした模
、１０ｄの　Ｌｕｒｉａ−ブロス（Ｌ−ｂｒｏｔｈ）を
添加して３７℃で３時間インキュベーシヨンを続行した
。

（４）　　セルライブラリー二 形質転換した培養液を穏やかに遠心した盪、上清を捨て
、細胞を約１，２ｄの１−ｂｒｏｔｈに再懸濁させた。

再懸濁した細胞のうち約２００成を、アンピシリンを１
１００ＪＪ／　ｍ含有する８個のｔｕｒｔａ−寒天（Ｌ
−ａａａｒ　）プレート上に接種した。このプレートを
一晩３７℃にインキュベートした。プレートの表面士に
生えてきた形質転換細胞をまとめて回収するために、各
プレートに２．５−の１０ｍＨＴｒｉｓ　ｐＨ７，５，
１０ｍＨＨａＣ１２を満たし、コロニーを全部掻き集め
、得られた懸濁液を１本のチューブ内にブールした。

（５）１ラスミドライブラリー二 ２．０ｄのセルライブラリーを、アンピシリンを１００
埒／ｄ含有するし−ｂｒｏｔｈ　５００ｍｆ！中に接種
した。

３７℃で一晩１１ｃＩ培養した後、４Ｋ　ｒｐｍで５分
遠心した。上清を捨て、細胞ベレッ］・をＩＭの２５％
スクロース、　５０ｍ）４　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，０に室
温で再懸濁させた。

０．２５ＨＥＤＴＡ、　ＤＨ８，０ヲ５ｍ、　Ｊ３Ｊ：
び１０１１１９／ｄｌＪソチーム（０，２５ＨＴｒｉｓ
、　ｐＨ８，０中）を３戒加えた。

得られた溶液を氷上に１時間放置した後、１２ｍの１％
　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，５０ｍＨＴｒｉｓ　ｐＨ
８，０６７ｍＨＥＤＴＡを添加し、この懸濁液に穏やか
に渦を巻かせて細胞の溶菌を誘導した。

溶菌した混合物をＳｏｄのチューブに移ｔノで１７Ｋｒ
ｌ）ｍ　、　４℃で４５分間遠心した。ピペットで上清
を取り出した。固体のＣｓＣ１を２０．０　ｇ秤諺して
５０ｄのプラスチック製ネジブタ付きチューブに入れ、
このチューブ中に１清２２．０ｇをピペツ］−で入れて
混合した。５■／ｄのエチジウムプロミド（１０ｍＨＴ
ｒｉｓ　ｐＨ８，０，１００ｍＨＮａｐ！、　　１ｍＨ
ＥＤＴＡ中）を　＋、０戒加えた。この溶液を、５／８
１ｎｘ３　ｉｎの遠心′？２２本に移し、ＢｅＣｋｍａ
ｎ　Ｔ　ｉ　７０ローター中４４Ｋ　ｒｐｍ　。

１７℃で４２時間回転させた。プラスミドを集めるため
に、これらのデユープを聞き、紫外光を照射して２本の
ケイ光バンドの下側の方を注射器で集めた。各デユープ
から１９だ下側のバンドを合わせ、等容邑の、水で飽和
した水冷ｎ−ブタノールで四回抽出することによってエ
チジウムプロミドを除去した。

抽出された溶液をＤＮＡ緩衝液を四回交換しながらこの
緩衝液に対して透析した後、２倍容１のイソプロパツー
ルと最終濃度が０．４Ｍとなるのに充分な５ＨＮａＣ１
！を添加して核酸を沈澱させた。得られた溶液を一晩−
２０℃で保存したｖ＆１５にｐｐｍ、０℃で１５分遠心
した。上清を捨て、ペレットを１５分間風乾した後、５
００ｐｉの１０＋ｎＨＴｒｉｓ　Ｄｌｌ　７．５．１ｍ
ＨＥＤＴＡに溶かして一２０℃で貯蔵した。プラスミド
ＤＮＡの濃度は約１００埒／ｄであった。

（６）　　プラスミドライブラリーの消化：６ｉ（６０
ｍ）のプラスミドライブラリーを４５０成の制限エンド
ヌクレアーゼ消化用緩衝液（上記第２項）に希釈した。

６０　ｕｎｉｔ　（７，５ｍ　）のＨａｅｌｌｌ制限エ
ンドヌクレアーゼを加え、チューブを１時間３７℃にイ
ンキュベートした後、１２分間７２℃に加熱して反応を
停止させた。

（７）　　形質転換： １２．５ｄ　（０，１８／ｌ　）の消化したライブラリ
ーを１００度のＳＳＣ／ＣａＧ！２（ｈ２第３項）　Ｊ
３よび２００度の水冷したコンピテントＥ、　ｃｏｌｉ
　　Ｒｌｔｌと混合した。得られた混合物を３分間４２
℃に暖めた後、アンピシリンを１００埒／ｄ含有するＬ
−ａｇａｒプレートに接種した。このプレートを一晩３
７℃にインキュベートした。Ｈａｅ■消化によって、形
質転換体の数は約１／１０３に減少した。このｌ−１ａ
ｅｌｌ消化で生き残ったもののうちから１４個のコロニ
ーを採り、それぞれ、１０戒のアンピシリン含有１−　
ｂｒｏｔｈ中に接種してミニカルチャー（小培養物）を
調製し、アンピシリンを含有するＬ　−ａｇａｒプレー
ト上に画線してマスターストックを調製した。

（８）　　生き残った個体の解析： 上記第７項に記載した１４個の生き残りのコロニーを１
０ｎｆ！になるまで増殖させ、これらが担持するプラス
ミドを、Ｂｉｒｎｂｏｉｎ　ａｎｄ　Ｄｏｌｙ、　　Ｎ
ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　　７　：　１５１
３　（１９７９）の方法を応用した以下のｍ１ｎｉｐｒ
ｅｐ精製法によって調製した。

ｍ１ｎｉｐｒｅｐ法： 各培養物を８にｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てて得
られた細胞ペレットを、Ｉ　ＩＩＦｇ／ｒｄリゾチーム
を含有する１、０威の２５ｍＨＴｒｉｓ、　１０ｍＨＥ
ＤＴＡ、　５０ｍＨグルコース、　ｐＨ８，０中に再懸
濁させた。室温に１０分間装いた後、各チューブに２．
（ｌｎｆ！の０．２ＨＮａＯ！１１χＳＤＳを加え、チ
ューブを振盪して細胞を溶解し、次いで氷、トに置いた
。溶液が透明になってから各々３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ４，８）を１．５ｄずつ加えて振盪した。生じた沈澱
を１５Ｋｒｐｍ、　４°Ｃで１０分間遠心して沈ませた
。得られた上清を各々、イソプロパツールを３戴含有す
る遠心管に流し入れて混合した。室温で１０分経った後
遠心管を１５Ｋｒｐｍで１０分間遠心して沈澱した核酸
をペレット化した。

上清を捨て、ペレットを室温で３０分風乾した。

乾燥した後ベレットを８５０成の　１０ｍＨＴｒｉｓ、
　１ｍＨＥＤＴＡ、　ｐｌ＋　８．０に再懸濁させた。

５８　ＮａＣ１！を７５ｐｉずつ加え、得られた溶液を
、５７５屑のイソプロパツールを含有するＥｐｐｅｎｄ
ｏｒｆデユープに移し、室温で１０分かけて再度沈澱さ
せた。次に、チューブをｍｉｃｒｏｆｕｇｅ中で４５秒
間回転し、上清を捨ててペレットを風乾した。このペレ
ットを、次いで、ＲＮａＳｅを１ｏｏＩＪ３／　ｍＩｌ
含有する５００１Ｊ１の１０ｍＨ丁ｒｉｓ１ｍＨＥＤＴ
へ、　ｐｌ＋　８．０に溶解し、１時間３７℃にインキ
ュベートしてＲＮＡを消化した。５０成の５ＨＮａｐ！
、次いで３５０成のイソプロパツールを添加してＤＮＡ
をもう一度沈澱させた。室温で１０分後、４５秒間遠心
してＤＮＡを沈トし上清を捨て、得られたベレンを１５
０屑の１０ｍＨＴｒｉｓ、　１ｍＨＥＤＴ八ｐへ８．０
に再溶解した。次いで、プラスミドｍ１ｎｉｐｒｅｐ　
（小調製物）をＦｎＬＩＤＩとＨｉｎｄ　［［ｌで消化
して解析した。

（９）　　Ｆ　ｎｕＤ　Ｉメヂラーゼ遺伝子クローン：
解析した１４個のプラスミドのうち８個が、Ｈａｅ■消
化に対して感受性でありＦ、　ｎｕｃ＋ｅａｔｕｍ　Ｄ
のＤＮＡのさまざまな断片を担持していることが判明し
た。これらのプラスミドは捨てた。残りの６個のプラス
ミドは、ＨａｅｌＩｌｉｌＩ化に対して抵抗性であり、
５．５ＫｂのＨｉｎｄ　ｍ断片を共通に担持しているこ
とが判明した。ｐＦｎｕＤＩＲＨ２−３３を代表とする
これらのプラスミドは同一であるように思われた。

これらのうちのいくつかを選択し、ＦｎＵＤＩ修飾メチ
ラーゼをコードしているばかりでなく、ＦｎｕＤＩ制限
エンドヌクレアーゼもコードしていることが示された。

このサンプルはｔｈｅ　ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに八ＴＣＣ４０５
２１として寄託されている。

（１０）　　Ｆ　ｎｕＤ　Ｉ制限遺伝子クローン：ｐＦ
ｎｕＤＩＲＨ２−３３および類似のプラスミドは、これ
らのプラスミドを担持しているＥ、　ｃｏｌｉ　ＲＲＩ
の抽出物を検定することにより、ＦｎｕＤＩ制限エンド
ヌクレアーゼをコードしていて発現することが判明した
。このクローンの培養物５０ｔｒｔｌを、１００埒／Ｉ
ｄアンピシリンを含有するｌ、−ｂｒｏｔｈ中３７℃で
一晩増殖させた。培養物を５にｒｐｒａで５分間遠心し
、得られた細胞ベレットをそれぞれ３ｍ１の細胞溶解用
緩衝液（１０ｍＨＴｒｌＳ　ｌ）Ｈ７，５，１０１１１
８メルカプトエタノール、　０．１ｍＨＥＤＴＡ中に再
懸濁させた。同じ緩衝液中に１０Ｒｇ／　ｔｒｄｌのリ
ゾデームを含有する液を０．５ｍｌずつ加え、得られた
懸濁液を２時間氷上に放置した。この懸濁液を一２０℃
で一晩凍結した後氷トで解凍し、０．００５Ｘ　Ｔｒｉ
ｔＯｎ　Ｘ−１００を含有する細胞溶解用緩衝液を３．
５ｄずつ激しく混合して細胞の溶解を誘導した。溶菌し
た溶液を５分間軽く遠心してＭＭを固め、上清のエンド
ヌクレアーゼ活性を以下のようにして検定した。

精製したλファージＤＮＡ３５埒を、７００成の制限エ
ンドヌクレアーぜ消化用緩衝液（上記第２項）中に希釈
した。この溶液を６本のチューブに、最初の１本には１
５０成、残りの５本には１００ｄずつ分注した。最初の
デユープに抽出物７．５成を入れてＤＮＡ１埒当たり抽
出物１成とした。次に、最初のチューブから５０成を取
り出して第二のデユープに移して０．３１１１．／１１
９とした。続けてチューブ３．４．５にも順次５０成ず
つ移して、チューブ３（ｏ、１１１１／埒＞　、４　（
０，０３／Ｊ／＃）および５　（０，００１ｄ／埒）と
した。６本口のチューブには抽出物を入れないで負のコ
ントロールとして使用した。これらのチューブを１時間
３７℃にインキュベートした後、各チューブのサンプル
２０ｃｃｇをゲル電気泳動によって分析した。これらの
抽出物は、１威に付き約３Ｘ１０’ｕ旧【のＦｎｕＤＩ
制限エンドヌクレアーゼを含有していることが判明した
。これは、細胞１９　当ｒ；−リ約１　ｘ　１０６ｕｎ
ｉｔニ相当スル（第３図）。

（１１）　　５．５Ｋｂ断片１７）ｐＵｃ１９　ヘ（７
）移入：精製したｐＦｎｕＤＩＲＨ２−３３のＤ　Ｎ　
Ａ　５＃　（５０薦）を、２０　ｕｎｔｔの＠　ｉｎｄ
　Ｉ［［制限エンドヌクレアーゼを含有する１００成の
制限エンドヌクレアーゼ消化用緩衝液（上記第２項）中
に準備した。この溶液を１時間３１℃にインキュベート
した後、１２分間７２℃に加熱して消化を停止した。消
化したｐＦｎｕＤＩＲＨ２−３３のＤＮＡ　３ＩＪ３（
６０ｍ）を、Ｈｉｎｄ　Ｉ［ｌで開裂し脱リン酸化した
Ｉ］ＵＣ１９（ＡＴＣＣ３７２５４）の　１５埒（７，
５ｐ１＞と混合した。１０ｇｆ！の１０Ｘ連結用緩衝液
（上記第３項）と２２，５μｍの滅菌蒸溜水を加えて容
量を１００成とした。４鱈のＴ４　ＤＮＡリガーゼを添
加し、１ｑられた溶液を４時間１７℃にインキュベート
シた。この連結物を、１５〃のクロロホルムで抽出して
滅菌した復軽く遠心して清澄化した。

こうして滅菌した連結′＃１２．５ＩＪＪ！、を、１０
０ｄのＣａＣ１！２／ＳＳＣ（上記第３項）および２０
０ＩＩｉ（７）氷冷したコンピテントＥ、　ｃｏｌｉ　
１１１１と混合した。得られた混合物を３分間４２℃に
インキュベートした後、アンピシリン含有Ｌ−ａｇａｒ
プレート上に接種した。

このプレートを一晩３７℃にインキュベーションした。

このプレートに２．５ｄの１０ｍＨＴｒｙｓ　Ｃ８７，
５１０ｍＨＨ（ＩＱ！　２を満たし、コロニーをまとめ
て掻き取ることによって形質転換体を回収してプールを
形成した。このプールを５００１ｎｆ！のアンピシリン
含有１−　ｂｒｏｔｈに接種し、プラスミド調製物を精
製した（上記第５項）。精製したプラスミド５埒をｉｏ
ｏ　ｎの制限エンドヌクレアーゼ緩衝液（上記第６項）
中で４０　ｕ旧【のＨａｅｌ［Ｉ制限エンドヌクレアー
ゼによって消化した。消化したＤＮＡの１２．５μをＥ
　、　ｃｏｌ＋　ＲＲＩ　（上記第７項）に形質転換し
、生き残る形質転換体を、アンピシリン含：６’　１−
ａｇａｒプレート上に接種して−＠３１℃にインキュベ
ートすることによって回収した。

１４　ｌ１７．］の形質転換体を採取し、ｍ１ｎｉｐｒ
ｅｐ法（上記第８項）によってスクリーニングして、Ｈ
ｉｎｄ　ｍ部位に挿入された　５．５Ｋｂ断片を右する
１）ＵＣｌ３から構成されたプラスミドを同定した。１
３個のプラスミドがこの構造を保有していることが判明
した。

これらは５．５にｂ断片を担持しており、ＨａｃＩ［ｌ
消化に対して完全な抵抗性を示した。これらのプラスミ
ドのうらの２　ツ、ｐＦｎｕＤＩＲＨ１０２−１とｐＦ
ｎｕＤＩＲＨ１０２−４を担持するＥ、　ｃｏｌｉ　Ｒ
ＲＩの粗細胞抽出物のＦｎｕ［）Ｉ制限エンドヌクレア
ーゼ活性を検定した。

これらの抽出物は、抽出物１ｍｌに付き約１×１０５ｕ
ｎｉｔ　（細胞１ｇに付き３　ｘ　１０６ｕｎｉｔ）で
ＦｎｕＤＩ制限エンドヌクレアーゼを含有していること
が判明した。

ｐＦｎｕＤＩＲＨ２−３３どｐＦｎｕＤＩＲＨ１０２−
１を相持するＥ、　ｃｏｌｉ　ＲＲｌは、Ｆｎｕｌ）Ｉ
制限エンドヌクレアーげを精製する際の好ましい宿主と
して使用することができる。この株を、醗酵槽のアンピ
シリン含有Ｌ−ｂｒｏｔｈ中３７℃で定常期まで増殖さ
せた後、遠心して細胞を集め、直ぐに破砕して抽出物を
調製してもよいし、使用時まで一７０℃で凍結保存して
もよい。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＦｎｔＪＤＩ制限エンドヌクレアーゼをクロ
ーニングして生産する方法の概略を示す。 第２図は、ＦｎｕＤＩ制限エンドヌクレア・−ゼおよび
修飾メチラーぜをコードしているＦｎｕｃ＋ｅａｔｕｍ
　ＤのＤＮＡの５．５Ｋｂ　Ｈｉｎｄ　ｍ　Ｖｆ＋片の
制限地図であり、この断片をｐＢＲ３２２（八ＴＣＣ３
７０１７）ノ＠　＋ｎｃｊ　ｍ部位にクローニングして
ｐＦｎｕＤｒＲＨ２−３３を所作し、その１ｍ　ｐｕ　
Ｃ１９（ＡＴＣＣ３７２５４）のＨｉｎｄｌｌ［部位に
移してｐＦｎｕＤ［ＲＨ１０２−１を創作した。 第３図は、ｐＦｎｕＤＩＲＨ２−３３を相持するＦ、ｃ
ｏｌｉＲＲＩ（ＡＴＣＣ３１３４３）の細胞抽出物中の
Ｆｎｕ［）■制限エンドヌクレアーゼ活性を示すアガ［
］−スゲルの写真である。 Ｈｉｎｄｌｌｌ ＦＩＧ、　２ Ｈｉｎｄｌｌｌ ＩＧ３

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＦｎｕＤ I 制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含
   むクローニングベクター。
2. （２）請求項１に記載のクローニングベクターを含有す
   る形質転換された宿主。
3. （３）ＦｎｕＤ I 遺伝子が、￥Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒ
   ｉｕｍｎｕｃｌｅａｔ−￥￥ｕｍ￥Ｄから切り出された
   ものである、請求項１に記載のクローニングベクター。
4. （４）ＦｎｕＤ I 修飾遺伝子を含むクローニングベク
   ター。
5. （５）請求項４に記載のクローニングベクターを含有す
   る形質転換された宿主。
6. （６）（ａ）￥Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ￥Ｄに由来する
   ＤＮＡからライブラリーを形成し、 （ｂ）ＦｎｕＤ I 修飾遺伝子を含有するクローンを単
   離し、 （ｃ）修飾遺伝子を含有するクローンをスクリーニング
   し、 （ｄ）ＦｎｕＤ I 制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を同
   時に含有しているクローンを単離する ことからなる、ＦｎｕＤ I 制限エンドヌクレアーゼ遺
   伝子のクローニング方法。
7. （７）前記ライブラリーを、 （ａ）￥Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ￥Ｄに由来するＤＮＡ
   を精製するステップ、 （ｂ）精製したＤＮＡを消化してＤＮＡ断片を形成する
   ステップ、 （ｃ）この断片をクローニングベクターに連結するステ
   ップ、 （ｄ）ステップ（ｃ）のクローニングベクターで宿主細
   胞を形質転換してセルライブラリーを形成するステップ
   、 （ｅ）このセルライブラリーから組換えベクターを精製
   してプラスミドライブラリーを形成するステップ によつて形成する、請求項６に記載の方法。
8. （８）クローニングベクターがｐＢＲ３２２である、請
   求項７に記載の方法。
9. （９）宿主細胞が￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥のｍｃｒＢ＾−およ
   びｈｓｄＲ＾−株である、請求項７に記載の方法。
10. （１０）プラスミドライブラリーをＦｎｕＤ I で消化
    して消化プールを形成し、この消化プールを宿主細胞中
    に形質転換し、修飾遺伝子を含有するクローンを選択す
    ることによつて、ＦｎｕＤ I 修飾遺伝子を含有するク
    ローンを単離する、請求項７に記載の方法。
11. （１１）（ａ）￥Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ￥Ｄに由来す
    るＤＮＡを精製し、 （ｂ）精製したＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼ
    で消化してＤＮＡ断片を形成し、（ｃ）この断片をクロ
    ーニングベクターに連結してＤＮＡ混合物を形成し、 （ｄ）ステップ（ｃ）のＤＮＡ混合物で宿主細胞を形質
    転換してライブラリーを形成し、（ｅ）ＦｎｕＤ I 修
    飾メチラーゼ遺伝子を含有するクローンを単離し、 （ｆ）ＦｎｕＤ I 修飾メチラーゼ遺伝子を含有するク
    ローンをスクリーニングし、ＦｎｕＤ I 制限エンドヌ
    クレアーゼ遺伝子を同時に含有しているクローンを単離
    し、 （ｇ）ステップ（ｆ）のクローンを含有する宿主細胞を
    培養し、 （ｈ）この培養物からＦｎｕＤ I 制限エンドヌクレア
    ーゼを回収する ことからなる、ＦｎｕＤ I 制限エンドヌクレアーゼの
    製造方法。
12. （１２）クローニングベクターがプラスミドまたはウィ
    ルスのＤＮＡ分子である、請求項１１に記載の方法。
13. （１３）プラスミドがｐＢＲ３２２である、請求項１２
    に記載の方法。
14. （１４）プラスミドがｐＵＣ１９である、請求項１２に
    記載の方法。